一种血液中长循环两性离子纳米药物载体及制备方法与流程

本发明涉及一种血液中长循环两性离子纳米药物载体及制备方法，以解决治疗蛋白药物在体内血液循环过程中，半衰期短而治疗效果差的问题，属于高分子材料学、生物学技术领域。

背景技术：

纳米载体已经被开发出来用于递送各种药物，利用其纳米尺寸表现出良好的血液循环和肿瘤靶向能力，不仅将治疗蛋白药物输送给肿瘤，减少体内正常组织和其他部位的毒性，还能避免药物降解，增加药物的半衰期、有效负载和溶解性，减少肾清除率(danhierf,ferono,préatv.toexploitthetumormicroenvironment:passiveandactivetumortargetingofnanocarriersforanti-cancerdrugdelivery[j].journalofcontrolledrelease,2010,148(2):135-146.)。然而，由于人体单核吞噬细胞系统(mps)和网状内皮系统(res)在血液输送过程中的作用，纳米药物载体引起的免疫反应大大限制了其在体内的应用与发展，使得载体很快便被清除体内，无法有效渗透到肿瘤深部，使药物的疗效受到限制。

两性离子既有阳离子基团，也有阴离子基团，但仍保持电荷中性，从而在载体表面通过静电相互作用，形成强缔合水化层，抑制非特异性蛋白质吸附和异物反应(lil,songy,hej,etal.zwitterionicshieldedpolymericprodrugwithfolate-targetingandphresponsivenessfordrugdelivery[j].journalofmaterialschemistryb,2019,7(5):786-795.)。近些年来，常用于生物领域的两性离子主要包括2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)、甲基丙稀酰乙基磺基甜菜碱(sbma)和3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯(cbma)等。cao等通过原子转移自由基聚合(atrp)在脂质体表面接枝两性离子聚3-[[2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基铵]丙酸酯(pcbma)，合成了一种超亲水两性离子聚合物稳定脂质体，在体内表现出良好的亲水性药物保留和长期血液循环特性，体内血液循环半衰期最长达8h，但atrp合成过程中使用的引发剂为cu(i)br，毒性较大，不易去除干净，对生物体有较大危害。(caoz,zhangl,jiangs.superhydrophiliczwitterionicpolymersstabilizeliposomes[j].langmuir,2012,28(31):11625-11632.)liu等将tpgs装饰到基于磷酸胆碱的隐形纳米微囊上，并通过酸响应性苯甲酸-亚胺键缀合抗癌药物dox，虽然表现出更长的体内半衰期(27.6h)，但酸响应键型释放导致药物的释放效率较低，治疗效果不理想。(ganl,tsaihi,zengx,etal.phosphorylcholine-basedstealthynanocapsulesdecoratingtpgsforcombattingmultidrugresistantcancer[j].acsbiomaterialsscience&engineering,2018:acsbiomaterials.8b00152.)尽管现在合成的纳米药物载体种类越来越多，但大都存在合成工艺繁琐，合成原料复杂的问题，且纳米药物载体的血液循环半衰期几乎都小于30h。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，解决目前药物载体中合成过程复杂，载体循环时间短、药物释放效率低且在肿瘤组织中积聚少的问题，提出一种长循环两性离子纳米药物载体及制备方法。

本发明的技术目的通过以下技术方案予以实现：

一种血液中长循环两性离子纳米药物载体，以蛋白药物为核，由两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)通过原位聚合成壳层，从而形成血液中长循环的包载蛋白药物的核壳结构纳米药物载体，其表面圆滑，粒径均一，粒径为8-20nm。

所述两性离子纳米药物载体在小鼠体内血液循环时间的研究中，在小鼠体内血液循环半衰期长达38.7h，显现出明显优于其他药物载体的血液循环性能，说明两性离子壳层能够延长治疗蛋白药物的血液循环能力，实现了治疗药物在肿瘤微环境的有效释放，提高了药物在肿瘤组织中的积聚，即本发明的纳米药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种血液中长循环两性离子纳米药物载体的制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1，将蛋白药物、两性离子单体、含碳碳双键正电性单体、含碳碳双键中性单体和交联剂在持续搅拌作用下在水中均匀分散，通过静电相互作用以在蛋白药物外层包裹两性离子单体、含碳碳双键正电性单体、含碳碳双键中性单体和交联剂；两性离子单体为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)，含碳碳双键正电性单体为n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐，含碳碳双键中性单体为丙烯酰胺，交联剂为可降解的多肽交联剂、含二硫键交联剂；两性离子单体与蛋白药物的摩尔比为1：(0.0001-0.01)；两性离子单体与含碳碳双键正电性单体、含碳碳双键中性单体的摩尔比为1：(0.01-10)：(0.0001-0.01)；两性离子单体与交联剂的摩尔比为1：(0.0001-0.01)；

在步骤1中，蛋白药物为牛血清白蛋白，尼妥珠单克隆抗体，西妥昔单克隆抗体。

在步骤1中，交联剂为n,n’-亚甲双丙烯酰胺、基质金属蛋白酶-2。

在步骤1中，两性离子单体与蛋白药物的摩尔比为1：(0.001-0.006)。

在步骤1中，两性离子单体与含碳碳双键正电性单体、含碳碳双键中性单体的摩尔比为1：(0.1-5)：(0.002-0.005)。

在步骤1中，两性离子单体与交联剂的摩尔比为1：(0.003-0.008)。

在步骤1中，选择将各个组分预先配置成相应浓度的溶液，再进行共混；持续搅拌的速度为每分钟100—300转，时间为10—40min。

步骤2，在步骤1得到的反应体系中加入催化剂和引发剂，通过原位聚合法形成核壳结构的两性离子纳米药物载体；催化剂为n,n,n’,n’-四甲基乙二胺，引发剂为过硫酸铵，两性离子单体与催化剂、引发剂的摩尔比为1：(0.01-10)：(0.1-100)

在步骤2中，反应温度为4—5摄氏度，反应时间为1—24小时，优选6—12小时。

在步骤2中，两性离子单体与催化剂、引发剂的摩尔比为1：(0.1-5)：(0.1-1)。

本发明的制得的两性离子纳米药物载体在原位聚合过程中可添加不同的单体以实现多功能化，可显著延长小鼠体内血液循环时间，延缓药物载体在体内的清除速率，改善肿瘤组织中的载体积聚，并且该壳层可响应肿瘤特异性环境，在肿瘤微环境裂解实现治疗蛋白药物的靶向投递，提高蛋白药物的治疗效果。本发明所利用的原位自由基聚合法通过分子间作用力或氢键形成核壳结构产物，具有反应条件温和、无需加热或加压、可聚合单体范围广、后处理简单、易提纯产物等优点。本发明壳层材料2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)，属于代表性磷酯类化合物，其典型的磷酰胆碱基团，置于水中可形成类磷脂双分子层，具有良好的血液相容性。本发明利用原位自由基聚合方法，使用两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)作为壳层材料包载纳米药物，制得血液中长循环两性离子纳米药物载体，合成方法简便易得，合成过程无毒无害，实现了治疗药物在肿瘤微环境的有效释放，并且在小鼠体内血液循环半衰期长达38.7h，说明两性离子壳层能够延长治疗蛋白药物的血液循环能力，提高药物在肿瘤组织中的积聚。

附图说明

图1是两性离子纳米药物载体的粒径分布图。

图2是两性离子纳米药物载体的zeta电位分布图。

图3是两性离子纳米药物载体的凝胶电泳图。

图4是两性离子纳米药物载体的透射电镜照片。

图5是两性离子纳米药物载体的核磁共振谱线图。

图6是两性离子纳米药物载体的体内血液循环时间关系图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本说明做进一步说明，而不是限制本发明的范围。选择搅拌速度为每分钟300转，持续30min。

实施例1

取1ml浓度为400mg/ml的两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)单体溶液，按照两性离子单体与牛血清白蛋白溶液的摩尔比为1：0.003，加入牛血清白蛋白溶液。按照两性离子单体与含碳碳双键单体n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和丙烯酰胺的摩尔比为1：0.02：0.002，按照两性离子单体与交联剂n,n’-亚甲双丙烯酰胺的摩尔比为1:0.01，在持续搅拌作用下均匀分散，通过静电相互作用，在治疗蛋白药物外层包裹两性离子、含碳碳双键单体和交联剂。按照两性离子单体与催化剂、引发剂的摩尔比为1：0.4：0.2的比例，依次加入催化剂和引发剂，通过原位聚合的方法，在4℃下反应24h，制得两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体，可选择离心、过滤或者旋蒸进行提纯，均匀分散在去离子水中，后续测试时再进行使用。将得到的两性离子纳米药物载体注射到小鼠体内，在不同时间点抽取小鼠血清，测定药物载体在小鼠体内的血液循环时间。

实施例2

取1ml浓度为400mg/ml的两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)单体溶液，按照两性离子单体与牛血清白蛋白溶液的摩尔比为1：0.001，加入牛血清白蛋白溶液。按照两性离子单体与含碳碳双键单体n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和丙烯酰胺的摩尔比为1：0.02：0.002，按照两性离子单体与交联剂n,n’-亚甲双丙烯酰胺的摩尔比为1:0.01，在持续搅拌作用下均匀分散，通过静电相互作用，在治疗蛋白药物外层包裹两性离子、含碳碳双键单体和交联剂。按照两性离子单体与催化剂、引发剂的摩尔比为1：0.4：0.2的比例，依次加入催化剂和引发剂，通过原位聚合的方法，在4℃下反应20h，制得两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体。将得到的两性离子纳米药物载体注射到小鼠体内，在不同时间点抽取小鼠血清，测定药物载体在小鼠体内的血液循环时间。

实施例3

取1ml浓度为400mg/ml的两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)单体溶液，按照两性离子单体与尼妥珠单抗溶液的摩尔比为1：0.003，加入尼妥珠单抗溶液。按照两性离子单体与含碳碳双键单体n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和丙烯酰胺的摩尔比为1：0.02：0.002，按照两性离子单体与交联剂n,n’-亚甲双丙烯酰胺的摩尔比为1:0.01，在持续搅拌作用下均匀分散，通过静电相互作用，在治疗蛋白药物外层包裹两性离子、含碳碳双键单体和交联剂。按照两性离子单体与催化剂、引发剂的摩尔比为1：0.4：0.2的比例，依次加入催化剂和引发剂，通过原位聚合的方法，在4℃下反应20h，制得两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体。将得到的两性离子纳米药物载体注射到小鼠体内，在不同时间点抽取小鼠血清，测定药物载体在小鼠体内的血液循环时间。

实施例4

取1ml浓度为400mg/ml的两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)单体溶液，按照两性离子单体与尼妥珠单抗溶液的摩尔比为1：0.001，加入尼妥珠单抗溶液。按照两性离子单体与含碳碳双键单体n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和丙烯酰胺的摩尔比为1：0.02：0.002，按照两性离子单体与交联剂n,n’-亚甲双丙烯酰胺的摩尔比为1:0.01，在持续搅拌作用下均匀分散，通过静电相互作用，在治疗蛋白药物外层包裹两性离子、含碳碳双键单体和交联剂。按照两性离子单体与催化剂、引发剂的摩尔比为1：0.4：0.2的比例，依次加入催化剂和引发剂，通过原位聚合的方法，在4℃下反应24h，制得两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体。将得到的两性离子纳米药物载体注射到小鼠体内，在不同时间点抽取小鼠血清，测定药物载体在小鼠体内的血液循环时间。

对本发明制备的纳米药物载体进行表征和测试，结果如下：

图1是两性离子纳米药物载体的粒径分布图。取80μl样品放于微量皿中，使用美国布鲁克-海文公司生产的bi-90plus激光粒度仪对制备得到的纳米药物载体进行粒径测试。从图中可以看出2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体粒径均一，集中在10nm左右。

图2两性离子纳米药物载体的zeta电位分布图。取1.5ml样品于器皿中，使用美国布鲁克-海文公司生产的bi-90plus激光粒度仪对制备得到的纳米药物载体进行zeta电位测试。纯bsa呈电负性，zeta电位值为-14mv，当正电性单体、中性单体及两性离子单体包覆在bsa表面形成纳米微囊时，所测电位的值有微弱正电性，为3mv。

图3是两性离子纳米药物载体的凝胶电泳图。使用北京六一厂的琼脂糖凝胶电泳仪对制备得到的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体进行分析。调节测试电压为150v，测试时间为15min，之后在紫外分析仪照射下观察得到的图像。从图中可以看出，如图3所示，未包载两性离子的牛血清白蛋白本身带有负电性，在电泳作用下向正极移动，条带偏离孔洞。制得的两性离子纳米药物载体本身为微弱正电性，大部分条带留在孔洞中，略向负极移动。由粒径分布及其凝胶电泳的结果表明，成功制得了2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体。

图4是两性离子纳米药物载体的透射电镜图。取少量聚合物溶液滴到碳膜铜网上，几分钟后用滤纸吸取多余溶液，铜网置于通风处干燥，待溶剂完全挥发，将样品置于透射电子显微镜下观察。观测结果如图3所示，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体呈核壳结构，分布均匀，粒径均一，为8-15nm。

图5为两性离子纳米药物载体的¹h-nmr谱图。将两性离子纳米药物载体在d2o中预溶解，浓度为5mg/ml，室温下用avenceiiitmhd400mhznanobay(bruker)测试。¹h-nmr谱图显示聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(pmpc)的特征峰为4.1-4.3ppm，3.1ppm和1.8ppm。说明两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)成功包覆在治疗性蛋白药物壳层，形成2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体。

图6为两性离子纳米药物载体的体内血液循环时间关系图。将两性离子纳米药物载体注射到小鼠体内，在不同时间点对小鼠进行眼底取血，使用高速离心机提取小鼠血清，通过酶标仪测定血清中荧光强度的变化，确定纳米微囊在体内的循环时间。如图4所示，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)纳米药物载体在小鼠体内显现出优异的血液循环时间，血液循环半衰期达38.7h，说明使用两性离子2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)作为药物载体壳层能够显著延长体内血液循环时间，更好改善肿瘤组织中的载体积聚，提高蛋白药物的治疗效果。

本发明中一种血液中长循环两性离子纳米药物载体的设计，通过原位聚合法制备了粒径均一的聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)包载的核壳结构纳米药物载体。本发明通过在蛋白药物表面包载两性离子壳层形成核壳结构纳米药物载体，聚2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱聚合的壳层显著延长了纳米药物载体在体内血液中的循环时间，可以在原位聚合过程中添加不同的单体以实现多功能化，并且该壳层可响应肿瘤特异性环境，在肿瘤微环境裂解实现治疗蛋白药物的靶向投递。本发明制备方法简便，制备过程无毒无害，在保护实验动物，尽量减少不必要的动物使用数量宗旨下，寻找具有血液中长循环的两性离子纳米药物载体，改善肿瘤组织中的载体积聚，提高蛋白药物的治疗效果。本发明操作简便，成本较低，易于实现放大化工业化生产，具有广阔的临床应用前景。

根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现纳米药物载体的制备，经测试表现出与本发明基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。