PRP产品及制备方法、PRP与调节性T细胞复合制剂及应用与流程

本发明涉及生物制剂
技术领域：
，尤其是涉及一种prp产品及制备方法、prp与调节性t细胞复合制剂及应用。
背景技术：
：随着世界范围内人口老龄化的日益严重，膝关节骨关节炎(kneeosteoarthritis，koa)的发病率也逐年增高。有效的预防和治疗koa已成为改善中老年人生活质量的关键所在。对于koa的治疗，依然遵循着金字塔式的阶梯治疗原则。如何延缓koa的发展，避免患者行胫骨近端高位截骨术、单间室置换术以及全膝关节表面置换术等手术治疗方式，采用更加微创的方式延缓骨关节炎的进展，是当前迫切需要解决的问题。研究发现，prp(platelet-richplasma，高浓度血小板血浆，指利用自身全血经过分离制备所得到的富含血小板的血液)含有大量的生长因子，如血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor，pdgf)、肿瘤转化因子β(tumortransformationfactor-β，tgf-β)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)等。这些细胞因子主要存在于血小板中的α颗粒内，当这些因子释放出来后，可促进各种软硬组织的再生和修复。目前，临床上prp也逐步被用于治疗koa，取得了一定的成效。目前上市的prp产品大多通过两步或三步离心法制备，整个流程时间长，操作繁琐，并且中间需要数次开放操作，容易出现人为带入污染和误差的风险。另外血小板激活剂一般使用凝血酶、胶原蛋白或cacl2，都属于添加了外源物质，容易带来额外风险，例如凝血酶一般源于牛，极易带来牛源病毒污染风险。再者，每次离心分离都会带来血小板损失，总回收率不会太高，影响了prp的浓度和治疗效果。技术实现要素：基于此，有必要提供一种操作时间短、污染小、安全性高且有利于提高血小板回收率的prp产品及其制备方法和应用。此外，还有必要提供一种含有上述prp产品的prp与调节性t细胞复合制剂及其应用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下。一种prp产品的制备方法，包括如下步骤：对全血原料进行超声波处理；取出上层血浆，进行离心处理；去除上层的乏血小板血浆，收集剩余的血浆，混匀。在其中一个实施例中，在对全血原料进行超声波处理时，超声波的输出频率为4.0mhz～5.0mhz，声压小于等于0.05mpa，持续8min～12min。在其中一个实施例中，所述prp产品的制备方法还包括对收集的剩余的血浆再次进行超声波处理，激活血小板的步骤。在其中一个实施例中，在对收集的剩余的血浆再次进行超声波处理激活血小板时，超声波的输出频率为1.0mhz～1.2mhz，作用时间为1.5min～2.5min，总强度为800w/cm2～1200w/cm2。在其中一个实施例中，所述离心处理的速度是2000rpm～3000rpm，时间是8min～12min。在其中一个实施例中，所述全血原料为外周血；和/或所述全血原料收集在用肝素钠润湿的容器中；和/或在进行超声波处理时，将容器置于超声波反应器的中心位置，并在所述超声波反应器的外壳与容器之间填充满脱气pbs溶液。一种prp产品，其采用上述任一实施例所述的制备方法制备得到。一种prp与调节性t细胞复合制剂，是cd4+cd25+调节性t细胞与上述prp产品混合得到。在其中一个实施例中，在所述prp与调节性t细胞复合制剂中，血小板的使用浓度不小于3×108个/ml，cd4+cd25+调节性t细胞的使用浓度不小于6×106个细胞/ml。上述prp产品或上述复合制剂在制备治疗膝关节骨关节炎治疗药物或注射制剂中的应用。上述prp产品是将全血原料经过超声波处理后分离收集上层富含血小板的血浆得到的，无需经过多次离心处理，整个制备过程操作简单、效率高，并且可以避免多次离心操作带来的人为污染和误差以及回收率低等问题，制备过程中无需使用凝血酶、胶原蛋白或氯化钙等外源物质，得到的prp产品安全性高。在对koa患者的外周血和滑液中淋巴细胞亚群的研究中发现，患者膝关节滑液中淋巴细胞亚群数量明显异常，滑膜中常有炎性细胞浸润，而激活的杀伤性t淋巴细胞(cd8+t)可以激活cd69、cd25、cd38、cd43、cd45和组织相容性白细胞抗原(hla)classⅱ进而产生抗原抗体反应，促进软骨细胞的破坏。进一步研究发现，病患处cd8+t淋巴细胞，还可分泌il-1、tnf-α等炎性因子，可以诱导其它炎症因子如il-6、il-8和基质降解过程中多种酶的产生，其中包括基质金属蛋白酶家族以及聚合酶，而且能够抑制ⅱ、ⅸ型胶原及蛋白聚糖的合成，此外还可以上调关节软骨中蛋白水解酶受体-2的表达及调节软骨细胞的凋亡。基于此，本发明提供一种prp与调节性t细胞复合制剂，该复合制剂通过将上述prp产品与cd4+cd25+调节性t细胞(cd4+cd25+treg)cd4+cd25+调节性t细胞混合。其中，cd4+cd25+调节性t细胞起源于胸腺，具有免疫无能性和免疫抑制性。免疫无能性表现为在体外经tcr激活后，cd4+cd25+调节性t细胞不发生增殖，不产生il-2；对高浓度il-2的单独刺激、抗cd3单抗、抗cd3单抗和抗cd28单抗的联合应用呈低应答状态。免疫抑制性表现在cd4+cd25+调节性t细胞经tcr刺激活化后能够抑制cd4+和cd8+t细胞的增殖。这种经tcr介导的信号既可以是用抗cd3单抗产生的多克隆刺激，也可以是抗原特异性刺激。cd4+cd25+treg细胞被活化后，其抑制作用即为非抗原特异性的，不具有mhc限制性。因此，cd4+cd25+调节性t细胞可以作为一种抑制cd8+t活性的成分，用于koa患者早期、中期治疗，可以获得良好效果。cd4+cd25+调节性t细胞与prp二者混合培养无冲突，在发挥prp产品和调节性t细胞各自对koa的治疗效果的同时，prp产品还可以促进调节性t细胞cd4+cd25+调节性t细胞的生长增殖，进而进一步有利于提高调节性t细胞cd4+cd25+调节性t细胞对koa的治疗效果。该prp产品以及该复合制剂可广泛用于膝关节骨关节炎(koa)的治疗中，如用于制备治疗膝关节骨关节炎治疗药物或注射制剂，安全性高，且有利于调节性t细胞cd4+cd25+调节性t细胞对koa提高治疗效果。附图说明图1为本发明一实施例的复合制剂的制备流程示意图；图2为实施例2不同prp添加量影响cd4+cd25+调节性t细胞cd4+cd25+调节性t细胞增殖度的结果示意图。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。针对传统的使用多步离心法制备prp产品过程中存在的操作复杂、回收率低、人为污染风险大以及易受外源物质干扰而导致安全性低等问题，本发明提供了一种新的prp产品的制备方法，其包括如下步骤：对全血原料进行超声波处理；取出上层血浆，进行离心处理；去除上层的乏血小板血浆，收集剩余的血浆，混匀。在一个具体示例中，在对全血原料进行超声波处理时，超声波的输出频率为4.0mhz～5.0mhz，声压小于等于0.05mpa，持续8min～12min；优选地，超声波的输出频率为4.4mhz，声压小于0.05mpa，持续10min。进一步，该prp产品的制备方法还包括对收集的剩余的血浆再次进行超声波处理，激活血小板的步骤。优选地，在对收集的剩余的血浆再次进行超声波激活血小板处理时，超声波的输出频率为1.0mhz～1.2mhz，作用时间为1.5min～2.5min，总强度为800w/cm2～1200w/cm2；进一步优选地，超声波的输出频率为1.1mhz，作用时间为2.0min，总强度为1000w/cm2。优选的，所述离心处理的速度是2000rpm～3000rpm，时间是8min～12min。本发明所述的全血原料可以是但不限于外周血。优选地，将全血原料收集在用肝素钠润湿的容器中。在进行超声波处理时，优选将容器置于超声波反应器的中心位置，并在超声波反应器的外壳与容器之间填充满脱气pbs溶液。本发明还提供了一种prp产品，其采用上述制备方法制备得到。上述prp产品是将全血原料经过超声波处理后分离收集上层富含血小板的血浆得到的，无需经过多次离心处理，整个制备过程操作简单、效率高，并且可以避免多次离心操作带来的人为污染和误差以及回收率低等问题，制备过程中无需使用凝血酶、胶原蛋白或氯化钙等外源物质，得到的prp产品安全性高。本发明进一步还提供了一种复合制剂，其是将cd4+cd25+调节性t细胞与上述prp产品混合得到。例如，可以将cd4+cd25+调节性t细胞制成细胞悬液，与prp产品混匀。在其中一个实施例中，在复合制剂中，血小板的使用浓度是不小于3×108个/ml，cd4+cd25+调节性t细胞的使用浓度不小于6×106个细胞/ml。如图1所示，在一个具体示例中，该复合制剂可以采用但不限于按照上述方法进行制备：(1)抽取患者外周血，使用ficoll分离液离心分离，收获白膜层单个核细胞；(2)使用cd4+cd25+磁珠，分离出cd4+cd25+调节性t细胞；(3)将获得的cd4+cd25+调节性t细胞按1×106个细胞/ml的密度混匀至x-vivo培养基中，添加l-谷氨酰胺2mmol/l，5％自体血浆，1：1添加cd3/cd28单抗包被的磁珠，并添加雷帕霉素(rapamycin)1μg/ml，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养；(4)培养一周后，在培养基中添加rmil-21000iu/ml，继续培养2周后，收获细胞用生理盐水制备成细胞悬液备用；(5)收获cd4+cd25+调节性t细胞当天，使用螺旋口注射器抽取肝素钠润湿，然后抽取患者外周血30ml，取下针头换上螺旋盖；(6)将注射器插入超声波反应器中心位置，反应器外壳和注射器之间填充满脱气pbs溶液；(7)打开电源开关，控制输出频率4.4mhz，声压＜0.05mpa，持续10min；(8)取出上层血浆，装入新一支离心管中，2500rpm离心10min，弃上上层的ppp(约占血浆总体积的70％)，剩余血浆继续放入激活型超声波反应器中心位置，超声波频率1.1mhz，作用时间2min，总强度1000w/cm2；(9)摇匀血浆，就是制备好的prp血浆；(10)将prp血浆和cd4+cd25+调节性t细胞悬液混合，得复合制剂。该复合制剂在使用时，混悬液应包含≥6×106个细胞/ml的cd4+cd25+调节性t细胞和≥3×108个/ml的血小板。使用时体积控制在8-15ml，用注射器局部注射入膝盖关节腔内。传统的koa保守治疗方案普遍使用布洛芬、阿司匹林、吲哚美辛等缓解症状，这些药物有中枢神经系统、胃肠道、肾脏的不良反应，会进一步加重关节损伤；中度膝骨关节炎，使用塞来昔布等非类固醇类抗炎药类用药，其副反应有增加心血管疾病风险；使用脂肪来源、骨髓来源间充质干细胞治疗koa，但是取材普遍麻烦(需要小手术)，给患者带来额外痛苦；使用透明质酸钠可以延缓软骨细胞死亡，其在关节腔内注射可缓解疼痛，但不能解决koa病因。针对现有技术的缺点，本发明提供一种prp与调节性t细胞复合制剂，prp与调节性t细胞优选来源于自体。该复合制剂通过将上述prp产品与cd4+cd25+调节性t细胞悬液混合，cd4+cd25调节性t细胞的抑制能力也要强于其他种类调节细胞，能用少量细胞就可以达到治疗效果。prp与调节性t细胞二者混合培养无冲突，在发挥prp产品和cd4+cd25+调节性t细胞各自对koa的治疗效果的同时，prp产品可以促进cd4+cd25+调节性t细胞的生长增殖，进而进一步有利于提高cd4+cd25+调节性t细胞对koa的治疗效果。该prp产品以及该复合制剂可广泛用于膝关节骨关节炎(koa)的治疗中，如用于制备治疗膝关节骨关节炎治疗药物或注射制剂，安全性高，且有利于cd4+cd25+调节性t细胞对koa提高治疗效果。以下结合具体实施例对本发明的prp产品、复合制剂及其应用作进一步详细的说明。实施例1抽取外周血时，将抗凝血液分成两组，组a使用传统离心法制备prp：第一次1000rpm离心10min，血液分为上层的血浆和下层的红细胞，弃去位于离心管下部的红细胞，吸取全部血浆至另一离心管；进行第二次离心，速度2500rpm离心10min，血浆分为上层的乏血小板血浆(ppp)和下层的prp，弃上上层的ppp(约占血浆总体积的70％)，剩余液体摇匀即为prp。组b使用超声波法制备prp：将装有抗凝血液的注射器置入超声分离器中心，打开电源，设置输出频率4.4mhz，声压＜0.05mpa，持续作用10min，血液分为上层的含血小板血浆和下层的血细胞层。吸取上层的含血小板血浆进行离心，速度2500rpm离心10min，弃去上层的ppp(约占血浆总体积的70％)，剩余液体摇匀，继续放入激活型超声波反应器中心位置，超声波频率1.1mhz，作用时间2min，总强度1000w/cm2，获得的血浆即是prp。分别对样本a、b组prp中的血小板数量进行检测。实验结果：血小板数量血小板浓度使用时间单位个/mla(离心法)2.64×1094.8×10830minb(超声法)3.9×1096.5×10815min由上表可知，超声波分离法操作环节少、时间短，血小板损失量少，获得的prp浓度会比离心法高。实施例2取消化、收集生长良好的第2周cd4+cd25+调节性t细胞，调整细胞浓度至1×106个细胞/ml，6孔培养板上每孔接种细胞悬液2ml，加入含l-谷氨酰胺2mmol/l，rapamycin1μg/ml，rmil-21000iu/ml的x-vivo培养基，分成2组：对照组不添加血浆，研究组补加5％自体prp产品，每组4个平行孔。继续培养1周后收获细胞，计算每组细胞数。结果如图2所示，可以看出添加了prp产品后，cd4+cd25+调节性t细胞的增殖度显著提高，说明prp具有促进cd4+cd25+调节性t细胞增殖的效果。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12