千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景技术：

千金藤碱(cepharanthine,cep)是从防己科植物头花千金藤中提取出来的单体化合物，属于生物碱一类，其被日本卫生部批准用于临床上治疗放疗导致的白细胞减少症，斑秃等。已有研究表明千金藤碱具有抗病毒，抗炎，抗肿瘤等多种活性，且尚未发现其存在安全问题，副作用报道甚少。在合理的用药下千金藤碱还具有调节免疫，维持细胞膜稳定性，促进血管循环等作用。一般地，千金藤碱会被制备成粉末，片剂，针剂的形式用于治疗。并且越来越多的研究表明千金藤碱能够逆转肿瘤的耐药性以及作为辅助药物治疗肿瘤，但因自噬会促使肿瘤存活而降低抗肿瘤药物的效果，千金藤碱单用抑制肿瘤过程中细胞自噬发挥何种作用，目前没有过多的报道，关于千金藤碱与细胞自噬的报道到目前为止也仅有几篇，结论却不尽相同。我们发现自噬对肿瘤细胞的保护机制，进而用千金藤碱与自噬抑制剂联用来达到抗肿瘤效果，而千金藤碱与自噬抑制剂联用尚未见有报道，他们联用的剂量就更没有相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。

为了解决以上技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了千金藤碱与自噬抑制剂联用在制备治疗肝癌药物中的应用。

进一步地，所述千金藤碱的剂量为1-1000mg/kg。

进一步地，所述千金藤碱的剂量为20mg/kg。

进一步地，所述自噬抑制剂的剂量为1-1000mg/kg。

进一步地，所述自噬抑制剂的剂量为50mg/kg。

进一步地，所述千金藤碱与自噬抑制剂的质量比为1:1-10。

进一步地，所述千金藤碱与自噬抑制剂的质量比为1:2.5。

进一步地，所述自噬抑制剂为自噬溶酶体抑制剂氯喹。

进一步地，所述千金藤碱为盐酸千金藤碱。

本发明首先检测了盐酸千金藤碱单用对于不同肝癌细胞生长的影响。

本发明选用1-100um的盐酸千金藤碱，测定该范围内盐酸千金藤碱对正常肝癌细胞hl-7702细胞株和肝癌细胞：smcc-7721、huh7、hepg2细胞株的药物毒性；优选5um盐酸千金藤碱验证其在体外对癌细胞的增殖，迁移，侵袭以及促凋亡作用。

本发明通过实验验证了千金藤碱单用对肝癌细胞生长的影响后，进一步用自噬抑制剂与盐酸千金藤碱联合用药在体外抑制癌细胞生长。

优选氯喹作为自噬抑制剂与盐酸千金藤碱联合用药在体外抑制癌细胞生长。

优选盐酸千金藤碱与氯喹1:7.5的比例在体外抑制癌细胞，用compusyn软件分析两者的联用治疗癌症联合指数。

本发明在体外验证得到了盐酸千金藤碱与自噬抑制剂氯喹联用后具有抑癌作用后，进一步在裸鼠体内进行进一步的体内实验验证。

异体移植方式在裸鼠体内构建实体瘤模型，随机分组后；根据体外实验的联合指数计算出加药量，每天给小鼠联合用药，根据测量小鼠肿瘤大小，体重，各项脏器的异常情况来表征发现，盐酸千金藤碱与氯喹联合用药的确有较好的治疗效果，并对其他组织无副作用。

本发明证实了盐酸千金藤碱在体内体外都具有抑制肿瘤的作用，并且与自噬抑制剂氯喹使用时，在体内外抑制肿瘤效果更好。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)本发明所选抗癌药物盐酸千金藤碱为临床上已批准使用的天然产物，副作用小甚至无，获取方式简单且经济；

(2)本发明发现盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药在体内外都具有良好的抑癌效果，提供了更多的治疗实体瘤方案，且两种联用药物来源广，经济有效；

(3)自噬保护机制对肿瘤的存活及增殖有重要的作用，本发明首次发现了通过使用自噬抑制剂来加强盐酸千金藤碱在体内外的抗癌作用，并在体内小鼠模型上验证，提供一种新型的治疗实体瘤有效，可行的方案。

附图说明

图1是实施例1盐酸千金藤碱抑制各株肝癌细胞存活的拟合曲线图；

图2是实施例2中划痕实验结果图；

图3是实施例2中克隆形成实验结果图；

图4是实施例2中transwell小室检测细胞侵袭的结果图；

图5是实施例2中凋亡实验结果图；

图6是盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药的联合指数分析图；

图7是盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤的重量的影响；

图8是盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤生长率的影响；

图9是随着时间变化盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤生长率的影响。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明进行详细的说明。以下实施案例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提在，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

用电子天平称取盐酸千金藤碱粉末，加入到dmso中溶解，配成浓度为100mm的母液，后用dmso稀释成不同的浓度。用mtt的方法检测盐酸千金藤碱对正常肝细胞hl-7702和肝癌细胞smcc-7721，huh7，hepg2细胞24h和48h的毒性，并且计算得到盐酸千金藤碱对不同肝癌细胞的ic50值。

具体方法：将正常肝细胞hl-7702用胰酶消化后接种到96孔板中，每孔接种细胞0.4×10⁴，过夜培养待贴壁后，将0-100um的盐酸千金藤碱加到培养皿中，分别在培养24h和48h时加入10ulmtt(5mg/ml)，37℃孵育4h后吸去培养液和mtt，加入dmso，在摇床上室温反应30min在570nm处测定吸光值，后用graphpadprism8绘制药物浓度对应细胞存活率的拟合曲线，其他细胞的操作同hl-7702。

盐酸千金藤碱抑制各株肝癌细胞存活的拟合曲线图如图1所示。图1的结果显示，盐酸千金藤碱对肝癌细胞的毒性具有浓度依赖性，随着时间延长，毒性作用无明显差异，但对正常肝细胞具有时间依赖性，并且与正常肝细胞相比，盐酸千金藤碱对肝癌细胞的毒性更大。

实施例2

在实施例1的前提下，本发明进一步验证了盐酸千金藤碱对肝癌细胞的生长的确有影响就进一步进行了划痕，克隆形成，transwell，以及流式分选仪检测凋亡细胞实验。

划痕实验具体方法：先在12孔板外表面底部画黑色横线，然后用胰酶消化huh7细胞后将20×10⁴个细胞接种到12孔板中，培养过夜。待细胞贴壁后，用pbs洗一遍后用200ul枪头在12孔板内表面底部划横线，与外表面的横线相互垂直，造成细胞划痕，完成过程后，用pbs清洗，分为3组(对照组(以control表示)，顺铂组(以cddp表示)，盐酸千金藤碱组(以ch表示))，顺铂组和盐酸千金藤组分别用含顺铂、盐酸千金藤碱的培养基培养后，分别在0h，24h以及48h拍照记录。划痕实验结果图如图2所示，与抗癌阳性药物cddp类似，ch抑制肝癌细胞的迁移。

克隆形成实验具体方法：将用胰酶消化下来的huh7细胞接种到6孔板中，分为3组(对照组(以control表示)，顺铂组(以cddp表示)，盐酸千金藤碱组(以ch表示))接种4×10⁴个/ml，培养贴壁后顺铂组和盐酸千金藤组分别加入阳性对照药物顺铂以及盐酸千金藤碱，培养48h后更换培养基。培养至肉眼可见贴壁细胞团后用pbs清洗后用4％的多聚甲醛固定细胞15min，后吸去多聚甲醛，加结晶紫染色15min，用清水浸泡洗去结晶紫后干燥，拍照记录。克隆形成实验结果图如图3所示。

由图3可以看出，huh7细胞的克隆形成被阳性药物cddp显著抑制，ch抑制细胞克隆形成的能力虽然没有cddp显著，但是与对照组相比，仍然抑制了肝癌细胞的克隆。这也是千金藤碱单用抗癌效果不理想的佐证。

transwell侵袭实验具体方法：取出干净的transwell小室放到12孔板，往小室中央加入40ul的基质胶工作液，放到37℃恒温培养箱孵育。取对数生长期的huh7细胞，用胰酶消化，离心后加入不含血清的培养基重悬细胞，血球计数板计数后将20×10⁴个细胞(200ul培养基)接种到transwell小室，分为3组(对照组(以control表示)，顺铂组(以cddp表示)，盐酸千金藤碱组(以ch表示))，transwell下室中对照组加入完全培养基、顺铂组加入含顺铂的完全培养基、盐酸千金藤碱组加入含5um的千金藤碱完全培养基，培养箱培养24h。用4％多聚甲醛固定后拍照记录细胞侵袭情况。transwell小室检测细胞侵袭的结果图如图4所示，ch显著抑制肝癌细胞的侵袭功能。

annexinv-alexafluor488/pi检测细胞凋亡实验具体方法：用胰酶消化huh7细胞，接种20×10⁴个/ml到6孔板中，12h贴壁后加入10um新鲜的培养基培养24或48h。用胰酶收集细胞到离心管中，离心后用pbs重悬清洗一遍，离心后去上清，后加入含5ul的annexinv染料的bindingbuffer重悬，后加入10ul的pi染料，室温孵育5min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。凋亡实验结果图如图5所示，ch可以显著增加凋亡细胞尤其是晚期凋亡细胞的比例。

实施例3

在实施例1和2的基础上，以盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药抑制肝癌细胞。用胰酶消化肝癌细胞huh7，将细胞密度调整为20×10⁴个/ml，将100ul/孔的细胞培养液加入到96孔板中，培养12h后去除培养液，以不同浓度的盐酸千金藤碱(m＝1-1000)和不同浓度的自噬抑制剂氯喹(n＝1-1000)按照1:7.5的比例混合，加入到96孔板中，培养48h后，用mtt测定细胞的存活率，并且结合单用盐酸千金藤碱以及氯喹时肝癌细胞的存活率，用compusyn软件计算分析两药联用的联合指数。盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药的联合指数分析图如图6所示，选取千金藤碱(m)和氯喹(n)的不同浓度组(m+n＝1um+7.5um，2um+15um，4um+30um，8um+60um，16um+120um)作用于肝癌细胞huh748h后，发现盐酸千金藤碱和氯喹联合用药浓度为8um+60um，16um+120um时显著抑制细胞的存活，联合指数分别为0.56253、0.40530，远小于1，说明盐酸千金藤碱与自噬抑制剂氯喹联用具有协同抗肿瘤的效果。

实施例4

在裸鼠肿瘤形成试验。雌性athymicbalb/c裸鼠(4-6周龄)购自中国北京实验动物科学研究所，置于特定的无致病性(spf)环境中。将悬浮于200ul基质凝胶/pbs(6mg/ml)中的huh7细胞(5×10⁵)皮下注射到小鼠侧翼，构建裸鼠肝癌模型。当小鼠体内肿瘤体积生长到100mm³时随机分为6组(n＝6-8)，即模型组(以model表示)、顺铂组(以cddp表示)、氯喹组(以cq表示)、盐酸千金藤碱低剂量组(以chlow表示)、盐酸千金藤碱低剂量+氯喹组(以chlow+cq表示)、盐酸千金藤碱高剂量组(以chhigh表示)、盐酸千金藤碱高剂量+氯喹组(以chhigh+cq表示)。采用腹腔注射的给药方式每天给后5组小鼠分别注射氯喹50mg/kg，盐酸千金藤碱20mg/kg，盐酸千金藤碱20mg/kg+氯喹50mg/kg，盐酸千金藤碱40mg/kg，盐酸千金藤碱40mg/kg+氯喹50mg/kg。顺铂组每5天腹腔注射阳性药顺铂，并且每隔1天测量小鼠的体重以及肿瘤大小。在第13天时处死小鼠收集移植瘤和肝脏，称重后用4％多聚甲醛固定进行免疫组化分析。表1为实验后各组小鼠肿瘤的重量，表2为实验后各组小鼠肿瘤生长率。图7为盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤的重量的影响。图8为盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤生长率的影响。图9为随着时间变化盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药对小鼠肿瘤生长率的影响。

表1：实验后各组小鼠肿瘤的重量

表2：实验后各组小鼠肿瘤生长率

由表1、表2以及图7、图8可以看出，盐酸千金藤碱与自噬抑制剂联合用药具有良好的抑制肿瘤生长的作用。由图9可以看出，联合用药低剂量组在前8天的抑制肿瘤的效果比阳性药效果更好，且联合用药的两组抑瘤效果较单独用药好。