海洋生物多糖基复合海绵的制备方法、复合海绵及应用与流程

本发明涉及高分子复合材料技术领域，尤其是涉及一种复合海绵的制备方法、复合海绵及应用。

背景技术：

皮肤是人体最大的器官，可以保护机体内部的各组织和器官免受外界环境中机械、物理、化学和病原微生物的侵袭，而且具有美观的作用。各种皮肤损伤中，尤其是大面积创面容易引发感染扩散和慢性创面的形成，导致病人行动不便，截肢甚至死亡。所以治疗大面积创面是国际上研究的热点。针对大面积创面易出血、感染、发炎和留疤等问题，如何制备出针对大面积创面修复的新型敷料，使其具有多重功能——集止血、抑菌、抗炎症反应、加速组织愈合、保湿淡疤等功效为一体，从而满足国内市场对于慢性创面医用敷料持续的需求，实现产学研有机结合，是我国医疗器械市场上亟待解决的实际问题。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的第一个目的在于提供一种复合海绵的制备方法，以至少缓解了现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供采用上述制备方法制备得到的复合海绵，该复合海绵具有较高的比表面积、孔隙率及孔的连通性。

本发明的第三个目的在于提供上述制备方法及制备得到的复合海绵在制备皮肤组织修复产品中的应用。

本发明提供了一种复合海绵的制备方法，所述方法包括：

将壳聚糖、海藻酸钠和任选的岩藻多糖的酸混合溶液经一次冻干固定成型后，放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联，然后经二次冻干得到复合海绵。

进一步地，所述酸混合溶液的浓度为1-5wt％，优选为2-4wt％，更优选为2.5-3.5wt％。

进一步地，所述壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:1-3，所述岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的10％-30％；

优选地，所述壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:2，所述岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的10％-30％。

进一步地，所述酸混合溶液为弱酸水溶液与壳聚糖、海藻酸钠和任选的岩藻多糖的混合溶液；

优选地，弱酸包括乙酸、碳酸或稀盐酸；

优选地，所述弱酸水溶液的浓度为0.1-2wt％，优选为0.2-1.5wt％，更优选为0.5-1wt％。

进一步地，所述氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中，氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比为1-10:1-10:80-100，优选为5-9:1-5:85-95，更优选为7:3:90；

优选地，所述交联的时间为4-8小时，优选为5-7小时，更优选为6小时。

进一步地，在交联后还包括洗涤的步骤，然后经二次冻干得到复合海绵；

优选地，使用蒸馏水进行洗涤。

进一步地，所述制备方法包括如下步骤：

(a)分别提供海藻酸钠的水溶液和壳聚糖的弱酸溶液；

(b)任选地，向所述海藻酸钠的水溶液中加入岩藻多糖，得到混合水溶液；

(c)将壳聚糖的弱酸溶液滴加入所述混合水溶液中，并搅拌均匀，得到粘溶液；

(d)将所述粘溶液注入模型，并一次冻干，得到复合海绵粗产品；

(e)将所述复合海绵粗产品放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联，得到交联产物；

(f)将所述交联产物经洗涤后二次冻干，得到所述复合海绵。

本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的复合海绵。

另外，本发明还提供了上述的复合海绵的制备方法或制备得到的复合海绵在制备皮肤组织修复产品中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的复合海绵制备方法，包括将壳聚糖、海藻酸钠和任选的岩藻多糖的酸混合溶液经一次冻干固定成型后，放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联，然后经二次冻干得到复合海绵。该方法工艺简单、操作方便，且原料来源广泛，适于大规模生产应用。本发明通过“冻干-交联-冻干”的方法制备出以海洋生物多糖海藻酸钠、壳聚糖和岩藻多糖为原料的复合海绵材料，不仅综合了各原料众多优良功能和生物活性，还能够有效增加复合海绵材料的比表面积，提高复合海绵材料的孔隙率和孔的连通性，从而改善营养物质运输和细胞的响应(粘附、增殖、活性和特定功能)。

本发明提供的复合海绵，采用本发明提供的制备方法制备得到，该海绵综合了各原料众多优良功能和生物活性，不仅能为细胞提供生长、增殖以及分化的理想微环境，而且具有抗菌、抗炎、止血、清创、促进新生血管和淡化瘢痕等功效。此外，该复合海绵还具有较强的吸水性及保水性，湿态下具有良好的压缩回弹性能。经动物实验表明本发明提供的复合海绵具有显著优于常规灭菌纱布敷料的修复性能。因此，本发明提供的复合海绵将在慢性创面修复领域有非常好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例提供的复合海绵直观图；

图2为本发明实施例提供的复合海绵电镜图；

图3为本发明实施例提供的复合海绵与各组分的红外光谱图；

图4为本发明实施例提供的复合海绵与各组分的xrd图；

图5为本发明实施例提供的复合海绵孔隙率；

图6为本发明实施例提供的复合海绵细胞毒性评价；

图7为本发明实施例提供的复合海绵用于大鼠全皮层大面积缺损的修复评价。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

根据本发明的一个方面，提供了一种复合海绵的制备方法，所述方法包括：

将壳聚糖、海藻酸钠和任选的岩藻多糖的酸混合溶液经一次冻干固定成型后，放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联，然后经二次冻干得到复合海绵。

其中，壳聚糖(chitosan,cs)是由甲壳素经脱乙酰基化反应得到的氨基多糖，具有良好的生物相容性、固有的抗菌性能和来源广泛等特点。海藻酸钠(sodiumalginate,sa)是海藻衍生物中的一种，其成本低廉、来源广泛，有很强的亲水性、低免疫原性以及一定的生物惰性，具有较强的吸收创面渗出物的能力。岩藻多糖(fucoidan)是从褐藻中提取的含有硫酸基的多糖，其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、双向调节免疫力、清除自由基、抗衰老、抗凝血和抗血栓等功效。另外，岩藻多糖也能够吸附、稳定和激活组织渗出物中多种肝素结合性细胞生长因子，进而诱导新血管生成。岩藻多糖还能调节细胞分泌较高水平的tgf-β，对刺激细胞分裂分化、减少瘢痕产生、促进典型肉芽组织形成具有重要作用。

本发明提供的复合海绵的制备方法工艺简单、操作方便，且原料来源广泛，适于大规模生产应用。本发明通过“冻干-交联-冻干”的方法制备出以海洋生物多糖海藻酸钠、壳聚糖和岩藻多糖为原料的复合海绵材料，不仅综合了各原料众多优良功能和生物活性，还能够有效增加复合海绵材料的比表面积，提高复合海绵材料的孔隙率和孔的连通性，从而改善营养物质运输和细胞的响应(粘附、增殖、活性和特定功能)。

需要进行说明的是，在本发明中，酸混合溶液指的是以酸溶液作为溶剂，壳聚糖、海藻酸钠和岩藻多糖作为溶质的溶液。

在本发明中，任选的岩藻多糖指的是可以以壳聚糖和海藻酸钠作为原料进行制备，也可以以壳聚糖、海藻酸钠和岩藻多糖作为原料进行制备。

在本发明中，一次冻干和二次冻干中，“一次”和“二次”仅作为区分，并一定不代表先后或主次，一次冻干和二次冻干的工艺可以相同，也可以不同，只要起到冻干作用即可，本发明对此不做限制。

在一些优选的实施方式中，所述酸混合溶液的浓度为1-5wt％，例如可以为，但不限于1wt％、2wt％、3wt％、4wt％或5wt％。

当酸混合溶液的浓度在上述浓度范围内时，制备得到的复合海绵具有更好的生物活性。

优选地，所述酸混合溶液的浓度为2-4wt％，更优选为2.5-3.5wt％。

通过对酸混合溶液的浓度进行进一步的调整和优化，能够使得制备得到的复合海绵的生物活性更好。

需要进行说明的是，在本发明中，酸混合溶液指的是以酸溶液作为溶剂，壳聚糖、海藻酸钠和岩藻多糖作为溶质的溶液，因此，酸混合溶液的浓度指的是在酸溶液中，壳聚糖、海藻酸钠和岩藻多糖的浓度，并不包含酸本身的浓度。

在一些优选的实施方式中，所述壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:1-3，例如可以为，但不限于1:1、1:2或1:3，所述岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的10％-30％，例如可以为，但不限于10％、15％、20％、25％或30％。

当壳聚糖、海藻酸钠和岩藻多糖的用量在上述浓度范围内时，制备得到的复合海绵具有更好的生物活性。

优选地，所述壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:2，所述岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的10％-30％。

通过对壳聚糖、海藻酸钠和岩藻多糖的用量进行进一步的调整和优化，能够使得制备得到的复合海绵的生物活性更好。

在一些优选的实施方式中，所述酸混合溶液为弱酸水溶液与壳聚糖、海藻酸钠和岩藻多糖的混合溶液。

提供一个酸性环境溶解壳聚糖，弱酸的使用可以避免对材料的性能破坏(比如：氧化导致的活性缺失、加速降解等)，也可以避免实验操作中的危险性和对环境的污染。

优选地，弱酸包括乙酸、碳酸或1n稀盐酸。

优选地，所述弱酸水溶液的浓度为0.1-2wt％，例如可以为，但不限于0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、0.8wt％、1wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.8wt％或2wt％，优选为0.2-1.5wt％，更优选为0.5-1wt％。

当弱酸水溶液的浓度在上述浓度范围内时，制备得到的复合海绵具有更好的生物活性。

在一些优选的实施方式中，所述氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中，氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比为1-10:1-10:80-100，例如可以为，但不限于1:1:80、10:10:100、1:10:80、10:1:100、5:5:90或9:3:90。

当氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比在上述浓度范围内时，制备得到的复合海绵具有更好的生物活性。

优选地，氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中，氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比为5-9:1-5:85-95，更优选为7:3:90。

通过对氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比进行进一步的调整和优化，能够使得制备得到的复合海绵的生物活性更好。

在一些优选的实施方式中，所述交联的时间为4-8小时，例如可以为，但不限于4小时、5小时、6小时、7小时或8小时，优选为5-7小时，更优选为6小时。

交联时间过短，会导致交联不够充分，交联时间过长，则浪费时间成本，当交联时间在上述范围内时，能够在最短的时间内保证交联的有效性，使得制备得到的复合海绵的生物活性更好。

在一些优选的实施方式中，在交联后还包括洗涤的步骤，然后经二次冻干得到复合海绵；

优选地，使用蒸馏水进行洗涤。

将交联后的产物进行洗涤处理，能够有效去除氯化钙-无水乙醇-甘油，使终产品纯度更高。

基于上述制备条件，在一些具体的实施方式中，本发明提供的复合海绵的制备方法包括如下步骤：

(a)分别提供海藻酸钠的水溶液和壳聚糖的弱酸溶液；

(b)向所述海藻酸钠的水溶液中加入岩藻多糖，得到混合水溶液；

(c)将壳聚糖的弱酸溶液滴加入所述混合水溶液中，并搅拌均匀，得到粘溶液；

(d)将所述粘溶液注入模型，并一次冻干，得到复合海绵粗产品；

(e)将所述复合海绵粗产品放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联，得到交联产物；

(f)将所述交联产物经洗涤后二次冻干，得到所述复合海绵。

本发明还提供了采用上述的制备方法制备得到的复合海绵。

本发明提供的复合海绵综合了三种原料众多优良功能和生物活性，不仅能为细胞提供生长、增殖以及分化的理想微环境，而且具有抗菌、抗炎、止血、清创、促进新生血管和淡化瘢痕等功效。此外，该复合海绵还具有较强的吸水性及保水性，湿态下具有良好的压缩回弹性能。经动物实验表明本发明提供的复合海绵具有显著优于常规灭菌纱布敷料的修复性能。因此，本发明提供的复合海绵将在慢性创面修复领域有非常好的应用前景。

另外，本发明还提供了上述的复合海绵的制备方法或制备得到的复合海绵在制备皮肤组织修复产品中的应用。

下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供的复合海绵的制备方法包括如下步骤：

(a)海藻酸钠(3％w/v，明月海藻)溶解于100ml蒸馏水中，采用机械搅拌直至其完全溶解，得到海藻酸钠的水溶液；壳聚糖(3％w/v，300kda，95％，浙江金壳药业)溶解于50ml1％乙酸溶液，得到壳聚糖的乙酸溶液；其中，壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:2；

(b)将壳聚糖的乙酸溶液滴加入所述海藻酸钠的水溶液中，得到浓度为3wt％的酸混合溶液，将所述酸混合溶液在室温下混合搅拌2h得到均匀的粘溶液；

(c)将所述粘溶液注入圆柱形模具中，在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行一次冻干，得到复合海绵粗产品；

(d)将所述复合海绵粗产品放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联6h，得到交联产物；其中，氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比为7:3:90；

(e)将所述交联产物经蒸馏水洗涤后在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行二次冻干，得到所述复合海绵(ac，如图1所示)。

实施例2

本实施例提供的复合海绵的制备方法包括如下步骤：

(a)海藻酸钠(3％w/v，青岛明月海藻集团)溶解于100ml蒸馏水中，采用机械搅拌直至其完全溶解，得到海藻酸钠的水溶液；壳聚糖(3％w/v，300kda，95％，浙江金壳药业)溶解于50ml1％乙酸溶液，得到壳聚糖的乙酸溶液；其中，壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:2；

(b)向所述海藻酸钠的水溶液中加入岩藻多糖(青岛明月海藻集团)，搅拌1h得到混合水溶液；其中，岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的20％；

(c)将壳聚糖的乙酸溶液滴加入所述混合水溶液中，得到浓度为3wt％的酸混合溶液，将所述酸混合溶液在室温下混合搅拌2h得到均匀的粘溶液；

(d)将所述粘溶液注入圆柱形模具中，在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行一次冻干，得到复合海绵粗产品；

(e)将所述复合海绵粗产品放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联6h，得到交联产物；其中，氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比为7:3:90；

(f)将所述交联产物经蒸馏水洗涤后在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行二次冻干，得到所述复合海绵(acf-2，如图1所示)。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的10％(acf-1，如图1所示)。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的30％(acf-3，如图1所示)。

实施例5

本实施例提供的复合海绵的制备方法包括如下步骤：

(a)海藻酸钠(3％w/v，青岛明月海藻集团)溶解于100ml蒸馏水中，采用机械搅拌直至其完全溶解，得到海藻酸钠的水溶液；壳聚糖(3％w/v，300kda，95％，浙江金壳药业)溶解于50ml0.1％乙酸溶液，得到壳聚糖的乙酸溶液；其中，壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:3；

(b)向所述海藻酸钠的水溶液中加入岩藻多糖(青岛明月海藻集团)，搅拌1h得到混合水溶液；其中，岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的20％；

(c)将壳聚糖的乙酸溶液滴加入所述混合水溶液中，得到浓度为1wt％的酸混合溶液，将所述酸混合溶液在室温下混合搅拌2h得到均匀的粘溶液；

(d)将所述粘溶液注入圆柱形模具中，在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行一次冻干，得到复合海绵粗产品；

(e)将所述复合海绵粗产品放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联8h，得到交联产物；其中，氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比为1:1:80；

(f)将所述交联产物经蒸馏水洗涤后在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行二次冻干，得到所述复合海绵。

实施例6

本实施例提供的复合海绵的制备方法包括如下步骤：

(a)海藻酸钠(3％w/v，青岛明月海藻集团)溶解于100ml蒸馏水中，采用机械搅拌直至其完全溶解，得到海藻酸钠的水溶液；壳聚糖(3％w/v，300kda，95％，浙江金壳药业)溶解于50ml0.2％乙酸溶液，得到壳聚糖的乙酸溶液；其中，壳聚糖与海藻酸钠的质量比为1:1；

(b)向所述海藻酸钠的水溶液中加入岩藻多糖(青岛明月海藻集团)，搅拌1h得到混合水溶液；其中，岩藻多糖的质量为壳聚糖与海藻酸钠总质量的20％；

(c)将壳聚糖的乙酸溶液滴加入所述混合水溶液中，得到浓度为5wt％的酸混合溶液，将所述酸混合溶液在室温下混合搅拌2h得到均匀的粘溶液；

(d)将所述粘溶液注入圆柱形模具中，在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行一次冻干，得到复合海绵粗产品；

(e)将所述复合海绵粗产品放入氯化钙-无水乙醇-甘油凝固浴中交联4h，得到交联产物；其中，氯化钙、甘油和无水乙醇的质量比为10:10:100；

(f)将所述交联产物经蒸馏水洗涤后在-20℃下预冷冻后放入冻干机(alpha1–2plus；germany)中进行二次冻干，得到所述复合海绵。

实施例7

本实施例与实施例1的区别在于，将乙酸替换为次氯酸。

对比例1

本对比例与实施例1的区别在于，不使用壳聚糖。

对比例2

本对比例与实施例1的区别在于，不使用海藻酸钠。

对比例3

本对比例与实施例1的区别在于，将乙酸替换为盐酸。

对比例4

本对比例与实施例1的区别在于，放入氯化钙-无水乙醇凝固浴中交联。

对比例5

本对比例与实施例1的区别在于，放入氯化钙-甘油凝固浴中交联。

对比例6

本对比例与实施例1的区别在于，不包括二次冻干。

实验例1复合海绵孔隙率的测定

将实施例1-7及对比例1-6制备得到的复合海绵样品经准确称量后，分别浸没到盛满少量无水乙醇的样品瓶中，然后将上述容器及样品放入数控超声波清洗机中进行清洗处理，最后再加满无水乙醇并静置30min后，将样品小心取出，计算样品的孔隙率p＝(w2－w1)/ρv，其中w1、w2分别是样品的浸入乙醇前后的质量，v是样品浸入乙醇前的体积，ρ是乙醇的密度。每样平行测三次，得出孔隙率如下表所示：

通过上述结果可以看出，应用本发明提供的制备方法制备得到的复合海绵均具有较好的孔隙率，其中，应用本发明优选制备条件制备得到的复合海绵孔隙率更佳。

为了节约成本，使用本发明实施例1-4提供的复合海绵进行如下实验，孔隙率实验的结果图如图5所示。

实验例2复合海绵水蒸汽透过率的测定

将实施例1-7及对比例1-6制备得到的复合海绵样品剪成直径为12mm×12mm的样品，取规格为12mm的螺口菌种瓶，测量其内径为d，注入10ml的去离子水。将海绵覆盖在菌种瓶瓶口，并用封口膜将海绵与瓶口的缝隙封住，放置一段时间至恒重，精密称量海绵样品、去离子水、螺口菌种瓶的总质量为m0，将其放入恒温干燥箱内，保持干燥箱温度在37℃，24h后拿出螺口瓶，精密测量海绵样品、去离子水和菌种瓶的总质量m1。则海绵的水蒸气透过率为wv＝4(m0-m1)/πd2,其中，wv为水蒸汽透过率、单位为g/(24h·m2)；m0为海绵样品、去离子水和菌种瓶的初始总质量；m1为干燥24h后海绵样品、去离子水、菌种瓶的总质量；d为螺口菌种瓶的内径；每个样品测量3次，求其平均值，得出水蒸汽透过率如下表所示：

理想的创面敷料，其水蒸汽透过率应在2000-2500g/(24h·m2)范围内，既能防止伤口干燥失水，又能防止创面渗出物的形成。通过上述结果可以看出，应用本发明提供的制备方法制备得到的复合海绵均具有较好的水蒸汽透过率，其中，应用本发明优选制备条件制备得到的复合海绵水蒸汽透过率更适合伤口修复。

实验例3复合海绵的表征鉴定

将实施例2中制备所得的复合海绵材料经扫描电镜(vega3,tescan)，傅里叶红外光谱仪(thermoscientificnicoletin10)和x射线衍射(d8advance,brukeraxsgmbh)测定其理化性能，如图2，图3和图4所示。图2为复合海绵的扫描电镜照片，从图中可以看出，复合海绵呈现出不规则的3d多孔微观结构，对比二组分与三组分海绵的电镜图，不难发现，随着岩藻多糖加入量的增大，孔洞尺寸逐渐变小，孔隙率变大。图3为海藻酸钠、壳聚糖、岩藻多糖、ac和三组份acf复合海绵的ftir图谱，其中1590cm-1和1409cm-1为海藻酸钠中羧基的不对称和对称伸缩振动特征吸收峰；壳聚糖在1645cm-1和1585cm-1波数的吸收峰归属于—c＝o(amidei)和—nh(amideii)；对于海藻酸钠与壳聚糖二组分复合海绵ac，在1605cm-1处出现了一个较强的吸收峰，该峰为海藻酸钠的羧基与壳聚糖的氨基的重叠峰，这说明在酸性条件下，壳聚糖的—nh2转化为—nh3+，与海藻酸钠的—coo-通过静电力相互作用。岩藻多糖的红外特征峰为1215cm-1处的s＝o键及828cm-1处的硫酸盐基团。而对比三组份acf复合海绵的红外光谱图，可以发现，s＝o特征峰发生了蓝移，说明岩藻多糖与壳聚糖发生了静电作用。从图4的xrd图可以看出，与原料衍射峰对比，二组分复合海绵特征衍射峰几乎消失，表明海藻酸钠与壳聚糖酸溶液中相互作用显著降低了其结晶度。然而当加入岩藻多糖以后，三组分acf图谱又呈现出宽且弱的衍射峰，这表明岩藻多糖与海藻酸钠、壳聚糖之间的静电力作用，同时增强了分子间氢键力。

实验例4复合海绵细胞毒性测定

用含10％胎牛血清和1％双抗的mem培养基培养hgf(人牙龈成纤维细胞)用于测定复合海绵的细胞毒性。将相同尺寸的复合海绵ac、acf-1、acf-2和acf-3样品放入24孔板中灭菌，将hgf以1×104个/孔的密度接种于海绵材料上，细胞接种后置于培养箱分别培养1和4天后(每两天更换一次培养基)，采用cck8试剂盒处理，用酶标仪在450nm处测定其吸光度，每组样品平行三次。细胞毒性结果如图6所示，从图中可以看出，与对照相比，复合海绵的存在对于细胞活性没有影响，ac组甚至好于对照组。这意味着所使用的的材料都没有细胞毒性，并适用于后续的动物体内实验。

实验例5复合海绵大鼠全皮层缺损修复效果的评价

健康sd大鼠12只分成3组，分别用于复合海绵ac组、acf-1、acf-3和医用灭菌纱布对照组。手术前，按50mg/kg的剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液对大鼠进行麻醉。将大鼠固定在支架上，背部备皮，对手术部位进行消毒。在大鼠背部圈出直径为20mm的圆形区域，用已消毒的组织剪沿线剪透全皮层深至筋膜层，创面用75％的酒精棉球消毒，将各组海绵敷料平铺在大鼠背部创面后包扎。单笼喂养，定期更换敷料。创面修复情况如图7所示，手术第14天后，使用不同材料处理的大鼠皮肤伤口修复情况不尽相同。可以看出，acf-1和acf-3均好于对照组，而没有添加岩藻多糖的ac组的修复效果较对照组略差，这说明岩藻多糖的加入有利于伤口愈合。当手术后第21天时，acf-1组已经完全恢复，而acf-3略差于对照组，这说明了敷料的物理结构对于伤口修复也是至关重要的，acf-3由于含有岩藻多糖较多，导致孔径相对较小，吸水性强而保水性差，导致敷料在长时间应用过程中透气性差，影响伤口的修复。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。