甲磺酸奥希替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用的制作方法

本发明属于医药制备领域，特别涉及甲磺酸奥希替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用。

背景技术：

在世界范围内，侵袭性真菌感染每年造成至少150万人的死亡，与抗细菌感染药物对比，抗真菌感染药物的数量相对较少，且由于真菌是真核生物，其细胞内部许多基本的生化反应和生物学过程都与人的细胞相似，这使得开发安全、广谱的抗真菌感染药物更加困难。目前已发现的抗真菌感染药物数量较少，临床常用的主要包括唑类、棘球白素类、多烯类和嘧啶类似物，治疗浅表皮肤真菌感染时还可应用丙烯胺类。其中，唑类是目前临床上应用最多的抗真菌感染药物，主要可分为咪唑类和三唑类，因咪唑类药物的毒性较大、副作用较多，且易与其他药物相互作用，目前已被三唑类药物取代。三唑类药物主要包括第一代的氟康唑(fluconazole,flc)和伊曲康唑等，第二代的伏立康唑和泊沙康唑等，以及最新的艾氟康唑和艾沙康唑等。

因flc具有溶解性好、广泛分布于机体、不良反应少、与其他药物之间的相互作用相对较弱，以及在针对非中性白细胞减少症患者的侵袭性真菌感染时，具有与两性霉素b相同的治疗效果等优势，flc已经成为目前真菌感染的常用治疗药物。尤其对于白色念珠菌感染而言，flc是首选药物。但是，由于flc仅具有抑菌作用而不能杀菌，因此目前临床上耐flc的白色念珠菌菌株逐渐增多，flc的治疗效果明显不足，临床上治疗白色念珠菌感染的失败率逐渐升高。

在2013年，美国肺癌新发病例数约占全部癌症新发病例数的14％，而由肺癌导致的死亡率约占全部癌症死亡率的27％。在全部肺癌病例中，非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)所占比例超过80％。肺癌患者的深部真菌感染率呈现逐年增长的趋势，nsclc患者因具备长期住院、接受化学或放射疗法、手术、静脉给药或内分泌紊乱等危险因素，是白色念珠菌的易感人群。

azd-9291mesylate又称甲磺酸奥希替尼(osimertinibmesylate)或mereletinibmesylate，商品名为泰瑞莎(tagrisso)，是第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseinhibitors,egfr-tkis)，由astrazeneca公司研发，是针对非小细胞晚期肺癌药物、治疗晚期非小细胞肺癌患者的口服药物。但是该药在真菌感染药物上的应用，未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供甲磺酸奥希替尼(azd)在制备治疗真菌感染药物中的应用。尤其是甲磺酸奥希替尼和氟康唑(flc)联合使用，对于真菌感染不仅仅是抑菌而且达到了杀菌的效果，

本发明提供的技术方案是提供甲磺酸奥希替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用。所述真菌包含念珠菌属、隐球菌属、酵母菌属的菌株。

进一步优选，所述念珠菌属的菌株为白色念珠菌；所述隐球菌属的菌株为新型隐球菌；所述酒酵母菌属的菌株为酿酒酵母菌。

上述治疗真菌感染药物中除含有甲磺酸奥希替尼外还含有其他有效成分。优选的，该有效成分为三唑类药物。进一步优选的，所述三唑类药物为氟康唑。

一种治疗真菌感染的药物，该药物通过vma1基因靶点或pdr5基因靶点为药物靶点进行治疗的物质。

上述治疗真菌感染的药物，该物质的有效成分中包含甲磺酸奥希替尼。

优选的，除含有甲磺酸奥希替尼外还含有的其他有效成分。

优选的，该有效成分为三唑类药物。进一步优选的，所述三唑类药物为氟康唑。

本发明的有益效果为：

1、甲磺酸奥希替尼(azd)对于真菌感染有治疗效果，尤其是与氟康唑(flc)联合使用时，对于真菌感染的治疗效果不仅仅是抑菌且达到了杀菌的效果，而且对于临床上耐flc的白色念珠菌菌株仍有良好的杀灭效果，因此azd对于临床上普遍出现的真菌耐药现状提供了一种潜在可行的解决方案，对未来治疗“超级真菌”引起的疾病也有一定的借鉴意义；

2、本发明通过实验验证了azd的抑菌机制与破坏细胞囊泡内ph稳态相关，而ph稳态一直是各大药企和研究者研发的重点，因此本发明的结果从反向遗传学的角度为开发ph稳态作为抗真菌感染药物提供了新的证据和思路。

3、flc联合azd用药后能够显著改善小鼠念珠菌病的治疗效果，为进一步推动azd的临床前实验提供了很好的实验基础；

4、本发明不仅仅适用于念珠菌病患者，同时更有利于提高非小细胞肺癌患者的生存率，改善生活质量。

5、本发明发现了基因pdr5(基因序列如seqidno.1所示)和vma1(基因序列如seqidno.2)所示是azd作为egfr-tki其抗真菌感染作用靶点治疗真菌感染的药物靶点，为真菌感染的治疗及治疗药物的研究开发提供了新的发展方向和药物靶标。

附图说明

图1是甲磺酸奥希替尼的抑菌效果图。其中，图1a是实施例1中，ypd培养基中白色念珠菌sc5314的生长曲线，说明flc和azd联合用药可以抑制白色念珠菌生长，图1b是实施例1中，ypd培养基中白色念珠菌sc5314的生长曲线图，说明ypd培养基中azd能够剂量依赖性的增强flc对白色念珠菌sc5314的抑制作用；

图1c是实施例2中，flc和azd对白色念珠菌sc5314的联合抑制作用效果图，说明flc和azd联合用药对白色念珠菌sc5314有杀菌作用；图1d是实施例3中，在m199、spider和ypd+10％serum三种培养基中，flc和azd联合抑制白色念珠菌sc5314菌丝相的形成图，其中m199和spider培养基的菌丝图片摄于6h，ypd+10％血清培养基的菌丝图片摄于2h。

图2a-图2c是实施例4中，耐flc白色念珠菌的抑菌效果图，其中图2a为ypd培养基中azd能够剂量依赖性的增强flc对耐flc白色念珠菌ccc49的抑制作用；图2b为ypd培养基中azd能够剂量依赖性的增强flc对耐flc白色念珠菌ccc80的抑制作用；图2c为ypd平板上flc和azd联合抑制耐flc白色念珠菌的产生；

图2d为实施例5中的非致病的酿酒酵母抑菌效果图。

图2e为实施例5中致病的新型隐球菌的抑菌效果图。

图3a为实施例6中ypd培养基中azd和flc联合抑制酿酒酵母by4742及pdr5δ的by4742的生长对比图；图3b为实施例6中的细胞示踪图，酿酒酵母by4742细胞内r6g浓度随azd浓度增加而逐渐升高。

图4a是实施例6中ypd培养基中azd抑制野生型和vma1δ的酿酒酵母sf8385aα菌株的生长对比图；图4b是实施例6中ypd培养基中azd处理野生型和vma1δ的酿酒酵母sf8385aα菌株48h后的终点od600值对比图。

图5是实施例7中，酿酒酵母细胞囊泡内的ph值对比图，其中，图5a为酿酒酵母ryo566的囊泡ph值对比图；图5b为酿酒酵母strain2336的囊泡ph值对比图。

图6是实施例8中azd抑制fadu细胞内吞白色念珠菌sc5314的效果图。

图7是实施例9中系统性感染白色念珠菌sc5314的balb/c小鼠的治疗效果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明：

本发明的实验所用的甲磺酸奥希替尼(azd-9291mesylate)，商品名为泰瑞莎(tagrisso)，购自targetmol公司；氟康唑(fluconazole,flc)购自mce公司。

实施例1

抑菌实验

实验过程描述：

1)细胞复苏与菌悬液制备：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.pbs洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs中，酶标仪测量细胞浓度od600；

c.将细胞接种于ypd液体培养基中，使od600＝0.02。

2)药物准备：

a.azd和flc均溶于dmso中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化。

3)对照设计与加样：

a.将azd和flc分别加入ypd液体培养基中，使药物浓度达到所需最高浓度的4倍；

b.将含有azd的ypd培养基加入第一块96孔板的第1列，100μl/孔，向第2-11列加入ypd培养基，50μl/孔，倍比稀释；

c.将含有flc的ypd培养基加入第二块96孔板的第1行，200μl/孔，向第2-7行加入ypd培养基，100μl/孔，倍比稀释；

d.将第二块96孔板中的液体一一对应加入第一块96孔板中，50μl/孔；

e.向第一块96孔板的第12行和第12列分别加入ypd培养基，50μl/孔；

f.向第一块96孔板中加入od600＝0.02的菌悬液，100μl/孔，使终od600＝0.01。

4)数据收集与结果分析：

a)30℃恒温培养细胞，利用酶标仪测量od600数据，每15min测量一次；

b)整理数据，graphpad绘制图表。

实验结果显示，当氟康唑(以下称flc)为0.82μm时，白色念珠菌标准菌株sc5314的生长即可被轻微抑制，在此基础上逐渐升高甲磺酸奥希替尼(以下称azd)的浓度，azd的浓度分别为0.0625μm、0.125μm、0.25μm、0.5μm，1μm、2μm、4μm、8μm、16μm、32μm和64μm，随着azd浓度的增加，白色念珠菌的生长曲线不断下压，说明flc和azd联合后对白色念珠菌生长的抑制作用逐渐增强，如图1b所示，所以，flc和azd的联合作用为增强作用，azd能够剂量依赖性的增强flc对白色念珠菌sc5314的抑制作用。

实施例2

杀菌实验

实验过程描述：

1)细胞复苏与菌悬液制备：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.pbs洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs中，酶标仪测量细胞浓度od600；

c.将细胞接种于ypd液体培养基中，使od600＝0.05。

2)药物准备：

a.azd和flc均溶于dmso中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化。

3)对照设计与加样：

a.将药物分别加入1ml菌悬液中，使药物达到所需浓度；

b.将与所加药物体积相同的dmso加入另一1ml菌悬液中，作为对照；

c.将1ml菌悬液混匀后加入无菌96孔板中，200μl/孔，3孔/1ml菌悬液。

4)数据收集与结果分析：

a.30℃恒温培养细胞，培养0小时、24小时、48小时时，将每一孔中的菌悬液混匀，并分别吸取5μl，1:250000稀释；

b.取300μl稀释后的菌悬液铺于ypd固体培养基上，30℃恒温培养24小时；

c.计数细胞，整理数据，graphpad绘制图表。

为探索与azd联用后，flc对白色念珠菌的抑制作用是否由单用flc的抑菌作用转变为杀菌作用，本发明对加药处理后的白色念珠菌进行铺板计数，实验发现在加药处理24h后，dmso对照组和azd(32μm)单药处理组的菌落数量显著增加，flc(52.29μm)单药处理组的菌落数量少量增加，azd(32μm)和flc(52.29μm)联合处理组的菌落数量基本没有变化，加药处理48h后，dmso对照组、azd单药处理组、flc单药处理组以及azd和flc联合处理组的菌落数量均没有明显变化，如图1c所示。因此，实验说明flc与azd联合后，flc对白色念珠菌的抑菌作用转变为杀菌作用。

实施例3

菌丝形成实验

实验过程描述：

1)细胞复苏与菌悬液制备：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.pbs洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs中，酶标仪测量细胞浓度od600；

c.将细胞分别接种于m199、spider和ypd+10％serum液体培养基中，使od600＝0.0001。

2)药物准备：

a.azd和flc均溶于dmso中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化。

3)对照设计与加样：

a.将药物分别加入1ml菌悬液中，使药物稀释至所需浓度；

b.将与所加药物体积相同的dmso加入另一1ml菌悬液中，作为对照；

c.将1ml菌悬液混匀后加入无菌96孔板中，200μl/孔，4孔/1ml菌悬液。

4)细胞培养与数据测量：

a.37℃恒温培养细胞，2h、6h后分别置于显微镜下拍照；

b.整理数据。

本发明为探究azd和flc联合对白色念珠菌菌丝相形成的影响，我们采用m199、spider和ypd+10％serum三种培养基进行菌丝诱导，同时采用dmso、azd(10μm)、flc(1.63μm)以及双药联合分别处理白色念珠菌sc5314细胞，并置于显微镜下观察细胞形态，结果显示，在培养基中刚加入药物时，白色念珠菌细胞均以酵母相存在，两小时后dmso对照组和azd单药处理组大部分细胞均已形成菌丝，且菌丝较长，flc单药处理组菌丝稍短，而azd+flc联合处理组仅有少量细胞形成菌丝，且菌丝较短，大部分细胞仍以酵母相存在。六小时后再次观察，三种培养基中的细胞数量都大量增加，但不同处理组之间的形态差异依旧明显，如图1d所示。

实施例4

耐flc白色念珠菌的抑菌实验

实验过程描述：

实验一：flc和azd联合抑制耐flc白色念珠菌的生长

1)细胞复苏与菌悬液制备：同实施例1

2)药物准备：同实施例1

3)对照设计与加样：同实施例1

4)数据收集与结果分析：

a.30℃恒温培养细胞，利用酶标仪测量od600数据，每15min测量一次；

b.整理数据，graphpad绘制图表。

实验二：flc与azd联合抑制耐flc白色念珠菌菌株的产生

1)细胞复苏与菌悬液制备：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.挑取单克隆，接种于20mlypd液体培养基中，30℃、200rpm培养过夜(15小时)；

c.pbs洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs中，利用酶标仪测量细胞浓度od600；

d.利用pbs稀释细胞至od600＝0.001。

2)药物准备：

a.azd和flc均溶于dmso中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化。

3)对照设计与加样：

a.配置ypd固体培养基，在尚未凝固时加入药物，使药物达到所需浓度；

b.配置ypd固体培养基，在尚未凝固时加入与所加药物体积相同的dmso，作为对照；

c.取300μl菌悬液铺于含有药物或dmso的ypd固体培养基上。

4)细胞培养与结果收集：

a.30℃恒温培养细胞，48小时后拍照；

b.整理数据。

本发明中，我们首先对flc和azd联合抑制耐flc白色念珠菌ccc49和ccc80的效果进行了探索，耐flc白色念珠菌ccc49实验结果如图2a，耐flc白色念珠菌ccc80实验结果如图2b所示。对于ccc49，当flc为209.15μm时，以及对于ccc80，当flc为104.58μm时，不断升高azd的浓度，使azd浓度分别为0.0625μm、0.125μm、0.25μm、0.5μm，1μm、2μm、4μm、8μm、16μm、32μm和64μm，可以发现随着azd浓度的增加，两种耐flc白色念珠菌的生长曲线均不断下压，对于耐flc白色念珠菌ccc49和ccc80，checkerboard实验结果显示，flc与azd联合时其抑菌效果均优于flc(209.15μm或104.58μm)单药，且azd对flc抑菌作用的增强呈剂量依赖性。

随后，为探索flc与azd联合后对flc耐菌株的产生是否有抑制作用，本研究将白色念珠菌sc5314接种于含有azd和flc的固体培养基中，结果显示，48小时培养后，dmso对照组和azd(32μm)单药处理组长出大量菌落，flc(104.58μm)单药处理组长出少量菌落，azd(32μm)和flc(104.58μm)联合处理组未长出菌落，揭示flc与azd联合用药能显著抑制耐flc白色念珠菌的产生，如图2c所示。

实施例5

其他真菌的抑菌实验

实验过程描述：

1)细胞复苏与菌悬液制备：同实施例1

2)药物准备：同实施例1

3)对照设计与加样：同实施例1

4)数据收集与结果分析：

a.30℃恒温培养细胞，利用酶标仪测量od600数据，每15min测量一次；

b.整理数据，graphpad绘制图表。

本发明对flc和azd联合抑制其他真菌的效果进行了探索。我们选取了非致病的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和致病的新型隐球菌(cryptococcusneoformans)。checkerboard实验结果显示，对于酿酒酵母by4742，flc与azd联合后能够显著增强flc单药对其的抑制作用，当flc浓度为52.29μm时，酿酒酵母的生长被轻微抑制；flc与azd联合后，当azd的浓度分别为、0.125μm、0.25μm、0.5μm，1μm、2μm、4μm、8μm、16μm、32μm、64μm，128μm时，随着azd浓度的增加，抑菌作用逐渐增强，azd为64μm时，azd和flc的联合作用完全抑制了酿酒酵母的生长，如图2d所示。同样，对于新型隐球菌h99，同样可以看到azd和flc联合对其有优于flc单药的抑制作用，如图2e所示。因此，azd能够增强flc对酿酒酵母和新型隐球菌的抑制作用，即除白色念珠菌外，flc与azd联合还能抑制其它真菌的生长。

实施例6

药物靶点实验

实验过程描述：

实验一：azd和flc联合抑制野生型和pdr5δ或vma1δ的酿酒酵母的生长

1)细胞复苏与菌悬液制备：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.pbs洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs中，酶标仪测量细胞浓度od600；

c.将细胞接种于ypd液体培养基中，使od600＝0.01。

2)药物准备：

a.fda药物库药物、azd和flc均溶于dmso中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化。

3)对照设计与加样：

a.将药物分别加入1ml菌悬液中，使药物达到所需浓度；

b.将与所加药物体积相同的dmso加入另一1ml菌悬液中，作为对照；

c.将1ml菌悬液混匀后加入无菌96孔板中，200μl/孔，4孔/1ml菌悬液。

4)数据收集与结果分析：

a.30℃恒温培养细胞，根据所需时间，利用酶标仪测量od600数据，每15min测量一次；

b.整理数据，利用t检验进行统计分析，graphpad绘制图表。

实验二：rhodamine6g反映flc在细胞内的浓度和pdr5的功能

1)细胞复苏与饥饿诱导：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.pbs洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs中，酶标仪测量细胞浓度od600；

c.将细胞接种于30mlypd液体培养基中，od600＝0.3，30℃、200rpm培养过夜(15小时)；

d.pbs(预先冰浴)洗涤细胞两次，将细胞重悬于10mlpbs(预先冰浴)中；

e.30℃、200rpm培养1小时；

f.pbs(预先冰浴)洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs(预先冰浴)中，酶标仪测量细胞浓度od600；

g.利用pbs(预先冰浴)稀释细胞至od600＝5。

2)药物准备：

a.azd和flc均溶于dmso中，rhodamine6g溶于水中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化。

3)药物处理与染色：

a.将药物分别加入1ml菌悬液中，使药物达到所需浓度；

b.将与所加药物体积相同的dmso加入另一1ml菌悬液中，作为对照；

c.30℃、200rpm培养2小时；

d.向每个样品中加入10μmrhodamine6g；

e.30℃、200rpm培养1.5小时；

f.pbs(预先冰浴)洗涤细胞两次；

g.向每个样品中加入2％葡萄糖；

h.30℃、200rpm培养1小时；

i.pbs(预先冰浴)洗涤细胞两次，将细胞重悬于1mlpbs(预先冰浴)中。

4)结果观察：

a.每个样品取15μl制成玻片，置于显微镜下观察、拍照；

b.整理数据。

本发明利用酿酒酵母作为模型，对azd与abc基因的关系进行探索。酿酒酵母中共有30个atp基因，其中与药物外排作用有关的基因有16个。在这16个abc基因中，pdr5被证实与酿酒酵母对flc耐药有关，tanabek等的研究显示，pdr5的过表达是酿酒酵母多重耐药的最常见原因，pdr5能够将进入酿酒酵母细胞内的flc排出，从而降低flc在细胞内的有效浓度，减轻其对细胞的抑制作用。在本发明中，利用flc处理酿酒酵母细胞，可以发现当flc浓度为52.29μm时，flc仅能轻微抑制野生型酿酒酵母的生长，而对于pdr5δ的酿酒酵母突变株，flc浓度为52.29μm时即能显著抑制其生长，如图3a所示，从而验证了pdr5的缺失能够显著增强flc的抑菌效果。

由于azd能增强flc的抑菌效果，因此，为探究azd是否通过作用于pdr5，从而增强flc的抑菌效果，本发明利用azd和flc处理酿酒酵母细胞，结果显示，在野生型酿酒酵母中，对于flc(52.29μm)单药处理组，其生长仅受到轻微抑制，而对于azd(8μm)和flc(52.29μm)联合处理组，其生长受到较为显著的抑制；在pdr5δ的酿酒酵母中，对于flc(52.29μm)单药处理组，细胞的生长已经受到显著抑制，且其对应的生长曲线低于野生型酿酒酵母中azd(8μm)和flc(52.29μm)联合处理组的生长曲线如图3a所示。因此我们认为，azd可能能够抑制pdr5的功能，当azd浓度为8μm时，pdr5的功能被部分抑制，因而flc的抑菌效果增强。

随后，为进一步验证azd抑制pdr5的功能后能否导致flc在酿酒酵母细胞内的积累，本发明应用rhodamine6g(r6g)处理酿酒酵母细胞。rhodamine6g(r6g)是一种常见的荧光示踪剂，kolaczkowskim等发现pdr5能够将细胞内的r6g排出，pdr5的敲除能够导致细胞内r6g的大量积累，因此，本发明利用r6g在细胞中的浓度间接反映flc在细胞内的浓度和pdr5的功能。实验结果显示，在dmso对照组中，酿酒酵母by4742细胞内的红色荧光并不明显，即r6g在细胞内的浓度较低，随着azd浓度的升高，细胞内的红色荧光逐渐增多，r6g在细胞内逐渐积累，如图3b所示，提示azd能够抑制pdr5的功能，从而使flc在细胞内积累。综上，azd能够抑制pdr5的功能，导致flc在酿酒酵母细胞内积累，从而极大增强flc的抑菌效果。

为探究azd进入真菌细胞后是否能作用于细胞内的靶点，从而增强flc的抑菌作用，将抑菌效果转变为杀菌效果，本发明利用含有高浓度azd的ypd平板筛选耐azd的菌株。我们向ypd平板中加入64μmazd，培养3天，共分离出18个可能的耐药菌株，随后，我们利用生长曲线实验对其耐药性进行了验证，选取其中6个耐药性较强的菌株进行全基因组测序，结果显示，6个耐azd菌株均出现了vma1基因的突变，提示vma1及可能是azd在真菌细胞内的靶点。

本发明利用酿酒酵母菌株sf8385aα验证azd对vma1的作用，结果显示，在dmso对照组中，野生型sf8385aα菌株的生长速度快于vma1δ的sf8385aα菌株，如图4a所示，其终点od600也高于vma1δ菌株，如图4b所示，而在azd64μm处理组中，野生型菌株的生长曲线基本为一条直线，即野生型菌株的生长被完全抑制，而vma1δ菌株尽管在早期被抑制，但仍能生长，如图4a所示，其终点od600甚至略高于dmso对照组，如图4b所示，提示vma1可能是azd作用的靶点，vma1被敲除后，azd失去作用靶点，丧失对细胞生长的抑制作用，导致细胞在高浓度azd下仍能生长。

实施例7

azd和flc能够升高酿酒酵母细胞囊泡内的ph值

实验过程描述：

1)细胞复苏与增殖：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.挑取单克隆，接种于30mlypd液体培养基中，30℃、200rpm培养过夜；

c.1mmmes洗涤细胞两次。

2)药物准备：

a.azd、flc和bcecf-am溶于dmso中，monensin、nigericin溶于无水乙醇中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化。

3)ph标准溶液准备：

a.ph标准溶液含有50mmmes、50mmhepes、50mmkcl、50mmnacl、0.2mammoniumacetate、10mmsodiumazide和10mm2-deoxy-d-glucose；

b.加入hcl或naoh调节ph至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0；

c.过滤除菌。

4)标准曲线组：

a.称重步骤1)中的细胞，加入1mmmes，使其浓度为0.5g/ml；

b.取450μl细胞，加入1350μl1mmmes和50μmbcecf-am，30℃、200rpm避光培养30分钟；

c.1mmmes洗涤细胞两次，称重细胞，加入1mmmes，使其浓度为0.5g/ml；

d.取36μl细胞分别加入各ph值的标准溶液中，再加入110μmmonensin和15μmnigericin，使终体积为900μl，30℃、200rpm避光培养1小时；

e.将各900μl菌悬液加入紫外96孔板中，200μl/孔，4孔/ph。

5)药物处理组：

a.称重步骤1)中的细胞，加入1mmmes，使其浓度为0.5g/ml；

b.向20mlypd液体培养基中分别加入药物或dmso，再加入60μl细胞，30℃、200rpm培养3小时；

c.1mmmes洗涤细胞两次，称重细胞，加入1mmmes，使其浓度为0.5g/ml；

d.每个样品取120μl细胞，加入360μl1mmmes和50μmbcecf-am，30℃、200rpm避光培养30分钟；

e.1mmmes洗涤细胞两次，称重细胞，加入1mmmes，使其浓度为0.5g/ml；

f.取36μl各样品细胞分别加入1mmmes中，使终体积为900μl，混匀，加入紫外96孔板中，200μl/孔，4孔/样品。

6)未处理组：

a.取36μl步骤4)c中的细胞加入1mmmes中，使终体积为900μl，混匀，加入紫外96孔板中，200μl/孔，4孔/菌。

7)数据测量与结果分析：

a.利用酶标仪分别测量激发波长为490nm、450nm和发射波长为535nm的荧光值，以及od600值；

b.计算i490/i450，利用graphpad将标准曲线组的数据拟合标准曲线，将药物处理组和未处理组的数据代入公式，计算ph值，利用t检验进行统计分析，graphpad绘制图表。

在酿酒酵母中，vma1编码血管h⁺-atp酶(vacuolarh⁺-atpase,v-atpase)v1亚复合体的a亚基，v-atpase能够调节真菌细胞囊泡内的ph值。囊泡是真菌细胞内重要的细胞器，其含有消化代谢废物的酶，囊泡内的ph通常为酸性，从而使酶的活性得到最大发挥。由于vma1可能是azd在酿酒酵母细胞内的靶点，为探究azd、以及azd和flc联合对酿酒酵母细胞囊泡ph值的影响，本发明利用荧光探针bcecf-am检测真菌细胞囊泡ph值，结果显示，对于酿酒酵母ryo566，正常情况下其囊泡ph值在6.0左右，flc(52.29μm)单药处理组和azd(8μm)单药处理组的囊泡ph值较dmso对照组均无明显差异，但azd和flc联合处理组的囊泡ph值较dmso对照组明显升高，达到8.0左右，差异有统计学意义(p＜0.01)，如图5a所示。对于酿酒酵母strain2336，正常情况下其囊泡ph在6.5左右，flc单药处理组的ph值超过8.5，azd单药处理组的ph值超过9.0，与dmso对照组的ph值相比均有显著差异(p＜0.01和p＜0.0001)，azd和flc联合处理组的ph值较dmso对照组的ph值升高更加明显(p＜0.0001)，达到10左右，如图5b所示。与ryo566相比，strain2336的16个与药物外排作用相关的abc基因均被敲除，因此，strain2336对azd和flc更加敏感，利用azd和flc处理后，其囊泡ph值变化幅度更大，azd单药和flc单药对ryo566的囊泡ph值无明显影响，但能明显升高strain2336的囊泡ph值，当azd和flc联用时，与dmso对照组相比，ryo566的囊泡ph值升高约1.5，而strain2336的囊泡ph值升高接近2。因此，azd和flc能够升高真菌细胞囊泡内的ph值，且两药联用比单独用药对真菌细胞囊泡ph的影响更大，这种影响能够破坏真菌细胞内环境的稳态，从而影响细胞生长代谢，抑制细胞生长。

实施例8

azd能够抑制宿主细胞对白色念珠菌的内吞杀伤

实验过程描述：

1)白念珠菌细胞复苏：

a.将冻存于-80℃冰箱的菌株接种于ypd固体培养基上，30℃恒温孵育过夜(15小时)；

b.pbs洗涤细胞两次，将细胞重悬于pbs中，酶标仪测量细胞浓度od600。

2)fadu细胞复苏：

a.将液氮中冻存的fadu细胞取出，加入mem培养基，加入24孔板中培养至融合度达到约100％；

b.pbs洗涤细胞一次，加入1mlmem培养基。

3)药物准备：

a.azd溶于dmso中；

b.将药物从-30℃冰箱取出并待其融化；

c.用mem1:10稀释azd和dmso备用。

4)加药处理：

a.向细胞中加入mem稀释后的azd，使其达到所需浓度；

b.向细胞中加入与所加药物体积相同的mem稀释后的dmso，作为对照；

c.37℃、5％co2培养45分钟。

5)白念珠菌感染：

a.计数fadu细胞，按照感染复数moi＝1:2加入白念珠菌细胞；

b.37℃、5％co2培养45分钟；

c.pbs贴孔壁加入，洗涤细胞两次；

d.每孔加入1ml0.5％tritonx，冰浴20分钟；

e.重悬细胞，用pbs1:500稀释细胞；

f.每个样品取200μl，铺于ypd固体培养基上。

6)数据测量与结果分析：

a.30℃培养48小时，计数细胞；

b.整理数据，利用t检验进行统计分析，graphpad绘制图表。

现有技术研究发现，白色念珠菌在侵袭小鼠口腔黏膜细胞的过程中，能够促进口腔黏膜细胞上egfr和her2的磷酸化，从而诱导宿主细胞对其内吞，而egfr和her2双重抑制剂能够显著降低口腔念珠菌病的严重程度。为探索azd作为egfr-tki是否能够抑制白色念珠菌被宿主细胞内吞，本发明对加药处理后进入表皮细胞的白色念珠菌进行计数，结果显示，当azd浓度为8μm时，表皮细胞内吞的白色念珠菌数量与dmso对照组相比显著降低(p＜0.05)，当azd浓度增加至16μm时，表皮细胞内吞的白色念珠菌数量进一步降低，与dmso对照组相比，azd16μm处理组宿主细胞内吞白色念珠菌的数量降低至50％左右，如图6所示，从而提示azd能够抑制宿主细胞内吞白色念珠菌。

实施例9

动物实验

1)小鼠来源：

a.小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，为6-8周、近交系balb/c雌鼠；

b.每组均有10只小鼠。

2)白念珠菌感染与用药治疗：

a.通过尾静脉向小鼠注射5*10⁶个白念珠菌sc5314细胞；

b.利用腹腔注射法在感染后4小时、24小时、48小时、72小时和96小时分别向小鼠注射药物或1％dmso+saline作为对照。

3)效果观察与生存分析：

a.观察和记录小鼠的精神状况、症状体征和生存情况等；

4)实验结果

本发明以感染白色念珠菌的balb/c小鼠作为模型，在小鼠感染后4h、24h、48h、72h和96h分别给药，结果显示，dmso对照组和azd单药处理组均在感染2天后全部死亡，flc(0.25mg/kg)单药处理组在第4天全部死亡，flc和azd联合处理组则在第10天才全部死亡，其中flc(0.25mg/kg)和低浓度azd(10mg/kg)联合处理组在第4天开始死亡，而flc(0.25mg/kg)和高浓度azd(25mg/kg)联合处理组在第7天才开始死亡，实验结果如图7所示，所以，flc联合azd能够显著改善小鼠念珠菌病的治疗效果。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

序列表

<110>上海交通大学医学院

<120>甲磺酸奥希替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用

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