递送siRNA药物的阳离子脂质体及其制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种递送sirna药物的阳离子脂质体。

背景技术：

小干扰rna(smallinterferingrna,sirna)是双链的小分子核酸，在转录后发挥基因沉默作用，可特异性抑制疾病相关靶基因的mrna的表达从而发挥治疗效果。随着sirna生物学机制的阐明和sirna合成方法的快速发展，绝大多数的基因可通过sirna技术进行沉默，以弥补小分子药物的不足。目前，已有多个sirna药物进入不同阶段的临床实验。但是，sirna体内应用存在着如下的难题：sirna注射给药后血液中的稳定性差，体内滞留时间短，细胞摄取效率低，缺少细胞内溶酶体的逃逸能力等。

脂质体是由一层或者多层的磷脂双分子层组成的封闭的囊泡状结构。当磷脂膜分散在过量的水中即可形成此结构。脂质体具有很高的生物相容性和生物可降解性，因此它可以被用来递送多种活性成分，包括化疗药物、反义寡核苷酸、dna、sirna、抗原和蛋白质。脂质体的内部与外部均为亲水相，磷脂双分子层中为亲油相，药物可根据其极性包裹于磷脂双分子中或内外水相中。目前已经有七种以脂质体作为载体的药物经fda批准进入临床中应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种阳离子脂质体，其与sirna混合后可包载sirna，并以较高的转染率向体内的细胞中递送sirna，并可避免sirna在转染前在体内被降解。

本发明提供的技术方案如下：

一种递送sirna药物的阳离子脂质体，其包含如下组分：dotap、hspc、dope、chol和dspe-peg2000，各组分的重量比例为dotap：hspc：dope：chol：dspe-peg2000=60：68：64：89-x：x，其中，x=35~45。

本领域技术人员熟知，dotap是指(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺、hspc是指氢化大豆卵磷脂、chol是指胆固醇、dope是指二油酰磷脂酰乙醇胺、dspe-peg2000是指二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。

进一步地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述阳离子脂质体粒径为100~150nm。

进一步优选地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述阳离子脂质体粒径为110~130nm。

进一步地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述阳离子脂质体zeta电位为50~70mv。

优选地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所包含的各组分的比例为：各组分的重量比例为dotap：hspc：dope：chol：dspe-peg2000=60：68：64：50：39。

进一步地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其由以下方法制备而成：

称取所述dotap、hspc、chol、dspe-peg2000和dope，溶于混合有机溶剂中，40~45℃减压旋转蒸发2~4h除去有机溶剂，加入纯水60℃水浴下水化40~55min，冰浴条件下超声处理脂质体10min，通过挤出器挤出200nm膜5~15次得到的阳离子脂质体。

进一步地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中所述混合有机溶剂为氯仿和甲醇按体积比4：1混合制成。

优选地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中减压旋转蒸发的温度为42℃，旋转蒸发时间为2h。

优选地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中水浴下水化时间为45min。

优选地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中所述超声条件为100w，工作1s和间隔1s重复进行。

优选地，本发明所述的递送sirna药物的阳离子脂质体，其中，所述制备方法中通过挤出器挤出200nm膜15次得到的阳离子脂质体。

本发明能实现的技术效果为：

阳离子脂质dotap可与带负电荷的无义sirna通过静电作用形成脂质体／sirna复合物，具有高效的体外转染效率。同时复合物也易于与带负电荷的细胞表面结合，有利于将sirna通过细胞膜融合或者受体介导的胞吞作用递送入细胞内。

dope可以帮助转染，其与dotap产生协同作用，加入dope可进一步提高转染效率。

加入hspc和胆固醇可增加脂质体的磷脂膜的刚性，提高脂质体的稳定性，同时使得sirna与脂质体结合的更加牢固，从而提高转染效率。

dspe-peg2000可以为脂质体提供保护，减少脂质体与血清中的物质结合，防止sirna/载体被血液中的血浆蛋白所吸附，提高载体在体内的循环时间。但是dspe-peg2000的加入对脂质体粒径、pdi和zeta电位产生较大影响，从而影响转染效率，因此发明人对配方进行了优化，得到了即能保持高效转染，又能在血浆中保持稳定的sirna脂质体载体。

经发明人试验发现，本发明制备的递送sirna药物的阳离子脂质体，转染效果好，能使sirna高比率快速到达靶部位发挥作用，脂质体与sirna结合牢固，在血液中不易降解，且作为药物在放置过程稳定性好，毒副作用低。本发明脂质体为100~150nm，优选为110~130nm，根据epr效应，脂质体的粒径在200nm以下，才能保证脂质体能更好的进入肿瘤部位，使sirna发挥治疗作用，本发明脂质体zeta电位为50~70mv，电位过小，不利于脂质体通过静电吸附作用吸附基因（rna或者质粒），电位过大，会引起较大的细胞毒性，产生较大的副作用。

附图说明

图1实施例1阳离子脂质体的粒度分布图；

图2实施例1阳离子脂质体透射电镜图；

图3实施例1阳离子脂质体4℃储存2周粒径和zeta电位图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：阳离子脂质体的制备

精密称取6.0mgdotap，6.8mghspc，5.0mgchol，3.9mgdspe-peg2000和6.4mgdope溶于混合有机溶剂（8ml氯仿，2ml甲醇），水浴超声2min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0ml超纯水60℃水浴下水化45min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10min（100w，工作1s，间隔1s），通过挤出器挤出200nm膜15次得到最终的阳离子脂质体。

实施例2：阳离子脂质体的制备

精密称取6.0mgdotap，6.8mghspc，5.4mgchol，3.5mgdspe-peg2000和6.4mgdope溶于混合有机溶剂（8ml氯仿，2ml甲醇），水浴超声2min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0ml超纯水60℃水浴下水化45min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10min（100w，工作1s，间隔1s），通过挤出器挤出200nm膜15次得到最终的阳离子脂质体。

实施例3：阳离子脂质体的制备

精密称取6.0mgdotap，6.8mghspc，4.4mgchol，4.5mgdspe-peg2000和6.4mgdope溶于混合有机溶剂（8ml氯仿，2ml甲醇），水浴超声2min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0ml超纯水60℃水浴下水化45min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10min（100w，工作1s，间隔1s），通过挤出器挤出200nm膜15次得到最终的阳离子脂质体。

对比例1：

称取8.9mgchol，0mgdspe-peg2000，其他操作同实施例1。

对比例2：

称取6.4mgchol，2.5mgdspe-peg2000，其他操作同实施例1。

对比例3：

称取3.4mgchol，5.5mgdspe-peg2000，其他操作同实施例1。

实施例4：阳离子脂质体的制备

精密称取6.0mgdotap，6.8mghspc，5.0mgchol，3.9mgdspe-peg2000和6.4mgdope溶于混合有机溶剂（8ml氯仿，2ml甲醇），水浴超声2min，使其充分溶解，42℃水浴下减压旋转蒸发2h除去氯仿和甲醇，在瓶壁形成一层薄膜，加入2.0ml超纯水60℃水浴下水化45min。将脂质体转移至试管中，冰浴条件下使用超声波细胞破碎仪探头超声处理脂质体10min（100w，工作1s，间隔1s），通过挤出器挤出200nm膜5次得到最终的阳离子脂质体。

实施例5：阳离子脂质体的粒径及表面电位(zetapotential)的测定

将实施例1~3、对比例1~3阳离子脂质体用超纯水稀释10倍后，采用马尔文粒度仪nanozs90测定其粒径分布（实施例1脂质体粒径分布见附图1）及其表面电位，结果见表1：

表1不同chol和dspe-peg2000质量比对脂质体粒径、电位及pdi影响

从表1中可以发现，当阳离子脂质体修饰peg之后，粒径会变小，这是因为dspe-peg2000的增加了整个脂质体的压缩性。随着dspe-peg2000的含量增加，pdi减小，同时，peg屏蔽了表面的正电荷，导致zeta电位减小。pdi小于0.2的脂质体具有更好的分散性，zeta电位大于50mv更有利于吸附负电荷的sirna药物。因此，我们选取chol：dspe-peg2000=89-x：x，其中，x=35~45。

注：pdi（polydispersityindex）为多分散系数，是由累积距法得到的一个无纲量的值，代表的是粒子尺寸的分布宽度。由dsl测得的值大小在0-1之间，pdi值越小，表明样品的粒子尺寸分布越狭窄。

实施例6：阳离子脂质体透射电镜（tem）检测

利用透射电镜负染技术，对制备好的脂质体进行透射电镜检测，目的是观察实施例1所制备脂质体的形态。

结果如附图2所示，观察到所制备的脂质体外观呈圆球形，通过对脂质体颗粒半高宽的测量，结果得到脂质体粒径大约为110~130nm。

实施例7：阳离子脂质体的体外稳定性考察

将实施例1制备的阳离子脂质体保存在4℃冰箱中保存，在两周内每隔一定时间取出，用超纯水稀释10倍后测定其粒径和zeta电位，结果如表2所示，说明实施例1阳离子脂质体在2周内粒径和电位没有发生明显的变化，表明其在4℃下的保存稳定性较好，如附图3所示。

表2实施例1脂质体稳定性考察

实施例8：细胞摄取实验

实验组为脂质体组，将ags细胞（小鼠胃癌细胞）按照300000个细胞每孔的密度接种于12孔板，每孔添加2ml含10%胎牛血清和1%双抗（耐氨苄青霉素和卡那霉素）的rpmi1640培养基，37℃、5%co2条件培养箱培养24h后，弃去培养基，用pbs清洗两次，每孔加入10µlfam-sirna（浓度：0.008od/µl，序列（5’-3’）为：uucuccgaacgugucacgutt）和30µl实施例1制备的阳离子脂质体，补充1%双抗的rpmi1640培养基至2ml，继续在培养箱中培养1h、4h、6h后吸去培养液，用预冷的pbs洗两次，采用2ml4%的多聚甲醛固定20min，加入2mlhoechst33258细胞核染料（2μg/ml），室温孵育10min，冰pbs润洗五次，在荧光显微镜下观察并拍照。另一组为空白对照组，以无脂质体载体的sirna在其他条件相同情况下进行转染。

fam-sirna在激发的条件下，fam基团能够发出绿色荧光，用hoechst33258细胞核染料，使得细胞核在激发的条件下，细胞核显示为蓝色。我们选取转染后1h、4h、6h为观察时间点，观察绿色荧光和蓝色荧光的表达情况。在每个时间点，采用相同的条件在显微镜下拍照，利用imagej定量每个时间点的绿色荧光和蓝色荧光的荧光强度，绿色荧光强度用fam-sirna表示，蓝色荧光用hochest表示。检测结果如表3：

表3细胞摄取试验检测结果（光密度值）

hochest的荧光强度在上述3个时间点变化不大，代表选取的拍照区域细胞数目基本无变化。fam-sirna的荧光强度，随着时间的推移显著上升，4h和6h相对于1h的荧光信号分别上升到3.6倍和5.7倍，说明绿色荧光代表的fam-sirna随脂质体穿过细胞膜进入细胞内部，随时间推移，进入细胞内部的比例增加。以上说明说明包载fam-sirna的阳离子脂质体能被细胞所摄取，并且具有较高的转染效率。

实施例9：转染效果试验

为验证本发明的脂质体转染效果，我们选取了keratin17（krt17）作为靶基因，利用本发明的实施例1制备的脂质体，向胃癌细胞系ags细胞中转染一条针对krt17的sirna，5’-3’方向的序列为：cgucaggugcguaccauug，对照sirna的序列为：uucuccgaacgugucacgutt。

在sirna转染ags细胞24h后，利用实时定量pcr的方法，检测了ags细胞中krt17mrna的相对表达量。具体方法如下：

1、细胞rna的提取及cdna的逆转录

吸去ags细胞培养液，并用pbs缓冲液清洗后，用trizol（invitrogen,carlsbad,ca,usa）裂解细胞。按1mltrizol加入0.2ml氯仿的量加入适量氯仿，震荡混匀，冰上静置15min后12,000rpm，4℃离心15min。取上层水相（约0.5ml）于新的rnaase-free的1.5mlep管中，加等体积异丙醇混匀，于-20℃静置30min以沉淀rna，12,000rpm，4℃离心15min。弃上清，沉淀的rna用1ml预冷75%乙醇洗一遍，于室温晾干后加入适量depc水溶解。用分光光度计检测充分溶解的rna在260nm处光吸收值，以确定rna的含量及纯度。取适量提取的总rna，利用rna快速逆转录试剂盒（takara,japan）逆转录成cdna。逆转录的cdna通过rt-pcr仪（roche,switzerland）检测相关基因mrna的相对表达量。

2、qpcr检测

1)反应体系为20μl，10μlybrmix（takara，japan），1μlcdna，1μl引物，8μl超纯水。

2)反应在rochelightcycler480或rotorgene2000仪器上进行。

3)反应条件为：95℃，2min，94℃，30s，60℃，1min，共40个循环，pcr结束后自动进入熔解曲线分析，以确定pcr产物的特异性。

4）数据分析：采用δδct法分析krt17mrna在ags细胞中的表达情况。

与对照sirna相比，krt17sirna能够显著降低，结果见表4：

表4转染效果试验数据

实施例10：空白阳离子脂质体毒性考察

将对数生长期的ags细胞以1×104cells/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，培养24h后，加入系列不同浓度的空白阳离子脂质体溶液（以不含血清的培养基进行稀释，并过0.45μm水膜除菌），平行操作三份。常规培养条件下避光孵育48h后，每孔加入10μl的cck-8溶液，继续孵育1h，并用酶标仪检测其吸光度值(a)。

结果见表5：

表5阳离子脂质体毒性考察数据

从结果可见，空白阳离子脂质体对ags细胞显示出一定的细胞毒性，这是由于脂质体表面的正电荷增加了细胞膜的通透性，使培养液中的双抗被细胞摄取，产生细胞毒性，是使用阳离子脂质体不可避免的问题。在最高浓度1000μg/ml条件下孵育48h后，细胞生存率大约在80%左右。而在50μg/ml和10μg/ml的浓度条件下孵育48h后，细胞生存率分别为95%和100%。根据上述数据，我们认为在浓度50μg/ml以下，载体对细胞的影响可控，有比较高的安全性。