一种基于3D打印的具有血管化潜能的脊髓补片及其制备方法与流程

所属技术领域

本发明专利涉及一种用于修复脊髓损伤的3d打印补片材料，尤其是移植它后能够促进脊髓损伤处的血管化和引导再生神经纤维有序线性生长的补片材料。

背景技术：

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤疾病，损伤区神经束的断裂、组织的坏死及恶劣的微环境，都给损伤后的修复带来了困难。组织工程领域的发展在软骨、皮肤、膀胱等领域取了一定的进展，也为仿生的脊髓组织移植填补缺损的脊髓组织带来了曙光。其中血管化是组织工程研究的热点和难点之一。脊髓组织内有丰富而复杂的血管网络，起到氧气及营养物质交换的作用。直接在脊髓损伤区内移植组织细胞，等待宿主血管自行长入损伤/移植区域，往往需要数天的时间。这样的血管自行长入滞后行为，不利于损伤/移植区的神经纤维再生，因此，应用组织工程技术在体外预构建血管化潜能的脊髓补片，这将是脊髓损伤修复后血管化的有效策略之一。

3d打印技术是一种计算机辅助设计的固体分层制造快速成型技术。大体分为：熔融沉淀制造，力学性能好，高温限制活细胞的结合；光固化，力学性能差；选择性激光烧结/熔融，高强度；喷墨打印机三维打印等，其发展，为制备各种仿生生物材料带来了便捷。其中3d打印的墨水至关重要。明胶甲基丙烯酰基(methacrylategelatin，gelma)水凝胶是一种具有可调节特性的可见光交联生物材料，gelma水凝胶有接近胶原的生物兼容性，已广泛应用于脊髓损伤修复领域。利用gelma水凝胶利用3d打印技术仿生脊髓白质区域多通道的结构，为引导神经纤维的再生带来了可能。骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,bmsc)，是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，其中可以分化成内皮样细胞。间充质干细胞的临床研究已经在许多国家开展，美国批准了60余项临床试验，我国也有多项临床研究备案项目，是目前最具临床应用前景的成体干细胞之一。

目前在国内、外，一种基于3d打印的具有生物活性并能血管化的脊髓补片仍未见报道。我们设想构建一种血管化潜能且能促进神经纤维再生的材料。拟将这种具有血管化潜能且能促进神经纤维再生的的补片移植到脊髓损伤处，在促进神经纤维再生的同时，促使神经纤维再生处血管化，改善其中的微环境，促进受损伤脊髓的修复。本发明的目的是想克服现有临床上治疗脊髓损伤的技术和方法上的不足，应用我们构建的具有血管化潜能的脊髓补片为神经再生修复脊髓损伤提供新思路和新方法。

技术实现要素：

为了克服现有的生物活性支架移植治疗脊髓损伤的方案不足，本发明专利提供一种3d打印的具有血管化潜能的脊髓补片，该补片不仅能够促进脊髓损伤后血管化，而且能够通过支架的物理结构引导受损伤脊髓再生神经纤维于凹陷处有序线性生长。

本发明专利解决其技术问题所采用的技术方案是：

利用gelma水凝胶作为3d打印墨水，混合血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bfgf)及骨髓间充质干细胞(bmscs)，利用挤压式3d打印机挤压生物墨水，制备出具有间隔凸起的脊髓补片。移植后，补片上的vegf和bfgf缓慢释放到凹陷的通道处，作用于其中的bmscs，诱导其形成血管内皮细胞。补片中凹陷形成的通道可引导再生的神经纤维线性生长，达到修复脊髓损伤的目的。

本发明专利的有益效果是：

这种具有血管化潜能的功能生物活性补片移植到脊髓损伤处后，可以持续释放vegf和bfgf，促进bmscs分化成内皮样细胞，形成更多的毛细血管(即血管化)，改善损伤/移植区的微环境；同时，在补片凹陷形成的通道物理引导下，促使再生神经纤维线性生长。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明专利进一步说明。

图1是3d打印的具有血管化潜能的脊髓补片的俯视模式图。灰色网格代表凸起的是混合了血管化因子(vegf和bfgf)和细胞(bmscs)的水凝胶(gelma)层；黄色代表bmscs。

图2是3d打印的具有血管化潜能的脊髓补片的侧面观模式图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器、生物补片和试剂作详尽的描述:

1.主要仪器

超净工作台(苏州净化电子设备厂)；气压式3d打印机；普通离心机(久保田日本)；恒温水浴箱(北京医疗设备厂)；5％co2培养箱(queue美国)；倒置相差显微镜(olympus日本)；荧光显微镜(leica德国)；扫描电镜(philips荷兰)；透射电镜(philips荷兰)；激光共聚焦成像系统(carlzeiss德国)；低温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高压消毒锅(江阴滨江医疗设备厂)；恒冷箱切片机(shandon英国)；超纯水仪(molsheim法国)；酶联免疫检测仪(bio-rad美国)；电泳仪电源(bio-rad美国)；垂直板电泳槽(bio-rad美国)；电转仪(bio-rad美国)；超高速低温离心机(beckman美国)；-80℃超低温冰箱(revcotech美国)；jy92-2d超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2.主要试剂

dmem-lg(gibico)，优级胎牛血清(tbd)，多聚赖氨酸(sigma)，d-hank’s平衡液(自配)，胰蛋白酶(sigma)，edta(sangon)，0.01mol/lpbs(中杉金桥)，mtt(ameresco公司)，二甲基亚砜(dmso，sangon)，hoechst33342(sigma)，dapi(sigma)，山羊血清(中杉金桥)，小鼠抗vwf单克隆抗体(sigma)，cy3标记羊抗小鼠igg(jacksonimmunoresearch)，calcein-am/ethd-ⅲlive/deadkit(biotium)，兔抗大鼠nf单克隆抗体(sigma)，小鼠抗大鼠nf单克隆抗体(sigma)，兔抗大鼠α-sma多克隆抗体(sigma)，小鼠抗大鼠mbp单克隆抗体(millipore)，山羊抗小鼠fitc(jacksonimmunologicalresearch)，cy3标记的羊抗小鼠igg(jacksonimmunoresearch)，cy3标记羊抗兔igg(jacksonimmunoresearch)，dylight405标记的羊抗小鼠igg(jacksonimmunoresearch)，amca标记羊抗兔igg(jacksonimmunoresearch)，山羊抗兔hrp(jacksonimmunoresearch)，蛋白定量检测试剂盒(鼎国)，细胞裂解液(boster)，蛋白酶抑制剂cocktail(sigma)，ecl发光底物检测试剂盒(康为世纪)，epon-812(tedpella)，考马斯亮蓝(bio-rad)，30％聚丙烯酰胺溶液(康为世纪)，x感光胶片(kodak)。

本发明详细的具体操作技术说明如下:

3.血管化脊髓补片的制备

1.1骨髓间充值干细胞(mscs)的体外分离、培养及纯化

将幼年sd大鼠(体重约50g,出生后7d)在碘酒中处死,无菌条件下快速获取两侧股骨。剪去股骨两端,用含10％胎牛血清(fbs)和抗生素(青霉素10⁵iu/l、链霉素100g/l)的l-dmem培养液反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液,接种到涂有多聚赖氨酸的50ml培养瓶中,置入37℃、5％co2培养箱中培养。第2d半量换液,以后每隔2～3d全量换液。6～12d待细胞长至接近70％～80％汇合时,弃旧培养液,用d-hanks液清洗3次,加入0.25％胰酶(0.02％edta)消化1min。再用含10％fbs的l-dmem培养液终止消化。用吸管轻轻吹打细胞,收集细胞悬液,1000r/min离心5min,弃上清,用含10％fbs的l-dmem培养液重新悬浮细胞。按1:2接种传代(p1代)后继续培养。当细胞再长至接近融合时,同样按照上述方法1:2进行传代。到p3～p5细胞纯度和活力较好时接种材料。

1.2生物墨水制备

将7.5％(w/v)gelma、25％(v/v)peg和0.225％(w/v)lap溶解于生理盐水中，制成用于打印的基质复合物。将1×10⁶mscs、20ng/mlvegf因子、10ng/mlbfgf及基质复合物混合成生物墨水。

1.3补片打印

根据脊髓创面大小建模，将其导入dmd芯片中，在打印过程中控制微镜。采用gelma、25％(v/v)peg和0.225％(w/v)lap的方法设计补片，以提高印刷支架的机械强度。将生物墨水溶液装入带有2mm聚二甲基硅氧烷间隔物的容器中，以控制印刷支架的z轴高度。然后将通道(直径200μm)整合到补片表面，为轴突再生提供线性指导。使用软件控制3d打印机，启动连续打印过程。支架分两步打印，每步0.8s长，一步用于基底膜打印，另一步用于血管化通道的打印。然后将印刷补片从储液罐中取出，用无菌的dulbecco的磷酸盐缓冲盐水和抗生素(1％penstrep)冲洗三次。

4.体外检测补片的性能

2.1孔隙率

将补片浸入体积为v0的无水乙醇中5min，负压脱气至导管无气泡逸出，浸没补片后的乙醇体积记录为v1；取出补片后剩余乙醇的体积为v2,按下列公式计算导管的孔(％)＝(v0-v2)/(v1-v2)×100％。测定导管(n＝3)的孔隙率(％)，取平均值。

2.2吸水率

补片放在pbs溶液中质量的变化，w0表示空白质量，wt表示滲泡pbs溶液t时间后的质量。

2.3力学性能

将补片浸入37℃下ph为7.4的0.01mol/lpbs中24h，在试验机上进行补片的压缩力学性能测试，0.5hz正弦波形，预载荷为0.1n，最大压缩应变10％，计算机屏幕上显示其应力-应变曲线，得出补片的弹性模量，分析导管(n＝3)的力学性能。

5.移植到大鼠体内的效能

大鼠脊髓全横断模型制备:选用成年雌性大鼠，体重约220g，每组大鼠各3-5只，在3组大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉，在消毒条件下切开皮肤，分离肌肉，切除t9和t10脊柱椎板，并在t9椎板中位全横断脊髓(此处位于t9和t10脊髓节段分界处)，并切除其后2mm脊髓组织块，清除损伤腔内残留的神经纤维。将3d打印的具有血管化潜能的脊髓补片包卷曲成厚3mm、直径2mm的圆柱形移植物，然后将其移植到全横断脊髓缺损处。在手术伤口充分止血后，逐层缝合肌肉和皮肤。术后每只动物腹腔内注射青霉素5万单位/d，连续注射3d，必要时给与补液。每天人工排尿，按常规饲养大鼠。

移植大鼠饲养30d后，使用4％多聚甲醛固定。每只大鼠各取损伤/移植区前后共1cm长的脊髓进行纵切片，切片隔5取1。检测3d打印的具有血管化潜能的脊髓补片包卷曲成的圆柱形移植物在脊髓损伤/移植区内形成毛细血管的数量和再生神经纤维的线性生长。