一种黄芩叶提取物及其制备方法和用途与流程

本发明属于中药材非药用部位的提取技术领域，具体涉及一种黄芩叶提取物及其制备方法，以及黄芩叶提取物在抗衰老方面的应用。

背景技术：

唇形科植物黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)常以根部入药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效，其主要活性成分黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、解热、镇痛、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等药理作用。叶作为黄芩的地上部分，生长茂盛且产量较大。

黄芩叶的功效与作用：抗菌抗病毒是黄芩叶的重要功效之一，它含有的黄芩苷和黄芩多糖都是天然的抗菌成分，它们对人体内的革兰氏阴性菌以及皮肤真菌还有革兰氏阳性菌都用明显抑制和消除作用，另外黄芩叶还能抗病毒，它能抑制人体内乙肝病毒与流感病的活性，能减少它们对人体的伤害。

黄芩叶还是一种能抗炎的中药材，它含有的黄芩苷和黄芩素等成分都能抑制人体内的急性炎症反应，而且能抑制炎症渗出，黄芩叶还能提高人体内毛细血管的通透性，抑制组胺释放，也能让白细胞数量明显提高，所以黄芩叶能起到明显抗炎作用。

黄芩叶能保护肝脏提高肝脏的解毒能力也能防止肝炎和肝硬化等多种肝类疾病发生，另外它还能预防胆囊炎，也能促进胆汁分泌，能防止胆固醇在身体内堆积，对胆结石和胆道病变也有良好的预防作用。

黄芩叶对人类的血液系统有十分明显的作用，它能提高人体的抗凝血能力，可以让血小板活性明显提高，也能抑制人体内凝血酶诱导蛋白产生，可以让人体的血液循环保持正常，能在预防动脉硬化的同时防止血栓发生。

但是目前对黄芩叶中具体的功效物质的研究报道较少，因此黄芩叶的综合开发利用、黄芩叶的经济价值未达到全面的提升。

技术实现要素：

本发明为了提高黄芩叶的利用度，提供了一种黄芩叶提取物及其制备方法和用途。黄芩叶提取物在抗衰老方面的应用。

本发明由如下技术方案实现的：一种黄芩叶提取物，该黄芩叶提取物为黄芩叶用水多次煎煮提取，合并提取液减压浓缩冷冻干燥，然后将其经hpd100大孔吸附树脂分离，以水、50%乙醇和95%乙醇作为洗脱溶剂，50%乙醇和95%乙醇洗脱液进行减压浓缩所得。

所述黄芩叶提取物中含有红花素-7-o-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、异红花素-7-o-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-o-葡萄糖醛酸苷、5,6,7,3',4'-五羟基黄酮-7-o-葡萄糖醛酸苷、夏佛塔苷、柚皮素-7-o-葡萄糖醛酸苷、5,7,8,3',4'-五羟基黄酮-7-o-葡萄糖醛酸苷、异高山黄芩素-8-o-葡萄糖醛酸苷。

制备所述的黄芩叶提取物的方法，步骤如下：取黄芩叶，分别用黄芩叶质量10-15倍的80-100℃水作为溶剂，煎煮回流提取2-3次，每次1-3h，合并提取液，减压浓缩，冷冻干燥得黄芩叶粗提物，将黄芩叶粗提物经hpd100大孔吸附树脂分离，分别以水、50%乙醇和95%乙醇作为洗脱溶剂进行回流提取；将50%乙醇和95%乙醇洗脱液进行减压浓缩，冷冻干燥即得黄芩叶提取物。

所述回流提取次数优选为2次，每次1h，第一次加入黄芩叶质量15倍的水，第二次加入黄芩叶质量10倍的水；所述回流温度为80-100℃。

所述水、50%乙醇和95%乙醇作为洗脱溶剂，以流速3bv/h进行洗脱，每个梯度收集3bv。

所述的黄芩叶提取物在制备抗衰老药物中的应用。所述的黄芩叶提取物在制备抗衰老保健品中的应用。

本发明经药理实验证明，采用d-半乳糖致衰老大鼠模型，灌胃分别给予黄芩叶粗提物和黄芩叶提取物，发现黄芩叶提取物能够改善衰老大鼠的学习记忆能力和氧化损伤，药效优于黄芩叶粗提物。因此，黄芩叶提取物抗衰老效果更佳，可用于制备天然抗衰老药品及保健品。增加了黄芩叶的可利用性。对扩大黄芩植物资源、增加经济价值具有重要的现实意义。

附图说明

图1为黄芩叶提取物主要成分提取离子流图，图中：1为5,6,7,3',4'-五羟基黄酮-7-o-葡萄糖醛酸苷；2为夏佛塔苷；3为5,7,8,3',4'-五羟基黄酮-7-o-葡萄糖醛酸苷；4为红花素-7-o-葡萄糖醛酸苷；5为异红花素-7-o-葡萄糖醛酸苷；6为黄芩素；7为芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷；8为柚皮素-7-o-葡萄糖醛酸苷；9为异高山黄芩素-8-o-葡萄糖醛酸苷；10为白杨素-7-o-葡萄糖醛酸苷。

图2为黄芩叶提取物对d-半乳糖致衰老大鼠学习记忆能力的改善作用（±s,n=10,与正常对照组比较^#p<0.05,^##p<0.01和^###p<0.001，与衰老模型组比较^*p<0.05,^**p<0.01）；

图3为黄芩叶提取物对d-半乳糖致衰老大鼠抗氧化的影响（±s,n=10，与正常对照组比较^#p<0.05,^###p<0.001,与衰老模型组比较^*p<0.05,^***p<0.001,组间比较^△p<0.05）。

具体实施方式

实施例1：黄芩叶提取物的制备方法：黄芩叶400g，水温89℃，第一次加15倍质量的水煎煮1h，过滤；第二次加10倍质量的水煎煮1h，过滤，合并滤液浓缩，再将浓缩液冷冻干燥从而获得黄芩叶粗提物。将上述得到的黄芩叶粗提物经hpd100大孔吸附树脂分离，分别以水、50%乙醇和95%乙醇作为洗脱溶剂，以流速3bv/h进行洗脱，每个梯度收集3bv。将50%乙醇和95%乙醇洗脱液进行减压浓缩，冷冻干燥得黄芩叶提取物。

实施例2：黄芩叶提取物化学成分分析：通过uhplc-qexactiveorbitrap-ms分析仪器，采用hsst3色谱柱分析对黄芩叶提取物主要成分进行鉴定。通过对照品及数据库对比，结合已有文献报道，共鉴定出10种主要化学成分，主要成分提取离子流图见图1。

液相条件：流动相：a（乙腈），b（水，含0.1%甲酸）；流动相梯度：0~4min,15%~20%a;4~8min,20~23%a;8~10min,23~25%a;10~14min,25~50%a;14~18min,50~52%a;18~20min,52~90%a;20~22min,90%a;22~22.5min,90~15%a;22.5~25min,15%a。流速0.30ml/min，2μl进样量，40°c柱温，watersacquityuplchsst3色谱柱（2.1×100m,1.8m）。

质谱条件：采用esi电喷雾负离子检测的电离模式，扫描模式：fullscan/dd-ms2，fullms分辨率：70000fwhm，agctarget:1×106；dd-ms2分辨率：17500fwhm，agctarget:1×105m/z，采集范围为100~1500。

结果显示，黄芩叶提取物中含有红花素-7-o-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、异红花素-7-o-葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-o-葡萄糖醛酸苷、5,6,7,3',4'-五羟基黄酮-7-o-葡萄糖醛酸苷、夏佛塔苷、柚皮素-7-o-葡萄糖醛酸苷、5,7,8,3',4'-五羟基黄酮-7-o-葡萄糖醛酸苷、异高山黄芩素-8-o-葡萄糖醛酸苷。

实施例3：黄芩叶提取物对衰老大鼠作用研究

一、40只spf级sd雄性大鼠购于北京维通利华有限公司，体重在（180±20）g范围内。动物实验室湿度（50±10）%、室温（25±1）℃、每12h光照循环，每个饲养笼放五只鼠，在实验期间可自由饮水、进食。

实验动物分组及给药：采用d-半乳糖致大鼠衰老模型，实验共分4组，即空白对照组、模型组、黄芩叶提取物组、黄芩叶粗提物组。模型组连续7周腹腔注射d-半乳糖溶液300mg·kg^-1、给药组造模的同时分别灌胃给予0.25g·kg^-1的黄芩叶提取物和黄芩叶粗提物。除空白组腹腔注射300mg·kg^-1生理盐水外其余各组均连续7周腹腔注射等体积d-半乳糖溶液。各给药组灌胃给予相应剂量的药物，空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水。

二、指标测定

学习记忆能力：采用水迷宫实验对黄芩叶提取物改善衰老大鼠空间学习记忆能力进行评价。水迷宫由高60cm、直径150cm的圆形水池组成，水池内装有高30cm、水温25℃的自来水。以水池中心为原点分为四个象限，逃生平台置于其中一个象限内，距水面约为1.5cm。各组大鼠连续训练5天，每天从不同象限内随机开始，每个象限训练1次，每次60s，训练间隔15min，大鼠到达逃生平台所用时间即为潜伏期。如未能在60s内找到逃生平台，则人为引导其在平台上停留15s，潜伏期记录为60s。5天训练结束后，撤去逃生平台，记录大鼠潜伏期、穿过原逃生平台所在象限的次数及在该象限内的停留时间。

氧化损伤及抗氧化体系测定：行为学考察结束后，腹腔注射20%乌拉坦（0.75ml/100g）麻醉大鼠，迅速股动脉取血。收集到的血液在3500r/min，4℃条件下离心20min，取上清液，测定sod、gsh-px活性及mda含量，具体步骤按试剂盒操作说明进行。

三、实验结果

1.黄芩叶提取物对衰老大鼠空间学习记忆能力的影响

本发明通过水迷宫实验对黄芩叶提取物改善衰老大鼠学习记忆能力的作用进行评价，结果如图2所示。结果表明，与空白组相比，给予d-gal后大鼠潜伏期明显延长（p<0.05），黄芩叶提取物给药后有回调作用（p<0.05）。与空白组相比，d-半乳糖诱导的衰老大鼠穿越平台次数和目标象限停留时间均明显减少（p<0.01、p<0.001），黄芩叶提取物组能够显著增加目标象限停留时间（p<0.01）和穿越平台次数（p<0.01）。各给药组对目标象限停留时间均有回调作用（p<0.01、p<0.05）上述结果表明，长期给予d-半乳糖溶液可导致大鼠学习记忆能力减退，黄芩叶提取物干预后能显著改善衰老大鼠认知能力，且黄芩叶提取物改善效果比黄芩叶粗提物更优。

2.黄芩叶提取物对衰老大鼠氧化损伤的影响

结果图3所示，与空白组相比，模型组大鼠血清中sod、gsh-px活性明显降低（p<0.001），mda含量明显升高（p<0.05）。与模型组相比，黄芩叶干预后sod、gsh-px活性和mda含量显著回调。说明长期注射d-半乳糖后将导致大鼠体内抗氧化酶活性降低，诱导氧化应激损伤，黄芩叶提取物能够有效改善机体氧化损伤，且黄芩叶提取物改善效果明显优于黄芩叶粗提物（p<0.05）。

啮齿类动物给予d-半乳糖溶液造模，常被用于研究与衰老相关疾病的发病机制和开发抗衰老药物。给予d-半乳糖可造成机体学习能力下降、记忆减退、组织器官退行性变化，ros水平升高，抗氧化酶活性降低。在本实验中，大鼠给予d-半乳糖后，学习记忆能力下降、氧化损伤明显，表明造模成功。给予黄芩叶提取物后，上述现象明显好转，且黄芩叶提取物改善效果优于黄芩叶粗提物。