经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法与流程

本发明涉及小卵泡穿刺改善卵巢低反应技术领域，具体地说，是一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法。

背景技术：

多囊卵巢综合征(pcos)是以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱的症候群。pcos是育龄妇女最常见的内分泌疾病，发病率多达5-18％。在ivf-et治疗周期中，患有pcos的女性在促排卵过程中需要特别注意。根据ivf周期中控制性促排卵(cos)期间的卵巢反应，pcos女性可分为3个亚组：高反应组，正常反应组和低反应组。对于高反应组患者，应控制促性腺激素使用剂量以预防卵巢过度刺激综合征(ohss)。对于低反应组患者，尽管使用大量的促性腺激素剂量(gn)，仍然没有或只有少数(<3)优势卵泡发育，从而取消ivf周期。

研究表明，异常激素水平，如雄激素过高，促黄体生成素(lh)和抗苗勒管激素(amh)过高，或催乳素水平降低可能与卵巢低反应有关。然而针对pcos患者促排卵过程中卵巢低反应的具体机制仍不清楚，也没有有效的治疗方法。

目前认为未成熟卵体外成熟培养(ivm)是一种可以尝试的治疗方法，可以将未能发育的小卵泡里的不成熟卵子取出体外培养后行受精获得胚胎。然而，ivm治疗有不良影响，如通过ivm后的胚胎植入率低，妊娠率低，活产率低，并存在远期风险。

在过去的30年中，针对克罗米芬耐药的pcos低反应患者，卵巢打孔术，包括腹腔镜下卵巢打孔术(lod)或经阴道卵泡穿刺术(tvod)，被认为是一种有效的治疗方法。为了解决pcos患者对gn的卵巢抵抗，ferraretti首次在合并卵子质量差、低反应等pcos患者应用tvod，并在tvod后2-6个月进行cos，发现部分患者排卵反应得以恢复。但该方法存在治疗周期长，后续gn用药量增加，部分患者无效等缺陷。因此针对低反应pcos患者，我们希望尝试促排卵当个周期行tvod，并第二日即行cos，观察患者的临床反应，评估该方案的临床效果，并通过获取患者的血清及卵泡穿刺液来探究其中的分子机制。

中国专利文献：cn101932934a，公开日：20101229，公开了一种预测存在卵巢癌(oc)的健康状况指征的方法。所述方法测量叫作代谢物的特异性小的有机分子在来自具有未确定的健康状况的患者的血液样品中的强度，并且将这些强度与在健康个体群体中观察到的强度和/或与先前在证实为卵巢癌-阳性个体群体中观察到的强度进行比较。具体地，本发明涉及通过测量维生素e同种型及相关的代谢物而诊断oc。

中国专利文献：cn101140261，公开日：2008.03.12，公开了一种确立参与卵巢肿瘤发生学的蛋白的研究方法，该方法为首先使用激光捕获微切割技术分离出卵巢癌和交界性卵巢肿瘤细胞，并使用表面加强激光解析电离化飞行时间质谱蛋白质芯片技术对以上细胞及其相对正常细胞进行分析，寻找蛋白质谱的差异点。

但是关于本发明的一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种评估经阴道小卵泡穿刺(tvod)后第二日开始行控制性促排卵对改善ivf治疗周期中低反应pcos患者卵巢反应的效果，并研究其潜在机制方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法，所述的一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法包括病例纳入、测量指标、标准操作规程；所述的病例纳入包含纳入标准和排除标准；所述的测量指标包含主要研究指标、卵泡液分析时间、次要研究指标、血清及卵泡液分析时间、安全指标；所述的标准操作规程包含临床促排卵方案、tvod方法；

所述的纳入标准包括：

根据鹿特丹标准诊断患有pcos的患者：(i)月经紊乱或闭经，即周期>35天；(ii)雄激素过多，即定义为ferriman-gallwey评分为≥8，睾酮>2.5nmol/l，和/或雄烯二酮>9.0nmol/l；(iii)多囊卵巢形态，即至少1个卵巢≥12个卵泡[2-9mm]；

将这些患者按促排卵时卵巢的反应分为3组：1)低反应者，即促性腺激素连续刺激2周，激素用量达450iu[至少7天]，患者无或<3个优势卵泡；2)正常反应者，即用药刺激2周内有5-15个优势卵泡发育，hcg扳机日e2水平<4200pg/ml；3)高反应者，即连续刺激后2周内多余15个卵泡发育，hcg扳机日e2水平>4200pg/ml；

所述的排除标准包括：曾行卵巢手术；患者患有内分泌疾病；

所述的主要研究指标：各组人群获卵数；elisa检测低反应组、高反应组、正常反应组的血清及卵泡液中的amh和睾酮水平；

所述的卵泡液分析时间：(1)低反应组：tvod取小卵泡液；第二日即行控制性促排卵，取卵时取主卵泡卵泡液；(2)正常反应组和高反应组：取卵时取小卵泡和主卵泡卵泡液；血清分析时间：(1)低反应组：月经周期第二天、tvod当天、tvod后6天和tvod后8-10天；(2)高反应组和正常反应组：月经周期第2天、第6天、第9天和第10天。

所述的次要研究指标：elisa检测三组患者血清及卵泡液中的lh、fsh、e2和prl水平，并检测患者年龄、bmi、用药时间、用药剂量和卵子质量，扳机日测量子宫内膜厚度及形态，并评价三组患者的临床结局，如累计着床率，妊娠率和流产率；

所述的血清及卵泡液分析时间和卵泡液分析时间相同；

所述的安全指标：tvod可能会造成患者盆腔、阴道出血，盆腔疼痛等症状，但该操作时间短，创伤小，发生以上并发症的概率极低；

所述的临床促排卵方案：所有患者均使用gnrh拮抗剂方案：于月经周期第二天注射果纳芬(gonal-f)150iu-300iu/天(注射剂量需要根据患者年龄、基础性激素水平(e2,fsh)、窦卵泡个数以及体重指数(bodymassindex,bmi)进行调整)，在用药期间连续监测卵泡生长，当卵泡直径达到14mm时肌注gnrh拮抗剂0.25mg/天；继续监测卵泡生长，当卵泡平均直径大于17mm时(至少有3个卵泡达到该直径)，肌注3000-7000iuhcg或者0.2mggnrh激动剂，注射hcg的35-36小时后，进行阴道超声辅助下的经阴道取卵术；

所述的tvod方法：使用异丙酚对患者进行麻醉，超声下使用17号，35厘米长的取卵针经阴道对卵巢从不同角度反复穿刺，将直径为0.6-0.8mm的卵泡穿刺并吸出卵泡液；患者门诊观察在2-3小时后离院，并在第二天早晨进行超声，血细胞比容评估和血红蛋白浓度测量；在tvod之后，所有患者在第二天继续以相同的促性腺激素剂量接受促排卵刺激，并且监测各种参数。

本发明优点在于：

1、本发明的经阴道小卵泡穿刺术后第二日即行控制性促排卵改善pcos患者卵巢低反应的方法，评估ivf促排卵周期经阴道小卵泡穿刺(tvod)后第二日即行控制性促排卵对改善ivf治疗周期中pcos患者卵巢反应的效果，并研究其内的潜在机制。

附图说明

附图1是一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法流程图。

附图2是一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法平面图。

具体实施方式

下面结合实施例并参照附图对本发明作进一步描述。

附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：

1、病例纳入

11、纳入标准

12、排除标准

2、测量指标

21、主要研究指标

22、卵泡液分析时间

23、次要研究指标

24、血清及卵泡液分析时间

25、安全指标

3、标准操作规程

31、临床促排卵方案

32、tvod方法

实施例1

请参照附图1、附图2，附图1是本实施例的一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法流程图，附图2是本实施例的一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法平面图。

所述的经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法包括病例纳入1、测量指标2、标准操作规程3；

所述的病例纳入1包含纳入标准11和排除标准12；所述的测量指标2包含主要研究指标21、卵泡液分析时间22、次要研究指标23、血清及卵泡液分析时间24、安全指标25；

所述的标准操作规程3包含临床促排卵方案31、tvod方法32。

实施例2

请参照附图1、附图2，附图1是本实施例的一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法流程图，附图2是本实施例的一种经阴道小卵泡穿刺术改善多囊卵巢患者卵巢低反应的方法平面图。

纳入和排除标准

1)纳入标准包括：根据鹿特丹标准诊断患有pcos的患者：(i)少经或闭经(周期>35天)，(ii)雄激素过多(定义为ferriman-gallwey评分为≥8，睾酮>2.5nmol/l，和/或雄烯二酮>9.0nmol/l)，(iii)多囊卵巢形态(至少1个卵巢≥12个卵泡[2-9mm])。将这些患者按促排卵时卵巢的反应分为3组：1)低反应者(促性腺激素连续刺激2周，激素用量达450iu[至少7天]，患者无或<3个优势卵泡)；2)正常反应者(用药刺激2周内有5-15个优势卵泡发育，hcg扳机日e2水平<4200pg/ml)；3)高反应者(连续刺激后2周内多余15个卵泡发育，hcg扳机日e2水平>4200pg/ml)；

2)排除标准包括：曾行卵巢手术；患者患有内分泌疾病(糖尿病，雌激素依赖性肿瘤，甲状腺疾病，库欣综合征或先天性肾上腺增生等)；

样本量估算

低反应pcos患者发病率较低，且本研究为单中心研究，因符合要求的病例数较少，未计算样本量；

随机和隐蔽分组的方法

未采用随机分组和分配隐藏，但本研究的正常组及高反应组系随机抽取；

盲法

本研究为开放研究，未采用盲法，在分析数据时设盲；

测量指标

1)主要研究指标：各组人群获卵数；elisa检测三组患者(低反应组，高反应组，正常反应组)血清及卵泡液中的amh及睾酮水平；

2)卵泡液分析时间：低反应组：tvod取小卵泡液；随后促排取卵时取主卵泡卵泡液；正常反应组和高反应组：取卵时取小卵泡和主卵泡卵泡液；血清分析时间：低反应组：月经周期第二天；tvod当天；tvod后6天，tvod后8-10天；高反应组和正常反应组：月经周期第2天，第6天，第9天，第10天。

3)次要研究指标：elisa检测三组患者血清及卵泡液中的lh,fsh,e2,prl水平，并检测患者年龄，bmi,用药时间，用药剂量，卵子质量，子宫内膜形态及厚度，以及三组患者的临床结局，如累计着床率，妊娠率和流产率；

4)血清及卵泡液分析时间同上；

5)安全指标：tvod可能会造成患者出血，盆腔疼痛等症状，但发生率极低；

对参试者有效性认定的定义

1)受试者有权在在临床实验的任何阶段随时退出试验，以保障受试者的安全和权益；

2)如果受试者因过敏、不良反应而退出，研究者应该根据受试者实际情况积极采取相应的治疗措施；

3)如果受试者因任何不良事件而退出试验，研究者应根据方案随访或直到不良事件解决，并将随访的信息记录在原始文件中存档；

4)受试者退出临床试验的记录应定期提交伦理委员会；

5)研究者在获知或决定受试者退出临床试验后，应完成所有能够完成的评价项目和数据采集；

6)受试者退出试验不意味着已经获得的受试者临床数据退出临床试验。截止到受试者退出的时点，已经获得的试验数据应该保留作为试验数据库的一部分提交，不应忽略或者删除；

不良事件和不良反应的定义、鉴定方法和管理制度

1)所有包括局部与全身性发反应的ae应使用病例报告表(crf)收集，收集的信息包括事件的描述、发生时间、研究者对于严重性的评估、与随机干预的相关性、事件至解决/稳定的时间。所有ae应给予尽可能充分的解决。在每次研究随访时，研究者将询问自上次随访后出现的ae/sae，且ae/sae将被随访直至解决或稳定。

2)在收集不良事件的时候，在记录诊断的时候最好尽可能的同时记下相关体征和症状。然而，若某些症状和体征与诊断没有太大关系，则要分别记录诊断和症状、体征。基于检验和检查的不良事件都要归纳总结到临床研究报告中。

基线指标和观测项目

观测项目包括：患者年龄、bmi、基础促黄体生成素、促卵泡生成素、雌激素、孕激素、催乳素、amh、睾酮水平；

标准操作规程

1)临床促排卵方案：所有患者均使用gnrh拮抗剂方案：于月经周期第二天注射果纳芬(gonal-f)150iu-300iu/天(注射剂量需要根据患者年龄、基础性激素水平(e2,fsh)、窦卵泡个数以及体重指数(bodymassindex,bmi)进行调整)，在用药期间连续监测卵泡生长，当卵泡直径达到14mm时肌注gnrh拮抗剂0.25mg/天；继续监测卵泡生长，当卵泡平均直径大于17mm时(至少有3个卵泡达到该直径)，肌注3000-7000iuhcg或者0.2mggnrh激动剂，注射hcg的35-36小时后，进行阴道超声辅助下的经阴道取卵术。

2)tvod方法：使用异丙酚对患者进行麻醉，超声下使用17号，35厘米长的穿刺针对卵巢从不同角度反复穿刺，将直径为0.6-0.8mm的卵泡穿刺并吸出卵泡液。患者在门诊观察2-3小时后离院，并在第二天早晨进行超声，血细胞比容评估和血红蛋白浓度测量。在tvod之后，所有患者在第二天继续以相同的促性腺激素剂量接受促排卵刺激，并且监测各种参数。

统计分析方法

1)对于分类变量，使用卡方和fisher精确检验来比较组间差异；

2)对于连续变量，进行studentt检验以比较2组之间的差异；

3)使用单因素方差分析(anova)进行3组之间的比较(样本要满足正态性(和方差同质性)假设，否则便使用kruskal-wallis检验，然后使用mann-whitneyu检验来分析数据)；

4)当比较tvod当天和6天后激素水平的差异时，使用配对样品t检验；

5)本研究拟采用意向性(itt)分析，没有预设亚组分析；

参试者管理制度

1)建立随访制度，定期以电话通知来随访；

2)病例信息保密(关于受试者的所有信息都严格保密，只有相关研究者才能察看这些医疗纪录，以便于他们检查所收集信息的准确性，并确保研究正常进行)；

标本管理制度

1)采集标本：卵泡液在tvod进行或取卵中由负责医师采集；血清由护士在患者就诊当天采集；

2)样本保管：卵泡液采集后保存至-80度冰箱，血清采集后直接检测；

3)样本送检：所有激素水平值由上海交通大学附属瑞金医院生殖中心临床检验室检测；

药品和器材管理制度

1、药品管理制度：

1)病区应根据病种特点保存一定数量的基数药品，便于临床应急使用，工作人员不得擅自取用。

2)根据药品种类、性质及储存要求分类放置，设专人负责领取及管理，用后及时补充，定期清查。护士长每月至少清查一次并签名，护理部定期检查各科室药品管理情况，保证用药安全。

3)定期检查药品质量，保证药品无过期、无变质、无失效。

4)抢救药品应固定存放于抢救车内，做到固定基数，统一编号排列、定位存放。由办公护士专人管理，每周大查一次，护士长每周至少抽查一次并有记录，用后及时清理补充，上封条并签名保管，做到班班交接有签名。

5)不定期组织护理人员进行药品安全管理及使用知识培训，科室使用新特药前要组织学习相关药理学知识。

6)发生药物不良反应时按相关规定程序处理。

2、器材管理制度

1)医疗仪器、器材指定专人负责保管，每周检查和维护，保持性能良好。

2)熟悉仪器性能及保养方法，严格按操作规程使用，用毕及时清洁、消毒处理。

3)精密仪器要定人管理，定点存放，定期检查，定期维护，若有损坏，及时送修。

4)新仪器使用前应由专业人员讲解仪器的使用、保管及注意事项，并示范操作。

5)各类仪器、器材应建立账目，帐物相符，其清领、维修、借出、报废等要详细记录。

6)负责人更换时，须清点所有医疗仪器及设备，办理移交手续，移交人和接收人应签名。

数据管理制度

1)crf中的数据来自于研究病历、理化检查报告单等原始文件并应与原始文件一致。

2)试验中的任何观察、检查结果均应及时、正确、完整、清晰、规范、真实的填写于crf中，不得随意更改。

3)crf中的所有项目均需填写，不得空项和漏项。

4)由专人录入电子数据库中，并由主要研究者核对。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。