CREG蛋白保护高盐诱导的肾脏损伤的医药用途的制作方法

本发明涉及e1a激活基因阻遏子（creg）蛋白的医药用途，具体涉及creg蛋白用于制备预防和/或治疗高盐诱导肾脏损伤的药物的用途。

背景技术：

高盐饮食是参与高血压形成和发展的最重要的环境因素之一。即使给予高盐饮食的大多数人也可以保持正常压力，因为他们可以通过肾脏有效地排泄钠，然而，在那些不能通过肾脏有效排泄钠的人群中，血压明显上升，随后产生肾脏、心脏等目标器官损伤，从而导致盐敏感问题。重要的是盐敏感的肾脏、心脏和其他靶器官的损害程度显著高于非敏感人群。dahl盐敏感（dahl-s）大鼠在高盐负荷后可以发展为进行性和硬化性肾脏病变，是最常用的盐敏感性高血压模型。给予高盐饮食的dahl-s大鼠可出现明显的高血压和肾损伤，这与释放纤维化激活因子如转化生长因子β（tgf-β）密切相关。

tgf-β是一种多效细胞因子。在肾脏纤维化中它可以促进细胞增殖和分化，促进胶原合成，抑制胶原蛋白降解，并且被认为是最强的促纤维化生长因子。在tgf-β/smad信号传导途径中，smad蛋白是信号传导途径下游的主要效应分子。tgf-β受体通过磷酸化smad蛋白来调节相关基因的表达并促进纤维化的发展。其功能的主要机制是：smad2，smad3与tgf-β受体复合物中的tgf-βⅰ型受体结合，同时进行磷酸化，然后与smad4（p-smad2/3-smad4）形成异源寡聚复合物，转移进入细胞核，介导tgf-βi的生物学作用。smad7是tgf-βi/smad信号传导途径中的抑制蛋白，降低肾脏smad7的表达可以产生纤维化，smad7过表达可以抑制tgf-β1介导的细胞外基质表达，从而抑制纤维化。

e1a激活基因阻遏子基因（cellularrepressorofe1a-stimulatedgenes,creg）是一种小分子量分泌的糖蛋白，在成熟组中广泛表达。它具有维持组织和细胞分化的重要生理功能，gill等研究表明creg在未分化组织中表达极低，并在分化和成熟组织中广泛表达。veal等发现creg蛋白在体外培养的四倍体细胞中可抑制四联体细胞增殖，促进细胞自发分化为神经细胞。这些发现提示creg是一种重要的内部稳态控制因子，可诱导细胞分化。自2000年以来，发明人的实验室一直专注于creg调节心血管系统稳态的研究，发现creg+/-小鼠心肌随着衰老而发生明显的纤维化，发现creg可以通过预防心室重构和减少心肌纤维化来显着改善心脏功能，总之creg在改善心肌纤维化中起重要作用。发明人还发现creg在肾脏中广泛表达，但是creg是否对dahl-s大鼠的肾损伤起保护作用尚未被研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供creg蛋白保护高盐诱导的肾脏损伤的医药用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

creg蛋白或其活性片段在制备用于预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤药物中的应用。

进一步地，creg蛋白或其活性片段在制备用于预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤药物中的应用，所述高盐诱导的肾脏损伤是指对高盐摄入所引起的血压升高，靶器官肾脏在结构、功能、代谢等方面发生进一步的损伤，恶化。

表达creg蛋白的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤的药物中的应用，其中所述重组细胞含有表达creg蛋白或其活性片段的重组载体，所述重组载体含有编码creg蛋白或其活性片段的核苷酸序列。

进一步地，表达creg蛋白的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤的药物中的应用，所述的重组载体为重组腺病毒载体。

能够抑制creg蛋白或其活性片段表达下调的制剂，在制备用于高盐诱导的肾脏损伤药物中的的应用。

creg蛋白或其活性片段用于筛选预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤的药物的应用。

检测creg蛋白表达水平的试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断高盐诱导的肾脏损伤。

进一步地，组合物，其含有creg蛋白、表达creg蛋白的重组载体或重组细胞、或者能够抑制creg蛋白表达下调的制剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤的药物中的应用。

试剂盒，其含有检测creg蛋白表达水平的试剂，所述试剂盒用于诊断高盐诱导的肾脏损伤。

creg蛋白用于对抗高盐诱导的肾脏损伤的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下。

本发明通过大量实验证明，在dahl-s大鼠高盐诱导肾脏损伤时，creg在rna和蛋白水平表达下降。与对照组相比较dahl-s大鼠高盐喂养8周后肾功能下降，肾脏纤维化明显加重。dahl-s大鼠高盐1周后同时给予外源性重组creg蛋白后肾功能得到显著改善，肾脏纤维化程度减轻；并且，研究发现dahl-s大鼠高盐1周后同时给予血管舒张剂肼苯哒嗪并不能改善肾功能和肾脏纤维化。以上结果说明creg蛋白能够改善高盐诱导的肾脏损伤，保护肾功能，这种保护作用不依赖其降压作用。进一步深入研究发现高盐诱导肾脏纤维化时tgf-β表达量增加，其信号通路中的smad2表达量增加，而smad7表达下降。给予外源性重组creg蛋白后tgf-β表达量下降，而发挥抑制纤维化作用的smad7表达量升高。可见，给予外源性重组creg蛋白能够通过调控tgf-β/smad7信号通路来对抗高盐诱导肾脏损伤，creg在保护高盐诱导的肾脏损伤过程中起重要调控作用，creg蛋白用于对抗高盐诱导的肾脏损伤的医药用途，将creg蛋白或其活性片段制备用于预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤的药物。因此，本发明提供creg蛋白在盐敏感的高血压肾损伤时对肾脏的保护作用及其分子机制，提供creg蛋白保护高盐诱导的肾脏损伤的医药用途，为高血压肾损伤的治疗提供新的依据。

在本发明的实施方案中，其中所述的重组腺病毒载体为人腺病毒5型ad5-creg，其于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心（cctcc，武汉，武汉大学），保藏号为cctcc－v200801，该保藏信息已在中国专利cn101475961a中公开。

在本发明的实施方案中，所述能够抑制creg蛋白表达下调的制剂例如能够降低在高盐诱导肾脏损伤时creg蛋白下降的制剂。

在本发明中，所述creg蛋白（即人e1a激活基因阻遏子蛋白，cellularrepressorofe1a-stimulatedgene）既包括具有完整序列的creg蛋白，也包括具有creg蛋白功能的只含有部分序列的creg蛋白。

在本发明的实施方案中，所述creg蛋白的genbank号为np_003842.1。

在本发明的实施方案中，所述creg基因的genbank号为nm_003581.2。

在本发明中，所述预防和/或治疗高盐诱导的肾脏损伤是指抑制或减缓高盐诱导的肾脏损伤的发生、进展、和/或逆转病理改变。

在本发明中，所述载体例如为原核表达载体、真核表达载体、噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为pet载体、pgex载体，所述真核表达载体例如为pcdna3.1、pegfp-c1、ppic9k，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λb，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。

在本发明的实施方案中，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。

在本发明的实施方案中，所述重组腺病毒载体为ad-creg-gfp。

在本发明中，所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动物细胞。所述细胞可以通过向原核细胞或真核细胞中引入重组载体而得到。

在本发明中，所述原核细胞例如可以为大肠杆菌dh5α、jm109、top10等，所述真核细胞例如可以为cho细胞、293t细胞、血管平滑肌细胞等，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人等。

在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或载体的宿主细胞，例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中；或者，可使用脂转染试剂如fugene6、x-tremegene和lipofectamine；或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒病毒载体将核酸引入细胞中。

在本发明中，可以通过本领域公知的方法检测creg蛋白的表达水平，例如通过扩增creg蛋白的mrna并进行定量或者westernblot来检测creg蛋白的表达水平。

在本发明中，所述蛋白的表达水平是指mrna的水平或者蛋白的水平。

在本发明中，所述上调/下调组织/细胞中蛋白的表达是指提高或降低组织/细胞中蛋白质水平或mrna水平的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，或者提高大于100%。其中所述的上调或下调是与未干预的组织/细胞例如转染对照载体组的组织/细胞进行比较。

附图说明

图1是高盐饮食诱导肾脏纤维化时，cregmrna和蛋白水平表达显著下调。其中a是给予dahl-s大鼠高盐饮食8周，结果发现肾脏发生严重纤维化；b-c是高盐饮食诱导dahl-s大鼠肾脏肾纤维化时creg在mrna和蛋白水平显著下调。

图2是重组creg蛋白能够改善肾功能和延缓肾脏纤维化，其中a-c为正常饮食、高盐喂养和同时给予高盐及外源性重组creg蛋白的三组dahl-s大鼠的肾功能比较；d-e为上述三组大鼠模型肾重/体重比值、肾重/胫骨长度的比较；f为上述三组dahl-s大鼠及同时给予高盐和血管舒张剂肼苯哒嗪组间肾脏纤维化的比较；g为上述四组大鼠模型肾脏组织中相关蛋白表达的比较。

图3是重组creg蛋白能够抑制肾脏细胞凋亡，其中a-b为westernblot检测上述三组dahl-s大鼠肾脏细胞凋亡相关蛋白cleavedcaspase3/bax/bcl2的表达情况；c-d为tunel染色检测肾脏细胞凋亡情况。

图4是creg调控tgf-β1/smad7信号通路延缓肾脏纤维化，a为免疫组化染色检测上述三组dahl-s大鼠肾脏组织tgf-β1的表达情况；b为westernblot检测上述三组dahl-s大鼠肾脏组织tgf-β1的表达情况；c-d为westernblot检测上述三组dahl-s大鼠肾脏组织psmad2,smad2/3andsmad7的表达情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用spss17.0软件包处理。p<0.05为有统计学差异。

实施例1给予dahl-s大鼠高盐(8%nacl)喂养8周处理能够下调肾脏组织中creg蛋白的表达。

1）dahl-s大鼠肾脏纤维化模型的建立。

将8周龄dahl大鼠随机分为正盐组（ns,0.3%氯化钠）、高盐组(hs)，每组10只，持续喂养8周。应用鼠尾测血压的方法检测血压，masson染色检测大鼠肾脏组织纤维化情况。

2）肾脏组织纤维化后creg的rna水平检测。

采用rt-pcr的方法检测dahl-s大鼠肾脏中creg表达情况。取各组肾脏组织，加1mltrizol裂解液，提取总rna。根据genbank中大鼠cregmrna序列（nm_011804.2），设计并合成的大鼠creg基因rt-pcr引物如下。

大鼠creg上游引物。

mcreg-f:5’-tgtcgggaactgtgaccaag-3′。

mcreg-r:5′-ctttagttgttgaaatctgtg-3′。

gapdh-f:5′-tcaacgaccccttcattgac-3′。

gapdh-r:5′-atgcagggatgatgttctgg-3。

将提取的rna合成cdna后（takara公司的cdna第一链合成试剂盒。扩增条件是：37℃，15min；85℃，5s），通过下列反应体系和反应条件扩增出大鼠creg编码序列共250个碱基。

具体条件。

dh2o：9.5μl。

2×taqmastermix（康为公司）：12.5μl。

上游引物：1μl。

下游引物：1μl。

模板cdna：1μl。

95℃，3min。

94℃，30s；59℃，30s；72℃，1min，30个循环。

72℃，10min。

扩增产物经2%的琼脂糖凝胶分离检测，用eb染色显影，可检测到大小约为250bp的cdna表达条带。结果提示：两组间cregmrna水平未见明显异常，结果见图1。

3）应用westernblot检测肾脏纤维化时肾脏组织中creg蛋白的表达。

采用westernblot的方法检测各组大鼠肾脏中creg蛋白的表达情况。取各组肾脏组织，裂解后采用bca比色法试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度，将40μg蛋白加入4×loadingbuffer,95℃煮沸8min后，经10%分离胶行sds-page电泳，判断电泳终止时间。以350ma的电流将样品转到纤维素膜上，时间为80min；在tbs-t稀释的5%脱脂奶粉中常温封闭1.5h后加入一抗（抗creg1抗体1:1000,抗β-actin抗体1:2000）4℃孵育过夜；第二天放置摇床上摇晃半小时后tbs-t洗膜3次，每次15min；加入兔抗鼠的二抗（1:1000稀释），常温孵育2h，tbs-t洗膜4次，每次20min;ecl化学发光显影。

结果提示：高盐诱导肾脏纤维化后，creg蛋白的表达水平显著下降。

实施例2肾脏组织中creg蛋白的表达变化能够影响大鼠的肾功能和缓解肾脏纤维化。

1）正盐组(ns)、高盐组(hs)和高盐+重组creg(hs+recreg)蛋白组三组肾功能的比较。高盐喂养1周后给予重组creg蛋白，喂养8周后收集各组大鼠尿液，检测肾功能。结果显示，高盐+重组creg蛋白组大鼠肾功能较高盐组明显改善，提示重组creg蛋白改善了大鼠的肾功能，结果见图2。

2）上述三组大鼠肾脏纤维化的比较。

应用masson染色的方法检测高盐喂养8周后大鼠肾脏纤维化的情况。取材，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，masson染色，

研究结果显示：高盐+重组creg蛋白组肾脏纤维化情况较高盐组明显缓解，提示重组creg蛋白抑制了大鼠的肾脏纤维化，具有明显的保护作用，结果见图2。

实施例3在高盐诱导肾脏纤维化时给予外源性重组creg蛋白能够减少肾脏细胞的凋亡。

1）采用tunel染色的方法检测各组细胞的凋亡情况。tunel染色时需配制染色所需试剂后，将冰冻组织切片置4%的多聚甲醛中室温固定10min，pbs洗2次，每次10min。3%过氧化氢甲醇溶液20min后，pbs洗3次，每次5min，0.1%枸橼酸钠冰上2min，tunel染色配制液加入样本表面后37℃温箱孵育1h，避光；pbs浸洗，dapi染色细胞核。结果提示：高盐+重组creg蛋白组肾脏细胞凋亡数目较高盐组明显减少，结果见图3，说明creg具有对抗肾脏细胞凋亡的作用。

2）应用westernblot检测心肌中凋亡蛋白的表达。采用westernblot的技术方法检测肾脏细胞凋亡指标蛋白cleavedcaspase3/bax/bcl2的表达情况，结果发现在高盐组大鼠肾脏组织中的表达最多，而给予外源性重组creg蛋白后明显减少，结果见图3，结果验证了tunel染色的结果，再次说明了creg蛋白对抗肾脏细胞凋亡的作用。

实施例4给予重组creg后观察肾脏组织中tgf-β1/smad7信号通路的表达。

1）免疫组化染色观察tgf-β1的表达。

应用免疫组化染色发现给予高盐喂养8周后肾脏组织中tgf-β1的表达较正盐组明显增多，然而给予重组creg蛋白后tgf-β1的表达显著下调。

2）westernblot检测tgf-β1的表达。

应用westernblot方法发现给予高盐喂养8周后肾脏组织中tgf-β1蛋白的表达较正盐组明显增多，然而给予重组creg蛋白后tgf-β1的表达减少。结果表明creg能够调控tgf-β1的表达。

3）westernblot检测各组肾脏组织中psmad2,smad2/3andsmad7的表达情况。

采用westernblot的技术方法检测发现高盐组psmad2,smad2/3的表达升高，而smad7表达量下降，给予重组creg蛋白后能够明显的下调psmad2,smad2/3的表达量，升高smad7的表达量，结果见图4，提示重组creg蛋白调控tgf-β1/smad7信号通路，改善肾脏纤维化。

上述研究结果提示，重组creg蛋白有望成为治疗高盐诱导肾脏损伤的有效药物。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。