金纳米簇及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种金纳米簇及其制备方法和应用。

背景技术：

癌症严重威胁人类生命健康，已然成为导致死亡的第二大原因，而且近20年来癌症呈现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高的趋势，每年就有1千万人死于癌症。

虽然近年来诊断设备和治疗技术有了很大的提高，但是目前临床上治疗恶性肿瘤常用手段主要有化疗、放疗和手术治疗。而化疗和放疗时抗肿瘤药物的药剂量高、对正常细胞的毒副作用大，能杀灭癌细胞，但对人体的正常细胞也一同杀害，而且绝大多数的化疗药物会给患者带来严重的不良反应。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种抗肿瘤效果好、毒副作用小的金纳米簇。

此外，还提供一种制备抗肿瘤效果好、毒副作用小的金纳米簇的制备方法及应用；还提供一种抗肿瘤效果好、毒副作用小的抗肿瘤药物。

一种金纳米簇，所述金纳米簇为苯硒酚修饰的金纳米簇，所述金纳米簇具有金原子和硒原子，所述金原子与所述硒原子以共价键结合。

上述金纳米簇通过金原子与硒原子键形成稳定的共价键结构，赋予金纳米簇抗肿瘤特性的官能团。经证实，该上述金纳米簇具有良好的抗肿瘤效果且毒副作用小。

在其中一个实施例中，所述金纳米簇的粒径不超过5nm。

一种金纳米簇的制备方法，包括以下步骤：

将金源、苯硒酚及还原剂混合后进行反应，得到金纳米簇。

在其中一个实施例中，所述金源为氯金酸。

在其中一个实施例中，所述还原剂选自还原型谷胱甘肽及柠檬酸钠中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述苯硒酚与所述还原剂的摩尔比为1:2～1:10。

在其中一个实施例中，所述将金源、苯硒酚及还原剂混合后进行反应，得到金纳米簇的步骤包括：

将还原剂与苯硒酚混合，得到混合物；

将所述混合物与金源混合后，得到粗产物；及

将所述粗产物纯化，得到所述金纳米簇。

在其中一个实施例中，所述将金源、苯硒酚及还原剂混合后进行反应，得到金纳米簇的步骤中，反应温度为60℃～80℃。

上述金纳米簇在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤药物包括上述金纳米簇。

附图说明

图1～图4依次为实施例1的auncs、实施例2的se1_au5ncs、实施例3的se1_au2ncs和实施例4的se1_au2’ncs的透射电镜图；

图5为实施例1的auncs、实施例2的se1_au5ncs、实施例3的se1_au2ncs的x射线光电子能谱图；

图6为实施例3的se1_au2ncs的波长与荧光强度关系图；

图7为不同浓度的实施例3的se1_au2ncs对胰腺癌细胞生长影响的共聚焦显微电镜图；

图8为不同浓度的实施例3的se1_au2ncs对黑色素瘤细胞生长影响的共聚焦显微电镜图；

图9为经实施例1的auncs、实施例3的se1_au2ncs及苯硒酚处理过的胰腺癌细胞的蛋白印迹结果图；

图10为实施例1的auncs与红细胞孵育之后的结果图；

图11为实施例3的se1_au2ncs与红细胞孵育之后的结果图；

图12为经过pbs、实施例1的auncs、苯硒酚、dox及实施例3的se1_au2ncs治疗14天之后的黑色素瘤瘤细胞；

图13为经过pbs、实施例1的auncs、苯硒酚、dox及实施例3的se1_au2ncs治疗14天之后的胰腺癌瘤细胞(包括脾脏)；

图14为经过pbs、实施例1的auncs、苯硒酚、dox及实施例3的se1_au2ncs治疗14天之后的胰腺癌瘤细胞(不包括脾脏)；

图15为图14的胰腺癌瘤细胞的体积统计图；

图16为实施例3的se1_au2ncs的细胞增殖实验结果；

图17为对比例1的se1_au2”ncs的透射电镜图；

图18为对比例1的se1_au2”ncs的细胞增殖实验结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明一实施方式提供了一种金纳米簇，该金纳米簇具有良好的抗肿瘤效果且毒副作用小。该金纳米簇为苯硒酚修饰的金纳米簇，具有金原子和硒原子，金原子与硒原子以共价键结合。通过金原子与硒原子键形成稳定的共价键结构，赋予了金纳米簇抗肿瘤特性的官能团。并且通过金原子与硒原子键形成稳定的共价键结构，使得金纳米簇的性质稳定，抗肿瘤效果稳定。

由于纳米材料具有高比表面积、尺寸小、高活性，能够携带药物直接进入肿瘤组织，并且直接作用于肿瘤细胞，通过经肾清除多余的药物，减少药物对正常细胞的毒副作用的同时也提高药物的治疗效果，避免产生耐药性。具有新型拓扑结构的金属纳米团簇在兼具以上纳米材料的优良性质外，还具有良好的生物相容性，多价效应和易于功能化和快捷的合成方法等优点。

硒(se)是人体中必不可少的微量元素，目前的纳米硒主要作为抗肿瘤药物的载体。硒原子的原料为苯硒酚。

在其中一个实施例中，金纳米簇的粒径不超过5nm。进一步地，金纳米簇的粒径为1nm～5nm。优选地，金纳米簇的粒径为2nm～4nm。金纳米簇的粒径为2nm～4nm时，金纳米簇的形貌更加稳定。

上述金纳米簇至少具有以下优点：

(1)经试验验证，上述金纳米簇通过诱导肿瘤细胞自噬并干扰肿瘤细胞肌动蛋白，从而有效抑制肿瘤细胞的增殖，抗肿瘤机理明确，表现出对多种肿瘤模型的优异抗肿瘤效率。

(2)上述金纳米簇尺寸较小，肿瘤细胞对上述金纳米簇的摄取量较高，从而使其在肿瘤细胞内维持较高浓度，具有较高抗肿瘤效果。

(3)上述金纳米簇经过了苯硒酚的修饰，以金纳米簇作为硒的运输载体，降低了硒的所需剂量，减少了对正常细胞的毒副作用，对临床应用具有重要的意义。

(4)上述金纳米簇具有荧光属性，能够为体外筛选试验提供了便利，可以不用对其进行进一步的修饰，就能观察到其与肿瘤细胞间的相互作用，探究其细胞摄取和溶酶体逃逸的性质。

(5)上述金纳米簇表面带有负电粒径范围窄、分散性好、在血清中稳定，可以直接注射使用，具有良好的生物相容性，生物安全性高。

本发明一实施方式还提供了一种上述金纳米簇的制备方法，包括步骤s110。具体地：

步骤s110、将金源、苯硒酚及还原剂混合后进行反应，得到金纳米簇。

具体地，金源为氯金酸。进一步地，氯金酸选自三水氯金酸及四水氯金酸中的至少一种。

具体地，还原剂选自谷胱甘肽及柠檬酸钠中的至少一种。需要说明的是，本文中的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽。

在其中一个实施例中，苯硒酚与还原剂的摩尔比为1:2～1:10。

在其中一个实施例中，将金源、苯硒酚及还原剂混合后进行反应，得到金纳米簇的步骤中，反应温度为60℃～80℃。

在其中一个实施例中，将金源、苯硒酚及还原剂混合后进行反应，得到金纳米簇的步骤包括操作s111～操作s113。具体地：

操作s111、将还原剂与苯硒酚混合，得到混合物。

在本实施方式中，混合的方式为搅拌混合。当然，混合方式不限于搅拌混合，还可以是本领域常用的其他混合方式。进一步地，在60℃～80℃条件下，将还原剂与苯硒酚搅拌混合。

操作s112、在60℃～80℃条件下，将混合物与金源混合后反应，得到粗产物。

操作s113、将粗产物纯化，得到金纳米簇。

具体地，纯化的方式为超滤。进一步地，将粗产物置于超滤管中进行超滤，以除去未反应的物质。进一步地，将放置由粗产物的超滤管离心，去除未反应的物质。

上述金纳米簇的制备方法至少包括以下优点：

(1)制备原料易得，且制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系成分明确。按照上述金纳米簇制备得到的金纳米簇保存和使用方便。

(2)通过上述金纳米簇的制备方法制备得到的金纳米簇形貌均匀、尺寸较小、粒径范围窄，有利于增加肿瘤细胞的摄取量，从而保证在肿瘤细胞内维持在较高浓度；另外，小尺寸的金纳米簇、分散性好、在血清中稳定，通过经肾清除排除体外，具有较高的生物安全性。

本发明一实施方式还提供上述金纳米簇在制备抗肿瘤药物中的应用。

一方面，上述金纳米簇具有良好的抗肿瘤效果且毒副作用小，对临床应用具有重要的意义。另一方面，上述金纳米簇具有荧光属性，能够为体外筛选试验提供了便利，可以不用对其进行进一步的修饰，就能观察到其与肿瘤细胞间的相互作用，探究其细胞摄取和溶酶体逃逸的性质。

本发明一实施方式还提供一种抗肿瘤药物，该抗肿瘤药物包括上述金纳米簇。

上述抗肿瘤药物包括上述金纳米簇，具有良好的抗肿瘤效果且毒副作用小。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)在圆底烧瓶中加入还原型谷胱甘肽(分子量307.33，100mm，0.6ml)水溶液，并添加超纯水至18ml。在70℃和500rpm的条件下温和搅拌5分钟后，向圆底烧瓶中加入三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司，20mm，2ml)，保持温度并反应24小时，得到含有未修饰的金纳米簇(下文简写为auncs)的粗产物。

(2)将步骤(1)获得的含有auncs的粗产物用超滤管进行超滤清洗除去未反应的物质，实验参数如下：8000转每分钟，20分钟。然后通过0.22微米过滤器(millipore)过滤灭菌，并保存于4摄氏度冰箱备用。

实施例2

(1)在圆底烧瓶中加入还原型谷胱甘肽(分子量307.33，100mm，0.6ml)水溶液和苯硒酚(分子量157.07，100mm，0.12ml)，并且添加超纯水至18ml。在70℃和500rpm的条件下温和搅拌5分钟后，向圆底烧瓶中加入三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司，20mm，2ml)，保持温度并反应24小时，得到含有苯硒酚修饰的金纳米簇(下文简写为se1_au5ncs)的粗产物。

(2)将步骤(1)获得的含有se1_au5ncs的粗产物用超滤管进行超滤清洗除去未反应的物质，得到实施例2的se1_au5ncs。其中，实验参数如下：8000转每分钟，20分钟。然后通过0.22微米过滤器(millipore)过滤灭菌，并保存于4摄氏度冰箱备用。

实施例3

(1)在圆底烧瓶中加入的还原型谷胱甘肽(分子量307.33，100mm，0.6ml)水溶液和苯硒酚(分子量157.07，100mm，0.3ml)，并且添加超纯水至18ml。在70℃和500rpm的条件下温和搅拌5分钟后，向圆底烧瓶中加入三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司，20mm，2ml)，保持温度并反应24小时，得到含有苯硒酚修饰的金纳米簇(下文简写为se1_au2ncs)的粗产物。

(2)将步骤(1)获得的含有se1_au2ncs用超滤管进行超滤清洗除去未反应的物质，得到实施例3的se1_au2ncs。其中，实验参数如下：8000转每分钟，20分钟。然后通过0.22微米过滤器(millipore)过滤灭菌，并保存于4摄氏度冰箱备用。

实施例4

(1)通过高分辨透射电子显微镜(tem,tecnaig2f20u-twin,feicompany,usa)分别对实施例1的auncs、实施例2的se1_au5ncs、实施例3的se1_au2ncs的形貌表征。结果如图1～图3所示。图1为实施例1的auncs的电镜图；图2为实施例2的se1_au5ncs的电镜图；图3为实施例3的se1_au2ncs的电镜图；图4为实施例4的se1_au2’ncs的电镜图。

由图1～图4可知，实施例1的auncs、实施例2的se1_au5ncs、实施例3的se1_au2ncs和实施例4的se1_au2’ncs的粒径均不超过5nm。

(2)采用x射线光电子能谱(xpsescalab250xi，thermofisherscientific，usa)分别将实施例1获得的auncs、实施例2获得的se1_au5ncs、实施例3获得的se1_au2ncs滴在硅片上并在室温下真空干燥过夜后检测各实施例的金纳米簇的化学元素含量，结果如图5所示。图5的横坐标为结合能(bindingenergy)

(3)通过紫外光分光光度计检测实施例3的se1_au2ncs的紫外光谱，结果如图6所示。图6的横坐标为波长(wavelength，nm)，纵坐标为荧光强度(fluorescenceintensity)。

由图6可知，实施例3的se1_au2ncs具有橘红色荧光。

(4)将不同浓度的实施例3的se1_au2ncs(0至128g/ml)与不同种类的肿瘤细胞进行孵育，通过calceinam/pi(dojindo，日本)对细胞进行染色，并通过激光共聚焦显微镜(lscm，zeisslsm710)评估细胞密度和形态。结果如图7～图8所示。图7为实施例3的se1_au2ncs对胰腺癌细胞生长影响的共聚焦显微电镜图；图8为实施例3的se1_au2ncs对黑色素瘤细胞生长影响的共聚焦显微电镜图。图7和图8中，calcein指钙黄绿素染色组，pi指碘化丙啶染色组；merge指两通道混合组。

由图7～图8可知，当se1_au2ncs浓度增加至32μg/ml时，se1_au2ncs表现出抑制肿瘤细胞伸展状态；当se1_au2ncs浓度增加至128μg/ml时，则出现肿瘤细胞数量减少的现象。

(5)将被实施例1的auncs、实施例3的se1_au2ncs及苯硒酚处理过的胰腺癌细胞裂解，通过蛋白印迹检测观察自噬和骨架蛋白的表达情况，结果如图9所示。图9中，control代表以pbs处理胰腺癌细胞的对照组；auncs代表以128μg/ml的auncs处理胰腺癌细胞的试验组；se代表以128μg/ml的苯硒酚处理胰腺癌细胞的试验组；se1_au2ncs代表以128μg/ml的se1_au2ncs处理胰腺癌细胞的试验组；lc3指自噬标志物蛋白质轻链3，作为自噬的标志物；actin是作为内参的肌动蛋白。

由图9可知，实施例3的se1_au2ncs能够有效的降低骨架蛋白的表达并且引起细胞自噬，实现杀害肿瘤细胞的作用。

(6)通过电感耦合等离子体分析(icp，icap6300，thermofisherscientific，usa)以测试金纳米簇的浓度。使用不同浓度的实施例1的auncs与红细胞孵育4小时，观察溶血现象，结果如图10所示。使用不同浓度的实施例3的se1_au2ncs与红细胞孵育4小时，观察溶血现象，结果如图11所示。图10和图11的上方为对应的溶血现象的实物。

从图10和图11中可以看出，实施例1的auncs和实施例3的se1_au2ncs的分散性好，在血清中稳定，具有较好的安全性，毒副作用小。

(7)通过黑色素瘤小鼠皮下模型和胰腺癌小鼠原位模型验证实施例1的auncs和实施例3的se1_au2ncs的治疗效果。结果如图12～图14所示。图12为从经过pbs、实施例1的auncs、苯硒酚、dox(阿霉素)及实施例3的se1_au2ncs治疗14天之后的黑色素瘤小鼠皮下模型上剥离的瘤细胞；图13为从经过pbs、实施例1的auncs、苯硒酚、dox及实施例3的se1_au2ncs治疗14天之后的胰腺癌小鼠原位模型上剥离的瘤细胞(包括脾)；图14为从经过pbs、实施例1的auncs、苯硒酚、dox及实施例3的se1_au2ncs治疗14天之后的胰腺癌小鼠原位模型上剥离的瘤细胞(不包括脾)；图15为胰腺癌小鼠原位模型上剥离的瘤细胞的体积统计图；图12～图15中pbs、auncs、se、dox及se_auncs分别表示经过pbs、实施例1的auncs、苯硒酚、dox及实施例3的se1_au2ncs处理的试验组。

由图12～图15可知，实施例3的se1_au2ncs具有优异的抗肿瘤效果，与抗肿瘤药物阿霉素(dox)相比，效果显著。

(8)用cck-8试剂盒检测实施例3的se1_au2ncs对黑色素瘤细胞a375细胞增殖的影响，结果如图16所示。图16中，横坐标为se1_au2”ncs的浓度(μg/ml)，纵坐标为细胞活力(cellviability，％)。

对比例1

(1)在圆底烧瓶中加入的还原型谷胱甘肽(分子量307.33，100mm，0.6ml)水溶液和l-胱氨硒(分子量334.09，100mm，0.3ml)，并且添加超纯水至18ml。在70℃和500rpm的条件下温和搅拌5分钟后，向圆底烧瓶中加入三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司，20mm，2ml)，保持温度并反应24小时，得到含有l-胱氨硒修饰的金纳米簇(下文简写为se1_au2”ncs)的粗产物。

(2)将步骤(1)获得的含有se1_au2”ncs用超滤管进行超滤清洗除去未反应的物质，得到实施例3的se1_au2”ncs。其中，实验参数如下：8000转每分钟，20分钟。然后通过0.22微米过滤器(millipore)过滤灭菌，并保存于4摄氏度冰箱备用。

(3)通过高分辨透射电子显微镜(tem,tecnaig2f20u-twin,feicompany,usa)对对比例1的se1_au2”ncs进行形貌表征。结果如图17所示。由图17可知，对比例1的se1_au2”ncs的粒径也不超过5nm。

(4)用mtt法检测对比例2的se1_au2”ncs对黑色素瘤细胞a375细胞增殖的影响，结果如图18所示。图18中，横坐标为se1_au2”ncs的浓度(μg/ml)，纵坐标为细胞活力(cellviability，％)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。