基于纳米颗粒的组合物的制作方法
本发明是基于申请日为2014年3月14日，申请号为“201480023784.8”(国际申请号为pct/us2014/029000)，发明名称为“基于纳米颗粒的组合物”的专利申请的分案申请。
优先权要求
本申请要求在2013年3月14日提交的美国专利申请序列号61/783,439的优先权，将其全部内容并入本文作为参考。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的nih/ro1ai069259和nih/ro1ai072252下在政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
发明领域
本发明涉及包含纳米颗粒的组合物和佐剂组合物。
发明背景
粘膜是体内最大的器官之一，并包含胃肠道，泌尿生殖道和呼吸道的内层(lining)。位于体内的这些粘膜实际上是外部环境和称为系统环境的无菌内部体腔之间的物理屏障。因此，粘膜的一个重要功能是使侵入的病原体保持在无菌体腔之外。事实上，绝大多数的人类病原体(包括细菌，病毒，寄生物和真菌)在粘膜表面上起始感染(ogra等人,clinmicrobiolrev.14(2):430-45,2001)。
粘膜免疫是重要的，因为粘膜免疫应答的刺激可导致保护性b细胞和t细胞在粘膜和系统环境两者中产生，以使在病原体进入到内部体腔之前终止感染(参见例如mccluskie等人,microbesinfect.1(9):685-98；1999；rosenthal等人,seminimmunol.9(5):303-14,1997)。尽管粘膜免疫系统起着重要作用，但很少的疫苗特异地靶向粘膜免疫系统。
疫苗接种可以是被动或主动的。规范地，主动疫苗接种涉及使个体的免疫系统暴露于一个或多个引发内源免疫应答的外源分子，所述内源免疫应答导致抗原特异性幼稚淋巴细胞的激活，随后，这产生抗体分泌性b细胞或抗原特异性效应细胞和记忆t细胞。这种方法可以导致长期的保护性免疫，其可以通过对相同抗原性材料的更新暴露而时常加强。对主动疫苗接种的成功免疫反应的长期性的前景使这一策略在大多数临床环境下相比于被动疫苗接种是更期望的，在所述被动疫苗接种中给接受者注射预先形成的抗体或抗原特异性效应淋巴细胞，其可以赋予快速保护，但通常不能建立持久的免疫。
发明概述
本公开至少部分地基于新的组合物的开发，该组合物包含附着于灭活的病原体的一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒。例如，新的组合物包括灭活的病原体和装载有一种或多种佐剂的一种或多种聚合物纳米颗粒，所述病原体例如细菌，如沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)，土拉热弗朗西丝氏菌(francisellatularensis)，结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)，肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)，单核细胞增生利斯特菌(listeriamonocytogenes)，霍乱弧菌(vibriocholera)，宋氏志贺菌(shigellasonnei)，弗氏志贺菌(shigellaflexneri)，或鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，或病毒诸如人类呼吸道合胞体病毒(rsv)，流感病毒，人免疫缺陷病毒(hiv)或丙型肝炎病毒，所述佐剂如toll样受体激动剂，例如，咪唑并喹啉瑞喹莫德(imidazoquinolineresiquimod)(r-848)，单磷酰脂质a(monophosphoryllipida)，或未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸，或内体膜靶向剂，例如endo-porter肽。所述聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)-block-poly(l-histidine)-block-poly(ethyleneglycol)(plga-plh-peg)triblockcopolymer)制成。使一种或多种装载有佐剂的纳米颗粒结合到每个灭活的病原体。这些组合物可用作用于预防和/或治疗由特定病原体引起的疾病的疫苗，尤其是当施用于受试者的粘膜时。
本文也提供用于在受试者中刺激针对病原体(例如细菌，病毒，寄生物或真菌)的粘膜免疫应答的方法，其通过粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，通过吸入，例如，肺或支气管，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径)向受试者施用本文所述的新的疫苗组合物进行。
在一些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒是表面带电的并通过静电引力附着于灭活的病原体。在一些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如，特异性结合灭活的病原体上的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽)附着于灭活的病原体。
例如，制备并在小鼠模型中评价了沙眼衣原体疫苗组合物，其包括附着于一个或多个装载有r848的聚合物纳米颗粒的灭活的沙眼衣原体。虽然单独的灭活的沙眼衣原体诱导免疫耐受，但是当通过粘膜途径(如鼻内或子宫内)施用时，新的沙眼衣原体疫苗组合物有效预防后续的沙眼衣原体感染。目前，没有可用于人类的针对沙眼衣原体感染的疫苗。因此，这些新的沙眼衣原体疫苗组合物是针对人沙眼衣原体感染的有希望的新的预防性和治疗性疫苗。
在一般情况下，在一个方面，本公开特征在于在有此需要的受试者中刺激针对一种或多种不同类型的病原体(例如，沙眼衣原体或土拉热弗朗西丝氏菌)的粘膜免疫应答的方法。该方法包括向受试者施用组合物，其包括病原体的灭活形式和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于灭活的病原体。
在这些方法中，所述病原体可以是细菌，病毒，寄生物，和/或真菌，并且该组合物可通过一个或多个粘膜途径(例如，通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径)施用于受试者。
在这些方法的一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以包含靶向内体膜的佐剂，和/或加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以包含toll样受体激动剂，例如，r848，单磷酰脂质a，或未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在一些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的病原体。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过一种或多种接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，和/或抗微生物肽)附着于灭活的病原体附着机制。
在一些实施方案中，本文公开了用于在受试者中刺激针对选自下组的细菌的粘膜免疫应答的方法：放线菌属(actinomyces)、鱼腥藻属(anabaena)、芽孢杆菌属(bacillus)、类杆菌属(bacteroides)、蛭弧菌属(bdellovibrio)、博德特菌属(bordetella)、疏螺旋体属(borrelia)、布鲁杆菌属(brucella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、柄杆菌属(caulobacter)、衣原体属(chlamydia)、绿菌属(chlorobium)、着色菌属(chromatium)、梭菌属(clostridium)、棒杆菌属(corynebacterium)、纤维粘菌属(cytophaga)、异常球菌属(deinococcus)、肠球菌属(enterococcus)、埃希氏菌属(escherichia)、弗朗西丝菌属(francisella)、嗜盐杆菌属(halobacterium)、螺杆菌属、嗜血菌属(haemophilus)、丝状细菌属(hyphomicrobium)、军团菌属(legionella)、钩端螺旋体、利斯特菌属(listeria)、脑膜炎球菌a、b和c、甲烷杆菌属(methanobacterium)、微球菌属(micrococcus)、分枝杆菌属(mycobacterium)、支原体属(mycoplasma)、粘球菌属(myxococcus)、奈瑟球菌属(neisseria)、硝化杆菌属(nitrobacter)、颤藻属(oscillatoria)、原绿菌属(prochloron)、变形杆菌属(proteus)、假单胞菌属(pseudomonas)、红螺菌属、立克次氏体(rickettsia)、沙门菌属(salmonella)、志贺菌属(shigella)、螺旋菌属(spirillum)、螺旋体属(spirochaeta)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、链霉菌属(streptomyces)、硫化叶菌属(sulfolobus)、热原体属(thermoplasma)、硫杆菌属(thiobacillus)、密螺旋体属(treponema)、弧菌属(vibrio)和耶尔森菌属(yersinia)。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对沙眼衣原体的粘膜免疫应答的方法。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对土拉热弗朗西丝氏菌的粘膜免疫应答的方法。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对结核分枝杆菌的粘膜免疫应答的方法。
在一些实施方案中，本文提供了用于在受试者中刺激针对选自下组的病毒的粘膜免疫应答的方法：腺病毒科(adenoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、动脉病毒属(arterivirus)、星状病毒科(astroviridae)、杆状病毒科(baculoviridae)、杆状dna病毒属(badnavirus)、杆状rna病毒科、双rna病毒科、雀麦花叶病毒科(bromoviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、嵌杯病毒科(caliciviridae)、毛状病毒组(capillovirus)、石竹隐潜病毒组(carlavirus)、花椰菜花叶病毒组(caulimovirus)、环状构象病毒科(circoviridae)、线形病毒组(closterovirus)、豇豆花叶病毒科(comoviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、被脂病毒科(corticoviridae)、囊病毒科(cystoviridae)、δ病毒(deltavirus)、石竹病毒(dianthovirus)、碗豆耳突花叶病毒组(enamovirus)、黄病毒科(flaviviridae)、纤丝病毒科(filoviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、嗜肝病毒科(hepadnaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、减毒病毒科(hypoviridae)、虹膜病毒科(iridoviridae)、轻病毒科(leviviridae)、脂毛病毒科(lipothrixviridae)、微病毒科(microviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、乳头状瘤病毒科(papillomaviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、副粘液病毒科(paramyxoviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、细小rna病毒科(picornaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠病毒科(reoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、披膜病毒科(togaviridae)和全病毒科(totiviridae)。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对人类呼吸道合胞体病毒(humanrespiratorysyncytialviruse)的粘膜免疫应答的方法。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对sars冠状病毒(sarscoronaviruses)的粘膜免疫应答的方法。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对诺如病毒(noroviruses)的粘膜免疫应答的方法。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyviruses)的粘膜免疫应答的方法。
在另一个一般性方面，本公开包括组合物，其包括一种或多种不同类型的灭活的病原体，例如，沙眼衣原体或土拉热弗朗西丝氏菌；和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过附着机制各自附着于灭活的病原体。在这些组合物中，灭活的病原体可以是灭活的细菌，灭活的病毒，灭活的寄生物，和/或灭活的真菌。例如，灭活的病原体可以是选自下组的灭活的细菌：沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)，土拉热弗朗西丝氏菌(francisellatularensis)，结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)，肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)，单核细胞增生利斯特菌(listeriamonocytogenes)，霍乱弧菌(vibriocholera)，宋氏志贺菌(shigellasonnei)，弗氏志贺菌(shigellaflexneri)和/或鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)。在一些实施方案中，本文公开的组合物由或基本上由一种或多种不同类型的灭活的病原体(例如，沙眼衣原体或土拉热弗朗西丝氏菌)；和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒组成，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过附着机制各自附着于灭活的病原体。
在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以包括靶向内体膜的佐剂，和/或toll样受体激动剂，例如，toll样受体激动剂可以是r848或未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
在多个实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的病原体。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的病原体附着机制。
可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如如本文详细说明的，通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的选自下组的细菌：放线菌属、鱼腥藻属、芽孢杆菌属、类杆菌属、蛭弧菌属、博德特菌属、疏螺旋体属、布鲁杆菌属、弯曲杆菌属、柄杆菌属、衣原体属、绿菌属、着色菌属、梭菌属、棒杆菌属、纤维粘菌属、异常球菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝菌属、嗜盐杆菌属、螺杆菌属、嗜血菌属、丝状细菌属、军团菌属、钩端螺旋体、利斯特菌属、脑膜炎球菌a、b和c、甲烷杆菌属、微球菌属、分枝杆菌属、支原体属、粘球菌属、奈瑟球菌属、硝化杆菌属、颤藻属、原绿菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、红螺菌属、立克次氏体、沙门菌属、志贺菌属、螺旋菌属、螺旋体属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、硫化叶菌属、热原体属、硫杆菌属、密螺旋体属、弧菌属和耶尔森菌属。在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的沙眼衣原体。在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的土拉热弗朗西丝氏菌。在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的结核分枝杆菌。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的选自下组的病毒：腺病毒科、沙粒病毒科、动脉病毒属、星状病毒科、杆状病毒科、杆状dna病毒属、杆状rna病毒科、双rna病毒科、雀麦花叶病毒科、布尼亚病毒科、嵌杯病毒科、毛状病毒组、石竹隐潜病毒组、花椰菜花叶病毒组、环状构象病毒科、线形病毒组、豇豆花叶病毒科、冠状病毒科、被脂病毒科、囊病毒科、δ病毒、石竹病毒、碗豆耳突花叶病毒组、黄病毒科、纤丝病毒科、黄病毒科、嗜肝病毒科、疱疹病毒科、减毒病毒科、虹膜病毒科、轻病毒科、脂毛病毒科、微病毒科、正粘病毒科、乳头状瘤病毒科、乳多空病毒科、副粘液病毒科、细小病毒科、细小rna病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科和全病毒科。在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的人类呼吸道合胞体病毒。在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的sars冠状病毒。在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的诺如病毒。在一些实施方案中，本文公开的组合物包括灭活的人免疫缺陷病毒。
在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包括灭活的沙眼衣原体和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于沙眼衣原体。在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包括靶向内体膜的佐剂和/或toll样受体激动剂。例如，佐剂可以是r848，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸和单磷酰脂质a中的一种或多种。在一些实施方案中，佐剂是r848。在多个实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的沙眼衣原体。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过一接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的沙眼衣原体附着机制。可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对沙眼衣原体的粘膜免疫应答的方法，其通过施用本文所述的组合物进行。
在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包括灭活的土拉热弗朗西丝氏菌和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于灭活的土拉热弗朗西丝氏菌。在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包括靶向内体膜的佐剂和/或toll样受体激动剂。例如，佐剂可以是r848，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸和单磷酰脂质a中的一种或多种。在一些实施方案中，佐剂是r848。在多个实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在一些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的土拉热弗朗西丝氏菌。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的土拉热弗朗西丝氏菌。可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对土拉热弗朗西丝氏菌的粘膜免疫应答的方法，其通过施用本文所述的组合物进行。
在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包括灭活的结核分枝杆菌和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于灭活的结核分枝杆菌上。在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包括靶向内体膜的佐剂和/或toll样受体激动剂。例如，佐剂可以是r848，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸和单磷酰脂质a中的一种或多种。在一些实施方案中，佐剂是单磷酰脂质a。在多个实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的结核分枝杆菌。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的结核分枝杆菌。可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对结核分枝杆菌的粘膜免疫应答的方法，其通过施用本文所述的组合物进行。。
在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包括灭活的人类呼吸道合胞体病毒(rsv)和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于灭活的人类呼吸道合胞体病毒。在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包括靶向内体膜的佐剂和/或toll样受体激动剂。例如，佐剂可以是r848，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸和单磷酰脂质a中的一种或多种。在一些实施方案中，佐剂是r848。在多个实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的人类呼吸道合胞体病毒。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的人类呼吸道合胞体病毒。可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对人类呼吸道合胞体病毒的粘膜免疫应答的方法，其通过施用本文所述的组合物进行。
在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包括灭活的sars冠状病毒和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于灭活的sars冠状病毒。在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包括靶向内体膜的佐剂和/或toll样受体激动剂。例如，佐剂可以是r848，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸和单磷酰脂质a中的一种或多种。在一些实施方案中，佐剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。在多个实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的sars冠状病毒。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的sars冠状病毒。可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对sars冠状病毒的粘膜免疫应答的方法，其通过施用本文所述的组合物进行。
在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包括灭活的诺如病毒和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于灭活的诺如病毒。在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包括靶向内体膜的佐剂和/或toll样受体激动剂。例如，佐剂可以是r848，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸和单磷酰脂质a中的一种或多种。在一些实施方案中，佐剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。在多个实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的诺如病毒。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的诺如病毒。可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对诺如病毒的粘膜免疫应答的方法，其通过施用本文所述的组合物进行。
在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包括灭活的人免疫缺陷病毒和一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于灭活的人免疫缺陷病毒上。在一些实施方式中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包括靶向内体膜的佐剂和/或toll样受体激动剂。例如，佐剂可以是r848，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸和单磷酰脂质a中的一种或多种。在一些实施方案中，佐剂是单磷酰脂质a。在多个实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒可以由可生物降解的聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物)制成。在某些实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于灭活的人免疫缺陷病毒。在其他实施方案中，一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头(例如，特异性结合灭活的病原体的表面分子的附着机制，如单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽中的一种或多种)附着于灭活的人免疫缺陷病毒。可以将组合物设计成适合粘膜施用(例如通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用)的形式。在一些实施方案中，提供了用于在受试者中刺激针对人免疫缺陷病毒的粘膜免疫应答的方法，其通过施用本文所述的组合物进行。
本文使用的“病原体”是在其宿主中引起疾病的传染原。病原体可以是细菌，病毒，寄生物，真菌或其它微生物传染原。
如本文使用的“纳米颗粒”是在500nm至小于0.5nm的范围的颗粒，例如，具有50至500nm之间的直径的颗粒。
如本文使用的，术语“佐剂”是指免疫学佐剂。借此意指能够增强或促进免疫系统对病原体的应答，从而诱导受试者中的免疫应答或一系列的免疫应答的化合物或组合物。例如，佐剂可以通过形成储库(depot)(延长组合物的半衰期)促进组合物的效果，提供额外的t细胞辅助，和/或刺激细胞因子的产生。
如本文使用的，“受试者”是动物，例如，哺乳动物，例如，人，猴，犬，猫，马，牛，猪，山羊，兔，或小鼠。
如本文使用的，“治疗/处理”可以是预防性的或治疗性的。预防性处理可以用于处理有风险形成来自传染性病原体的疾病的受试者。前往或生活在地方性传染病的区域的个体可被认为是处在风险中并且是针对特定传染性病原体进行预防性疫苗接种的候选者。用疫苗进行的治疗性处理可用于起始或增强受试者对感染病原体的免疫应答。
如本文中通常使用的，“有效量”是在所治疗的受试者中足以诱导保护性免疫应答的量。疫苗的实际有效量可以根据以下而改变：特定病原体和所使用的佐剂，配制的特定疫苗组合物，施用方式，在接种疫苗的受试者的年龄，体重，状况，以及施用途径和疾病或病症。
如本文所用的，“免疫刺激性”指的是物质对免疫系统具有刺激作用。使用标准测定法可以容易地鉴定这些物质，所述测定法指示免疫应答的多个方面，如细胞因子分泌，抗体产生，nk细胞活化和t细胞增殖。参见，例如，wo97/28259；wo98/16247；wo99/11275；krieg等人(1995)nature374:546-549；yamamoto等人(1992)j.immunol.148:4072-76；ballas等人(1996)j.immunol.157:1840-45；klinman等人(1997)j.immunol.158:3635-39；sato等人(1996)science273:352-354；pisetsky(1996)j.immunol.156:421-423；shimada等人(1986)jpn.j.cancerres.77:808-816；cowdery等人(1996)j.immunol.156:4570-75；roman等人(1997)nat.med.3:849-854；lipford等人(1997a)eur.j.immunol.27:2340-44；wo98/55495和wo00/61151。因此，这些和其它方法可用于鉴定，测试和/或确认免疫刺激性物质，如免疫刺激性核苷酸，例如免疫刺激性的分离的核酸。
如本文所用的，“偶联”或“偶联的”或“偶联物”(等)指化学联合一个实体(例如一个部分)与另一个。在一些实施方式中，偶联是共价的，这意味着在两个实体之间存在共价键的情况下发生偶联。在非共价实施方式中，非共价偶联是通过非共价相互作用介导，所述非共价相互作用包括但不限于电荷相互作用，亲和相互作用，金属配位，物理吸附，宿主-客体(host-guest)相互作用，疏水相互作用，tt堆积相互作用(stackinginteraction)，氢键键合相互作用，范德华相互作用，磁相互作用，静电相互作用，偶极-偶极相互作用，和/或它们的组合。在一些实施方式中，包囊是偶联的一种形式。
如本文使用的，“包囊”是指包封在合成的纳米颗粒中，优选完全包封在合成的纳米颗粒中。被包囊的物质的大部分或全部不暴露于合成纳米颗粒外部的局部环境。包囊不同于吸收，吸收使物质大部分或全部置于合成纳米颗粒的表面上，并且使物质暴露于合成纳米颗粒外部的局部环境。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但是以下还是描述了合适的方法和材料。将本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其整体并入本文作为参考。在存在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料，方法和实例仅是说明性的，并不意在进行限制。
本发明的其他特征和优点在以下的说明书和权利要求书中是明显的。
附图简述
图1a是点图，其显示用uv-灭活的ct(uv-ct)的子宫内免疫导致对随后活体衣原体攻击的增强的易感性，这表明通过uv-ct诱导的免疫耐受。
图1b是点图，其显示佐剂的共同施用未克服uv-ct诱导的免疫耐受。
图1c-1d是条形图，其显示通过foxp3+treg细胞介导uv-ct诱导的免疫耐受。
图1e是点图，其显示用抗cd25单克隆抗体处理克服了uv-ct诱导的免疫耐受，这表明cd4+foxp3+treg细胞在介导uv-ct诱导的免疫耐受中起关键作用。
图1f是点图，其显示了il-10缺陷消除了灭活的衣原体诱导的免疫耐受，确认treg分泌的il-10在灭活的衣原体诱导的免疫耐受中起关键作用。
图2a是说明表面电荷转换的合成佐剂颗粒(csap)结合灭活的沙眼衣原体的示意图。
图2b是冰冻-tem(冷冻透射电子显微镜)图像，其显示装载有r848的纳米颗粒结合到灭活的沙眼衣原体的表面。
图2c是动态光散射图，其确认纳米颗粒与灭活的沙眼衣原体的结合。
图2d-2e是一组流式细胞术图和相应的柱状图，其显示在ph7.4和6.0，baclight染色的uv-ct与经alexafluor488-标记的csap或缺少plh组(sap)的对照颗粒的结合。
图2f是点图，其显示用包括uv-ct-csaps的疫苗组合物免疫保护小鼠免受随后的活衣原体攻击。
图2g是点图，其显示在附着于uv-ct之前，滴定或中和装载有r848的csap未改变疫苗组合物的免疫保护性质。
图2h是点图，其显示包括uv-ct-csaps的疫苗组合物的igg诱导。从两个独立实验合并数据。n.d.＝＝未检测。
图3a-3d是一组点图，其显示由新的沙眼衣原体疫苗组合物刺激的保护性免疫是由cd4+t细胞介导的。
图4a是条形图，其显示当与用uv-灭活的衣原体(uv-ct)免疫的小鼠或者未感染的对照组小鼠(未免疫)相比时，用新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)或传染性衣原体(ct)攻击的小鼠的淋巴结中存在显著更多的衣原体特异性转基因cd4+t细胞。
图4b是一组流式细胞术图，其显示在用ct或uv-ct-csaps免疫的小鼠中的衣原体特异性cd90.1+cd4+t细胞的数目大大超过未感染的小鼠或者用uv-ct免疫的小鼠中的数目，表明是ct和uv-ct-csaps而非uv-ct诱导衣原体特异性cd4+t细胞的增殖。
图4c是一组饼图，其显示当与用uv-ct免疫的小鼠或未感染的对照小鼠相比时，在用ct或uv-ct-csaps免疫的小鼠中产生全部三种细胞因子(tnf-α,ifn-γ和il-2)的cd90.1+cd4+t细胞的数目显著更高。
图5a是一组流式细胞术图，其显示f4/80+cd103-巨噬细胞表达高水平的cd11b和cx3cr1，但低水平的cd11c；f4/80-cd103-树突细胞表达表达高水平的cd11c,cd11b和cx3cr1；f4/80-cd103+树突细胞表达低水平的cd11b和cx3cr1，但高水平的cd11c。
图5b和5c是一组点图，其显示在子宫(5b)和淋巴结(5c)两者中，cd103-树突细胞比f4/80+巨噬细胞和cd103+树突细胞具有显著更高的衣原体载量，表明cd103-树突细胞在识别和呈递衣原体中起重要的作用。
图5d和5e是一组条形图，其显示从用传染性衣原体(ct)或新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)免疫的小鼠的子宫中分离的cd103-树突细胞，而不是其他抗原呈递细胞既在体外(5d)又在体内(5e)诱导衣原体特异cd90.1+cd4+转基因t细胞(nr1细胞))的增殖。
图5f是条形图，其显示用uv-ct免疫后，cd103+树突细胞增加foxp3+cd25+nr1细胞的数目。
图6a是点图，其显示用新的疫苗组合物或传染性衣原体，而不是灭活的衣原体进行的子宫内免疫在在免疫后导致针对随后的生殖器衣原体感染的六个月的保护。
图6b是点图，其显示用新的疫苗组合物的鼻内，而不是皮下免疫导致针对随后的生殖器衣原体感染的保护性免疫，表明通过新疫苗组合物诱导了交叉粘膜保护性免疫。
图6c是一组流式细胞术图，其显示通过子宫内或鼻内，但不是皮下免疫诱导衣原体特异性转基因cd4+t细胞对子宫的组织归巢(tissuehomingintotheuterusofchlamydia-specifictransgeniccd4+tcells)。
图6d是一组条形图，其显示通过子宫内(i.u.)或鼻内(i.n.)途径，而非皮下(sc)途径用uv-ct-csap的免疫诱导保护性nr1细胞在生殖器粘膜和肺中的募集和保留。在不同的免疫途径中，nr1细胞在肝，淋巴结，脾，或血液中的数目是相当的。
图7a是示意图，其显示实施例5的实验方案。
图7b-7c是条形图，其显示阻断alpha4整联蛋白有效地防止t细胞在子宫中的积累(7c)，但对脾中的nr1细胞的数目无影响(7b)。
图7d是条形图，其显示存在于脾中的系统性nr1细胞未受α4抗体注射的影响。
图7e是条形图，其显示在用igg处理的gr.1小鼠，及仅在用衣原体攻击后用抗α4mab处理的gr.3小鼠中，而非在疫苗接种和攻击二者后用抗α4mab处理的gr.2小鼠中观察到nr1细胞的积累。
图7f是点图，其显示与未免疫的对照小鼠和在免疫和攻击二者后用抗α4mab处理的gr.2小鼠相比，仅在用衣原体攻击后用抗α4mab处理的gr.3小鼠(含子宫驻留的记忆t细胞，但没有额外募集的循环记忆细胞的组)受到保护免于生殖器衣原体攻击。
图8a是示意图，其显示实施例6的异种共生(parabiosis)实验方案。
图8b-8c是点图，其显示a组小鼠的两个配偶体都受到保护免于后续的生殖器衣原体攻击(8b)，但是b组小鼠中仅经免疫的配偶体(cd45.2)而不是另一个配偶体(cd45.1)受到保护免于后续的生殖器衣原体攻击(8c)。
图8d-8e是条形图，其显示与未被保护的小鼠相比，在受到保护免受后续的生殖器衣原体攻击的小鼠中存在更多的nr-1细胞。
图8f-8g是点图，其显示用uv-ct免疫诱导不依赖于异种共生时机的免疫耐受。
图9a是线图，其显示经uv-lvs-csap免疫的小鼠完全被保护免受减毒的土拉热弗朗西丝氏菌lvs菌株的后续攻击。
图9b是线图，其显示经uv-lvs-csap免疫的小鼠部分被保护免受土拉热弗朗西丝氏菌的有完全毒力的schus4菌株的后续攻击。
图9c-9d是线图，其显示在用uv-lvs-csap通过腹膜内途径(9c)而不是通过皮下途径(9d)免疫后获得了针对减毒的土拉热弗朗西丝氏菌lvs菌株的后续攻击的完全保护。
图9e-9f是线图，其显示在经uv-lvs-csap免疫的小鼠中诱导的igg(9e)和igm(9f)抗体水平高于活的lvs感染的小鼠中的水平。
对于所有图，*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001。
发明详述
本公开至少部分地基于新的疫苗组合物的开发，该疫苗组合物包含附着于灭活的病原体的一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒。例如，新的疫苗组合物包含灭活的病原体和装载有一种或多种佐剂的一种或多种聚合物纳米颗粒，所述病原体例如，细菌，如沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)，土拉热弗朗西丝氏菌(francisellatularensis)，结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)，肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)，单核细胞增生利斯特菌(listeriamonocytogenes)，霍乱弧菌(vibriocholera)，宋氏志贺菌(shigellasonnei)，弗氏志贺菌(shigellaflexneri)，或鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，或病毒诸如流感病毒，人类呼吸道合胞体病毒(rsv)，人免疫缺陷病毒(hiv)，丙型肝炎病毒，所述佐剂如toll样受体激动剂，例如，咪唑并喹啉瑞喹莫德(imidazoquinolineresiquimod)(r-848)，单磷酰脂质a，或未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸，或内体膜靶向剂，例如endo-porter肽。使一种或多种装载了佐剂的纳米颗粒结合到每个灭活的病原体。这些疫苗组合物可用于预防和/或治疗由特定病原体引起的疾病，尤其是当施用于受试者的粘膜时。
本文公开的疫苗组合物包括一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其通过例如附着机制附着到每种灭活的全病原体。此附着机制可以是静电引力，共价偶联，或疏水相互作用。佐剂可以是树突细胞靶向分子，例如toll样受体激动剂，例如r-848(它被认为是tlr7/tlr8的有力的合成激动剂)，或者未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸(它是tlr-9的免疫刺激性激动剂)，或单磷酰脂质a(它是tlr-4的免疫刺激性激动剂)，或内体膜靶向剂，例如endo-porter肽。
当今可获得的绝大多数疫苗靶向全身免疫系统，并且在病原体已经越过了粘膜屏障并且进入了通常无菌的系统环境后阻止疾病进展。本文所公开的疫苗组合物可以靶向粘膜并且刺激经免疫的受试者中的粘膜免疫，从而保护受试者免于包括在疫苗中的灭活的病原体的活性形式的感染。这些疫苗组合物通过防止病原体的起始建群和复制或通过阻止进一步感染进展而实现了免疫保护。因此，这些疫苗组合物既是预防性的又是治疗性的。
灭活的病原体
本文使用的“病原体”是在其宿主中引起疾病的传染原。病原体可以是细菌，病毒，寄生物，真菌或其它微生物传染原。针对病原体的许多疫苗包含活的或减毒的微生物。然而，活的或减毒的微生物有时可引起感染病理学，尤其是当施用于免疫受损的接受者时。其他疫苗利用病原体裂解物的一种或多种纯化成分，如一种或多种表面碳水化合物或重组病原体衍生的蛋白质。然而，由于致病性抗原的部分呈递，在这种类型的疫苗中可见不完全的保护。不包括在疫苗中的那些致病性抗原仍可以在经免疫的个体中引起感染性病理学。
本文所公开的疫苗组合物包括一种或多种灭活的完全病原体，例如，灭活的细菌，灭活的病毒，灭活的寄生物，或灭活的真菌。本文中公开的疫苗组合物的接受者都被给予特定病原体的致病性抗原的全谱，从而获得针对该病原体的完全的免疫保护。
完全病原体可通过本领域已知的物理或化学处理(例如，通过暴露于uv光，升高的温度，固定，电离辐射，低聚甲醛，福尔马林，羟胺，酚，polysorbate等)失活。可以选择灭活方法的类型，以保持完全病原体的免疫原性。
细菌病原体引起细菌性疾病，如炭疽，细菌性脑膜炎，肉毒中毒(botulism)，布鲁杆菌病(brucellosis)，猫抓病，霍乱，白喉，流行性斑疹伤寒，淋病，脓疱病，麻风病(汉森(hansen)氏病)，利斯特菌病，风湿热；诺卡菌病，百日咳(pertussis；whoopingcough)，瘟疫(plague)，肺炎球菌性肺炎(pneumococcalpneumonia)，鹦鹉热，q热(qfever)，落矶山斑点热(rmsf)，沙门菌病，猩红热，志贺氏菌病(shigellosis)，梅毒，破伤风，沙眼，结核病，土拉菌病，伤寒，斑疹伤寒和尿路感染。
一种或多种灭活的全细菌可以用作本文公开的疫苗组合物中的病原体，并且可以来源于以下细菌属的任一种：放线菌属、鱼腥藻属、芽孢杆菌属(例如炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis))、类杆菌属、蛭弧菌属、博德特菌属、疏螺旋体属、布鲁杆菌属、弯曲杆菌属、柄杆菌属、衣原体属、绿菌属、着色菌属、梭菌属、棒杆菌属、纤维粘菌属、异常球菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝菌属(例如土拉热弗朗西丝氏菌)、嗜盐杆菌属、螺杆菌属、嗜血菌属(例如，流感嗜血杆菌b型(hemophilusinfluenzatypeb))、丝状细菌属、军团菌属、钩端螺旋体、利斯特菌属、脑膜炎球菌a、b和c、甲烷杆菌属、微球菌属、分枝杆菌属(例如结核分枝杆菌)、支原体属、粘球菌属、奈瑟球菌属、硝化杆菌属、颤藻属、原绿菌属、变形杆菌属、假单胞菌属(例如肺炎假单胞菌(pseudomonaspneumonia))、红螺菌属、立克次氏体、沙门菌属、志贺菌属、螺旋菌属、螺旋体属、葡萄球菌属、链球菌属(例如肺炎链球菌(streptococcuspneumonia))、链霉菌属、硫化叶菌属、热原体属、硫杆菌属、密螺旋体属、弧菌属(例如霍乱弧菌(vibriocholera))和耶尔森菌属。
病毒病原体引起病毒性疾病，如aids，aids相关综合症，水痘(chickenpox)，感冒-流感(flu)，登革热，口蹄疫，肝炎，单纯疱疹，hpy，拉沙热(lassafever)，麻疹，流行性腮腺炎(mumps)，脊髓灰质炎，狂犬病，sars，天花，病毒性脑炎，病毒性胃肠炎，病毒性脑膜炎，病毒性肺炎，西尼罗河病(westniledisease)和黄热病。
一种或多种灭活的病毒可以用作本文公开的疫苗组合物中的病原体，并且可以来源于以下病毒科的任一种：腺病毒科、沙粒病毒科、动脉病毒属、星状病毒科、杆状病毒科、杆状dna病毒属、杆状rna病毒科、双rna病毒科、雀麦花叶病毒科、布尼亚病毒科、嵌杯病毒科、毛状病毒组、石竹隐潜病毒组、花椰菜花叶病毒组、环状构象病毒科、线形病毒组、豇豆花叶病毒科、冠状病毒科(例如冠状病毒，如严重急性呼吸系统综合征(severeacuterespiratorysyndrome)(sars)病毒)、被脂病毒科、囊病毒科、δ病毒、石竹病毒、碗豆耳突花叶病毒组、黄病毒科、纤丝病毒科(例如马尔堡病毒和埃波拉病毒(例如zaire,reston,ivorycoast或sudan株))、黄病毒科(例如丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus),登革热病毒1(denguevirus1),登革热病毒2,登革热病毒3和登革热病毒4)、嗜肝病毒科、疱疹病毒科(例如人疱疹病毒(humanherpesvirus)i,3,4,s和6,以及巨细胞病毒(cytomegalovirus))、减毒病毒科、虹膜病毒科、轻病毒科、脂毛病毒科、微病毒科、正粘病毒科(例如流感病毒(influenzavirus)a和b和c)、乳头状瘤病毒科、乳多空病毒科、副粘液病毒科(例如麻疹，流行性腮腺炎和人类呼吸道合胞体病毒)、细小病毒科、细小rna病毒科(例如脊髓灰质炎病毒，鼻病毒，嗜肝病毒和鹅口疮病毒)、多瘤病毒科、痘病毒科(例如牛痘和天花病毒)、呼肠病毒科(例如轮状病毒属)、逆转录病毒科(例如慢病毒，如人免疫缺陷病毒hivi和hiv2)、弹状病毒科(例如，狂犬病病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞体病毒等)、披膜病毒科(例如，风疹病毒，登革热病毒等)和全病毒科。
还可以使用病毒样颗粒或包含抗原性病毒蛋白的假型化(psedotyped)病毒(例如，rsv,hiv或诺如病毒)制成基于病毒的疫苗。
寄生性病原体引起寄生性疾病，如非洲锥虫病(africantrypanosomiasis)，阿米巴病(amebiasis)，蛔虫病(ascariasis)，巴贝虫病(babesiosis)，chagas病(chagasdisease)，华支睾吸虫病(clonorchiasis)，隐孢子虫病(cryptosporidiosis)，囊虫病(cysticercosis)，裂头绦虫病(diphyllobothriasis)，龙线虫病(dracunculiasis)，棘球蚴病(echinococcosis)，蛲虫病(enterobiasis)，片形吸虫病(fascioliasis)，姜片虫病(fasciolopsiasis)，丝虫病(filariasis)，非寄生性阿米巴性感染(free-livingamebicinfection)，贾第虫病(giardiasis)，腭口线虫病(gnathostomiasis)，膜壳绦虫病(hymenolepiasis)，等孢球虫病(isosporiasis)，黑热病(kala-azar)，利什曼病(leishmaniasis)，疟疾，后殖吸虫病(metagonimiasis)，蝇蛆病(myiasis)，盘尾丝虫病(onchocerciasis)，虱病(pediculosis)，蛲虫感染(pinworminfection)，疥疮，血吸虫病(schistosomiasis)，绦虫病(taeniasis)，弓蛔虫病(toxocariasis)，弓形体病(toxoplasmosis)，旋毛虫病(trichinellosis)，旋毛虫病(trichinosis)，鞭虫病(trichuriasis)，滴虫病(trichomoniasis)和锥虫病(trypanosomiasis)。
一种或多种灭活的寄生物可以用作本文公开的疫苗组合物中的病原体，并且可以来源于例如人蛔虫(ascarislumbricoides)、果氏巴贝虫(babesiamicroti)、babesiaduncani、马来丝虫(brugiamalayi)、帝汶布鲁丝虫(brugiatimori)、华支睾吸虫(clonorchissinensis)、隐孢子虫属(cryptosporidium)、裂头属(diphyllobothrium)、麦地那龙线虫(dracunculusmedinensis)、胞生绦虫(echinococcusgranulosus)、溶组织内阿米巴(entamoebahistolytica)、蠕形住肠蛲虫(enterobiusvermicularis)、肝片形吸虫(fasciolahepatica)、大片吸虫(fasciolagigantica)、布氏姜片吸虫(fasciolopsisbuski)、gardialambli、颚口线虫属(gnathostoma)、膜壳绦虫属(hymenolepis)、贝氏等孢子球虫(isosporabelli)、利什曼原虫属(leishmania)、曼森线虫属(mansonella)、后殖吸虫属(metagonimus)、福氏耐格里原虫(naegleriafowleri)、旋盘尾丝虫(onchocercavolvulus)、plasmodiumjalciparum、疥螨(sarcoptesscabiei)、曼森血吸虫(schistosomamansoni)、猪肉绦虫(taeniasolium)、弓蛔虫属(toxocara)、鼠弓形虫(toxoplasmagondii)、旋毛线虫(trichinellaspiralis)、鞭形鞭虫(trichuristrichiura)、阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis)、布鲁斯锥虫(trypanosomabrucei)、克鲁斯锥虫(trypanosomacruzi)、鼠弓形虫(toxoplasmagondii)、阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis)或班氏吴策线虫(wuchereriabancrofti)。
致病性真菌在宿主中引起真菌性疾病，如曲霉病，芽生菌病，念珠菌病，球孢子菌病，隐球菌病，组织胞浆菌病和足癣。一种或多种灭活的真菌可以用作本文公开的疫苗组合物中的病原体，并且可以来源于例如真菌属，例如曲霉菌属(aspergillus)、芽生菌属(blastomyces)、念珠菌属(candida)、球孢菌属(coccidioides)、隐球菌属(cryptococcus)、组织胞浆菌属(histoplasma)、肺囊虫属(pneumocystis)、葡萄穗霉属(stachybotrys)、发癣菌属(trichophyton)。
聚合物纳米微粒
本文所公开的疫苗和佐剂组合物包括一种或多种加载有佐剂的纳米颗粒或纳米载体。形成纳米颗粒的聚合物可以是任意可生物降解的或不可生物降解的合成或天然聚合物。优选地，聚合物是可生物降解的聚合物。有用的可生物降解的聚合物的实例包括聚乳酸(pla)，聚(乙醇酸)(pga)，或聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)。这些聚合物具有已经确定的安全记录，并且可以在人受试者中使用(jiang,等人,adv.drugdeliv.rev.,57(3):391-410,2005；aguado和lambert,immunobiology,184(2-3):113-25,1992；bramwell,等人,adv.drugdeliv.rev.,57(9):1247-65,2005)。其它两亲性聚(氨基酸)纳米颗粒，两亲性多糖纳米颗粒或聚离子纳米颗粒可以用于本文所公开的疫苗组合物(参见akagi等人,advpolymsci.247:31-64,2012)。
前述聚合物可以单独，作为物理混合物，或通过形成共聚物使用。在某些实施方案中，纳米颗粒由聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物(即plga-peg二嵌段共聚物和pla的混合物)形成。这些共聚物可以用标准技术来合成。例如，共聚物plga-plh-peg可以使用嵌段末端植入策略(blockend-graftingstrategy)来合成。
线性结构plga-plh-peg可以为纳米颗粒提供与延长的循环和电荷介导的靶向相容的几个特征。首先，在酸性条件下，plh段带正电荷，在纳米颗粒表面产生总体正电势，从而促进与带负电荷的病原体的相互作用并产生强的多价静电介导的结合。其次，plga段可以形成一个坚实的核心基质，而在酸性ph值下不具有plh的失稳力(destabilizingforce)。第三，在聚合物自组装期间，由于plh段在通常的配制条件下固有的亲水性，以及它与peg(其由于其相对亲水性而将优先地上升到表面)的紧密结合，plh段上升到纳米颗粒表面附近。这是有意义的，因为它增加了纳米颗粒表面的阳离子电荷。第三，在聚合物的末端具有peg部分利于纳米颗粒在生理ph的胶体稳定性和循环时间(radovic-moreno,等人,acsnano6:4279-4287,2012；gref等人,science263:1600–1603,1994)。
在一些实施方案中，可以使用天然聚合物。天然聚合物的实例包括藻酸盐和其它多糖，胶原蛋白，白蛋白和其他亲水蛋白质，玉米醇溶蛋白和其他谷醇溶蛋白和疏水蛋白质，它们的共聚物和混合物。在一般情况下，这些材料通过酶促水解或在体内暴露于水，通过表面或骨架溶蚀(bulkerosion)降解。
其它合适的可生物降解的聚合物包括但不限于聚(羟酸)，如乳酸和乙醇酸的聚合物和共聚物、聚酐、聚(原)酯(poly(ortho)ester)、聚酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(己内酯)、聚(羟基链烷酸酯)(poly(hydroxyalkanoates))和聚(丙交酯-共-己内酯)。
聚合物可以是亲水性的或疏水性的生物粘附聚合物。亲水聚合物包括carbopoltm(noveon生产的高分子量，交联的，基于丙烯酸的聚合物)，聚卡波非(polycarbophil)，纤维素酯和葡聚糖。
可以从诸如sigmachemicalco.,st.louis,mo.；polysciences,warrenton,pa.；aldrich,milwaukee,wis.；fluka,ronkonkoma,n.y.；和biorad,richmond,calif.的来源获得这些聚合物，或可以使用标准技术通过从这些或其他供应商获得的单体合成。
极其多种聚合物和用于从所述聚合物形成聚合物基质的方法是常规已知的。在一般情况下，聚合物基质包含一种或多种聚合物。聚合物可以是天然或非天然(合成的)聚合物。聚合物可以是包含两个或更多个单体的共聚物或均聚物。在序列方面，共聚物可以是随机的，嵌段的，或包含随机的和嵌段的序列的组合。通常情况下，根据本发明的聚合物是有机聚合物。
适用于本发明的聚合物的实例包括，但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1,3-二
在一些实施方式中，根据本发明的聚合物包括由美国食品和药物管理局(fda)在21c.f.r.§177.2600下批准用于人类的聚合物，包括但不限于聚酯(例如，聚乳酸，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚己内酯(polycaprolactone)，聚戊内酯(polyvalerolactone)，聚(1,3-二
在一些实施方式中，聚合物可以是亲水性的。例如，聚合物可包含阴离子基团(例如，磷酸根，硫酸根，羧酸根(carboxylategroup))，阳离子基团(例如，季胺基)，或极性基团(例如，羟基，硫醇基团，胺基)。在一些实施方式中，聚合物可以是疏水性的。聚合物的亲水性或疏水性的选择可对合成纳米颗粒内掺入(例如，偶联)的材料的性质产生影响。
在一些实施方式中，聚合物可以用一个或多个部分和/或官能团修饰。根据本发明可以使用多种部分或官能团。在一些实施方式中，可以用聚乙二醇(peg)，碳水化合物和/或源自多糖的非环状聚缩醛修饰聚合物(papisov,2001,acssymposiumseries,786:301)。可以使用gref等人的美国专利号5,543,158或vonandrian等人的wo公开文本wo2009/051837的一般教导进行某些实施方式。
在一些实施方式中，聚合物可以用脂质或脂肪酸基团修饰。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是以下中的一个或多个：丁酸，己酸，辛酸，癸酸，月桂酸，豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生酸，山酸(behenicacid)或木蜡酸中。在一些实施方式中，脂肪酸基团可以是以下中的一个或多个：棕榈油酸，油酸，异油酸，亚油酸，α-亚油酸，γ-亚油酸，花生四烯酸，鳕烯酸，花生四烯酸，二十碳五烯酸，二十二碳六烯酸或芥酸。
在一些实施方式中，聚合物可以是聚酯，其包括共聚物和均聚物，所述共聚物包括乳酸和乙醇酸单元，如聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，本文统称为“plga”，所述均聚物含有乙醇酸单元，在本文中称为“pga”，和乳酸单元，如聚l-乳酸，聚d-乳酸，聚d，l-乳酸，聚l-丙交酯，聚-d-丙交酯和聚-d，l-丙交酯，本文统称为“pla”。在一些实施方式中，示例性的聚酯包括例如聚羟酸；peg共聚物，丙交酯和乙交酯的共聚物(例如pla-peg共聚物，pga-peg共聚物，plga-peg共聚物)及其衍生物。在一些实施方式中，聚酯包括，例如，聚(己内酯)，聚(己内酯)-peg共聚物，聚(l-丙交酯-共-l-赖氨酸)，聚(丝氨酸酯)，聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)，聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]及其衍生物。通过改变乳酸：乙醇酸的比例可以调节plga的降解率。在一些实施方式中，根据本发明使用的plga的特征在于，乳酸：乙醇酸的比例约为85:15，约75:25，约60:40，约50:50，约40:60，约25:75或约15:85。
在一些实施方式中，聚合物可以是一种或多种丙烯酸类聚合物。在某些实施方式中，丙烯酸类聚合物包括，例如，丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物，甲基丙烯酸甲酯共聚物，乙氧基乙基甲基丙烯酸酯，氰乙基甲基丙烯酸酯，氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物，聚(丙烯酸)，聚(甲基丙烯酸)，甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物(methacrylicacidalkylamidecopolymer)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸酐)，甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸酯，聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物，聚丙烯酰胺，氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物，甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物(glycidylmethacrylatecopolymer)，聚腈基丙烯酸酯(polycyanoacrylates)和包括前述聚合物中的一种或多种的组合。丙烯酸类聚合物可包含丙烯酸和甲基丙烯酸酯与低含量的季铵基团的完全聚合的共聚物。
在一些实施方式中，聚合物可为阳离子聚合物。在一般情况下，阳离子聚合物能够浓缩和/或保护带负电荷的核酸链(例如，dna或其衍生物)。含胺的聚合物，如聚(赖氨酸)(zauner等人,1998,adv.drugdel.rev.,30:97；和kabanov等人,1995,bioconjugatechem.,6:7)，聚(乙烯亚胺)(pei；boussif等人,1995,proc.natl.acad.sci.,usa,1995,92:7297)和聚(乙二胺)(poly(amidoamine))-树枝状聚合物(dendrimer)(kukowska-latallo等人,1996,proc.natl.acad.sci.,usa,93:4897；tang等人,1996,bioconjugatechem.,7:703；和haensler等人,1993,bioconjugatechem.,4:372)在生理ph下带正电荷，与核酸形成离子对，并介导对多种细胞系的转染。
在一些实施方式中，聚合物可以是含有阳离子侧链的可降解的聚酯(putnam等人,1999,macromolecules,32:3658；barrera等人,1993,j.am.chem.soc.,115:11010；kwon等人,1989,macromolecules,22:3250；lim等人,1999,j.am.chem.soc.,121:5633；和zhou等人,1990,macromolecules,23:3399)。这些聚酯的实例包括聚(l-丙交酯-共-l-赖氨酸)(barrera等人,1993,j.am.chem.soc.,115:11010)，聚(丝氨酸酯)(zhou等人,1990,macromolecules,23:3399)，聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)(putnam等人,1999,macromolecules,32:3658；和lim等人,1999,j.am.chem.soc.,121:5633)，和聚(4-羟基-l-脯氨酸酯)(putnam等人,1999,macromolecules,32:3658；和lim等人,1999,j.am.chem.soc.,121:5633)。
这些和其它聚合物的性质和用于制备它们的方法在本领域是已知的(参见,例如美国专利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；和4,946,929；wang等人,2001,j.am.chem.soc.,123:9480；lim等人,2001,j.am.chem.soc.,123:2460；langer,2000,acc.chem.res.,33:94；langer,1999,j.control.release,62:7；和uhrich等人,1999,chem.rev.,99:3181)。更一般地，多种用于合成某些合适的聚合物的方法记载于goethals编,pergamonpress,1980的conciseencyclopediaofpolymerscienceandpolymericaminesandammoniumsalts；odian,johnwiley&sons,fourthedition,2004的principlesofpolymerization；allcock等人,prentice-hall,1981的contemporarypolymerchemistry；deming等人,1997,nature,390:386；和美国专利6,506,577,6,632,922,6,686,446,和6,818,732。
在一些实施方式中，聚合物可以是线性或分支的聚合物。在一些实施方式中，聚合物可以是树枝状聚合物。在一些实施方式中，聚合物可以是基本上彼此交联的。在一些实施方式中，聚合物可以是基本没有交联的。在一些实施方式中，可以根据本发明在不进行交联步骤的情况下使用聚合物。还应该理解的是，本发明的合成的纳米颗粒可以包含嵌段共聚物，接枝共聚物，共混物(blend)，混合物和/或任何上述物质和其它聚合物的加合物。本领域技术人员将认识到，本文所列出的聚合物仅代表示例示性的，而不是全面的一批可以根据本发明使用的聚合物。
在一些实施方式中，合成的纳米颗粒可以任选包含一种或多种两亲性实体。在一些实施方式中，两亲性实体可以促进具有增加的稳定性，改进的均匀度或增加的粘度的合成纳米颗粒的产生。在一些实施方式中，两亲性实体可以与脂膜(例如，脂双层，脂单层等)的内表面相结合。本领域中已知的许多两亲性实体适用于制造根据本发明的合成纳米颗粒。这样的两亲性实体包括，但不限于，磷酸甘油酯；磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)；二油醇磷脂酰乙醇胺(dioleylphosphatidylethanolamine)(dope)；二油醇氧丙基三乙基胺(dioleyloxypropyltriethylammonium)(dotma)；二油醇磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)；胆固醇；胆固醇酯；二酰甘油、二酰基甘油琥珀酸(diacylglycerolsuccinate)；二磷脂酰甘油(dppg)；十六醇(hexanedecanol)；脂肪醇如聚乙二醇(peg)；聚氧乙烯-9-月桂基醚(polyoxyethylene-9-laurylether)；表面活性脂肪酸，例如棕榈酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸单甘油酯(fattyacidmonoglyceride)；脂肪酸甘油二酯(fattyaciddiglyceride)；脂肪酰胺；三油酸山梨坦(sorbitantrioleate)(
在一些实施方式中，合成的纳米颗粒可以任选地包含一种或多种碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生化的天然的碳水化合物。在某些实施方式中，碳水化合物包含单糖或二糖，包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸(galactoronicacid)、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺(galatosamine)和神经氨酸。在某些实施方式中，碳水化合物是多糖，包括但不限于：芽霉菌糖(pullulan)、纤维素、微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟基纤维素(hc)、甲基纤维素(mc)、葡聚糖、环状葡聚糖(cyclodextran)、糖原、羟乙基淀粉、鹿角菜胶(carageenan)、糖基(glycon)、直链淀粉(amylose)、脱乙酰壳多糖(chitosan)、n、o-羧基甲基脱乙酰壳多糖(n,o-carboxylmethylchitosan)、藻胶、藻酸、淀粉、壳多糖(chitin)、菊粉、konjac、葡甘露聚糖(glucommannan)、石耳素(pustulan)、肝素、透明质酸、凝胶多糖(curdlan)和黄原胶(xanthan)。在实施方式中，本发明的合成纳米颗粒不包含(或明确排除)碳水化合物，如多糖。在某些实施方式中，糖可以包含碳水化合物衍生物如糖醇，包括但不限于甘露醇，山梨醇，木糖醇，赤藓醇，麦芽糖醇和乳糖醇。
佐剂
本文公开的疫苗和佐剂组合物包括加载有佐剂的纳米颗粒。可以使一种或多种佐剂包囊或以其它方式包载于纳米颗粒中，或与纳米颗粒的表面相结合。
如本文使用的术语“佐剂”是指免疫佐剂。借此意指能够增强或促进免疫系统对病原体的应答，从而诱导受试者中的免疫应答或一系列的免疫应答的化合物或组合物。佐剂例如可以通过形成储库(延长疫苗的半衰期)促进疫苗组合物的效果，提供额外的t细胞帮助，和/或刺激细胞因子的产生。
树突细胞是体内最有力的抗原呈递细胞并负责通过结合到致病抗原启动所有病原体特异性免疫应答。树突细胞也通过趋化信号将遇到的病原体的性质传达给t细胞，并诱导适当的t细胞应答。因此，靶向树突细胞可以增强致病抗原的递送和呈递并控制疫苗接种诱导的免疫应答的性质。
响应于遇到的不同类型的病原体，树突细胞利用不同的表面受体与暴露的致病抗原结合。在迁移过程中，树突细胞经历成熟的过程，其中它们失去吞噬细胞的能力并发展了增加的与淋巴结中的t细胞通信的能力。这个成熟过程依赖于从病原体相关分子模式(pamp)分子通过模式识别受体，如toll样受体家族(tlr)成员的信号传导。pamp靶向树突细胞表面上的tlr并向内部传递信号，从而有可能增加树突细胞抗原摄取，成熟和t细胞刺激能力。因此tlr激动剂是有力的树突细胞活化剂，并且可以包括在本文所述的疫苗组合物中，例如cpg寡脱氧核苷酸(细菌)、双链rna(病毒)、脂多糖(细菌)、肽聚糖(细菌)、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannin)(细菌)、酵母聚糖(zymosans)(酵母)、支原体脂蛋白如malp-2(细菌)、鞭毛蛋白(细菌)、聚(肌苷酸-胞苷酸)(poly(inosinic-cytidylic))(细菌)、脂磷壁酸(细菌)或咪唑并喹啉(合成的)。
r848(瑞喹莫德)是咪唑并喹啉的鸟苷衍生物，是tlr7和tlr8的激动剂。r848是有效的佐剂，其激活树突细胞和b细胞以产生最适于t辅助1(th1)细胞免疫和抗体产生的细胞因子。因而，r848可以作为佐剂被包括在本文公开的疫苗组合物中，以增强体液和细胞介导的免疫反应两者。在下面的实施例中详细地描述了使用这种佐剂的方法。
tlr9特异性识别未甲基化的cpg基序，即微生物dna的标志，其可以通过合成的含有cpg基序的寡脱氧核苷酸来模拟。通过cpgdna或cpg寡脱氧核苷酸刺激tlr9触发细胞内信号传导，导致巨噬细胞、树突细胞和b细胞的活化，以及细胞因子，趋化因子和免疫球蛋白的产生。随后，树突细胞产生的细胞因子(如il-12)诱导未处理的t细胞分化成th1和细胞毒性t细胞(ctl)。有研究表明，cpg寡脱氧核苷酸作为疫苗佐剂可以增强针对多种病毒，细菌和寄生性疾病，例如，乙型肝炎的免疫保护(krieg等人,procamthoracsoc.4(3):289-94,2007；schmidt等人,nat.biotechnol.25(8):825-6,2007)。因而，未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸可作为佐剂包含在本文公开的疫苗组合物中以增强体液和细胞介导的免疫应答两者。
已知脂质a，即革兰氏阴性细菌细胞壁组分脂多糖(lps)的生物学活性部分具有强的免疫刺激性质且已经被评价为用于促进免疫应答的佐剂。tlr4被鉴定为脂质a的信号传导受体。单磷酰脂质a(mpla)包含明尼苏达沙门氏菌(salmonellaminnesota)lps的脂质a部分。lps和mpla诱导类似的细胞因子谱，但mpla毒性较低。将mpla与其他免疫刺激剂组合可以促进引发有效的免疫应答。
在具体的实施方案中，本发明组合物掺入toll样受体(tlr)-9的配体，如包含cpg的免疫刺激性dna分子，其诱导i型干扰素的分泌，并刺激t细胞和b细胞的活化，从而导致增加的抗体产生和细胞毒性t细胞应答(krieg等人,cpgmotifsinbacterialdnatriggerdirectbcellactivation.nature.1995.374:546-549；chu等人，cpgoligodeoxynucleotidesactasadjuvantsthatswitchonthelper1(th1)immunity.j.exp.med.1997.186:1623-1631；lipford等人，cpg-containingsyntheticoligonucleotidespromotebandcytotoxictcellresponsestoproteinantigen:anewclassofvaccineadjuvants.eur.j.immunol.1997.27:2340-2344；roman等人，“immunostimulatorydnasequencesfunctionasthelper-1-promotingadjuvants,”nat.med.1997.3:849-854；davis等人cpgdnaisapotentenhancerofspecificimmunityinmiceimmunizedwithrecombinanthepatitisbsurfaceantigen.j.immunol.1998.160:870-876；lipford等人,“bacterialdnaasimmunecellactivator,”trendsmicrobiol.1998.6:496-500；krieg等人的美国专利6,207,646；tuck等人的美国专利7,223,398；vannest等人的美国专利7,250,403；或krieg等人的美国专利7,566,703。
树突细胞靶向分子也可包括单克隆或多克隆抗体或其片段，其识别并结合树突细胞的表面上所展示的表位。例如，凝集素dec-205(一种树突细胞表面表位)已经在小鼠中通过抗dec205重组抗体靶向，并增强针对附着到该抗体重链的抗原的体液和细胞应答两者(hawiger,等人,j.exp.med.,194(6):769-79,2001；bonifaz,等人,j.exp.med.,196(12):1627-38,2002；bonifaz,等人,j.exp.med.,199(6):815-24,2004)。也已经以这种方式靶向多种其他的内吞受体，包括甘露糖特异性凝集素(甘露糖受体)和iggfc受体，具有抗原呈递效率的相似增强。可以靶向的其它合适的受体包括但不限于dc-sign、33d1、siglec-h、dcir、cd11c、热休克蛋白受体和清除剂受体。
用于将疫苗靶向至树突细胞的许多受体(诸如凝集素dec-205)具有递送抗原至晚期内体的性质，在那里形成了免疫原性肽并将其装载到mhcii类分子上(其是cd4t细胞和抗体应答需要的)(mellman,adv.exp.med.biol.560:63-7,2005；mellmanandsteinman,cell106(3):255-8,2001)。然而，有效的疫苗接种通常需要产生cd8细胞毒性t细胞应答，这仅在抗原存在于胞质中时发生。树突细胞通过交叉呈递实现此功能，其中外源性抗原逃脱内吞小泡并进入胞质，在那里它们被蛋白体(proteosome)切割成肽，输入到内质网中，并装载到新合成的mhci类分子上(其是刺激cd8t细胞所需要的)。交叉呈递的效率可以通过在抗原摄取期间内体-溶酶体膜的有限破坏而被人为增强。因此，内体膜破坏剂可以充当有效的佐剂，并且可以包括例如小分子药物，肽，多肽(包括弹性蛋白)和合成剂，其破坏胞内ph或小泡膜(vesicularmembrane)。在某些实施方案中，内体破坏剂是一种低ph值活化的两亲性成孔肽，例如，endo-porter肽(endo-porter；genetools,philomath,oreg.)(summerton,ann.n.y.acad.sci.,1058:1-14,2005)。因此，endo-porter肽可以作为佐剂包括在本文公开的疫苗组合物中，以增强致病抗原的交叉呈递。
多种佐剂描述于例如pctwo2012/068295中。此种佐剂可包括但不限于，模式识别受体(如rig-1和nod-样受体(nlr))的刺激剂，矿物盐，如明矾，明矾与肠杆菌(如大肠杆菌，明尼苏达沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，或弗氏志贺菌)的单磷酰脂质(mpl)a或特别地与
除了上文提到的toll样受体之外，佐剂可以包括模式识别受体(prr)的激动剂，所述模式识别受体(prr)包括但不限于toll样受体(tlr)，特别是tlr2，3，4，5，7，8，9和/或其组合。在其它实施方式中，佐剂包含toll样受体3激动剂，toll样受体7和8激动剂，或toll样受体9激动剂；腺嘌呤衍生物例如在美国专利6,329,381(sumitomopharmaceuticalcompany)中公开的那些；免疫刺激性dna；或免疫刺激性rna。在具体的实施方式中，本发明组合物中掺入的佐剂化合物是toll样受体(tlr)7和8激动剂(“tlr7/8激动剂”)。在tomai等人的美国专利6,696,076中公开的tlr7/8激动剂化合物有效用，包括但不限于，咪唑并喹啉胺，咪唑并吡啶胺，6,7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺(6,7-fusedcycloalkylimidazopyridineamine)和1,2-桥连咪唑并喹啉胺。
在具体的实施方式中，佐剂可以是表面分子cd40的激动剂。在某些实施方式中，为了刺激免疫而非耐受，本发明组合物掺入了促进dc成熟(对于未处理t细胞的引发需要)和促进产生促进抗体免疫应答的细胞因子(如i型干扰素)的佐剂。在实施方式中，佐剂还可以包括免疫刺激性rna分子，例如，但不限于，dsrna或聚i：c(tlr3刺激剂)，和/或在以下公开的那些佐剂：f.heil等人,“species-specificrecognitionofsingle-strandedrnaviatoll-likereceptor7and8”science303(5663),1526-1529(2004)；j.vollmer等人,“immunemodulationbychemicallymodifiedribonucleosidesandoligoribonucleotides”，wo2008033432a2；a.forsbach等人,“immunostimulatoryoligoribonucleotidescontainingspecificsequencemotif(s)andtargetingthetoll-likereceptor8pathway”wo2007062107a2；e.uhlmann等人,“modifiedoligoribonucleotideanalogswithenhancedimmunostimulatoryactivity”，美国专利申请公开号us2006/0241076；g.lipford等人,“immunostimulatoryviralrnaoligonucleotidesandusefortreatingcancerandinfections”，wo2005097993a2；g.lipford等人,“immunostimulatoryg,u-containingoligoribonucleotides,compositions,andscreeningmethods”，wo2003086280a2。在一些实施方式中，佐剂可为tlr-4激动剂，如细菌脂多糖(lps)，vsv-g和/或hmgb-1。在一些实施方式中，佐剂可以包含tlr-5激动剂，如鞭毛蛋白及其部分或生物，包括但不限于在美国专利6,130,082,6,585,980和7,192,725中公开的那些佐剂。
在一些实施方式中，佐剂可以是从坏死细胞释放的促炎性刺激物(例如，尿酸盐结晶)。在一些实施方式中，佐剂可以是补体级联的活化组分(例如，cd21，cd35等)。在一些实施方式中，佐剂可以是免疫复合物的活化组分。佐剂也可包括补体受体激动剂，例如结合cd21或cd35的分子。在一些实施方式中，补体受体激动剂诱导合成纳米颗粒的内源性补体调理。在一些实施方式中，佐剂是细胞因子，其是细胞释放的小的蛋白质或生物因子(在5kd–20kd的范围内)，并且对细胞-细胞间相互作用、通信和其它细胞的行为起着特定作用。在一些实施方式中，细胞因子受体激动剂是小分子，抗体，融合蛋白或适体。
在多种实施方式中，至少一部分剂量的佐剂可以被偶联至合成的纳米颗粒，例如，全部剂量的佐剂可以被偶联至合成的纳米颗粒。在其他实施方式中，至少一部分剂量的佐剂不被偶联至合成的纳米颗粒。在某些实施方式中，佐剂的剂量包含两种或更多种类型的佐剂。例如，但不限于，可以组合作用于不同的tlr受体的佐剂。作为一个实例，在一个实施方式中，可以将tlr7/8激动剂与tlr9激动剂组合。在另一实施方式中，可以将tlr7/8激动剂与tlr4激动剂组合。在另一实施方式中，可以将tlr9激动剂与tlr3激动剂组合。
在一些其他实施方案中，佐剂可以包括以下中的一种或多种：糖脂α-半乳糖神经酰胺、油乳剂(oilemulsion)(例如弗氏佐剂)、皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、细菌和微生物衍生物，包括但不限于碳水化合物，如脂多糖(lps)、免疫刺激性寡核苷酸、adp-核糖基化毒素和去毒衍生物、明矾、bcg、含矿物的组合物(例如，矿物盐，诸如铝盐和钙盐，氢氧化物，磷酸盐，硫酸盐等)、生物粘附剂和/或粘膜粘附剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂、聚磷腈、胞壁酰基肽、咪唑喹诺酮化合物、和表面活性物质(如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚)。
佐剂还可以包括免疫调节剂诸如细胞因子，白介素(例如，il-1，il-2，il-4，il-5，il-6，il-7，il-12等)，干扰素(例如，干扰素-γ)，巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子；以及共刺激分子，例如那些b7家族的那些共刺激分子。
用于装配加载有佐剂的纳米颗粒的方法
许多已知的方法可以用于形成加载有佐剂的纳米颗粒。例如，通过溶剂蒸发技术(如在mathiowitz,等人,j.scanningmicroscopy4:329,1990；beck等人,fertil.steril.31:545,1979；benita,等人,j.pharm.sci.,73:1721,1984；和美国专利号3,960,757中描述的)可形成加载有佐剂的纳米颗粒。一种或多种聚合物溶解在挥发性有机溶剂，如二氯甲烷中。可以将佐剂加入到溶液中，并将混合物悬浮在含有表面活性剂，如聚(乙烯醇)的水性溶液中。将所得乳液搅拌直到大部分有机溶剂蒸发，留下固体纳米颗粒。
在其它实例中，通过使用相转化可以形成加载有佐剂的纳米颗粒，其中聚合物溶解在溶剂中，佐剂的细颗粒混合或溶解于聚合物溶液中，将混合物倾入用于聚合物的一种强非溶剂中，从而在有利的条件下自发地产生聚合物微球，其中聚合物上涂布有颗粒或颗粒分散在聚合物中。
某些佐剂可非共价地(如通过吸附)偶联至纳米颗粒。例如，核酸吸附至纳米颗粒的表面可以通过盐形成来实现。当使用这种方法时，以这样的方式制备纳米颗粒，使得纳米颗粒包含将电荷引入到该纳米颗粒中的材料。通常使用的带电荷的表面活性剂(例如在纳米颗粒制备过程中用于吸附带负电荷的核酸的阳离子表面活性剂)足以为纳米粒子提供表面电荷。使带电荷的纳米粒子与核酸溶液接触导致核酸的吸附。这种方法描述于以下专利申请中：woo'hagen等人的公开的国际专利申请wo00/06123。
纳米颗粒可包囊一些佐剂。例如，核酸(如未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸)的包囊可以通过以下实现：使核酸溶解于水性缓冲液中，然后在单一或双重乳剂过程中使用这种溶液以通过自装配形成纳米颗粒。此过程描述于tse,etalinternationaljournalofpharmaceutics,370(1-2),33(2009)。此外，使用多种方法可将多种材料包囊到合成的纳米颗粒中，所述方法包括但不限于c.astete等人,“synthesisandcharacterizationofplgananoparticles”j.biomater.sci.polymeredn,vol.17,no.3,pp.247–289(2006)；k.avgoustakis“pegylatedpoly(lactide)andpoly(lactide-co-glycolide)nanoparticles:preparation,propertiesandpossibleapplicationsindrugdelivery”currentdrugdelivery1:321-333(2004)；c.reis等人,“nanoencapsulationi.methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles”nanomedicine2:8–21(2006)。
可以使用适合将材料(例如核酸)包囊到合成的纳米颗粒中的其他方法，其包括但不限于以下公开的方法：在2003年10月14日公告的unger的美国专利6,632,671；h.martimprey等人,“polymernanocarriersforthedeliveryofsmallfragmentsofnucleicacids:oligonucleotidesandsirna”europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics71:490-504(2009)；或p.malyala,等人,“enhancingthetherapeuticefficacyofcpgoligonucleotidesusingbiodegradablemicroparticles”advanceddrugdeliveryreviews61:218-225(2009)。
共价偶联可通过多种方法，例如，hermanson的bioconjugatetechniques,2ndedition,elsevier(2008)中描述的方法来完成。用于将核酸偶联至携带胺官能团的聚合物或纳米颗粒的一种方法是用1-(3-二甲基氨基)丙基-3-乙基碳二亚胺甲碘化物(1-(3-dimethylamino)propyl-3-ethylcarbodiimidemethiodide)(edc)和咪唑活化核酸的5’磷酸根，然后使活化的核酸与胺取代的聚合物或纳米颗粒反应(shabarova等人，febsletters,154288,(1983))。用于表面胺官能化纳米颗粒的方法的图示显示如下。
在某些实施方案中，可通过共价接头来进行共价偶联。例如，共价接头可以是或包含酰胺接头、二硫化物接头、硫醚接头、腙接头、酰肼接头、亚胺或肟接头、脲或硫脲接头、脒接头、胺接头和氨苯磺胺接头。
经由一个元件上的胺和第二元件如纳米颗粒的羧酸基团之间的酰胺键形成酰胺接头。在接头中的的酰胺键可使用适当保护的氨基酸或抗原或佐剂和活化的羧酸，例如n-羟基琥珀酰亚胺活化的酯之间进行的任何常规的酰胺键形成反应来制备。
二硫化物接头通过例如r1-s-s-r2形式的两个硫原子之间形成二硫键(s-s)来制备。二硫键可以通过用含有活化硫醇基团的元件对含有硫醇/巯基基团(-sh)，且在含有巯基/硫醇基团的元件上具有另一活化硫醇基团的抗原或佐剂进行硫醇交换形成(adisulfidebondcanbeformedbythiolexchangeofanantigenoradjuvantcontainingthiol/mercaptangroup(-sh)withanotheractivatedthiolgrouponanelementcontainingthiol/mercaptangroupswithanelementcontaininganactivatedthiolgroup)。
三唑接头，例如，形式
硫醚接头通过以例如r1-s-r2的形式形成硫-碳(硫醚)键来制备。硫醚可以通过用烷化基(诸如第二元件上的卤化物或环氧化物)对一种组分(诸如元件)上的硫醇/巯基(-sh)基团的烷基化来制备。硫醚接头还可以通过一个元件上的硫醇/巯基基团对第二元件(例如含马来酰亚胺基作为迈克尔受体的聚合物)上的缺电子烯烃基的迈克尔加成(michaeladdition)来形成。在另一种方式中，硫醚接头可以通过一个元件上的硫醇/巯基基团与第二元件(如聚合物或纳米颗粒)上的烯烃基的自由基硫醇-烯反应(radicalthiol-enereaction)来制备。
腙接头是通过一个元件上的酰肼基与第二元件上的醛/酮基反应制备。
酰肼接头是由一个元件上的肼基与第二元件上的羧酸基团反应形成的。一般使用与形成酰胺键相似的化学方法进行此种反应，其中用活化试剂活化羧酸。
亚胺或肟接头是通过一个元件上的胺基或n-烷氧基胺(或氨氧基)基与第二元件上的醛基或酮基反应形成的。
脲或硫脲接头是通过一个元件上的胺基与第二元件上的异氰酸酯或硫异氰酸酯(thioisocyanate)反应来制备的。
脒接头是通过一个元件上的胺基与第二元件上的亚氨酸酯基团反应来制备的。
胺接头是通过一个元件上的胺基与第二元件上的烷基化基团(例如卤化物，环氧化物，或磺酸酯基团)进行的烷基化反应来制备的。备选地，胺接头也可以通过在合适的还原剂，如氰基硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠(sodiumtriacetoxyborohydride)的存在下，用第二元件上的醛基或酮基还原性胺化一个元件上的胺基来制备。
氨苯磺胺接头是通过一个元件上的胺基与第二元件上的磺酰基卤化物(如磺酰氯)反应来制备的。
多种佐剂也可通过非共价偶联方法偶联。例如，通过静电吸附可将带负电荷的佐剂偶联至带正电荷的载体上。还可以将含有金属配体的佐剂通过金属-配体复合体偶联至含有金属复合体的载体上。
在某些实施方案中，在合成纳米颗粒装配之前，佐剂可以连接到聚合物，例如聚乳酸-嵌段-聚乙二醇上，或合成的纳米颗粒可以在其表面上形成反应性或可活化基团。在后一种情况下，佐剂可以制备为具有如下的基团，所述基团与由合成纳米颗粒表面呈现的附着化学相容。在其他实施方式中，使用合适的接头可以将肽佐剂附着到病毒样颗粒(vlp)或脂质体上。
在某些实施方案中，接头可以是如在hermanson2008中所述的同双功能或异双功能试剂。例如，在edc的存在下，可以用同双功能接头己二酸二酰肼(adipicdihydrazide)(adh)处理在表面上含有羧基的vlp或脂质体合成纳米颗粒，以与adh接头形成相应的合成纳米颗粒。然后将得到的连接adh的合成纳米颗粒通过nc上的adh接头的另一端与含有酸基团的肽抗原缀合，以产生相应的vlp或脂质体肽缀合物。
附着机制
一种或多种加载有佐剂的纳米颗粒可通过多种附着机制连接至每一灭活病原体上，所述附着机制包括但不限于，静电引力，直接或通过接头共价偶联或疏水相互作用。
在一些实施方案中，灭活的病原体通过静电引力附着到加载有佐剂的纳米颗粒上。大部分原生动物，细菌和病毒在生理ph下具有负的表面电荷(roberta.freitasjr.,nanomedicine,volumeiia:biocompatibility,landesbioscience,georgetown,tx,2003)。例如，革兰氏阴性菌具有由脂多糖组成的外膜，所述脂多糖对其表面赋予强负电荷。几乎所有的革兰氏阳性菌细胞壁均是由厚的肽聚糖层构成，所述肽聚糖层富含带负电荷的磷壁酸(knox,等人,bacteriol.rev.37(2):215,1973)。阳离子纳米颗粒可用于通过静电引力有效地靶向那些带负电荷的病原体(liu等人,naturenanotechnology4,457-463,2009)。
在一些实施方案中，由plga-plh-peg形成的纳米颗粒在其表面上具有足够强的阳离子电荷，从而它们可通过静电引力结合带负电荷的灭活病原体。
在一些实施方案中，灭活的病原体可通过缀合于纳米颗粒表面的接头附着至加载有佐剂的纳米颗粒上。接头可以是特异性结合灭活病原体的表面抗原的单克隆抗体，例如靶向大肠杆菌o157表面抗原的单克隆抗体(zhao等人,procnatlacadsciusa.101(42):15027-32,2004)。接头可以是特异性结合灭活病原体的表面靶标的适体，例如，以高亲和力和特异性结合有毒力的毒株结核分枝杆菌(h37rv)的适体nk2(chen等人,biochembiophysrescommun.8；357(3):743-8,2007)。接头可以是一种抗生素，例如，万古霉素，其特异性地结合灭活病原体的表面靶标(kell等人,acsnano2:1777-1788,2008)。接头可以是特异性结合灭活病原体的表面多糖的凝集素，例如，结合幽门螺杆菌(h.pylori)菌株的碳水化合物受体的荆豆凝集素i(ulexeuropaeusagglutinini)(ueai)或刀豆蛋白a(conconavalina)(cona)凝集素(umamaheshwari等人,jdrugtarget.11(7):415-23,2003)。接头也可以是抗微生物肽，例如，sushi1，其特异性地结合灭活病原体的表面靶标(leptihn等人,bmcbiol7:22,2009)。也可使用本文所述的其他接头。
在一些实施方案中，灭活的病原体通过一对结合配偶体附着至加载有佐剂的纳米颗粒上，所述一对结合配偶体彼此相互形成高特异性的非共价相互作用。本领域公知合适的结合对，例如，生物素和亲合素、生物素和链霉亲合素、生物素和中性亲合素(neutravidin)、谷胱甘肽-s-转移酶和谷胱甘肽、麦芽糖结合蛋白和淀粉酶、以及麦芽糖结合蛋白和麦芽糖。
使用疫苗组合物的方法
本文所公开的疫苗组合物用作预防性疫苗，其在受试者中针对随后在疫苗中包含的特定病原体的感染赋予免疫保护。例如，病原体可以是细菌，如沙眼衣原体，土拉热弗朗西丝氏菌，结核分枝杆菌，肺炎链球菌，单核细胞增生利斯特菌，霍乱弧菌，宋氏志贺菌，弗氏志贺菌，或鼠伤寒沙门氏菌，或病毒，诸如流感病毒，人免疫缺陷病毒(hiv)或丙型肝炎病毒。可以预防性地用本文公开的疫苗组合物治疗有风险形成来自传染性病原体的疾病的受试者。前往或生活在地方性传染病的区域的个体可被认为是处在风险中并且是针对特定传染性病原体进行预防疫苗接种的候选者。预防性治疗可以应用于任何数量的病原体相关疾病，其中在特定疾病和特定的风险因素，如地理位置或工作环境之间有已知关系。
疫苗组合物也可以用作治疗性疫苗，其可用于启始或增强受试者对感染病原体的免疫应答。可以用本文所公开的疫苗组合物治疗性处理感染传染性病原体的受试者。
这些疫苗组合物引发t细胞介导的粘膜免疫应答的能力使这些组合物在预防和治疗由通过粘膜进入受试者的细菌，病毒，寄生物，真菌，或其他微生物病原体引起的感染性疾病中尤其有用。
根据本领域中公知的理论，依照疾病的不同，预防性或治疗性免疫应答的期望结果可能不同。例如，针对病原体的免疫应答可以抑制或防止病原体的建群和复制，实现保护性免疫，并且使任何疾病症状的消失或减少。然而，如果针对病原体的疫苗减少了症状的数量，严重性或持续时间，或减少了群体中具有症状的个体的数目；或者即使仅仅减少了传染性病原体的传播，那么它可被认为是有效的。可以以单一剂量实现或以时间间隔重复治疗。适当的剂量取决于本领域技术人员所理解的各种参数如疫苗组合物本身，施用途径或待接种疫苗的受试者的状况(体重，年龄等)。
施用
通常，可以通过多种途径施用疫苗，包括但不限于：口服，吸入(鼻，支气管或肺)，静脉内，腹膜内，肌内，经皮，皮下，局部，舌下，阴道或直肠途径。
将本文公开的预防或治疗感染的疫苗组合物和方法通过粘膜施用于口腔/消化道，呼吸道，或泌尿生殖道是特别有效的。例如，疫苗组合物可以通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用。在一些实施方案中，疫苗组合物可以通过鼻内接种施用。鼻内接种疫苗的方法包括施用疫苗的微滴，喷雾，或干粉形式，例如，将喷雾或气雾疫苗组合物施用于待免疫的个体的鼻咽内。备选施用途径包括阴道内和直肠内施用，可以利用用于直肠或阴道施用的栓剂。可以通过阴道途径施用疫苗组合物，并且可使用用于阴道施用的药学可接受的赋形剂，包括乳化剂，聚合物如
将疫苗组合物直接靶向粘膜极大地促进了疫苗组合物诱导粘膜免疫的能力。在病原体跨越粘膜屏障前，粘膜免疫对于提供保护免于病原体的感染是重要的。此外，通过一个途径的粘膜疫苗接种(如鼻内疫苗接种)，不仅在该粘膜部位，而且在远端粘膜部位，如生殖粘膜可诱导粘膜免疫(mestecky,journalofclinicalimmunology,7:265-276,1987)。除了在诱导粘膜免疫应答中的优势，粘膜疫苗接种的另一个吸引人的优势在于它也诱导良好的全身免疫的能力。尤其是在需要加强剂(boost)以维持有力的免疫时，粘膜施用也绕过痛苦的注射和相关的对病人的负面影响。
疫苗组合物的施用可以通过任何可接受的方法来实现，所述方法允许有效量的疫苗到达它的靶标。适合于粘膜施用的穿透剂可包括在疫苗组合物中，例如，去垢剂，胆汁盐，或梭链孢酸(fusidicacid)衍生物。选择的的特定模式将取决于许多因素，如特定组合物，待治疗的受试者的状态的严重性，在受试者中诱导有效的免疫应答所需的剂量。如本文中通常使用的，“有效量”是足以在治疗的受试者中诱导免疫应答的量。疫苗的实际有效量根据以下而变化：特定病原体和所利用的佐剂，配制的特定疫苗组合物，施用模式，正在接种疫苗的个体的年龄，体重，状况，施用途径和疾病或病症。
实施例
在以下实施例中进一步描述了本发明，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例1.用灭活的沙眼衣原体免疫诱导调节性t细胞介导的免疫耐受
衣原体属的细菌引起眼部多血症，生殖和呼吸系统疾病，如结膜炎和致盲性沙眼，非淋菌性泌尿道炎，宫颈炎，盆腔炎，异位妊娠，输卵管因素不育症，和间质性肺炎(igietseme等人,expertreviewofvaccines10:1585-1596,2011)。沙眼衣原体(此后称“衣原体”或“ct”)是一种专性细胞内病原体，在其生命周期中在感染性原生小体(infectiouselementarybody)(eb)和代谢活性网状体(rb)之间交替。目前，针对沙眼衣原体感染，在人类中无可用的疫苗(igietseme等人,expertreviewofvaccines10:1585-1596,2011)。
首先检查了基于灭活的衣原体的疫苗的免疫保护作用。通过暴露于uv光30分钟灭活活的致病性衣原体原生小体。通过感染性mccoy细胞分离灭活的衣原体菌，以排除活的增殖衣原体。
用传染性或uv-灭活的衣原体子宫内免疫小鼠。使用非手术胚胎移植设备(nset，paratechs)按照所附说明书进行子宫内接种。在将单一小塑料“窥器(speculum)”插入阴道时将小鼠短暂约束。这允许放置一个特殊的微量移液管吸头(在规则的移液管上)，用于将10-20μl衣原体细菌精准递送穿过子宫颈。
免疫后4周，用106感染单位(ifu)的活衣原体子宫内攻击经免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠。六天后，从所有经攻击的小鼠收获子宫，并且从子宫制备rna样品。进行定量pcr(qpcr)以检测并测定相对于小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)的量的衣原体16srna的量。对于四个独立实验中的每一小鼠，计算了衣原体16srrna的标准化量并在图1a中呈现为衣原体载量。用传染性衣原体子宫内免疫导致降低的衣原体载量和针对随后活衣原体的子宫内攻击的免疫保护(图1a)。然而，用uv-灭活衣原体(uv-ct)的子宫内免疫导致对随后活衣原体攻击的增强的易感性，表明通过uv-灭活的衣原体已诱导了免疫耐受(图1a)。这表明单独的灭活的细菌不能诱导保护，而是诱导免疫耐受。
然后，共同施用不同类型的佐剂与uv-灭活的衣原体，以判断它们是否能够克服由灭活的衣原体诱导的耐受诱导。用传染性衣原体，uv-灭活的衣原体，或uv-灭活的衣原体与下列佐剂之一子宫内免疫小鼠：氢氧化铝(明矾)、咪喹莫特(imq)或cpg寡脱氧核苷酸c型(cpg)。免疫后4周，如上所述用活的衣原体子宫内或皮下攻击经免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠。在攻击后第6天，通过qpcr测量衣原体载量，图1b中显示了来自代表性实验的数据。用uv-灭活的衣原体的子宫内免疫再次导致免疫耐受，而佐剂的共施用未克服免疫耐受作用(图1b)。即使与明矾，imq或cpg共施用时，用uv-灭活的衣原体的皮下免疫未提供针对随后的生殖器衣原体攻击的保护或耐受(图1b)。
通过使用衣原体特异性tcr转基因小鼠研究了介导免疫耐受的特定t细胞类型。将野生型cd90.1+转基因cd4+t细胞(nr1细胞)转移到cd90.2+宿主小鼠中。一天后，用106ifu传染性或uv-灭活的衣原体子宫内接种受体小鼠。在感染后第4天，收获引流淋巴结并制备用于流式细胞术的细胞。分析了转移的cd90.1+cd4+t细胞的细胞内foxp3表达，其是调节性t(treg)细胞的标记。在uv-ct免疫后，观察到子宫和引流ln内表达foxp3的cd25高nr1细胞的显著增加(图1c-1d)。通过转化而不是增殖产生这些foxp3+细胞，因为通过facs分离的egfp-nr1细胞的转移产生了相似数目的treg细胞(图1c-1d)。这些数据表明，uv-ct免疫导致foxp3+treg的诱导，并且可以解释为什么这种疫苗方法是无效的，并诱导免疫耐受。
cd25是小鼠中已确定的cd4+foxp3+treg细胞的标记。为确定treg是否负责耐受，在衣原体攻击之前和之后三天在以前用uv-ct免疫接种的小鼠中通过抗cd25单克隆抗体处理消耗了treg细胞。如上所述检查了衣原体的载量。具体地，用106ifu的uv-灭活衣原体子宫内免疫小鼠。四周后，用106ifu的传染性衣原体攻击经免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠。攻击前三天和攻击后三天，用抗cd25单克隆抗体(pc61.5)或对照igg(500mg)处理经免疫的小鼠。在攻击后第6天，通过qpcr测量衣原体载量。相对于对照igg处理的小鼠，treg的消耗减少了生殖道中的衣原体水平(图1e)，表明cd4+foxp3+treg细胞在介导灭活的衣原体诱导的免疫耐受中起关键作用。
当被激活时，treg细胞分泌大量白介素-10(il-10)。因此，检查了il-10在灭活的衣原体诱导的免疫耐受中的作用。用传染性或uv-灭活的衣原体子宫内免疫野生型或il-10-/-小鼠。如上所述进行活衣原体的攻击和衣原体载量的测定。il-10缺陷消除了灭活的衣原体诱导的免疫耐受(图1f)，这证实treg分泌的il-10在灭活的衣原体诱导的免疫耐受中起着关键作用。
这些结果表明，uv-ct疫苗接种以il-10依赖的方式通过诱导衣原体特异性cd4+treg刺激耐受。
实施例2.沙眼衣原体疫苗组合物的产生和评价
制备并评价了疫苗组合物，其包括附着于加载有佐剂的聚合物纳米颗粒的uv-灭活的衣原体。将tlr7激动剂r848用作可包括在疫苗组合物中的合适的佐剂的实例。将r848共价连接pla，并装配成纳米颗粒，其在生理ph7.4下略带负电荷并且是表面聚乙二醇化的。将ph降低至ph6激活表面转换机制，导致纳米颗粒的正表面电荷及随后结合带负电荷的衣原体(图2a)。
聚合物合成
由genscript(piscataway,nj)定制合成了聚(l-组氨酸)(plh)，以包含n末端赖氨酸和c末端半胱氨酸以及之间的20个组氨酸残基(n到c末端序列：kh20c)。在水中将此kh20c肽(0.01mmol)与0.01mmol经原吡啶基(orthopyridyl)修饰的甲氧基聚(乙二醇)(mpeg-opss,购自laysanbio,arab,al)混合，以产生plh-peg二嵌段共聚物，使用slide-a-lyzer2,000mwco透析盒(thermoscientific)通过渗析纯化所述二嵌段共聚物，并将其冻干成干燥产物。
分开地，在2ml二氯甲烷中通过0.246mmol1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和0.295mmoln-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化5μmol特性粘度(inherentviscosity)为0.67的聚(乳酸-共-乙醇酸)-cooh(plga-cooh)(购自lactelabsorbables)。通过-20℃的甲醇沉淀plga-nhs，并在50℃下在真空干燥。然后通过在dmso中反应至少24小时使干燥的plga-nhs(104.9mg)偶联至24.8mgplh-peg二嵌段共聚物(如上所述合成的)上，以产生plga-plh-peg三嵌段共聚物。plga-peg二嵌段共聚物购自boehringeringelheimgmbh。
通过开环聚合合成r848-pla(聚乳酸)。在50℃下真空干燥r-848(100mg，3.18×10-4mole，来自invivogen)，d/l-丙交酯(5.6gm,3.89x10-2moles,来自sigmaaldrich)和无水硫酸钠(4.0gm)8小时，随后加入甲苯(100ml)。在设定在120℃的油浴中搅拌反应物，然后加入乙基己酸锡(tinethylhexanoate)(75mg，60μl)溶液。然后在氩气下持续加热16小时。通过加入水，随后加入额外的甲苯(200ml)终止反应。然后依次用含有5％盐酸(200ml)的10％氯化钠溶液，之后用饱和碳酸氢钠(200ml)洗涤甲苯溶液。该溶液通过硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发，得到3.59克聚乳酸r-848缀合物。该聚合物的一部分在碱中水解，并且通过hplc检测r-848含量。通过比较r-848浓度及hplc响应的标准曲线，确定聚合物含有每克聚合物5.6mgr-848。聚合物的分子量通过gpc测定为约27,000(参见美国专利申请公开号20110268805)。
加载有r848的聚合物纳米颗粒的制备
如先前所述(kamaly等人,chem.soc.rev.,41:2971-3010,2012)，通过将含聚合物的有机相乳化到水相中制备加载有r848的纳米颗粒。通过混合以下三种聚合物制备有机相：(1)聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物(40wt％)，(2)plga-peg二嵌段共聚物(20wt％)，和(3)聚(乳酸)-r848缀合物(pla-r848)(40wt％)。加入plga-peg共聚物，以改善该有机相的稳定性。活性成分与生物可降解聚合物形成缀合物改善了包囊并控制活性成分从基于plga-或pla的纳米颗粒的释放(kolishetti等人,proc.natl.acad.sci.usa.,107:17939-17944,2010)。
疫苗配制
在典型的制剂中，通过在400μl的15/85dmso/乙酸乙酯溶液中混合5.33mg含plh的聚合物、2.66mgplga-peg和5.33mgr848-pla缀合物制备设计为附着衣原体菌的纳米颗粒。以类似的方式，仅使用8.0mgplga-peg和5.33mgr848-pla配制未带正电荷的对照纳米颗粒。对于不包含r848-pla的纳米颗粒，使用等量的plga(0.67的特性粘度，lactelabsorbables)。使用探针尖端超声波仪(misonixsonicators-4000,farmingdale,ny)以连续模式在40％振幅下将含聚合物的有机溶液超声处理30秒到2ml的纯水中，然后在通风橱中在磁性搅拌下稀释于8ml的纯水中。允许溶剂蒸发至少2小时，此点时收集纳米颗粒并且通过使用amiconultra-4100000nmwl截留滤器(amiconultra-4100,000nmwlcutofffilter)重复超滤来纯化所述纳米颗粒。
将聚合物纳米颗粒(40wt％的plga-plh-peg，40wt％的pla-r848，20wt％的plga-peg)(0.67mg/剂量)与在ph6.0的稀释盐溶液中的每剂107ifu的uv-灭活的衣原体一起温育。在此ph，纳米颗粒产生正表面电荷(ζ电位20.7±1.0mv)，并且可以结合到带负电荷的uv-灭活的细菌的表面(ζ电位-12.9±0.6mv)上，形成所希望的衣原体的纳米颗粒缀合物(图2a)。作为对照配制剂，用与上述相同的步骤制备和处理含有：(1)plga-peg(60wt％)和(2)pla-r848缀合物(40wt％)的配制剂。
通过原子力显微术检查了加载有r848的纳米颗粒(也称为“电荷转换合成佐剂颗粒”(csaps))与灭活的衣原体的结合。图2b是冰冻tem(低温透射电子显微镜)图像，其显示在低ph条件下，例如ph6下，加载有r848的纳米颗粒结合到灭活的沙眼衣原体的表面。动态光散射通过揭示uv-ct-csap构建体相比于单独的uv-ct或csaps的大小差异证实加载有r848的纳米颗粒结合到灭活的衣原体菌上(图2c)。
用baclight染色试剂盒对uv灭活的衣原体(uv-ct)染色，然后在ph7.4和6.0与经alexafluor488-标记的csap或缺少plh基团(sap)的对照颗粒一起温育。使用流式细胞术检查uv-ct和csap或sap之间的结合。uv-ct仅在ph6，而不是在ph7.4结合csaps(图2d-2e)
疫苗组合物的评价
检查了疫苗组合物的免疫保护作用，所述疫苗组合物包括附着到加载有r848的纳米颗粒的uv-灭活的衣原体。用106ifu传染性衣原体或包括uv灭活的衣原体(uv-ct)，附着到加载有r848的纳米颗粒的uv-ct，或附着到空纳米颗粒的uv-ct子宫内免疫小鼠。免疫后四周，用106ifu活衣原体攻击经免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠。在攻击后第6天，通过qpcr测量衣原体载量。用包括附着加载有r848的纳米颗粒的uv-灭活的衣原体的疫苗组合物，而不是其他的组合物免疫可以保护小鼠免于后续的活衣原体攻击(图2f)。在某些条件下，在附着到uv-灭活的衣原体之前，用氢氧化钠(naoh)中和加载有r848的纳米颗粒。在一些其它条件下，在附着到uv-灭活的衣原体之前，以1:10或1：100倍稀释加载有r848的纳米颗粒。在附着到uv-灭活衣原体之前，以1:10滴定或中和加载有r848的纳米颗粒不会改变疫苗组合物的免疫保护性质(图2g)。
通过elisa测定了活衣原体，uv-灭活的衣原体，以及uv-ct-csap诱导血清中的抗衣原体igg。在图2h显示的数据为来自单个小鼠的血清的光密度(od)。uv-ct-csap能够在小鼠中以与活衣原体相似的水平诱导igg(图2h)。
实施例3.沙眼衣原体疫苗组合物诱导的保护性免疫是通过cd4+t细胞介导的
为了检查介导保护性免疫的效应细胞，用包括附着到uv-灭活的衣原体的加载有r848的纳米颗粒的新疫苗组合物免疫c57bl/6野生型，dhlmp2a-/-(抗体缺陷)，μmt(b细胞缺陷)，cd8-/-，ii-/-类mhc(缺少通过cd4-t细胞的抗原识别)和rag-2-/-小鼠(缺乏t和b淋巴细胞)，并且一个月后用传染性衣原体攻击生殖道。针对随后衣原体感染的保护性免疫保存于dhlmp2a-/-(抗体缺陷)，μmt(b细胞缺陷)和cd8-/-小鼠中，但在ii-/-类mhc(缺少通过cd4+t细胞的抗原识别)和rag-2-/-小鼠(缺乏t和b淋巴细胞)中丧失(图3a-3c)。这些发现表明，cd4+t细胞可能在介导通过新疫苗组合物刺激的保护性免疫中发挥重要的作用，所述新疫苗组合物包括附着到uv-灭活的衣原体的加载有r848的纳米颗粒。
为了证实cd4+t细胞介导由新疫苗组合物刺激的保护性免疫，用传染性衣原体(ct)，uv-灭活的衣原体(uv-ct)，或新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)免疫小鼠。四周后，从经免疫小鼠或对照小鼠中分离cd4+或cd8+t细胞，或t细胞消减的淋巴细胞，并将其转移至未免疫小鼠中。转移后1天，用106ifu活衣原体攻击受体小鼠，并且在攻击6天后，从这些小鼠收获子宫。如上文在实施例1所述测定衣原体载量。
在转移有获自用传染性衣原体或新的疫苗组合物免疫的小鼠的cd4+t细胞的受体小鼠，而不是在其他受体小鼠中观察了针对后续衣原体攻击的保护性免疫(图3d)。来自用单独灭活的衣原体免疫的小鼠的cd4+t的转移，赋予对随后衣原体攻击的增强的易感性，确认免疫耐受还取决于cd4+t细胞(图3d)。因此，图3d显示通过cd4+t细胞，而不是cd8+t细胞或其它淋巴细胞介导保护性免疫。
用衣原体特异性t细胞受体(tcr)转基因小鼠检查了新疫苗组合物的衣原体特异性cd4+t细胞诱导。免疫前一天，用荧光染料二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记野生型cd90.1+转基因cd4+t细胞(nr1细胞)，并将其转移到cd90.2宿主小鼠中。用106ifu传染性衣原体(ct)、uv灭活的衣原体(uv-ct)，或新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)子宫内攻击受体小鼠。在攻击后第4天，从受体小鼠收获引流淋巴结和子宫并通过流式细胞术分析。计数了在淋巴结和子宫中的衣原体特异的转基因cd4+t细胞的绝对数量。当与用uv-灭活的衣原体攻击的小鼠相比时，用传染性衣原体或新的疫苗组合物攻击的小鼠的子宫和引流ln中积累显著更多的nr1细胞(图4a)。
通过流式细胞术分析了来自淋巴结的衣原体特异性cd90.1+cd4+t细胞的增殖，以用于cfse稀释。在转移到未感染的小鼠中后，cd90.1+cd4+t细胞保持高水平的cfse，这显示在不存在感染的情况下，那些cd90.1+cd4+t细胞不增殖(图4b)。用uv-灭活的衣原体(uv-ct)感染的小鼠具有与对照小鼠相当水平的衣原体特异性cd4+t细胞，这指示在那些小鼠中也没有衣原体特异性cd4+t细胞的刺激(图4b)。另一方面，用传染性衣原体(ct)或新疫苗组合物(uv-ct-csaps)攻击的小鼠中cd90.1+cd4+t细胞的数目大大超过未感染的对照小鼠或者用uv-ct攻击的小鼠中的数目(图4b)。这些发现表明，新的疫苗组合物以与活衣原体类似的方式诱导衣原体特异性cd4+t细胞的增殖。
在免疫后第4天从淋巴结分离cd90.1+转基因cd4+t细胞，通过t细胞刺激剂佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol12-myristate13-acetate)(pma)和离子霉素(ionomycin)体外再刺激，并且在tnf-α,ifn-γ和il-2的产生上染色。与用uv-灭活的衣原体免疫的小鼠或对照小鼠相比时，在用新的疫苗组合物或传染性衣原体免疫的小鼠中产生全部三种细胞因子的cd90.1+cd4+t细胞的数目显著更多(图4c)，这显示新的疫苗组合物以与活衣原体类似的方式诱导活性衣原体特异性t细胞应答。
这些数据显示用uv-ct-csap接种疫苗导致nr1细胞增殖(图4b)和在子宫和引流ln中的积累(图4a)，其与来自用活衣原体感染的小鼠产生细胞因子tnf-α,ifn-γ和il-2不能区分(图4c)。因此，佐剂与灭活细菌的直接连接促进了多功能的抗原特异性细胞免疫应答，其保护粘膜免受随后的细菌感染。
实施例4.子宫的cd103-树突细胞诱导衣原体特异性t细胞
根据f4/80和cd103表达将cd45+mhc-ii+抗原呈递细胞分成三个亚组：f4/80+cd103-巨噬细胞，f4/80-cd103-树突细胞，和f4/80-cd103+树突状细胞，并分析cd11c，cd11b和cx3cr1的表达。f4/80+cd103-巨噬细胞显示高的cd11b和cx3cr1表达，但低的cd11c表达；f4/80-cd103-树突细胞显示高的cd11c,cd11b和cx3cr1表达；f4/80-cd103+树突细胞显示低的cd11b和cx3cr1，但高的cd11c表达(图5a)。
用传染性衣原体(ct)，uv-灭活的(uv-ct)衣原体，或新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)子宫内攻击小鼠。感染后18或24小时，从子宫或淋巴结中分离cd45+mhc-ii+细胞，并根据其cd103和f4/80的表达通过荧光激活细胞分选(facs)分选。通过qpcr测量每1000个分选的抗原呈递细胞中的衣原体载量。将子宫的分离的cd326+上皮细胞(ec)充当阳性对照。在子宫(5b)和淋巴结(5c)两者中，cd103-树突细胞比f4/80+巨噬细胞和cd103+树突细胞具有显著更高的衣原体载量，这表明cd103-树突细胞在识别和呈递衣原体中起重要的作用。
用cfse标记衣原体特异性cd4+转基因t细胞(nr1细胞)并且与从用传染性衣原体(ct)，uv-灭活的衣原体(uv-ct)，或新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)子宫内攻击的小鼠的子宫中分离的f4/80+巨噬细胞，cd103-树突细胞，或cd103+树突细胞共培养三天。通过cfse稀释测定衣原体特异性cd4+转基因t细胞的增殖。从用传染性衣原体免疫的小鼠的子宫分离的cd103-树突细胞，而不是其他抗原呈递细胞诱导衣原体特异性cd4+转基因t细胞的体外增殖(图5d)。然后在体内检测了cd103-树突细胞对衣原体特异性cd4+转基因t细胞的作用。用cfse标记野生型cd90.1+转基因cd4+t细胞，并将其转移到cd90.2宿主小鼠中。一天后，将从用传染性衣原体(ct)，uv-灭活的衣原体(uv-ct)，或新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)免疫的小鼠的子宫中分离的f4/80+巨噬细胞，cd103-树突细胞，或cd103+树突细胞注射到受体小鼠的右足垫中。在细胞注射后第3天对左和右腘淋巴结(popliteallymphnode)分析经cfse稀释的cd90.1+转基因cd4+t细胞。再次，从用活ct或uv-ct-csaps免疫的小鼠的子宫中分离的cd103-树突细胞，而不是其他抗原呈递细胞诱导衣原体特异性cd4+转基因t细胞在右腘淋巴结中的增殖(5e)。因此，子宫的cd103-树突细胞在体外和在体内诱导衣原体特异性t细胞的增殖。
这些数据显示如通过cfse稀释测量，从用活衣原体感染的或uv-ct-csap免疫的小鼠分选的cd103-树突细胞在体外和在体内刺激nr1细胞的增殖(图5d-5e)。在仅uv-ct免疫后，cd103+树突细胞通过增加foxp3+cd25+nr1细胞的数目能够促进显著的nr1增殖(图5f)。
这些结果一起表明，在衣原体感染或uv-ct-csap免疫后，来自生殖粘膜的cd103-树突细胞运输(traffic)衣原体抗原并直接活化衣原体特异性cd4+t细胞以促进保护性免疫。相反地，cd103-树突细胞群不能有效地摄取uv-ct，而且它在cd103+树突细胞中找到，从而导致tregu的诱导，这可能影响在生殖粘膜中的保护和耐受之间的平衡。
实施例5.沙眼衣原体疫苗组合物诱导的交叉粘膜保护免疫
评价了新的疫苗组合物诱导的保护性免疫的长度。在用全无、传染性或灭活的衣原体，或新的疫苗组合物(uv-ct-csaps)子宫内免疫后6个月，用活的衣原体子宫内攻击小鼠。如上文在实施例1中所述测定衣原体载量。用新的疫苗组合物或传染性衣原体，而不是灭活的衣原体进行的子宫内免疫在免疫后导致针对随后生殖器衣原体感染的保护达至少六个月(图6a)，指示存在长期免疫。
也测试了不同的疫苗施用途径。新的疫苗组合物通过另一个粘膜界面：鼻内粘膜，或者通过传统途径：皮下施用。对于鼻内攻击，将小鼠麻醉并将一滴疫苗组合物放置在其鼻孔直到被吸入。对于皮下接种，在尾部基部或体侧的皮肤下施用疫苗组合物。免疫后4周，用传染性衣原体子宫内攻击小鼠，并测定衣原体载量。用新疫苗组合物(uv-ct-csap)鼻内，而不是皮下免疫导致针对随后的生殖器衣原体感染的保护性免疫(图6b)。因此，通过新疫苗组合物诱导了交叉粘膜保护性免疫。
接着，将野生型cd90.1+转基因cd4+t细胞(nr1)转移到cd90.2宿主小鼠中，之后一天用uv-ct-csaps子宫内(i.u.)，鼻内(i.u.)或皮下(i.n.)免疫。在免疫后第7天，收获子宫并通过流式细胞仪分析。计数了衣原体特异性转基因cd4+t细胞的绝对数量。通过子宫内或鼻内，但不是皮下免疫，使衣原体特异性转基因cd4+t细胞迁移到生殖粘膜组织中(图6c)。
研究了鼻内免疫和皮下免疫后衣原体特异性t细胞应答之间的定量和/或定性的差异。子宫驻留记忆细胞可以在免疫后在肺部留下印记，然后流通到它们介导保护的生殖道。为了检验这一假设，对小鼠注射nr1细胞，然后用新的疫苗组合物uv-ct-csap通过不同的途径免疫小鼠。接种疫苗后7天和30天定量了若干器官中的nr1细胞的数量。在不同的免疫途径中，循环nr1细胞(例如，在血液，脾)的诱导以及在淋巴结和肝中的nr1细胞数目是相当的(图6d)
与此相反，子宫内免疫导致最高水平的nr1募集和保留在生殖粘膜中，而皮下疫苗接种并没有导致任何nr1保留(图6d)。有趣的是，甚至在鼻内免疫后30天，子宫中存在显著数目的nr1细胞(图6d)。对于鼻内和子宫疫苗接种，肺中的nr1细胞的数量与子宫中的nr1细胞的数目相反(图6d)。这些数据显示，通过子宫内或鼻内途径免疫足以诱导保护性nr1细胞在生殖粘膜中的募集和保留。
为了剖析粘膜驻留和循环记忆t细胞的功能，给小鼠静脉内注射nr1细胞，然后用uv-ct-csap鼻内接种疫苗。将这些经免疫的小鼠分成三组，并用抗alpha4整联蛋白(α4)单克隆抗体(mab)和/或对照igg处理，如下所述的。在免疫后9天(d9)用活的衣原体子宫内攻击所有三组小鼠。用对照igg从第3天至11天(d3-11)静脉内处理第一组小鼠(gr.1)。在d3-11期间用抗α4mab处理第二组小鼠(gr.2)，以完全阻断衣原体特异性t细胞的迁移。在d3-9期间用对照igg处理第三组小鼠(gr.3)，以允许组织驻留记忆t细胞流通到生殖器组织，然后在衣原体攻击后的d9-11期间用抗α4mab处理，以阻断t细胞的额外募集。阻断α4整联蛋白有效地防止t细胞在子宫内的积聚(7c)，但对脾中的nr1细胞的数目无影响(7b)。存在于脾中的系统性nr1细胞未受α4抗体注射的影响(图7d)。
图7e显示在用igg处理的gr.1小鼠中和仅在衣原体攻击后用抗α4mab处理的gr.3小鼠，而不是在疫苗接种和攻击两者后用抗α4mab处理的gr.2小鼠中观察到nr1细胞的积聚。图7f显示与未免疫的对照小鼠和在免疫和攻击两者后用抗α4mab处理的gr.2小鼠相比，仅在衣原体攻击后用抗α4mab处理的gr.3小鼠(含子宫驻留记忆t细胞，但没有额外招募的循环记忆细胞的组)显著地被保护免受生殖器衣原体的攻击。
实施例6.驻留粘膜记忆t细胞通过在远端粘膜表面免疫被诱导，并赋予针对随后细菌攻击的保护
为了测试驻留粘膜记忆t细胞和募集的循环记忆性t细胞在疫苗诱导的针对随后细菌攻击的保护中的作用，如图8a所示产生异种共生小鼠对，并免疫。在异种共生之前(b组)或之后(a组)，用uv-ct-csap或uv-ct鼻内免疫异种共生配偶体中的一个(cd45.2)，而另一个配偶体(cd45.1)未被免疫。异种共生后两周，淋巴细胞的嵌合大于45％(数据未显示)。在异种共生或免疫后两周(以较晚者为准)，用活的衣原体攻击两个配偶体。通过qpcr测定每一小鼠子宫中的衣原体细菌水平。a组小鼠的两种配偶体被保护免受后续生殖器衣原体的攻击(图8b)。
当用uv-ct-csap免疫之前两只小鼠共享血液循环时，通过免疫诱导的粘膜驻留记忆细胞能流通到两个配偶体的子宫，并对这两只小鼠赋予针对随后细菌攻击的保护。对于b组小鼠，仅经免疫的配偶体(cd45.2)而不是另一个配偶体(cd45.1)被保护免受后续生殖器衣原体的攻击(图8c)。与未被保护的小鼠相比，在被保护免受后续生殖器衣原体攻击的小鼠中nr-1细胞更高(图8d-8e)。重要地，用uv-ct的子宫内免疫诱导了免疫耐受，其不依赖于异种共生的时机(图8f-8g)。
这些数据表明，驻留的粘膜记忆性t细胞可以通过用本文所述的疫苗组合物免疫在远端粘膜表面诱导，并且可以赋予针对随后的细菌攻击的保护。与此相反，用未修饰的uv-ct免疫诱导循环tregs，其影响免疫耐受。这些数据共同表明使用本文所述的衣原体疫苗组合物可以实现交叉粘膜免疫。
实施例7.土拉热弗朗西丝氏菌疫苗组合物的产生和评价
土拉热弗朗西丝氏菌是一种革兰氏阴性菌，其是强毒性的，并导致土拉菌病。取决于细菌如何以及在何处进入机体，存在几种类型的土拉菌病。溃疡淋巴腺型土拉菌病是最常见的一种土拉菌病，其中在感染部位-通常是昆虫或动物咬伤形成皮肤溃疡。肺炎土拉菌病引起典型肺炎的体征和症状并可致死。由于其低感染剂量，便于通过气雾(aerosol)传播和高毒性，土拉热弗朗西丝氏菌与其他潜在的生物恐怖剂如鼠疫耶尔森菌，天花，埃博拉一起被美国政府分类为a类选择剂(classaselectagent)。有土拉热弗朗西丝氏菌的两个不同的实验室菌株：减毒株lvs和完全毒力株schus4。在超过50年前通过耗尽细菌的体外传代创造了lvs，并且已被用作活疫苗。严重的不良副作用，不完全免疫和未定义免疫原性使lvs不是一个理想的疫苗。
通过暴露于uv光30分钟灭活活的lvs细菌。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活的lvs细菌，以排除活跃增殖的细菌。如实施例2所述，制备加载有r848的纳米颗粒并将其附着至uv-灭活的土拉热弗朗西丝氏菌(uv-lvs)。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠，所述疫苗组合物包括附着至uv灭活的lvs的加载有r848的纳米颗粒(uv-lvs-csap)。用活lvs或对照颗粒(csap,uv-lvs,uv-lvs+sap)鼻内施用于对照小鼠。4周后，用致死剂量的活lvs鼻内攻击经免疫的小鼠和对照小鼠，并观察这些小鼠的存活达21天。图9a显示，经uv-lvs-csap免疫的小鼠完全被保护免受减毒的土拉热弗朗西丝氏菌lvs菌株的后续攻击。
研究了疫苗组合物赋予的针对完全毒性的土拉热弗朗西丝氏菌schus4菌株的后续攻击的保护。用uv-lvs-csap鼻内免疫小鼠或用活lvs，或对照颗粒(uv-lvs或uv-lvs+sap)处理小鼠。用相同的组合物以2周的间隔进行两次加强免疫或处理。4周后，用完全毒性的schus4菌株鼻内攻击经免疫的小鼠和对照小鼠，并观察这些小鼠的存活达30天。图9b显示经uv-lvs-csap免疫的小鼠部分被保护免受完全毒性的土拉热弗朗西丝氏菌schus4菌株的后续攻击。
研究了施用途径对保护性免疫的影响。用uv-lvs-csap,活lvs,或uv-lvs+sap皮下或腹膜内处理小鼠。4周后，用致死剂量的活lvs鼻内攻击经免疫的小鼠和对照小鼠，并观察这些小鼠的存活达21天。在用uv-lvs-csap通过腹膜内途径(图9c)而不是通过皮下途径(图9d)免疫后获得了针对lvs后续攻击的完全保护。
研究了在uv-lvs-csap免疫后四周的igg和igm抗体的诱导。在经uv-lvs-csap免疫的小鼠中诱导的igg(9e)和igm(9f)抗体水平高于活的lvs感染的小鼠中的水平。用对照颗粒(uv-lvs+sap或uv-lvs)的处理未诱导igg或igm抗体的增加(图9e-9f)
这些数据表明，用本文所述的土拉热弗朗西丝氏菌疫苗组合物免疫对后续的土拉热弗朗西丝氏菌的攻击具有保护性。
实施例8.链球菌肺炎的疫苗组合物的产生和评价
肺炎链球菌或肺炎球菌是一种革兰氏阳性，α-溶血，耐氧的厌氧菌。重要的人类致病菌肺炎球菌是肺炎的一个主要原因，并可以在近50％的肺炎病例中分离得到。尽管名称如此，除肺炎外，肺炎球菌还可引起许多类型的肺炎球菌感染，包括急性窦炎，中耳炎，脑膜炎，菌血症，败血症，骨髓炎，脓毒性关节炎，心内膜炎，腹膜炎，心包炎，蜂窝织炎和脑脓肿。
通过暴露于uv光30分钟灭活活肺炎球菌细菌。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活的肺炎球菌细菌，以排除活跃增殖的细菌。
如实施例2所述制备加载有r848的纳米颗粒并附着至uv-灭活的肺炎球菌上。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的肺炎球菌的加载有r848的纳米颗粒。一个月后，用活肺炎球菌攻击用肺炎球菌疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的肺炎球菌16srna的qpcr测量肺炎球菌载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的肺炎球菌载量低于对照小鼠时，确定肺炎球菌疫苗组合物是有效的。
实施例9.甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌疫苗组合物的产生和评价
甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(mrsa)是已通过自然选择过程而形成了对β-内酰胺抗生素，包括青霉素(甲氧西林，双氯西林，萘夫西林，苯唑西林等)和头孢菌素的抗性的金黄色葡萄球菌的任何菌株。不能抵抗这些抗生素的菌株被分类为甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌，或mssa。这种抗生素抗性的发展不会使细菌的毒性比没有抗生素抗性的金黄色葡萄球菌的菌株本质上更强，但抗性确实使mrsa感染更难以用标准类型的抗生素治疗，因而更加危险。
金黄色葡萄球菌最常见居住在鼻孔，其他呼吸道，开放性创伤，静脉内导管或泌尿道。健康个体可从几周到多年期间无症状地携带mrsa。具有受损的免疫系统的患者处在有症状的继发性感染的风险显著更大。mrsa在医院，监狱和养老院中是特别麻烦的，其中具开放性创伤，侵入性装置和减弱的免疫系统的患者比普通公众有更大的感染风险。
通过暴露于uv光30分钟灭活活mrsa。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活的mrsa，以排除活跃增殖的细菌。
如实施例2所述制备加载有r848的纳米颗粒并附着至uv-灭活的mrsa上。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的mrsa的加载有r848的纳米颗粒。一个月后，用活mrsa攻击用mrsa疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的mrsa16srna的qpcr测量mrsa载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的mrsa载量低于对照小鼠，确定mrsa疫苗组合物是有效的。
实施例10.甲型流感病毒疫苗组合物的产生和评价
甲型流感病毒是正粘病毒科病毒的一个属，并且能在鸟类和哺乳动物中引起流感。甲型流感病毒的一些分离株在家禽和人类中都引起严重的疾病。甲型流感病毒从野生水栖鸟类到家禽的传播可引起流感暴发并引起人类流感流行。
通过暴露于uv光30分钟灭活活a型流感病毒。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活的甲型流感病毒，以排除活跃增殖的病毒。
如实施例2所述制备加载有r848的纳米颗粒并附着至uv-灭活的甲型流感病毒上。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的甲型流感病毒的加载有r848的纳米颗粒。一个月后，用活甲型流感病毒攻击用甲型流感病毒疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的甲型流感病毒rna的qpcr测量甲型流感病毒载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的甲型流感病毒载量低于对照小鼠，确定甲型流感病毒疫苗组合物是有效的。
实施例11.人类呼吸道合胞体病毒(rsv)疫苗组合物的产生和评价
人类呼吸道合胞体病毒(rsv)是一种引起呼吸道感染的病毒。rsv是副粘病毒科的负义单链rna病毒，包括常见的呼吸道病毒，如引起麻疹和腮腺炎的那些病毒。rsv是副粘病毒亚科肺炎病毒亚科(pneumovirinae)的成员。它是婴儿期和儿童期下呼吸道感染和医院就诊的主要原因。在美国，60％的婴儿都在他们的第一个rsv季被感染，到2-3岁龄几乎所有的孩子都会感染此病毒。感染rsv的大约2-3％的患者发展成细支气管炎，这必需住院治疗。
通过暴露于uv光30分钟灭活活rsv。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活的rsv病毒，以排除活跃增殖的病毒。还可以使用包含抗原rsv蛋白的病毒样颗粒或假型病毒制备rsv疫苗。
如实施例2所述制备加载有r848的纳米颗粒并附着至uv-灭活的rsv上。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的rsv的加载有r848的纳米颗粒。一个月后，用活rsv攻击用rsv疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的rsv16srna的qpcr测量rsv载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的rsv载量低于未经免疫的对照小鼠，确定rsv疫苗组合物是有效的。
实施例12.sars冠状病毒疫苗组合物的产生和评价
严重急性呼吸器官综合征(sars)是由sars冠状病毒(sars-cov)引起的动物传染病来源的病毒性呼吸道疾病。根据世界卫生组织，在2002年11月至2003年7月，华南的sars爆发造成多个国家的775人死亡，死亡率约9.6％。初期症状类似流感，并且可以包括发热，肌痛，嗜睡症状，咳嗽，咽痛，和其他非特异性症状。
通过暴露于uv光30分钟灭活活sars-cov。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活sars-cov病毒，以排除活跃增殖的病毒。
使用如us2012/0213812中所述单一或双重乳化方法，通过将cpg寡脱氧核苷酸c型包囊到纳米颗粒中合成加载有cpg的纳米颗粒。如下实现包囊：通过在水性缓冲液中溶解cpg寡脱氧核苷酸c型，然后在单一或双重乳化方法中使用该溶液与实施例2中所述的电荷转换共聚物以通过自组装形成纳米颗粒。如实施例2所述，将加载有cpg的纳米颗粒附着于uv灭活的sars-cov。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的sars-cov的加载有cpg的纳米颗粒。
一个月后，用活sars-cov攻击用sars-cov疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的sars-cov16srna的qpcr测量sars-cov载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的sars-cov载量低于未经免疫的对照小鼠，确定sars-cov疫苗组合物是有效的。
实施例13.诺如病毒疫苗组合物的产生和评价
诺如病毒是杯状病毒科的遗传多样化单链rna，无包膜病毒的一个属。该病毒通过粪便污染的食物或水，人和人接触，并经由病毒的烟雾化和随后的表面污染传播。诺如病毒是人类中的病毒性胃肠炎的最常见的原因，并影响所有年龄的人。属中的已知病毒都被认为是称为诺如病毒的单一物种的变异株。这个物种造成约90％的全球性肠胃炎流行性非细菌性爆发，并且可能占美国的胃肠炎的所有食物传染性爆发的50％。诺如病毒感染的特征是恶心，强烈呕吐，水泻，腹痛，并在某些情况下，味觉丧失。可能发生一般性嗜睡(generallethargy)，乏力，肌肉酸痛(muscleaches)，头痛和低烧(low-gradefever)。
通过暴露于uv光30分钟灭活活诺如病毒。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活的诺如病毒，以排除活跃增殖的病毒。
如实施例12所述合成加载有cpg的纳米颗粒。如实施例2所述制备加载有cpg的纳米颗粒并附着至uv-灭活的诺如病毒上。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的诺如病毒的加载有cpg的纳米颗粒。
一个月后，用活诺如病毒攻击用诺如病毒疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的诺如病毒16srna的qpcr测量诺如病毒载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的诺如病毒载量低于未经免疫的对照小鼠，确定诺如病毒疫苗组合物是有效的。
实施例14.人免疫缺陷病毒(hiv)疫苗组合物的产生和评价
人免疫缺陷病毒(hiv)是引起获得性免疫缺陷综合症(aids)的慢病毒，所述aids是一种人类状况，其中免疫系统的进行性衰退允许威胁生命的机会性致病菌感染和癌生长。hiv感染通过血液，精液，阴道液，前射精(pre-ejaculation)或母乳的转移而发生。在这些体液中，hiv以两种形式存在：游离病毒颗粒和感染的免疫细胞内的病毒。hiv感染人免疫系统中的重要细胞，例如辅助性t细胞(具体地cd4+t细胞)，巨噬细胞，和树突细胞，并杀死那些细胞。
通过暴露于uv光30分钟灭活活hiv。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活hiv病毒，以排除活跃增殖的病毒。
使用单一或双重乳化方法，通过将单磷酰脂质a(mpla)包囊到纳米颗粒中合成加载有mpla的纳米颗粒。如实施例2所述将加载有mpla的纳米颗粒附着至uv-灭活的hiv上。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的hiv的加载有mpla的纳米颗粒。
一个月后，用活hiv攻击用hiv疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的hiv16srna的qpcr测量hiv载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的hiv载量低于未经免疫的对照小鼠，确定hiv疫苗组合物是有效的。
实施例15.结核病疫苗组合物的产生和评价
结核病(tb)是一种由分枝杆菌的多种菌株，通常是结核分枝杆菌引起的传染病。结核病通常攻击肺部，但也可影响身体的其他部位。当具有活跃的tb感染的人咳嗽，打喷嚏，或以其它方式将呼吸流体传播到空气时，它扩散到空气。大多数感染没有症状，被称为潜伏性结核病。大约十分之一的潜伏感染最终发展为活动性疾病，如果保持不治疗，则该活动性疾病杀死那些感染者的50％以上。活动性tb感染的典型症状是久咳，伴随着血迹痰，发热，盗汗，体重减轻等。其他器官的感染引起一大批的症状。治疗是困难的，需要在较长的一段时间里施用多种抗生素。抗生素抗性是多药物抗性结核病(mdr-tb)感染中的一个日益严重的问题。
通过暴露于uv光30分钟灭活结核分枝杆菌。通过感染人胚肾(hek)293细胞分离灭活结核分枝杆菌，以排除活跃增殖的细菌。
如实施例14所述合成加载有单磷酰脂质a(mpla)的纳米颗粒。如实施例2所述将加载有mpla的纳米颗粒附着至uv-灭活的结核分枝杆菌上。将疫苗组合物鼻内施用于小鼠并通过如实施例2所述的方法进行评价，所述疫苗组合物包括附着至uv-灭活的结核分枝杆菌的加载有mpla的纳米颗粒。
一个月后，用活结核分枝杆菌攻击用结核分枝杆菌疫苗组合物免疫的小鼠和未免疫的对照小鼠，并从小鼠组织制备rna样品。通过相对于小鼠gapdh标准化的结核分枝杆菌16srna的qpcr测量结核分枝杆菌载量。当用疫苗组合物免疫的小鼠中的结核分枝杆菌载量低于未经免疫的对照小鼠，确定结核分枝杆菌疫苗组合物是有效的。
其他实施方案
应理解虽然已经结合本发明的详细说明描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面，优点和修改均落入以下权利要求书的范围之内。
本发明还涉及如下内容：
1.一种在有此需要的受试者中刺激针对病原体的粘膜免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用组合物，其包含：
所述病原体的灭活形式，和
一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于所述灭活的病原体。
2.项1的方法，其中所述病原体是细菌，病毒，寄生物，或真菌。
3.项1或2中任一项的方法，其中所述组合物通过粘膜途径施用于所述受试者。
4.项3的方法，其中所述粘膜途径选自眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径。
5.项1至4中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
6.项1至4中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
7.项6的方法，其中所述toll样受体激动剂是r848。
8.项6的方法，其中所述toll样受体激动剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
9.项1至8中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含可生物降解的聚合物。
10.项9的方法，其中所述可生物降解的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物。
11.项1至10中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于所述灭活的病原体。
12.项1至10中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头附着于所述灭活的病原体。
13.项12的方法，其中所述接头选自下组：特异性结合所述灭活的病原体的表面分子的单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽。
14.一种在有此需要的受试者中刺激针对沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)的粘膜免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用组合物，其包含：
灭活的沙眼衣原体，和
一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于所述灭活的沙眼衣原体。
15.项14的方法，其中所述组合物通过粘膜途径施用于所述受试者。
16.项15的方法，其中所述粘膜途径选自：眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径。
17.项14至16中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
18.项14至16中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
19项18的方法，其中所述toll样受体激动剂是r848。
20.项18的方法，其中所述toll样受体激动剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
21.项14至20中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含可生物降解的聚合物。
22.项21的方法，其中所述可生物降解的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物。
23.项14至22中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于所述灭活的病原体。
24.项14至22中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头附着于所述灭活的病原体。
25.项24的方法，其中所述接头选自下组：特异性结合所述灭活的病原体的表面分子的单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽。
26.一种组合物，其包含
灭活的病原体，和
一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过附着机制各自附着于所述灭活的病原体。
27.项26的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的细菌，灭活的病毒，灭活的寄生物，或灭活的真菌。
28.项26的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的选自下组的细菌：沙眼衣原体，结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)，肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)，单核细胞增生利斯特菌(listeriamonocytogenes)，霍乱弧菌(vibriocholera)，宋氏志贺菌(shigellasonnei)，弗氏志贺菌(shigellaflexneri)和鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)。
29.项26至28中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
30.项26至28中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
31.项30的组合物，其中所述toll样受体激动剂是r848。
32.项30的组合物，其中所述toll样受体激动剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
33.项26至32中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含可生物降解的聚合物。
34.项33的组合物，其中所述可生物降解的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物。
35.项26至34中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于所述灭活的病原体。
36.项26至34中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头附着于所述灭活的病原体。
37.项36的组合物，其中所述接头选自下组：特异性结合所述灭活的病原体的表面分子的单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽。
38.项26至37中任一项的组合物，其中所述组合物处于适合于粘膜施用的形式。
39.项38的组合物，其中所述组合物处于适合于通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用的形式。
40.一种组合物，其包含
灭活的沙眼衣原体，和
一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于所述灭活的沙眼衣原体。
41.项40的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
42.项40的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
43.项42的组合物，其中所述toll样受体激动剂是r848。
44.项42的组合物，其中所述toll样受体激动剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
45.项40至44中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含可生物降解的聚合物。
46.项45的组合物，其中所述可生物降解的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物。
47.项40至46中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于所述灭活的病原体。
48.项40至46中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头附着于所述灭活的病原体。
49.项48的组合物，其中所述接头选自下组：特异性结合所述灭活的病原体的表面分子的单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽。
50.项40至49中任一项的组合物，其中所述组合物处于适合于粘膜施用的形式。
51.项50的组合物，其中所述组合物处于适合于通过眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径施用的形式。
52.项26的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的选自下组的细菌：放线菌属(actinomyces)、鱼腥藻属(anabaena)、芽孢杆菌属(bacillus)、类杆菌属(bacteroides)、蛭弧菌属(bdellovibrio)、博德特菌属(bordetella)、疏螺旋体属(borrelia)、布鲁杆菌属(brucella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、柄杆菌属(caulobacter)、衣原体属(chlamydia)、绿菌属(chlorobium)、着色菌属(chromatium)、梭菌属(clostridium)、棒杆菌属(corynebacterium)、纤维粘菌属(cytophaga)、异常球菌属(deinococcus)、肠球菌属(enterococcus)、埃希氏菌属(escherichia)、弗朗西丝菌属(francisella)、嗜盐杆菌属(halobacterium)、螺杆菌(heliobacter)、嗜血菌属(haemophilus)、丝状细菌属(hyphomicrobium)、军团菌属(legionella)、钩端螺旋体(leptspirosis,leptospira)、利斯特菌属(listeria)、脑膜炎球菌(meningococcus)a、b和c、甲烷杆菌属(methanobacterium)、微球菌属(micrococcus)、分枝杆菌属(mycobacterium)、支原体属(mycoplasma)、粘球菌属(myxococcus)、奈瑟球菌属(neisseria)、硝化杆菌属(nitrobacter)、颤藻属(oscillatoria)、原绿菌属(prochloron)、变形杆菌属(proteus)、假单胞菌属(pseudomonas)、红螺菌属(phodospirillum,rhodospirillum)、立克次氏体(rickettsia)、沙门菌属(salmonella)、志贺菌属(shigella)、螺旋菌属(spirillum)、螺旋体属(spirochaeta)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、链霉菌属(streptomyces)、硫化叶菌属(sulfolobus)、热原体属(thermoplasma)、硫杆菌属(thiobacillus)、密螺旋体属(treponema)、弧菌属(vibrio)和耶尔森菌属(yersinia)。
53.项52的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的沙眼衣原体。
54.项52的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的土拉热弗朗西丝氏菌(francisellatularensis)。
55.项52的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的结核分枝杆菌。
56.项26的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的选自下组的病毒：腺病毒科(adenoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、动脉病毒属(arterivirus)、星状病毒科(astroviridae)、杆状病毒科(baculoviridae)、杆状dna病毒属(badnavirus)、杆状rna病毒科(bamaviridae)、双rna病毒科(bimaviridae)、雀麦花叶病毒科(bromoviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、嵌杯病毒科(caliciviridae)、毛状病毒组(capillovirus)、石竹隐潜病毒组(carlavirus)、花椰菜花叶病毒组(caulimovirus)、环状构象病毒科(circoviridae)、线形病毒组(closterovirus)、豇豆花叶病毒科(comoviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、被脂病毒科(corticoviridae)、囊病毒科(cystoviridae)、δ病毒(deltavirus)、石竹病毒(dianthovirus)、碗豆耳突花叶病毒组(enamovirus)、黄病毒科(flaviviridae)、纤丝病毒科(filoviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、嗜肝病毒科(hepadnaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、减毒病毒科(hypoviridae)、虹膜病毒科(iridoviridae)、轻病毒科(leviviridae)、脂毛病毒科(lipothrixviridae)、微病毒科(microviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、乳头状瘤病毒科(papillomaviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、副粘液病毒科(paramyxoviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、细小rna病毒科(picornaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠病毒科(reoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、披膜病毒科(togaviridae)和全病毒科(totiviridae)。
57.项56的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的人类呼吸道合胞体病毒(humanrespiratorysyncytialviruse)。
58.项56的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的sars冠状病毒(sarscoronaviruses)。
59.项56的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的诺如病毒(noroviruses)。
60.项56的组合物，其中所述灭活的病原体是灭活的人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyviruses)。
61.项52至60中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
62.项52至60中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
63.项52至60中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含r848。
64.项52至60中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
65.项52至60中任一项的组合物，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含单磷酰脂质a。
66.项1的方法，其中所述病原体是选自下组的细菌：放线菌属、鱼腥藻属、芽孢杆菌属、类杆菌属、蛭弧菌属、博德特菌属、疏螺旋体属、布鲁杆菌属、弯曲杆菌属、柄杆菌属、衣原体属、绿菌属、着色菌属、梭菌属、棒杆菌属、纤维粘菌属、异常球菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝菌属、嗜盐杆菌属、螺杆菌属、嗜血菌属、丝状细菌属、军团菌属、钩端螺旋体、利斯特菌属、脑膜炎球菌a、b和c、甲烷杆菌属、微球菌属、分枝杆菌属、支原体属、粘球菌属、奈瑟球菌属、硝化杆菌属、颤藻属、原绿菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、红螺菌属、立克次氏体、沙门菌属、志贺菌属、螺旋菌属、螺旋体属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、硫化叶菌属、热原体属、硫杆菌属、密螺旋体属、弧菌属和耶尔森菌属。
67.项66的方法，其中所述病原体是沙眼衣原体。
68.项66的方法，其中所述病原体是土拉热弗朗西丝氏菌。
69.项66的方法，其中所述病原体是结核分枝杆菌。
70.项1的方法，其中所述病原体是选自下组的病毒：腺病毒科、沙粒病毒科、动脉病毒属、星状病毒科、杆状病毒科、杆状dna病毒属、杆状rna病毒科、双rna病毒科、雀麦花叶病毒科、布尼亚病毒科、嵌杯病毒科、毛状病毒组、石竹隐潜病毒组、花椰菜花叶病毒组、环状构象病毒科、线形病毒组、豇豆花叶病毒科、冠状病毒科、被脂病毒科、囊病毒科、δ病毒、石竹病毒、碗豆耳突花叶病毒组、黄病毒科、纤丝病毒科、黄病毒科、嗜肝病毒科、疱疹病毒科、减毒病毒科、虹膜病毒科、轻病毒科、脂毛病毒科、微病毒科、正粘病毒科、乳头状瘤病毒科、乳多空病毒科、副粘液病毒科、细小病毒科、细小rna病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科和全病毒科。
71.项70的方法，其中所述病原体是人类呼吸道合胞体病毒。
72.项70的方法，其中所述病原体是sars冠状病毒。
73.项70的方法，其中所述病原体是诺如病毒。
74.项70的方法，其中所述病原体是人免疫缺陷病毒。
75.项66至74中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
76.项66至74中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
77.项66至74中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含r848。
78.项66至74中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
79.项66至74中任一项的方法，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含单磷酰脂质a。
80.组合物在制备药物中的用途，所述药物用于执行在有此需要的受试者中刺激针对病原体的粘膜免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用所述组合物，其包含：
所述病原体的灭活形式，和
一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于所述灭活的病原体。
81.项80的用途，其中所述病原体是细菌，病毒，寄生物，或真菌。
82.项80或81的用途，其中所述组合物通过粘膜途径施用于所述受试者。
83.项82的用途，其中所述粘膜途径选自眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径。
84.项80至83中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
85.项80至83中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
86.项85的用途，其中所述toll样受体激动剂是r848。
87.项85的用途，其中所述toll样受体激动剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
88.项80至87中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含可生物降解的聚合物。
89.项88的用途，其中所述可生物降解的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物。
90.项80至89中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于所述灭活的病原体。
91.项80至89中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头附着于所述灭活的病原体。
92.项91的用途，其中所述接头选自下组：特异性结合所述灭活的病原体的表面分子的单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽。
93.组合物在制备药物中的用途，所述药物用于执行在有此需要的受试者中刺激针对沙眼衣原体的粘膜免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用所述组合物，其包含：
灭活的沙眼衣原体，和
一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒各自附着于所述灭活的沙眼衣原体。
94.项93的用途，其中所述组合物通过粘膜途径施用于所述受试者。
95.项94的用途，其中所述粘膜途径选自：眼，鼻内，口服，含服，舌下，扁桃体，肺，胃，肠，直肠，阴道或泌尿道途径。
96.项93至95中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
97.项93至95中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
98项97的用途，其中所述toll样受体激动剂是r848。
99.项97的用途，其中所述toll样受体激动剂是未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
100.项93至99中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含可生物降解的聚合物。
101.项100的用途，其中所述可生物降解的聚合物是聚(乳酸-共-乙醇酸)-嵌段-聚(l-组氨酸)-嵌段-聚(乙二醇)(plga-plh-peg)三嵌段共聚物。
102.项93至101中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过静电引力附着于所述灭活的病原体。
103.项93至101中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒通过接头附着于所述灭活的病原体。
104.项103的用途，其中所述接头选自下组：特异性结合所述灭活的病原体的表面分子的单克隆抗体，适体，抗生素，凝集素，或抗微生物肽。
105.项80的用途，其中所述病原体是选自下组的细菌：放线菌属、鱼腥藻属、芽孢杆菌属、类杆菌属、蛭弧菌属、博德特菌属、疏螺旋体属、布鲁杆菌属、弯曲杆菌属、柄杆菌属、衣原体属、绿菌属、着色菌属、梭菌属、棒杆菌属、纤维粘菌属、异常球菌属、肠球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝菌属、嗜盐杆菌属、螺杆菌属、嗜血菌属、丝状细菌属、军团菌属、钩端螺旋体、利斯特菌属、脑膜炎球菌a、b和c、甲烷杆菌属、微球菌属、分枝杆菌属、支原体属、粘球菌属、奈瑟球菌属、硝化杆菌属、颤藻属、原绿菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、红螺菌属、立克次氏体、沙门菌属、志贺菌属、螺旋菌属、螺旋体属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、硫化叶菌属、热原体属、硫杆菌属、密螺旋体属、弧菌属和耶尔森菌属。
106.项105的用途，其中所述病原体是沙眼衣原体。
107.项105的用途，其中所述病原体是土拉热弗朗西丝氏菌。
108.项105的用途，其中所述病原体是结核分枝杆菌。
109.项80的用途，其中所述病原体是选自下组的病毒：腺病毒科、沙粒病毒科、动脉病毒属、星状病毒科、杆状病毒科、杆状dna病毒属、杆状rna病毒科、双rna病毒科、雀麦花叶病毒科、布尼亚病毒科、嵌杯病毒科、毛状病毒组、石竹隐潜病毒组、花椰菜花叶病毒组、环状构象病毒科、线形病毒组、豇豆花叶病毒科、冠状病毒科、被脂病毒科、囊病毒科、δ病毒、石竹病毒、碗豆耳突花叶病毒组、黄病毒科、纤丝病毒科、黄病毒科、嗜肝病毒科、疱疹病毒科、减毒病毒科、虹膜病毒科、轻病毒科、脂毛病毒科、微病毒科、正粘病毒科、乳头状瘤病毒科、乳多空病毒科、副粘液病毒科、细小病毒科、细小rna病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、呼肠病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科和全病毒科。
110.项109的用途，其中所述病原体是人类呼吸道合胞体病毒。
111.项109的用途，其中所述病原体是sars冠状病毒。
112.项109的用途，其中所述病原体是诺如病毒。
113.项109的用途，其中所述病原体是人免疫缺陷病毒。
114.项105至113中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含靶向内体膜的佐剂。
115.项105至113中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含toll样受体激动剂。
116.项105至113中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含r848。
117.项105至113中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含未甲基化的cpg寡脱氧核苷酸。
118.项105至113中任一项的用途，其中所述一种或多种加载有佐剂的聚合物纳米颗粒包含单磷酰脂质a。
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