用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物、用途及蜜蜂养殖方法与流程

本发明涉及特种经济动物养殖领域，具体为一种用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物、用途及蜜蜂养殖方法。

背景技术：

东方蜜蜂微孢子(nosemaceranae)属于真菌、细胞内寄生虫，主要感染蜜蜂肠道的上皮细胞。当东方蜜蜂微孢子进入蜜蜂肠道后，会伸出空心极管，并且将极管刺入上皮细胞。通过极管，孢子原质被注射到蜜蜂肠道上皮细胞内，并开始繁殖。最终，被感染的蜜蜂肠道上皮细胞会破裂，并且释放出更多的成熟孢子。这些成熟孢子可以立即感染新的上皮细胞，也可以通过粪便排出体外，以感染其它蜜蜂个体。

因此，东方蜜蜂微孢子对蜂群危害很大，是造成蜜蜂大量死亡的重要因素，当蜜蜂被东方蜜蜂微孢子感染后，其寿命、免疫力、飞行能力和记忆力都显著下降。目前可以用抗生素防治东方蜜蜂微孢子感染，但是会导致微孢子产生耐药性，并且还会严重污染蜂产品。

桉叶油(eucalyptusoil)是桉树叶、枝经过蒸汽蒸馏而得，主要成分为桉树脑，并含少量萜烯类，多用于止咳、漱口剂和配置牙膏等，美国食品药品监督管理局(fda)将桉叶油归入“一般认为安全(gras)”之列，其对于细菌、螨和滴虫等感染表皮的微生物具有抑制作用，但是对于在细胞内繁殖的寄生虫(细胞内寄生虫)，尤其是对于蜜蜂养殖中常见的东方蜜蜂微孢子虫的作用未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物、用途及蜜蜂养殖方法，其将作为天然植物提取物的桉叶油作为有效成分，以此有效杀灭蜜蜂体内感染的东方蜜蜂微孢子，同时不会污染蜂产品。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

一方面，提供了一种用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物，所述组合物包括：桉叶油以及糖水，且按体积比计，桉叶油：糖水＝1：(18-20)。

优选的，所述糖水由葡萄糖/蔗糖和水配制而成，且葡萄糖/蔗糖与水的重量比为1：(1-1.5)。

优选的，所述桉叶油来自桉树叶和/或桉树枝。

另一方面，还提供一种上述用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物在制备防治东方蜜蜂微孢子虫病的药物中的用途。

另一方面，还提供一种蜜蜂养殖方法，其包括如下步骤：s1、制备制上述组合物；s2、让蜜蜂自由取食。

与现有技术相比，本发明可使得蜜蜂体内东方蜜蜂微孢子虫的平均相对含量降低80％，能极显著地抑制东方蜜蜂微孢子虫的繁殖，同时，饲喂本发明的组合物后，蜜蜂的免疫基因hymenoptaecin的相对平均表达量显著提高，使得蜜蜂的免疫应答得到显著提升，抗病力增强，进一步的，本发明的组合物还能显著提高蜜蜂卵黄蛋白表达量，以此延长蜜蜂寿命。同时，本发明的组合物、用途及养殖方法为绿色环保方案，其不会对蜂产品以及养蜂环境造成污染。

附图说明

图1为饲喂本发明的组合物后，蜜蜂体内东方蜜蜂微孢子的平均相对含量；

图2为饲喂本发明的组合物后，免疫基因hymenoptaecin的相对平均表达量；

图3为饲喂本发明的组合物后，卵黄蛋白(vitellogenin)的相对平均表达量。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

本实施例提供了一种用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物，所述组合物包括：桉叶油以及糖水，且按体积比计，桉叶油：糖水＝1：(18-20)(优选为1:19)。

其中，所述糖水由葡萄糖/蔗糖(即葡萄糖和蔗糖中的一种)和水配制而成，且葡萄糖/蔗糖与水的重量比为1：(1-1.5)(优选为1:1)；同时，所述桉叶油来自桉树类植物(例如蓝桉、小叶桉和赤桉)的桉树叶和/或桉树枝，如，可将桉树叶、枝经过蒸汽蒸馏制得所述桉叶油。

实施例二：

本实施例与实施例一的不同之处仅在于，所述组合物由桉叶油以及糖水配制而成，且按体积比计，桉叶油：糖水＝1：(18-20)(优选为1:19)。

实施例三：

本实施例提供了实施例一或二所述的用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物在制备防治东方蜜蜂微孢子虫病的药物中的用途。

实施例四：

本实施例提供了一种蜜蜂养殖方法，其包括如下步骤：

s1、配制实施例一或二所述的组合物；

s2、让蜜蜂自由取食。

以下通过具体实例说明本发明的技术效果：

1.组合物配制

将50微升桉叶油与950微升糖水(糖和水的重量比为1：1)混合，配置成终浓度为500ppm的溶液，所述溶液即为本发明中用于防治东方蜜蜂微孢子虫病的组合物。

2.东方蜜蜂微孢子制备

2.1收集东方微孢子：收集蜜蜂，解剖出肠道组织，运用percoll纯化方法提纯蜜蜂肠道组织内的东方蜜蜂微孢子。其具体方法包括：

①碾碎：在单纯水中将蜜蜂肠道组织碾碎，获得碾碎液；

②过滤：将碾碎液倒入滤纸中过滤，滤纸孔径为65微米；

③离心：3000转/min条件下离心5分钟，倒掉上清液；

④纯化：将沉淀重新溶解在1毫升单纯水中，然后从下至上缓慢倒入25％、50％、75％、100％的percoll分层梯度溶液；

⑤离心：将percoll分层梯度溶液在5000转/min条件下离心20分钟；

⑥溶解：倒掉上清梯度溶液，将沉淀再次溶解在1毫升单纯水中；

⑦重复④、⑤、⑥步3次。

⑧在光学显微镜下，用血细胞计数器计算东方蜜蜂微孢子数目，并用1：1糖水配置成50000孢子每微升的溶液备用。

2.2确认东方蜜蜂微孢子物种：提取从蜜蜂肠道组织中收集到的东方蜜蜂微孢子dna(qiagen,dneasyplantminikit)；再根16srna基因设计好引物，通过pcr验证提纯化的是否是东方蜜蜂微孢子，以确定没有其他种类的微孢子污染。其具体方法包括：

①引物设计及合成：

运用引物设计软件设计并合成如下引物：

nosemaceranae–正向引物cgttaaagtgtagataagatgtt

通用反向引物gacttagtagccgtctctc

②pcr扩增反应：

反应体系：1μldna(100ng)模板，0.5utaqpolymerase聚合酶，2×taqreactionbuffer缓冲液，0.3mmdntp(dntpmix)，0.4μm镁离子，0.4μm正向引物，0.5μm反向通用引物，反应体系总共10μl。

反应条件：95℃预变性2分钟，95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后，75℃后延伸5分钟。

pcr反应结束后，取出反应产物，用1μl上样缓冲液和5μlpcr产物在80v电压和140ma电流下进行琼脂糖凝胶电泳40min，在凝胶成像系统中观察结果。条带为143bp的即说明提取的是东方蜜蜂微孢子(nosemaceranae)。

3.东方蜜蜂微孢子和组合物的饲喂

收集新出房的蜜蜂，每只蜜蜂饲喂2.25*10⁵个东方蜜蜂微孢子，一共饲喂360只蜜蜂。每30只蜜蜂为一组，放在饲喂杯中饲养，一共12个饲喂杯。将配好的组合物不间断提供给其中6个饲喂杯中的蜜蜂，供蜜蜂自由采食；另外6个饲喂杯中的蜜蜂不间断提供糖水作为对照。6天之后，将每个饲喂杯中的蜜蜂混合提取rna，用荧光定量pcr的方法检测东方蜜蜂微孢子、免疫基因hymenoptaecin和卵黄元蛋白相对含量。

4.结果分析

从图1中可以看出，对照组中仅饲喂糖水的蜜蜂体内东方蜜蜂微孢子的平均相对含量为2.2，而饲喂本发明组合物的蜜蜂体内东方蜜蜂微孢子的平均相对含量为-6.2，通过统计学t检验(t＝-3.8，p-value<0.01)显示饲喂本发明的组合物能极显著地抑制微孢子的繁殖，相对对照组而言，饲喂本发明的组合物后，蜜蜂体内的东方蜜蜂微孢子数量能减少80％。

不仅如此，如图2所示，饲喂本发明组合物之后，蜜蜂的免疫基因hymenoptaecin的相对平均表达量为0.55，而仅饲喂糖水的蜜蜂免疫基因hymenoptaecin的相对平均表达量为-4.5，通过统计学t检验(t＝2.357,p-value<0.05)说明本发明组合物可极显著显的促进免疫基因hymenoptaecin的表达，使得蜜蜂的免疫应答水平显著提升，由此增强抗病力增强。

此外，卵黄蛋白(vitellogenin)是蜜蜂健康指数的重要指标，卵黄蛋白表达量高，说明蜜蜂可以获得更长的寿命。如图3所示，饲喂本发明组合物之后，蜜蜂卵黄蛋白的平均相对表达量为-2.9，而仅饲喂糖水的蜜蜂卵黄蛋白相对平均表达量为-5.4，说明饲喂本发明组合物可促进蜜蜂卵黄蛋白的表达量，相对仅饲喂糖水的蜜蜂而言，卵黄蛋白相对平均表达量增加45％，说明本发明组合物有助于延长蜜蜂寿命。

本发明可使得蜜蜂体内东方蜜蜂微孢子虫的平均相对含量降低80％，能极显著地抑制东方蜜蜂微孢子虫的繁殖，同时，饲喂本发明的组合物后，蜜蜂的免疫基因hymenoptaecin的相对平均表达量显著提高，使得蜜蜂的免疫应答得到显著提升，抗病力增强，进一步的，本发明的组合物还能显著提高蜜蜂卵黄蛋白表达量，以此延长蜜蜂寿命。同时，本发明的组合物、用途及养殖方法为绿色环保方案，其不会对蜂产品以及养蜂环境造成污染。

需要说明的是，上述实施例一至四中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本申请的保护范围。在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。