一种金铂复合纳米诊疗剂的制备方法及应用与流程

本发明属于纳米材料领域，特别是一种金铂复合纳米诊疗剂au2pt-peg-ce6的制备方法及应用。

背景技术：

世界上癌症患者逐年增多，严重威胁了人们的健康，传统的治疗方法因其固有的局限性限制了癌症的有效治疗。光动力治疗和光热治疗因其具有微创，低毒，高选择性等优点而引起了研究者们的广泛关注。但是该类疗法也面临着一些挑战，如光的组织穿透深度，肿瘤区域的乏氧，以上都限制了该类疗法的治疗效果。所以开发一种金铂复合纳米诊疗剂，以便能够克服肿瘤乏氧以及能实现多种治疗方法并用的体系显得尤为重要。

近年来，纳米酶因其具有催化效率高、结构稳定、价格低廉等特点以及同时具有纳米材料的特性而广泛引起了人们的关注。贵金属纳米酶中au和pt纳米材料因其具有更高的体内外生物相容性，良好的光稳定性和较高的光热转换效率受到研究者们的青睐。混合双金属纳米材料比单元素的纳米粒子具有更好的光学和化学性能，同时还具有过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性，在弱酸性条件下能和肿瘤内过表达的过氧化氢(h2o2)反应原位产生氧气(o2)和高毒性的活性氧羟基自由基(·oh)，从而起到克服乏氧类增强光动力效果并杀死肿瘤细胞的作用。aupt合金还可同时实现ct成像，光声成像和光热成像等多模式成像，实现诊疗一体化。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种制备au2pt-peg-ce6纳米粒子的合成方法。该纳米粒子可用于光热治疗和光动力治疗以及用于光热成像、光声成像和ct成像。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的金铂复合纳米诊疗剂的制备方法，是用l-脯氨酸为螯合剂，l-抗坏血酸为还原剂，合成一种au2pt纳米粒子。

所述的au2pt纳米粒子中au与pt的原子比例为2：1，粒径大小为25-80纳米。

所述的方法包括以下步骤：

(1)利用l-脯氨酸，抗坏血酸，氢氧化钠，haucl4和h2ptcl6溶液合成au2pt合金；

(2)合成au2pt-peg-ce6纳米粒子：利用巯基和au，pt的配位能力在au2pt表面修饰sh-peg-nh2然后根据氨基和羧基的缩合反应共价连接ce6，最终得到au2pt-peg-ce6纳米粒子。

本发明用l-脯氨酸作为螯合剂合成在水中分散性良好的au2pt合金，其粒径25-80纳米符合细胞胞吞尺寸。

本发明中au2pt合金的紫外可见吸收可到近红外区，实验证明可用于808纳米光热治疗。

本发明中au2pt合金具有过氧化氢酶活性，实验证明可以与过氧化氢反应产生氧气。

本发明中au2pt合金具有过氧化物酶活性，实验证明可以与过氧化氢反应产生高毒性羟基自由基。

本发明用sh-peg-nh2修饰au2pt合金，并在此基础上共价连接二氢卟吩e6(ce6)，实验证明在乏氧环境中，650纳米激光照射au2pt-peg-ce6纳米粒子可产生单线态氧。ce6的用量是40-100mgg^-1。

本发明利用光动力治疗和光热治疗以及纳米粒子在原位产生羟基自由基来杀死肿瘤细胞的方法。

本发明可实现三模式成像，包括光热成像、光声成像和ct成像。

本发明与现有技术相比，具有以下主要的优点：

(1)合成方法简单环保，反应皆在室温下进行；

(2)所合成的au2pt-peg-ce6在固体肿瘤微环境中与过表达的h2o2原位反应产生o2，克服肿瘤乏氧环境，增强光动力效果，还可与h2o2原位反应产生·oh，在体内可同时产生两种活性氧(¹o2和·oh)，同时联合光热治疗协同杀死肿瘤细胞；

(3)共价连接光敏剂ce6可增强其稳定性，避免其在复杂生物体内提前释放；

(4)可同时实现三模式成像(ct成像，光声成像，光热成像)为药物追踪提供强有力的支持。基于以上优点以及良好的生物相容性，使得该纳米平台对肿瘤有很好的杀伤效果，为癌症的有效治疗提供了新的希望。

附图说明

图1为au2pt的xrd图。

图2图2a为au2pt的透射电子显微镜图像，图2b为au2pt的元素映射图像。

图3图3a，图3b分别为au2pt和au2pt-peg-ce6的水合粒径图。

图4为au2pt、au2pt-peg-nh2和au2pt-peg-ce6的zeta电位图。

图5为au2pt和au2pt-peg-ce6的紫外可见吸收图。

图6中，图6a为不同浓度的au2pt-peg-ce6在808nm(1wcm^-2，5min)照射下的温度变化曲线，图6b为au2pt-peg-ce6(400μgml-1)在不同功率的激光照射(808nm，5min)下的温度变化曲线。

图7为不同浓度的au2pt-peg-ce6加入3.2mmh2o2(ph＝7)后溶液中氧气浓度随时间的变化图。

图8为au2pt-peg-ce6(100μgml^-1)溶液中加入2mmh2o2和0.04mmtmb后，tmb的吸收峰随时间的变化图。

图9为au2pt-peg-ce6(50μgml^-1)加入h2o2(2mmoll^-1)后在反应0，5，10min时和单独h2o2(2mmoll^-1)的esr谱图。

图10分别为au2pt-peg-ce6，h2o2混合溶液和au2pt-peg-ce6溶液中加入dpbf后，在650nm激光器照射下dpbf的吸收峰随时间的变化。

图11为不同浓度的au2pt和au2pt-peg-ce6对l929细胞和hela细胞的存活率的影响。

图12为au2pt-peg-ce6在不同ph下对hela细胞的细胞毒性。

图13为经不同处理的au2pt-peg-ce6的细胞毒性。

图14为小鼠注射材料前后的ct成像图(轴位、冠位及正位、侧位vr图)。

图15为原位注射生理盐水和au2pt-peg-ce6的光热成像图。

图16为原位注射生理盐水和au2pt-peg-ce6的光声成像图。

图17为14天内小鼠的体重和肿瘤大小变化图。其中，图17a是14天内小鼠的体重变化图，图17b是14天内小鼠的肿瘤大小变化图。

具体实施方式

本发明提供的一种金铂复合纳米诊疗剂的制备方法及应用，其是一种用l-脯氨酸为螯合剂，l-抗坏血酸为还原剂合成的au2pt纳米粒子及将其后修饰得到的au2pt-peg-ps(ps：光敏剂)的方法及应用。au2pt-peg-ps纳米粒子具有过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性，在弱酸性条件下能和肿瘤内过表达的过氧化氢(h2o2)反应原位产生氧气(o2)和高毒性的活性氧羟基自由基(·oh)，从而起到克服乏氧，增强光动力效果和杀死癌细胞的作用。au2pt合金还可同时实现ct成像，光声成像和光热成像等多模式成像，实现联合治疗和诊疗一体化。

所述方法包括以下步骤：

(1)将l-脯氨酸溶于水得到溶液a；

(2)将氯金酸溶液和氯铂酸溶液加到溶液a中，得到溶液b；

(3)用氢氧化钠调节溶液b的ph值，得到溶液c；

(4)将l-抗坏血酸逐滴加入到溶液c中，得到溶液d；

(5)将溶液d分离得沉淀，最后分散在水中，得到金铂复合纳米诊疗剂。

下面通过在au2pt表面连接光敏分子ce6对本发明进行详细介绍，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

合成au2pt纳米粒子：将33mmoll^-1l-脯氨酸溶解在10ml水中。然后将2mmoll^-1的haucl4和h2ptcl6溶液加入混合物中。调节溶液ph＝9后，逐滴加入6.7mmoll^-1的抗坏血酸溶液，室温下搅拌20分钟，高速离心分离(14000rpm/min，5min)，去离子水洗涤3次，分散在10ml水中。

为验证合成的纳米粒子为au2pt合金，用x-射线衍射仪对其进行分析，x射线衍射图中的代表性衍射峰出现在38.34°，44.44°，64.86°和77.88°，它们起源于面心立方晶格(fcc)au2pt合金的(111)，(200)，(220)和(311)面，这些峰都在单质au和单质pt之间，表明其合金性质(附图1)。可证明成功合成au2pt纳米粒子。用透射电子显微镜(tem)可以观察到au2pt纳米粒子是直径约为42±3nm的球形聚集体。通过高角度环形暗场扫描透射电子显微镜能量色散x射线光谱及其元素映射图像和线扫描图像可以看见au和pt原子在球型聚集体中均匀分布，且au原子和pt原子个数比为2:1(附图2)。

实施例2：

合成au2pt-peg-ce6纳米粒子：将10mgsh-peg-nh2加入到实施例1制备的溶液中，室温搅24小时即可得到au2pt-peg-nh2，高速离心，水洗3次，分散在5ml水中。

然后取1mgce6，8mgedc，12mgnhs溶于5mldmf溶液中，反应1小时，再加入au2pt-peg-nh2，室温反应24小时。离心收集沉淀，水洗3次，即得到au2pt-peg-ce6纳米粒子。

下面提供对上述实施例制备的纳米粒子进行测试后分析的结果。

(1)对合成的au2pt和au2pt-peg-ce6纳米粒子进行水合粒径分析：

如图3所示从57.03纳米增加至70.89纳米。

对合成的au2pt，au2pt-peg-nh2，au2pt-peg-ce6纳米粒子分别进行zeta电位分析：

如图4所示，au2pt的zeta电位为-26.5mv，在其表面修饰sh-peg-nh2后，因其表面裸露氨基，其zeta电位上升至10.6mv，共价连接ce6后，zeta电位又下降至-24.2mv。

以上两种分析均表明au2pt-peg-ce6纳米粒子的成功合成。

(2)对au2pt-peg-ce6纳米粒子进行紫外可见吸收光谱分析：

如图5所示，其吸收可到近红外区，可用于808纳米光热治疗。

(3)对合成的au2pt-peg-ce6纳米粒子进行光热效果检测：

将不同浓度的au2pt-peg-ce6纳米粒子(0，50，100，200，300和400μgml^-1)放在离心管里，然后用808nm激光(1wcm^-2)照射5分钟，由红外热成像仪监测温度的变化，每隔15秒记录一次温度。然后固定au2pt-peg-ce6纳米粒子的浓度为400μgml^-1，改变激光功率(0.5，0.75，1wcm^-2)，再监测记录温度。

结果如图6所示，随着au2pt-peg-ce6浓度的增加，溶液的温度也随之升高；然后改变激光功率，随着激光功率的增大，溶液温度也会随着升高。

(4)类过氧化氢酶样活性检测：

将不同浓度的au2pt-peg-ce6(0，20，40，60，80和100μgml^-1)、h2o2(3mmoll^-1)加入到3ml的磷酸盐缓冲溶液中(ph＝7)，用溶解氧测定仪测量溶液中溶解氧的浓度。

结果如图7所示，在只有h2o2存在时，溶液中氧气浓度无明显变化，随着au2pt-peg-ce6的浓度增加，h2o2产氧速率逐渐加快，说明au2pt-peg-ce6具有过氧化氢酶样活性，可以与肿瘤内过表达的h2o2反应产生o2，从而改善肿瘤缺氧，增强光动力效果。

(5)类过氧化物酶样活性检测：

使用tmb作为底物检测au2pt的过氧化物酶活性，将au2pt-peg-ce6(100μgml^-1)、h2o2(1mmoll^-1)和tmb(0.02mmoll^-1)顺序加入到3ml的磷酸盐缓冲溶液中(ph＝4.5)，用紫外可见分光光度计来观察tmb在652nm处的吸收变化即可(过氧化物酶和h2o2反应可以将无色的tmb变为蓝色的oxtmb，在370nm和652nm处能观察到明显的吸收峰)。

向100μgml^-1au2pt-peg-ce6溶液中加入1mmh2o2和0.02mmtmb后，能看见tmb明显的吸收峰，tmb的吸收峰随时间的变化如图8所示，证明其具有类过氧化物酶的活性。

(6)对纳米粒子进行电子自旋共振技术分析：

au2pt-peg-ce6(50μgml^-1)，h2o2(2mmoll^-1)加入到2mlpbs(ph＝5)中，之后加入5，5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo，25mm)，在反应0，5，10min时记录esr谱图，结果如图9所示，在5分钟即可发现强度为1:2:2:1的四线谱图，10分钟时更加明显，说明随着反应的不断进行有更多的·oh产生。

(7)单线态氧的检测：

在乏氧条件下，au2pt-peg-ce6(50μgml^-1)，h2o2(2mmoll^-1)加入到3mlpbs(ph＝7)中，然后加入1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf，20μgml^-1)，用650nm激光器(0.1wcm^-2)照射0，3，6，9，12，15min，用紫外可见分光光度计分别记录照射不同时间时dpbf在420nm处的吸收峰(单线态氧会氧化dpbf使其结构改变，使420nm处吸收峰下降)。

为了模拟肿瘤缺氧微环境，将dpbf、au2pt-peg-ce6和h2o2加入到用n2长时间吹过的pbs溶液中，在650nm激光照射下，dpbf在420nm处的吸收峰随激光照射时间的延长而下降如图10所示，证明au2pt-peg-ce6和h2o2在650nm激光照射下可以产生单线态氧。

(8)细胞培养及相容性的检测：

将l929和hela细胞放在含有1％(v/v)青霉素/链霉素和10％(v/v)胎牛血清(fbs)的高糖dmem培养基中，并放置在37℃，5％co2培养箱中培养。将l929或hela细胞每孔8000个接种到96孔板中，并用含不同浓度(0,100,200,300,400和500μgml^-1)的au2pt或au2pt-peg-ce6的高糖dmem培养基孵育24小时。通过标准3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(mtt)测定法检测相对细胞活力。

如图11所示，在对纳米粒子不做任何处理时，au2pt和au2pt-peg-ce6对l929细胞和hela细胞均无明显毒性，表明其体外生物相容性良好。

(9)au2pt-peg-ce6在不同ph下的体外细胞毒性检测：

将hela细胞(每孔8000个细胞)接种到96孔板中孵育24小时。加入使用或不使用h2o2(100μm)的au2pt-peg-ce6(0,100,200,300和400μgml^-1)。随后分别加入hcl(1m)将培养基的ph值调节至7.35和6.75。然后，将细胞在37℃，5％co2下进一步培养24小时。最后，使用mtt测定评估细胞活力。如图12所示au2pt-peg-ce6在微酸性环境中具有过氧化物酶活性，可以与h2o2产生·oh从而杀死细胞。

(10)au2pt-peg-ce6在不同光照下的体外细胞毒性检测：

将hela细胞(每孔8000个细胞)接种到96孔板中孵育24小时。随后，将au2pt-peg-ce6(0,100,200,300和400μgml^-1)加入板中，在37℃，5％co2下再孵育4小时。再用新鲜培养基替换原来培养基，分别用808nm激光(1wcm^-2)照射hela细胞10分钟，650nm激光(0.259wcm^-2)照射10分钟或808nm和650nm激光同时照射10分钟。然后，将细胞在37℃，5％co2下进一步培养24小时。最后，使用mtt测定评估细胞活力。

如图13所示，ptt和pdt联合治疗使hela细胞存活率降低至12％左右，而单独的pdt治疗和ptt治疗的细胞存活率分别为55％和34％。证明了联合治疗的效果比单独的治疗效果好很多。

(11)计算机断层扫描活体成像：

选6-8周雌性balb/c小鼠，在左前腿腋下荷小鼠子宫颈癌细胞u14，当肿瘤长到合适大小时，原位注射实施案例合成的纳米粒子100μl(4mgml^-1)，然后用计算机断层扫描技术成像。取未注射前的图像作为对照。如图14所示，实施案例合成的纳米粒子可用于ct成像，可作为一种ct成像造影剂应用在生物成像中。

(12)活体光热成像：

选6-8周雌性balb/c小鼠，在左前腿腋下荷小鼠子宫颈癌细胞u14，当肿瘤长到合适大小时，原位注射实施案例合成的纳米粒子100μl(4mgml^-1)，用808纳米激光器照射(1wcm²)5分钟，在照射同时用红外热成像仪成像，取未注射前的图像作为对照。如图15所示，实施案例合成的纳米粒子可用于光热成像，可应用在生物成像中。

(13)活体光声成像：

选6-8周雌性balb/c小鼠，在左前腿腋下荷小鼠子宫颈癌细胞u14，当肿瘤长到合适大小时，原位注射实施案例合成的纳米粒子100μl(4mgml^-1)，将小鼠麻醉后放到动物支架上，然后将小鼠和支架转移到多光谱断层扫描系统(msot)成像舱中进行成像，注射生理盐水的图像作为对照。如图16所示，实施案例合成的纳米粒子可用于光声成像，可应用在生物成像中。

(14)活体抑制肿瘤实验：

选35只6-8周雌性balb/c小鼠，在左前腿腋下荷小鼠子宫颈癌细胞u14，当肿瘤长到合适大小时，随机分成7组，分别给小鼠尾静脉注射生理盐水和实施例2中合成的纳米粒子，12小时后，用808纳米激光器和650纳米激光器给小鼠治疗，每隔一天记录一次小鼠体重和瘤径。

结果如图17所示，各组小鼠体重均有些许增长，表明实施例的材料的毒性可以忽略不计。控制组和单纯激光照射组肿瘤体积在持续增长，而单纯材料组略有所抑制。单独光热治疗以及光动力治疗对抑制肿瘤均有效果，但因单独治疗效果不佳，肿瘤体积均略有增长，而光热和光动力联合治疗组则能很好的抑制肿瘤生长。

本发明发明具有以下的特点：

1.一步法合成au2pt，且合成方法简单环保，溶剂为水，在室温下即可发生反应；

2.共价连接光敏剂ce6，避免在复杂生物体内提前泄露，对正常组织造成伤害；

3.au2pt-peg-ce6在固体肿瘤微环境中与过表达的h2o2原位反应可同时产生o2和·oh，o2克服肿瘤乏氧环境，增强光动力效果，同时联合光热治疗协同杀死肿瘤细胞；

4.可以作为三模式成像造影剂(ct成像，光声成像，光热成像)。

上述实施例为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。