本发明属于植物多肽领域,具体涉及植物多肽在制备治疗糖耐量异常的药物中的用途。
背景技术:
糖耐量异常是隐性糖尿病,是介于正常血糖和显性糖尿病之间的一种代谢状态,因无临床症状或症状较轻且空腹血糖多为正常,常导致患者的忽视和医务人员的麻痹大意,饮食上未加以控制,用药上不注意方法,无疑会延误治疗,对患者的健康产生威胁。
糖耐量异常没有显性糖尿病的典型症状“三高一低”(多食多饮多尿消瘦);空腹血糖和餐后血糖都高,达到糖尿病的诊断标准。目前用于临床的糖尿病诊断标准是1980年who推荐,1985年又进行修订过的,具体如下表所示:
国内的糖尿病人能自己发现患糖尿病的只有25%,而多达75%的病人身在病中不知病;日久病情不知不觉地发展,导致显性糖尿病发现过迟,引起心血管系统及肾脏等重要器官的并发症,进而危害健康和寿命。有文献报道隐性糖尿病患者术后又未采取相应的降糖措施而导致腰椎间盘突出术后发生感染(李淑英,等,隐性糖尿病致腰椎间盘突出术后感染的病例分析,承德医学院学报,vol.30no.22013);隐性糖尿病伴发面神经麻痹(黄娣,等,隐性糖尿病伴发面神经麻痹临床分析,河北医药2011年12月第33卷第23期);隐性糖尿病伴发泌汗异常(党志敏等,隐性糖尿病伴发泌汗异常,脑与神经疾病杂志2006年第14卷3期)。
目前报道的药物多是针对糖尿病的治疗,而针对治疗糖耐量异常的隐性糖尿病,目前还没有特定治疗的药物。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供植物多肽在制备治疗糖耐量异常的药物中的用途。
本发明提供了植物多肽在制备治疗糖耐量异常的药物中的用途。
进一步地,所述植物多肽是从豆类植物中提取得到的多肽。
进一步地,所述豆类植物选自大豆、豌豆、鹰嘴豆、绿豆、扁豆、赤豆;
优选的,所述豆类植物选自大豆、豌豆、鹰嘴豆;
更优选的,所述豆类植物为鹰嘴豆。
进一步地,所述植物多肽是由37个氨基酸组成的多肽,其氨基端为丙氨酸或者缬氨酸,羧基端为甘氨酸。
进一步地,所述植物多肽中含6个半胱氨酸,分别位于序列的第3、7、15、20、22、32位,且由第3位与第20位、第7位与第22位、第15位与第32位的半胱氨酸形成3对二硫键。
进一步地,所述植物多肽的序列选自:
ascngvcspfemppcgtsacrcipvglvigycrnpsg;(seqidno.1)
ascngvcspfemppcgssacrcipvglvvgycrhpsg;(seqidno.2)
vscngvcspfemppcgssacrcipyglvvgncrhpsg;(seqidno.3)
adcngacspfevppcrsrdcrcvpiglfvgfcihptg;(seqidno.4)
adcngacspfemppcgstdcrcvpialvggfcihptg;(seqidno.5)
adcngacspfevppcrsrdcrcvpiglfvgycrhpsg。(seqidno.6)
进一步地,所述植物多肽的制备方法包括:
(1)将豆类植物种子经萌发后,在提取液中提取,得提取液;
(2)将步骤(1)所得提取液与海藻酸混合,吸附,然后洗涤,取液体,盐析,析出固体;
(3)将步骤(2)所得固体脱盐,干燥,得蛋白质粉;
(4)将步骤(3)所得蛋白质粉纯化,即得植物多肽。
进一步地,步骤(1)中,所述提取液为乙酸水溶液;
步骤(2)中,所述吸附时的ph为2.7;所述盐析时的ph为3.5,盐析时在体系中加入饱和氯化钠溶液;
步骤(3)中,所述脱盐方式为:将固体溶于醋酸水溶液中,取上清液,通过凝胶柱层析柱,收集洗脱液,冻干;
步骤(4)中,所述提纯方式为:将蛋白质粉在丙酮与水的混合溶液中提取,取上清液,干燥,得粗品,然后将粗品通过半制备反相色谱柱,即得。
进一步地,步骤(4)中,所述粗品是溶于0.1%的三氟乙酸后通过半制备反相色谱柱的。
本发明多肽能明显使葡萄糖耐量回复正常水平,胰岛素分泌水平更接近正常范围,可用于治疗糖尿病早期葡萄糖耐量异常的人群,效果明显,具有临床应用价值。
实验证明,本发明植物多肽能显著降低葡萄糖耐量异常动物的血糖水平,治疗糖耐量异常,使糖耐量异常大鼠的血糖和胰岛素水平恢复到正常范围。本发明植物多肽可用于制备治疗葡萄糖耐量异常的隐性糖尿病的药物,其治疗效果明显,具有非常好的临床应用价值。
本发明中,盐析是指在含多肽或蛋白质的水溶液中加入中性盐,随着盐浓度增大而使多肽或蛋白质沉淀出来的现象。
氨基端、羧基端:由多个氨基酸残基按一定顺序所组成的多肽链,通常在一端含有一个游离的α氨基,称为氨基端,另一端含有一个游离的α羧基,称为羧基端。
植物多肽是指从植物中提取得到的多肽。
根据本发明的上述内容,按照本发明相关领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1绿豆多肽的制备
称绿豆种子100g于培养皿中,加入水浸泡,于25℃下萌发48小时,然后将发芽的种子与0.5m的乙酸水溶液(含0.1%β-巯基乙醇)混合匀浆。加入1升0.5m的乙酸水溶液,于4℃下搅拌提取24小时。4℃下低温离心25分钟(6000rpm)取上清液备用。
将上一步得到的上清液用盐酸调ph值至2.7,然后与海藻酸混合搅拌吸附30分钟,抽滤、滤饼用蒸馏水洗涤3-5次,然后用0.2m的稀盐酸洗涤吸附有蛋白质的海藻酸,洗涤3-5次,充分将蛋白质洗脱,滤液收集备用。滤饼海藻酸再用蒸馏水洗涤3-5次后再次进行吸附操作,如此重复吸附、洗脱3-5次,合并洗脱液用醋酸钠调ph值至3.5,加入饱和氯化钠溶液320克盐析过夜,抽滤得到盐析物。
将称好的sephadexg25fine凝胶颗粒用水处理装柱,再用0.2m的醋酸溶液平衡柱子3小时备用。将盐析物溶于0.2m醋酸水溶液中(1g/15ml),然后于4℃下离心10分钟(12000rpm),收集上清液,用0.4μm的滤膜过滤,滤液过凝胶柱脱盐处理,收集洗脱液冻干处理得到蛋白质粉。
蛋白质粉与25ml的丙酮/水(4:1)混合,-20℃下搅拌提取12小时,4℃下离心25分钟,上清液减压浓缩,残留物进行冻干处理得到粗品。粗品溶于0.1%的三氟乙酸中,用半制备反相色谱柱分离纯化得到约10mg多肽,纯度98.8%。所述多肽的序列为:ascngvcspfemppcgtsacrcipvglvigycrnpsg。
本实施例多肽还可以根据氨基酸序列直接合成。
实施例2鹰嘴豆多肽的制备
称鹰嘴豆种子100g于培养皿中,加入水浸泡,于25℃下萌发60小时,然后将发芽的种子与0.5m的乙酸水溶液(含0.1%β-巯基乙醇)混合匀浆。加入1升0.5m的乙酸水溶液,于4℃下搅拌提取10小时。4℃下低温离心25分钟(6000rpm)取上清液备用。
将上一步得到的上清液用盐酸调ph值至2.7,然后与海藻酸混合搅拌吸附30分钟,抽滤、滤饼用蒸馏水洗涤3-5次,然后用0.2m的稀盐酸洗涤吸附有蛋白质的海藻酸,洗涤3-5次,充分将蛋白质洗脱,滤液收集备用。滤饼海藻酸再用蒸馏水洗涤3-5次后再次进行吸附操作,如此重复吸附、洗脱3-5次,合并洗脱液用醋酸钠调ph值至3.5,加入饱和氯化钠溶液320克盐析过夜,抽滤得到盐析物。
将称好的sephadexg25fine凝胶颗粒用水处理装柱,再用0.2m的醋酸溶液平衡柱子3小时备用。将盐析物溶于0.2m醋酸水溶液中(1g/15ml),然后于4℃下离心10分钟(12000rpm),收集上清液,用0.4μm的滤膜过滤,滤液过凝胶柱脱盐处理,收集洗脱液冻干处理得到蛋白质粉。
蛋白质粉与25ml的丙酮/水(4:1)混合,-20℃下搅拌提取15小时,4℃下离心25分钟,上清液减压浓缩,残留物进行冻干处理得到粗品。粗品溶于0.1%的三氟乙酸中,用半制备反相色谱柱分离纯化得到约50mg多肽,纯度99.2%。所述多肽的序列为:ascngvcspfemppcgtsacrcipvglvigycrnpsg。
本实施例多肽还可以根据氨基酸序列直接合成。
实施例3豌豆多肽的制备
称豌豆种子100g于培养皿中,加入水浸泡,于25℃下萌发40小时,发芽后采用实施例2的方法经过提取、吸附、盐析、脱盐、纯化等步骤得到约25mg多肽,纯度99.0%。所述多肽的序列为:ascngvcspfemppcgssacrcipvglvvgycrhpsg。
本实施例多肽还可以根据氨基酸序列直接合成。
实施例4大豆多肽的制备
称大豆种子100g于培养皿中,加入水浸泡,于25℃下萌发50小时,发芽后采用实施例2的方法经过提取、吸附、盐析、脱盐、纯化等步骤得到约15mg多肽,纯度99.6%。所述多肽的序列为:vscngvcspfemppcgssacrcipyglvvgncrhpsg。
本实施例多肽还可以根据氨基酸序列直接合成。
以下通过具体实验例来证明本发明的有益效果。
试验例1本发明植物多肽的药效
1、实验材料
①药物
本发明植物多肽1组:实施例1制备的多肽,用注射用水稀释,浓度为2ng/ml,供动物灌胃用。
本发明植物多肽2组:实施例2制备的多肽,用注射用水稀释,浓度为2ng/ml,供动物灌胃用。
本发明植物多肽3组:实施例3制备的多肽,用注射用水稀释,浓度为2ng/ml,供动物灌胃用。
本发明植物多肽4组:实施例4制备的多肽,用注射用水稀释,浓度为2ng/ml,供动物灌胃用。
模型对照:链脲佐菌素(stz,美国sigma公司),配制:临用时0.1mol/l枸橼酸钠缓冲液配成20%溶液,供腹腔注射用。
空白对照组:0.1mol/l枸橼酸钠缓冲液,腹腔注射。
②动物
新生雄性wistar大鼠,符合纳入标准进入试验者共60只。
2、葡萄糖耐量测定
动物禁食12小时后,尾静脉取血,用血糖测定仪(ondtouch血糖测定仪,强生中国有限公司)测定空腹血糖值。30分钟后1.11mol/l葡萄糖溶液2g/kg灌胃,2小时后尾静脉取血,用血糖仪测定血糖。
3、胰岛素测定
测定葡萄糖耐量同时,取尾静脉0.5ml,离心取血清,行胰岛素测定(胰岛素放免试剂盒,中国原子能科学研究院胰岛素研究所)。
4、动物模型建立
糖耐量异常表现为糖负荷后2小时血糖水平比正常水平升高,同时胰岛素水平与正常水平相比基本无变化。
新生雄性wistar大鼠,腹腔一次性注射stz80mg/kg,建立葡萄糖耐量异常动物模型,空白对照组注射等量枸橼酸钠缓冲液。
大鼠断奶后常规正常饲料喂养,长至10周时进行葡萄糖耐量试验及血糖胰岛素测定,剔除阴性者。
5、试验方法
共6组:空白对照组10只;模型对照组10只;4组给药物组(分别取上述建立的葡萄糖耐量异常动物模型大鼠,每只大鼠灌服容量1ml药物,每天一次,连续3周),按照灌服的药物分为:植物多肽1组10只,植物多肽2组10只,植物多肽3组10只,植物多肽4组10只。给药3周后测定糖负荷后2小时血糖水平和胰岛素水平见表1。
6、试验结果
表1给药8周糖负荷后2小时血糖和胰岛素水平
由表1可知,与空白对照组(正常小鼠)相比,模型对照组的2小时血糖水平显著升高,胰岛素水平基本无变化,证明葡萄糖耐量异常动物模型造模成功。
而本发明植物多肽给药后,均可有效降低葡萄糖耐量异常动物的血糖水平,使血糖水平恢复到正常小鼠的范围,说明本发明的植物多肽均能够有效治疗糖耐量异常。
综上,本发明植物多肽能显著降低葡萄糖耐量异常动物的血糖水平,治疗糖耐量异常,使糖耐量异常大鼠的血糖和胰岛素水平恢复到正常范围。本发明植物多肽可用于制备治疗葡萄糖耐量异常的隐性糖尿病的药物,其治疗效果明显,具有非常好的临床应用价值。
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