一种海藻倍半萜类化合物在制备抑菌药物中的用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及结构式如(i)所示的海藻倍半萜类化合物在制备抑制副溶血性弧菌和溶藻弧菌的抑菌剂药物上的用途。

背景技术：

冈村凹顶藻(laurenciaokamurai)在分类地位上属于红藻门、红藻纲、仙菜目、松节藻科、凹顶藻属海藻，主要分布于中国、日本和朝鲜半岛等太平洋西部沿海地区，一般生长在潮间带的岩石上(史大永，贺娟，许凤等.海洋科学,2007,31(4):81-91.masudam.；abet.；suzukit.phycologia,1996,35(6):550-562.)。倍半萜类化合物是冈村凹顶藻次级代谢产物中最为丰富的一类化合物，并且生物活性多样。

副溶血性弧菌(vibrioparahemolyticus)属于弧菌科弧菌属，为革兰氏阴性杆菌，是一种食源性致病菌，该菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中，人们食用含有该致病菌的海鲜会引起食物中毒，造成腹痛、呕吐、腹泻等症状，属于人畜共患病病原菌。溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌，是一种常见的海洋致病菌，生物学特性与副溶血性弧菌相似，可对人引起伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病，也是鱼、虾、贝等海水养殖动物的一种条件致病菌，当环境恶化是机体免疫机能下降，溶藻弧菌病容易爆发。

目前，主要采用抗生素治疗上述两种病菌，但抗生素容易使病菌产生耐药性，并且长期使用抗生素会对生态环境造成破坏。而海藻倍半萜化合物作为抑菌剂具有低毒和纯天然等优点，其研究显示出良好的生态效益、经济效益和社会效益，其应用将对水产养殖业和人类医疗行业产生巨大影响。

技术实现要素：

本发明首次发现海藻倍半萜类化合物aplysinol对副溶血性弧菌和溶藻弧菌显示出很好的抑制活性，提供该天然的海藻倍半萜类化合物在制备抑菌药物中的用途，特别是用于制备抑制副溶血性弧菌和溶藻弧菌活性的抗菌剂。

该海藻倍半萜类化合物来源于海洋红藻冈村凹顶藻(laurenciaokamurai)，其分子式为c15h19o2br，结构式如(i)所示：

上述海藻倍半萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将海洋红藻冈村凹顶藻阴干、粉碎，有机溶剂a提取2～5次，合并提取液进行浓缩，经乙酸乙酯萃取后浓缩，得到粗提物；其中，所述有机溶剂a为二氯甲烷(ar)、丙酮(ar)、氯仿(ar)、乙酸乙酯(ar)、乙醇(ar)或甲醇(ar)中的一种或几种；

(2)取步骤(1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂b进行梯度洗脱，收集洗脱液；其中，所述有机溶剂b为石油醚-丙酮任意体积比的混合物(ar)，所述梯度洗脱按照石油醚和丙酮体积比分别为100:0、99:1、98:2、95:5、9:1、8:2和7:3进行洗脱，并收集石油醚和丙酮体积比为9:1的洗脱部分；

(3)将收集的洗脱组分进行凝胶柱和薄层层析分离纯化，收集rf值为0.5～0.6的组分，得到如式(i)所示的海藻倍半萜类化合物；其中，所述凝胶柱的层析洗脱液为体积比1:1的氯仿-甲醇混合溶剂，tlc检测，用香兰素-硫酸显色，收集红色斑点组分；所述薄层层析的展开剂为体积比9:1的石油醚-丙酮混合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明首次发现海藻倍半萜类化合物aplysinol对副溶血性弧菌和溶藻弧菌显示出很好的抑制活性，且该化合物属于小分子天然有机化合物，容易制备获得，可作为一种新型抑菌剂。

2、与广谱抗生素相比，海藻倍半萜类化合物aplysinol对副溶血性弧菌和溶藻弧菌具有特异性，对其他微生物影响小，不影响微生态。虽然抗菌效果比抗生素效果稍弱，但其低毒、环境友好、纯天然和不会产生耐药性，在目前国内抗生素药物在水产养殖业和医疗行业要求谨慎使用的形式下，该海藻倍半萜类化合物用于制备新型抑菌药物具有广泛的前景。

附图说明

图1是海藻倍半萜类化合物aplysinol的¹hnmr谱图。

图2是海藻倍半萜类化合物aplysinol的抑菌效果(左-副溶血性弧菌，右-溶藻弧菌)。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细说明。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：海藻倍半萜类化合物aplysinol的制备方法

(1)从中国浙江南麂岛海域采集新鲜的冈村凹顶藻(laurenciaokamurai)经海水洗净，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处阴干，然后粉碎。用95％的工业酒精浸泡提取，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；将粗提物经乙酸乙酯萃取六次并在温度40℃减压浓缩，得到萃取后粗提物16.0g。

(2)将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析，用石油醚-丙酮以体积比100:0，99:1,98:2,95:5,9:1,8:2,7:3的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(tlc)检测(香兰素-硫酸显色)，根据rf值来判断、合并相同或类似部分，获得13个组分(1-13)。

(3)将组分6即以石油醚-丙酮9:1梯度洗脱下的组分进行凝胶柱和薄层层析分离，凝胶柱层析时洗脱液用体积比1:1的氯仿-甲醇混合溶液，tlc检测(香兰素-硫酸显色)，收集红色斑点的组分；薄层层析用体积比9:1的石油醚-丙酮为展开剂，收集rf值为0.5-0.6的组分，得式(i)所示的化合物(68.3毫克)，经tlc检测(香兰素-硫酸显色)，呈单个、均匀红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为aplysinol，结构式如(i)所示。

该化合物具有以下理化和波谱特性：白色针晶，tlc板上在紫外分析仪254nm下暗斑明显，香兰素硫酸显色剂加热显红色。分子式为c15h19o2br；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.16(s,h-11),6.66(s,h-8),3.84,3.73(d,j＝12.0hz,h2-14),2.32(s,h3-12),1.85(m,h-3),1.85,1.63(eachm,h2-5),1.63,1.26(m,h2-4),1.48(s,h3-13),1.09(d,j＝6.7hz,h3-15)。

实施例2：海藻倍半萜类化合物的制备方法

(1)采集新鲜的冈村凹顶藻(laurenciaokamurai)经海水洗净，除去表面附着的沙砾及杂藻，阴凉处阴干，然后粉碎。用甲醇-二氯甲烷(体积比3:1)浸泡提取，合并提取液进行浓缩，得到粗提物；将粗提物经乙酸乙酯萃取六次并在温度40℃减压浓缩，得到萃取后粗提物16.0g。

(2)将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以100:0/50:1/20:1/10:1,5:1,2:1到0:100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(tlc)检测(香兰素-硫酸显色)，根据rf值来判断、合并相同或类似部分，共获得14个组分(1-14)。

(3)将组分3即以石油醚-乙酸乙酯20:1梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱和薄层层析分离。凝胶柱层析时洗脱液用体积比5：5：1的石油醚-氯仿-甲醇混合溶液，tlc检测(香兰素-硫酸显色)，收集红色斑点的组分；薄层层析用体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集rf值为0.5-0.6的组分，得到式(i)所示化合物。

实施例3：抑菌活性实验

实验所用的菌培养基为lb固体培养基和lb液体培养基，利用无菌涂布器把移液枪吸取的100ul菌悬液均匀涂布于lb固体培养基上。所使用的五种菌分别为水霉(真菌)、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。

将实施例1所制备的化合物测试样品溶解于甲醇中，浓度分别为5.0、2.5、1.5、1和0.5毫克/毫升。取200微升样品溶液加到牛津杯中(每个牛津杯中样品的含量为50、25、15、10和5微克)，测试不同梯度下的抑菌效果；并用加有相同体积的甲醇的牛津杯作为阴性对照，用卡那霉素、氨苄青霉素和红霉素作为抗副溶血性弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌的阳性对照，用孔雀石绿和强力霉素作为抗水霉的阳性对照，各三个平行。加有样品的平板培养基置于28℃静置培养10小时，观察实验结果，出现抑菌圈的测量其抑菌圈直径。

实验结果显示，只有副溶血性弧菌和溶藻弧菌出现了抑菌圈，说明上述海藻倍半萜类化合物对副溶血性弧菌和溶藻弧菌具有抑制活性，具有特异性。海藻倍半萜类化合物aplysinol的抑菌效果如表1所示。

表1

卡那霉素、氨苄青霉素和红霉素对副溶血性弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌都有抑制效果，牛津杯中的样品含量为50微克时的抑菌效果如表2所示。

表2

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。