一种抗鱼类疾病的有机酸类抑制剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于水产动物疾病防治领域，具体地，设计一种抗鱼类疾病的有机酸类抑制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，我国海洋经济迅猛发展，《2017年中国海洋经济统计公报》数据显示2017年全国海洋生产总值达到7.76万亿元，其中海洋渔业经济在海洋经济中占比超过17.8％。石斑鱼肉质细腻，营养丰富，作为我国华南地区最大宗海水养殖鱼类之一，在活海鲜市场中的经济价值极高。然而在高密度、集约化养殖条件下，各种养殖病害的频频爆发造成巨大经济损失。其中，石斑鱼虹彩病毒被称为“海洋口蹄疫”，其所导致的鱼病致死率极高，是导致石斑鱼发病的主要病毒性病原。然而目前针对石斑鱼虹彩病毒病尚无市场化的有效抗病毒药物，石斑鱼养殖业正处于无药可用的困局。因此亟需开拓新的思路研发高效抗病毒药物，用于石斑鱼养殖中虹彩病毒病的防控治疗。

近年来，从药用植物中寻找具有抗病毒作用的天然活性成分，已成为国内外开发新型植物源药物的研究热点。我国拥有丰富的药用植物资源，药用植物使用历史悠久，从药用植物中筛选抗病毒药物的应用前景极为广阔。药用植物含有众多天然活性化学成分，主要包含有机酸类、皂苷类、黄酮类、多糖类、生物碱等，其活性化学成分具有结构多样化、生物活性多样化的特点，能通过破坏病毒结构的完整性，影响病毒的蛋白质和遗传物质的合成，或者激活鱼体的免疫系统来发挥抗病毒作用。深入系统地研究水产用药用植物将能够有效解决抗生素等化学药物所造成的耐药性和药残问题，是实现绿色无公害、高效防病、水产高质化生态养殖的重要发展方向。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抗鱼类疾病的有机酸类抑制剂及其制备方法和应用，以有效地防治石斑鱼虹彩病毒。

根据本发明的一个方面，提供一种抗鱼类疾病的有机酸类抑制剂：其组分包括异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸中的至少一种；按照质量比计算，异绿原酸a：异绿原酸b：异绿原酸c：咖啡酸＝0–4：0–4：0–4：0–1。

优选地，组分包括异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸；按照质量比计算，异绿原酸a：异绿原酸b：异绿原酸c：咖啡酸＝0.5–4：0.5–4：1–4：0.25–1。

优选地，组分中的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸的质量比为：异绿原酸a：异绿原酸b：异绿原酸c：咖啡酸＝2：2：4：1。

根据本发明的另一个方面，提供一种上述抗鱼类病毒的有机酸类抑制剂的制备方法：采用植物源的异绿原酸a、植物源的异绿原酸b、植物源的异绿原酸c和植物源的咖啡酸，按照质量比，配制而成。

优选地，选取金银花、杜仲、冬葵果、蒲公英、丹参、红花和川穹中的一种作为植物源，提取异绿原酸a；选取金银花、杜仲、冬葵果、蒲公英、丹参、红花和川穹中的一种作为植物源，提取异绿原酸b；选取金银花、杜仲、冬葵果、蒲公英、丹参、红花和川穹中的一种作为植物源，提取异绿原酸c；选取金银花、杜仲、冬葵果、蒲公英、丹参、红花和川穹中的一种作为植物源，提取咖啡酸。

优选地，以金银花作为植物源，分别提取异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸。

根据本发明的另一个方面，提供一种复合配方制剂：以上述抗鱼类病毒的有机酸类抑制剂作为活性成分，用于预防和/抑制虹彩病毒。

优选地，虹彩病毒为石斑鱼虹彩病毒。

优选地，有机酸类抑制剂的浓度为62.5–300μg/ml。

优选地，有机酸类抑制剂的浓度为250μg/ml。

异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸能够通过破坏石斑鱼虹彩病毒的结构、影响病毒复制感染的过程，从而对石斑鱼虹彩病毒感染产生显著的抑制效果。采用异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸复配制备的抗鱼类疾病的有机酸类抑制剂中，共同作为活性成分的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸协同增效，使有机酸类抑制剂能够在不超出其中的各活性成分的安全使用浓度范围的前提下有效抑制石斑鱼虹彩病毒。与分别以采用异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸作为单一的活性成分相比，本发明采用异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸共同配制有机酸类抑制剂，能够降低各活性成分的有效作用浓度，减少各活性成分的剂量，由此可以降低活性成分的原料成本，提高生产效益，降低活性成分所产生的副作用影响，降低药物残留量，提高药品安全性，同时，不会折减有机酸类抑制剂对虹彩病毒的抑制效果。另外，本发明所采用的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸都能够利用常见的药用植物提取得到，可用于提取上述有效成分的植物源来源广泛，利用植物源的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸替代现有抗病毒兽药中的常见抗生素等化学药物，能够避免耐药性等药品药效问题和药物残留等食品安全问题的发生。综上，本发明提供的抗鱼类病毒的有机酸类抑制剂及应用其的复合配方制剂能够安全、高效地预防和抑制石斑鱼虹彩病毒，并且符合绿色无公害的可持续发展要求，能够促进水产业的高质化生态养殖，带来不可忽视的经济效益。

附图说明

图1是不同浓度的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸分别对石斑鱼脾脏细胞的细胞毒作用的光镜观察结果；

图2是不同浓度的异绿原酸a对石斑鱼脾脏细胞活力影响的细胞活性检测结果；

图3是不同浓度的异绿原酸b对石斑鱼脾脏细胞活力影响的细胞活性检测结果；

图4是不同浓度的异绿原酸c对石斑鱼脾脏细胞活力影响的细胞活性检测结果；

图5是不同浓度的咖啡酸对石斑鱼脾脏细胞活力影响的细胞活性检测结果；

图6是是不同浓度(不超出安全使用浓度范围)的化合物单体异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、咖啡酸单独对石斑鱼虹彩病毒的抑制作用；

图7是不同浓度的复合配方制剂对石斑鱼脾脏细胞活力影响的细胞活性检测结果；

图8是不同浓度(不超出安全使用浓度范围)的复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒的抑制作用；

图9是不同浓度(不超出安全使用浓度范围)的复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒结构的破坏作用；

图10是安全使用浓度的复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒在宿主细胞内的复制合成过程中的抑制作用。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中涉及的定量实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用spss17.0统计软件运用单因素水平方差分析的方法对组间比较数据进行统计处理。

石斑鱼脾脏细胞(grouperspleencell,gs)保存于本实验室，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。

石斑鱼虹彩病毒(广西株，grouperiridovirusguangxistrain,sgiv-gx)分离自广西北海患病的珍珠龙胆石斑鱼(epinephelusfuscoguttatus♀×e.lanceolatus♂)，保存于申请人实验室，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。下述实施例中使用前将sgiv-gx病毒在细胞培养基中稀释至10⁵tcid50/ml。

异绿原酸a：成都瑞芬思生物科技有限公司产品(分析纯度﹥98％)，产品编号为y-068，cas#2450-53-5。异绿原酸b：成都瑞芬思生物科技有限公司产品(分析纯度﹥98％)，产品编号为y-069，cas#14534-61-3。异绿原酸c：成都瑞芬思生物科技有限公司产品(分析纯度﹥98％)，产品编号为y-070，cas#32451-88-0。咖啡酸：成都瑞芬思生物科技有限公司产品(分析纯度﹥98％)，产品编号为k-003，cas#331-39-5。

石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白(majorcapsidprotein，mcp)基因引物：正向引物(qmcp-f)5’-gcacgcttctctcaccttca-3’，反向引物(qmcp-r)5’-aacggcaacgggagcacta-3’。内参基因β-actin引物：正向引物(β-actin-f)5’-tacgagctgcctgacggaca-3’，反向引物(β-actin-r)5’-ggctgtgatctccttctgca-3’。引物由上海生工合成。

实施例1

1.主要仪器及试剂

光学显微镜。

2.实验方法

将gs细胞按照10000个/孔的数量传入96孔板，28℃培养24小时，然后分别将异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸这四种植物源化合物单体在细胞培养基中稀释成不同的浓度(异绿原酸a：1000，500，250μg/ml；异绿原酸b：1000，500，250μg/ml；异绿原酸c：2000，1000，500μg/ml；咖啡酸：500，250，125μg/ml)；实验组是将含有不同浓度的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸分别与96孔板中的gs细胞在28℃孵育培养48h，对细胞形态进行光镜观察。本实验的对照组是培养基中没有加入上述植物源化合物单体的gs细胞。

3.实验结果

细胞光镜观察结果如图1所示，对照组gs细胞无明显变化，实验组中异绿原酸a浓度高于500μg/ml、异绿原酸b浓度高于500μg/ml、异绿原酸c浓度高于1000μg/ml、咖啡酸浓度高于250μg/ml时，实验组gs细胞出现明显的形态变化和细胞病变，包括细胞变圆、皱缩、从细胞培养面上脱落等。异绿原酸a浓度低于250μg/ml、异绿原酸b浓度低于250μg/ml、异绿原酸c浓度低于500μg/ml、咖啡酸浓度低于125μg/ml时，gs细胞形态无明显变化，大致与对照组的gs细胞形态相同。

实施例2

1.主要仪器及试剂

酶标仪，5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝苯基)-2h-四唑钠内盐溶液(wst-8溶液)。

2.实验方法

将gs细胞按照10000个/孔的数量传入96孔板，28℃培养24小时，然后分别将异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸这四种植物源化合物单体在细胞培养基中设置成不同的浓度(异绿原酸a：2000，1000，500，250，125μg/ml；异绿原酸b：2000，1000，500，250，125μg/ml；异绿原酸c：2000，1000，500，25，125μg/ml；咖啡酸：2000，1000，500，250，125，62.5μg/ml)；将不同浓度的植物源化合物单体分别与96孔板中的gs细胞在28℃孵育培养48h。为了检测细胞活性，各孔中的细胞加入20μl的wst-8溶液继续在28℃培养4小时，然后用酶标仪检测450nm处的吸光度。细胞存活率的计算方式为：

细胞存活率＝实验组od450/对照组od450×100％。

实验分别重复三次。根据细胞存活率测定结果确定各植物源化合物单体的最大无毒浓度，即最高安全使用浓度。本实验的对照组是培养基中没有加入植物源化合物单体的gs细胞。

3.实验结果

图2–5分别展示了四种不同的植物源化合物单体对应的细胞存活率测定结果，异绿原酸a浓度低于250μg/ml、异绿原酸b浓度低于250μg/ml、异绿原酸c浓度低于500μg/ml、咖啡酸浓度低于125μg/ml时的实验组细胞存活率均超过95％。结合实施例1光镜观察结果，确定各植物源化合物单体异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸的最高安全使用浓度分别为250μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、125μg/ml。

实施例3

1.主要仪器及试剂

实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr)。

2.实验方法

分别将异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸在细胞培养基中倍比梯度稀释，设置成不同浓度(异绿原酸a：250，125，62.5μg/ml；异绿原酸b：250，125，62.5μg/ml；异绿原酸c：500，250，125μg/ml；咖啡酸：125，62.5，31.25μg/ml)的植物化合物单体溶液，利用rt-qpcr技术检测了本实施例配制的植物化合物单体溶液，在不同浓度条件下抑制石斑鱼虹彩病毒感染的效果。将gs细胞按照40000个/孔的数量传入24孔板，28℃培养24小时。分别将待测的植物化合物单体溶液与sgiv-gx病毒(10⁵tcid50/ml)一起加入24孔板的细胞中，28℃培养。培养48小时，收集实验组和对照组中的细胞和培养基提取rna，并将其反转录成cdna，以cdna为模板，β-actin基因作为内参基因，用rt-qpcr检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白mcp基因的表达情况，来判断参试的植物化合物单体溶液对石斑鱼虹彩病毒的抑制作用。本实验的对照组为只加入了sgiv-gx病毒的gs细胞。

3.实验结果

rt-qpcr技术检测mcp基因表达结果如图6所示，与对照组细胞中mcp基因表达量相比，实验组细胞中mcp基因的表达量明显降低，说明本实施例中化合物单体异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、咖啡酸单独作为有效成分时，对石斑鱼虹彩病毒感染具有抑制效果。

实施例4

按照如下质量配比：异绿原酸a：异绿原酸b：异绿原酸c：咖啡酸＝2：2：4：1，称取异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸，将上述原料按上述质量配比混合均匀，得到混合液，使用细胞培养基溶解混合液，配得浓度(异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸在溶液中的总浓度)为1000μg/ml的复合配方制剂母液，使用0.22μm滤柱过滤除菌后，-20℃保存备用。

实施例5

1.主要仪器及试剂

酶标仪，wst-8溶液。

2.实验方法

将gs细胞按照10000个/孔的数量传入96孔板，28℃培养24小时备用。将实施例4配制的复合配方制剂母液在细胞培养基中倍比梯度稀释，设置成不同浓度(1000，500，250，125，62.5μg/ml)的复合配方制剂；将不同浓度的复合配方制剂分别加入96孔板中的gs细胞，在28℃孵育培养48h。为了检测细胞活性，各孔中的细胞加入20μl的wst-8溶液继续在28℃培养4小时，然后用酶标仪检测450nm处的吸光度。细胞存活率的计算方式为：

细胞存活率＝实验组od450/对照组od450×100％。

实验分别重复三次。根据细胞存活率测定结果确定复合配方制剂的最大无毒浓度，即最高安全使用浓度。本实验的对照组是培养基中没有加入复合配方制剂的gs细胞。

3.实验结果

本实施例的细胞活力测定结果如图7所示，复合配方制剂浓度低于250μg/ml的实验组细胞存活率超过95％，即复合配方制剂的最高安全使用浓度为250μg/ml。

实施例6

1.主要仪器及试剂

实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr)。

2.实验方法

将实施例4配制的复合配方制剂母液在细胞培养基中倍比梯度稀释，设置成不同浓度(250，125，62.5μg/ml)的复合配方制剂，利用rt-qpcr技术检测了本实施例配制的复合配方制剂，在不同浓度条件下抑制石斑鱼虹彩病毒感染的效果。将gs细胞按照40000个/孔的数量传入24孔板，28℃培养24小时。分别将三种不同浓度的复合配方制剂与sgiv-gx病毒(10⁵tcid50/ml)一起加入24孔板的细胞中，28℃培养。培养48小时，收集实验组和对照组中的细胞和培养基提取rna，并将其反转录成cdna，以cdna为模板，β-actin基因作为内参基因，用rt-qpcr检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白mcp基因的表达情况，来判断本实施例配制的复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒的抑制作用。本实验的对照组为只加入了sgiv-gx病毒的gs细胞。

3.实验结果

rt-qpcr技术检测mcp基因表达结果如图8所示，与只加入了sgiv-gx病毒的对照组gs细胞中mcp基因表达量相比，同时加入sgiv-gx和本实施例配制的复合配方制剂的实验组细胞中mcp基因的表达量明显降低，说明浓度为250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml的复合配方制剂都能对石斑鱼虹彩病毒感染具有显著的抑制效果。

另外，通过对比本实施例的测试结果(图8)与实施例3的测试结果(图6)，分别与异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、咖啡酸单独作为有效成分相比，本实施例配制的复合配方制剂的有效作用浓度明显更低，而当单独作为有效成分的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、咖啡酸各自的浓度与本实施例配制的复合配方制剂的浓度处于同一水平时，本实施例配制的复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒的抑制效果更为明显。由此，说明本实施例配制的复合配方制剂中，共同作为有效成分的异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c和咖啡酸能够协同增效，对石斑鱼虹彩病毒感染达到更好的抑制效果。

实施例7

1.主要仪器及试剂

实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr)、冷冻高速离心机、pbs缓冲液。

2.实验方法

将gs细胞按照40000个/孔的数量传入24孔板，28℃培养24小时。然后将将实施例4配制的复合配方制剂母液在细胞培养基中稀释成浓度为250μg/ml(最高安全使用浓度)的复合配方制剂，将复合配方制剂与sgiv-gx病毒(10⁵tcid50/ml)一起加入24孔板的细胞中，4℃孵育30分钟，然后使用冷冻高速离心机35000g、4℃离心30分钟，移除上清中复合配方制剂，将离心沉淀的病毒用pbs缓冲液漂洗后，重悬于400μl细胞培养基并加入24孔板的gs细胞，细胞在28℃继续培养12小时。本实施例中，对照组处理方法是：sgiv-gx病毒(10⁵tcid50/ml)与细胞培养基(对照组的细胞培养基的组成以及用量与本实施例实验组中的设置保持一致)4℃孵育30分钟，然后使用冷冻高速离心机35000g、4℃离心30分钟，移除上清后将离心沉淀的病毒用pbs缓冲液漂洗，重悬于400μl细胞培养基并加入24孔的gs细胞，在28℃继续培养。12小时后收集实验组和对照组中细胞和培养基提取rna，并将其反转录成cdna；然后，以cdna为模板，β-actin基因作为内参基因，用rt-qpcr检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白mcp基因的表达情况，来判断复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒结构的破坏作用。

3.实验结果

rt-qpcr技术检测mcp基因表达结果如图9所示，与对照组细胞中mcp基因表达量相比，实验组细胞中mcp基因的表达量明显降低，说明本实施例配制的复合配方制剂能够通过破坏石斑鱼虹彩病毒的结构来发挥抗石斑鱼虹彩病毒感染的效果。

实施例8

1.主要仪器及试剂

实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr)、冷冻高速离心机、pbs缓冲液。

2.实验方法

将gs细胞按照40000个/孔的数量传入24孔板，28℃培养24小时。将sgiv-gx病毒(10⁵tcid50/ml)加入细胞中，4℃静置30分钟，然后将细胞移至28℃培养2小时。移除24孔板细胞中的培养基，用新鲜培养基将细胞清洗两次，然后将实施例4制备的复合配方制剂母液在细胞培养基中稀释成浓度为250μg/ml(最高安全使用浓度)的复合配方制剂，将本实施例配制的复合配方制剂加入24孔板的细胞中，在28℃继续培养12小时。本实施例中，对照组处理方法是：sgiv-gx病毒(10⁵tcid50/ml)加入细胞中，4℃静置30分钟，然后将细胞移至28℃培养2小时。移除24孔板细胞中的培养基，用新鲜培养基将细胞清洗两次，然后在细胞中加入细胞培养基对照组，28℃继续培养12小时。然后收集实验组和对照组中的细胞和培养基提取总rna，并将其反转录成cdna，以cdna为模板，β-actin基因作为内参基因，利用rt-qpcr技术检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白mcp基因的表达情况，来判断复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒在宿主细胞内的复制合成过程中的抑制作用。

3.实验结果

rt-qpcr技术检测mcp基因表达结果如图10所示，与对照组细胞中mcp基因表达量相比，实验组细胞中mcp基因的表达量明显降低，说明本实施例配制的复合配方制剂具有抑制石斑鱼虹彩病毒在宿主细胞内的复制合成的作用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。