本发明属于兽用疫苗佐剂技术领域，尤其涉及一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法。
背景技术：
免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较强、持久的免疫应答，佐剂大致可分为两类，第一类是抗原载体，例如乳剂类和脂质体等，能够以更有效的方式提呈抗原进入免疫系统，第二类为免疫刺激剂，如toll样受体（tlr）、氢氧化铝、皂苷和细胞因子等。随着生物技术的发展，一些新型佐剂随着时代的需要逐步出现，其中壳聚糖及其衍生物由于具有良好的可生物降解性、低毒性、免疫刺激活性、缓释作用及靶向性，已成为了构建疫苗免疫佐剂的优良载体。
铝盐作为经典的传统佐剂应用于临床已经有80多年，也是至今唯一被fda批准可用于人类疫苗的佐剂，它能有效的诱导体液免疫应答，但对细胞免疫不起作用。油乳佐剂分为水包油、油包水乳剂和水包油包水双相乳剂，其中最著名的属弗氏佐剂（freund’sadjuvant，fa），但该佐剂易引起注射部位的炎症或肉芽肿等不良反应。传统佐剂的局限性使得纳米佐剂等一系列新型佐剂得到飞速发展，而脂质体作为一种纳米传送体系，不仅拥有纳米佐剂的优势，还能够同时刺激体液和细胞免疫，使疫苗的免疫效果增强数十倍。
同时，与其他佐剂制剂相比，脂质体制剂对制备条件的变化更为敏感。
由于脂质体属于热力学不稳定体系，随着时间推移，粒子大小和分布会朝较大粒子方向发展，即出现颗粒聚集或沉降。
目前市售的兽用脂质体佐剂存在如下问题：粒径较大，均一性差，稳定性差，热力学稳定性不好，久置易分层，佐剂中有机溶剂残留的风险较高，高水平抗体在体内的维持时间短。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，通过本发明制备得到的兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂粒径小，均一性好，具有较好的热稳定性和良好的细胞相容性，贮存稳定性高，久置不分层，极大消除了佐剂中有机溶剂残留的风险，可以延长高水平抗体在体内的维持时间。
为实现上述目的，所采取的技术方案是：
一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将磷脂和胆固醇均溶解在三氯甲烷中混合后得到混合溶液a；
（2）按照蜂胶：95％的乙醇=1kg：（15-25）l的比例，将蜂胶溶于95％的乙醇中配制成蜂胶乙醇溶液；
（3）步骤（1）中得到的混合溶液a与步骤（2）中得到的蜂胶乙醇溶液按照体积比1：（1-3）进行均匀混合，得到混合溶液b；
（4）将步骤（3）中得到的混合溶液b转移至旋转蒸发仪中，进行真空旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成脂质膜；
（5）用去离子水洗下步骤（4）中旋转蒸发仪烧瓶内壁的脂质膜，混匀溶液后得到混合溶液c；
（6）使步骤（5）中得到的混合溶液c在40-60℃温度下、在功率150-250w的超声处理下、在压力为12-16mpa的二氧化碳气氛下孵化0.5-1.5h，得到蜂胶脂质体溶液；
（7）将壳聚糖盐酸盐用去离子水溶解后制得壳聚糖盐酸盐溶液，壳聚糖盐酸盐溶液与步骤（6）中制得的蜂胶脂质体溶液按照等体积比例进行均匀混合，在（500-700）r/min的条件下结合0.5-1.5h；
（8）微球制备处理；以重量份计，取步骤（7）中处理得到的溶液5-15份加入50-100份液体石蜡（含3%（质量分数）span80）中，40-60℃恒温水浴条件下800-1500r/min搅拌20-60min，形成白色w/o乳液，逐滴加入戊二醛水溶液交联，继续搅拌2-5h；石油醚、异丙醇充分洗涤沉淀后离心分离，真空干燥，即得；
所述磷脂：胆固醇：三氯甲烷：壳聚糖盐酸盐的重量份比例为：（75-100）：（25-100）：（10-15）：（15-20）。
优选的，所述磷脂为卵磷脂或豆磷脂或卵磷脂与豆磷脂任意比例的混合物。
优选的，所述卵磷脂为蛋黄卵磷脂。
优选的，步骤（4）中真空旋转蒸发处理的旋蒸温度为35-40℃，转速为80-150r/min。
优选的，步骤（3）中混合溶液a与蜂胶乙醇溶液在超声作用下进行均匀混合。
蜂胶是指蜜蜂在植物中所采集的花粉以及蜂蜡等多种物质的混合物，采集的花粉当中含有多种生物活性物质，里面有多种维生素、脂肪酸、多糖等活性物质，这些物质具有极强的抗毒与抗霉菌的效果。
蜂胶是一种具有广谱生物学活性和免疫增强作用的天然物质，作为天然的免疫增强剂，其具有安全、无残留的优点。它能够全面启动机体的免疫系统，激活红细胞膜上的cab受体，从而增强红细胞的免疫功能，激活与保护中枢免疫器官，刺激机体产生各种细胞因子。
蜂胶具有广谱的生物学活性，是一种天然的免疫增强剂。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力。
使用佐剂中含有蜂胶的疫苗可全面刺激机体的免疫防疫系统，包括细胞和体液免疫系统、红细胞免疫系统和巨噬细胞补体免疫系统，且注射疫苗部位无肿胀，无坏死，使用安全、有效、可靠，抗体产生快，免疫效果好，可以延长高水平抗体在体内的维持时间。
壳聚糖盐酸盐是一种具有强阳离子型的壳聚糖衍生物，能促进体细胞对营养成份或药物的吸收，可用于制备创伤、烧伤敷料，止血效果极佳；其可用于亲水性药物和天然营养化妆品等的吸收促进剂；壳聚糖盐酸盐具有良好的成膜性和抑菌性，可用于食品、果蔬等的添加剂和保鲜剂。
水溶性壳聚糖盐酸盐分子量小，水溶液粘度低，在相同的机械搅拌条件下，相比壳聚糖更易被机械分散，加入交联剂戊二醛后，能快速与壳聚糖盐酸盐分子上的氨基发生交联反应，使乳滴固化保持现有微小球形。壳聚糖盐酸盐微球成球性好，粒径小，球形圆整，微球表面光滑，粒径分布范围小。相对于壳聚糖盐酸盐，壳聚糖盐酸盐微球的分子结构未发生明显变化。壳聚糖盐酸盐微球具有较好的热稳定性和良好的细胞相容性。在搅拌过程中，微球与微球之间发生相互碰撞也不会形成更大体积的微球。
本发明步骤（7）中的壳聚糖盐酸盐包覆了蜂胶脂质体之后，再通过微球制备处理使得壳聚糖盐酸盐形成微球，因壳聚糖盐酸盐微球的性状特点使得制备得到的兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂粒径较小且稳定，其还具有较好的热稳定性和良好的细胞相容性，随着时间的推移，粒子大小和分布也不会朝较大粒子方向发展，不会出现颗粒聚集或沉降。
步骤（6）中混合溶液c在超声强化超临界二氧化碳流体的处理下，溶液分散更加均匀，能得到非常均一、粒径小、稳定性好的蜂胶脂质体。
超临界二氧化碳流体是一种环境友好型溶剂，在处理结束后易于与产物分离且不造成环境污染，其还具备优良溶剂的特性，制备得到的脂质体有机溶剂残留量低。超临界二氧化碳法制备的脂质体粒径较为均匀，单分散性高，在孵化过程中，超临界二氧化碳流体可以溶解磷脂中的小分子杂质，释放二氧化碳时杂质会被带离体系，能进一步纯化磷脂提高脂质体质量的目的；在超声强化超临界二氧化碳流体环境下孵化的过程中，体系中的高压有利于蜂胶等生物活性分子进入脂质体的内水相，进而提高脂质体的包封率。超临界二氧化碳流体环境能塑化磷脂分子的结构，有利于磷脂分子形成热力学更稳定的构象，使双分子层的排列更加均匀，以达到提高脂质体稳定性的目的。
与现有技术相比，通过本发明制备得到的兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂具有如下有益效果：
（1）佐剂均一、粒径小、稳定性好，具有较好的热稳定性和良好的细胞相容性。
（2）乳液液滴分散度好，热力学稳定性好，贮存稳定性高，久置不分层，经离心加速试验仍未分层，粒子大小和分布不会朝较大粒子方向发展，不会出现颗粒聚集或沉降。
（3）粘度低、通针性好、制剂稳定、在水中分散性良好。
（3）利用超临界二氧化碳流体避免了制备得到的佐剂中有机溶剂的残留。
（4）可全面刺激机体的免疫防疫系统，包括细胞和体液免疫系统、红细胞免疫系统和巨噬细胞补体免疫系统，且注射疫苗部位无肿胀，无坏死，使用安全、有效、可靠，抗体产生快，免疫效果好，可以延长高水平抗体在体内的维持时间。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1：
一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将磷脂和胆固醇均溶解在三氯甲烷中混合后得到混合溶液a；
（2）按照蜂胶：95％的乙醇=1kg：15l的比例，将蜂胶溶于95％的乙醇中配制成蜂胶乙醇溶液；
（3）步骤（1）中得到的混合溶液a与步骤（2）中得到的蜂胶乙醇溶液按照体积比1：3进行均匀混合，得到混合溶液b；
（4）将步骤（3）中得到的混合溶液b转移至旋转蒸发仪中，进行真空旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成脂质膜；
（5）用去离子水洗下步骤（4）中旋转蒸发仪烧瓶内壁的脂质膜，混匀溶液后得到混合溶液c；
（6）使步骤（5）中得到的混合溶液c在50℃温度下、在功率250w的超声处理下、在压力为12mpa的二氧化碳气氛下孵化1.0h，得到蜂胶脂质体溶液；
（7）将壳聚糖盐酸盐用去离子水溶解后制得壳聚糖盐酸盐溶液，壳聚糖盐酸盐溶液与步骤（6）中制得的蜂胶脂质体溶液按照等体积比例（即体积比例1：1）进行均匀混合，在700r/min的条件下结合0.5h；
（8）微球制备处理；以重量份计，取步骤（7）中处理得到的溶液10份加入100份液体石蜡（含3%（质量分数）span80）中，50℃恒温水浴条件下800r/min搅拌40min，形成白色w/o乳液，逐滴加入戊二醛水溶液交联，继续搅拌5h；石油醚、异丙醇充分洗涤沉淀后离心分离，真空干燥，即得；
所述磷脂：胆固醇：三氯甲烷：壳聚糖盐酸盐的重量份比例为：75：60：12：15。
优选的，所述磷脂为卵磷脂，该卵磷脂为蛋黄卵磷脂。
优选的，步骤（4）中真空旋转蒸发处理的旋蒸温度为35℃，转速为80r/min。
优选的，步骤（3）中混合溶液a与蜂胶乙醇溶液在超声作用下进行均匀混合。
实施例2：
一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将磷脂和胆固醇均溶解在三氯甲烷中混合后得到混合溶液a；
（2）按照蜂胶：95％的乙醇=1kg：25l的比例，将蜂胶溶于95％的乙醇中配制成蜂胶乙醇溶液；
（3）步骤（1）中得到的混合溶液a与步骤（2）中得到的蜂胶乙醇溶液按照体积比1：2进行均匀混合，得到混合溶液b；
（4）将步骤（3）中得到的混合溶液b转移至旋转蒸发仪中，进行真空旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成脂质膜；
（5）用去离子水洗下步骤（4）中旋转蒸发仪烧瓶内壁的脂质膜，混匀溶液后得到混合溶液c；
（6）使步骤（5）中得到的混合溶液c在40℃温度下、在功率150w的超声处理下、在压力为14mpa的二氧化碳气氛下孵化1.5h，得到蜂胶脂质体溶液；
（7）将壳聚糖盐酸盐用去离子水溶解后制得壳聚糖盐酸盐溶液，壳聚糖盐酸盐溶液与步骤（6）中制得的蜂胶脂质体溶液按照等体积比例（即体积比例1：1）进行均匀混合，在500r/min的条件下结合1.5h；
（8）微球制备处理；以重量份计，取步骤（7）中处理得到的溶液5份加入50份液体石蜡（含3%（质量分数）span80）中，60℃恒温水浴条件下1500r/min搅拌20min，形成白色w/o乳液，逐滴加入戊二醛水溶液交联，继续搅拌2h；石油醚、异丙醇充分洗涤沉淀后离心分离，真空干燥，即得；
所述磷脂：胆固醇：三氯甲烷：壳聚糖盐酸盐的重量份比例为：100：100：10：18。
优选的，所述磷脂为豆磷脂。
优选的，步骤（4）中真空旋转蒸发处理的旋蒸温度为40℃，转速为150r/min。
优选的，步骤（3）中混合溶液a与蜂胶乙醇溶液在超声作用下进行均匀混合。
实施例3：
一种兽用水溶性壳聚糖脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将磷脂和胆固醇均溶解在三氯甲烷中混合后得到混合溶液a；
（2）按照蜂胶：95％的乙醇=1kg：20l的比例，将蜂胶溶于95％的乙醇中配制成蜂胶乙醇溶液；
（3）步骤（1）中得到的混合溶液a与步骤（2）中得到的蜂胶乙醇溶液按照体积比1：1进行均匀混合，得到混合溶液b；
（4）将步骤（3）中得到的混合溶液b转移至旋转蒸发仪中，进行真空旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成脂质膜；
（5）用去离子水洗下步骤（4）中旋转蒸发仪烧瓶内壁的脂质膜，混匀溶液后得到混合溶液c；
（6）使步骤（5）中得到的混合溶液c在60℃温度下、在功率200w的超声处理下、在压力为16mpa的二氧化碳气氛下孵化0.5h，得到蜂胶脂质体溶液；
（7）将壳聚糖盐酸盐用去离子水溶解后制得壳聚糖盐酸盐溶液，壳聚糖盐酸盐溶液与步骤（6）中制得的蜂胶脂质体溶液按照等体积比例（即体积比例1：1）进行均匀混合，在600r/min的条件下结合1.0h；
（8）微球制备处理；以重量份计，取步骤（7）中处理得到的溶液15份加入75份液体石蜡（含3%（质量分数）span80）中，40℃恒温水浴条件下1000r/min搅拌60min，形成白色w/o乳液，逐滴加入戊二醛水溶液交联，继续搅拌3.5h；石油醚、异丙醇充分洗涤沉淀后离心分离，真空干燥，即得；
所述磷脂：胆固醇：三氯甲烷：壳聚糖盐酸盐的重量份比例为：90：25：15：20。
优选的，所述磷脂为卵磷脂与豆磷脂任意比例的混合物，如卵磷脂与豆磷脂按重量份2.5：1.5的比例混合而成的混合物，也可为卵磷脂与豆磷脂按重量份1.0：1.5的比例混合而成的混合物。
优选的，步骤（4）中真空旋转蒸发处理的旋蒸温度为37℃，转速为100r/min。
优选的，步骤（3）中混合溶液a与蜂胶乙醇溶液在超声作用下进行均匀混合。