一种长双歧杆菌婴儿亚种的应用的制作方法

本发明属于功能性微生物技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌婴儿亚种的应用。

背景技术：

自闭症(autism)又称孤独症，已被公认为一种多发病于婴幼儿时期的广泛性神经发育障碍，主要表现为社会交往障碍、交流(言语和非言语)功能损伤以及重复刻板行为，常伴随智力障碍、癫痫或多动等多种临床症状，一般在3岁前发病。根据美国疾病预防控制中心(cdc)发布的最新数据，2018年asd患病率为1:59，比2016年的1:68上升了15％，其中男性的患病率是女性的4～5倍。

asd是一种异质性高的神经发展疾患，遗传因素是主要因素，但也仅能解释5％～25％的病因,现普遍认为可能是易感基因与内外环境因素互相作用动态发展从而影响个体多方面发育障碍的结果。近几年的研究发现，孕期或围产期药物、病毒感染、重金属中毒等会增加子代asd风险。人群调查表明孕期服用丙戊酸钠的母体生育asd患儿的概率是正常人的7倍，怀孕初期(前三个月)的严重病毒感染会导致孩子自闭症风险增加3倍，孕中期(三到六个月)严重细菌感染自闭症风险增加1.42倍。另外，接触超量神经毒害类的杀虫剂农药(多氯化联苯(pcbs)、有机磷酸酯等)的婴儿与正常的婴儿相比，识别面孔能力差、注意力集中困难、综合智力降低。

asd的确切病理生理学基础尚不清楚，已有证据支持其主要原因来源于神经炎症系统的失调。自闭症患者脑内活跃的小胶质细胞数量是正常人的2倍，且具有区域差异。胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)的持续活动和增殖，并发生形态学的改变，释放多种促炎介质(细胞因子和趋化因子)来协调免疫反应以及调节神经元功能和连接，虽然这种反应可以起到神经保护作用(即帮助修复受损组织)，但cns细胞因子的长期失调会通过它们在认知和突触调节中的作用导致神经元功能的破坏，这些细胞因子包括il-6和tnf-α等。

多氯联苯(pcbs)又称氯化联苯,是一类人工合成有机物，是联苯苯环上的氢原子为氯所取代而形成的一类氯化物。多氯联苯在工业上的广泛使用，已造成全球性环境污染问题。pcbs可经动物的皮肤、呼吸道和消化道而为机体所吸收，消化道的吸收率很高，因环境污染引起的家禽和人的pcbs中毒，基本上都是由口侵入、经消化道吸收后发生的。

筛选出一种能够调节肠道功能，且可有效缓解自闭症的益生菌意义重大。利用益生菌相关膳食干预策略和途径也为缓解自闭症开辟出新的途径和解决方案。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种长双歧杆菌婴儿亚种的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种长双歧杆菌婴儿亚种的应用，其中：所述长双歧杆菌婴儿亚种为长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687，所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够用于制备耐受胃肠液并缓解自闭症和吸附pcbs的食品或药物。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687还能够用于制备改善自闭症造成的在陌生环境中的自主行为与探究行为障碍的食品或药物。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够用于制备改善自闭症造成的社交障碍的食品或药物。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够用于制备改善自闭症造成的刻板行为的食品或药物。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够用于制备改善自闭症造成的对新物体的认知能力障碍的食品或药物。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687还能够用于制备改善自闭症造成的行为绝望状态的食品或药物。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述pcbs，包括aroclor1242。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述pcbs，包括aroclor1254、aroclor1260。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述食品，包括发酵食品。

作为本发明所述的长双歧杆菌婴儿亚种的应用的一种优选方案：所述发酵食品，包括乳制品、豆制品、果蔬制品。

本发明的有益效果：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能提升自闭症造成的在陌生环境中的自主行为与探究行为、缓解自闭症造成的社交障碍、较明显改善自闭症造成的刻板行为、提升自闭症对新物体的认知能力、改善自闭症造成的行为绝望(抑郁)状态、并且有效吸附pcbs。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1是长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687的菌落形态；

图2是长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对自闭症大鼠自主探索行为的影响；

图3是长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对自闭症大鼠社交行为的影响；

图4是长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对自闭症大鼠重复刻板行为的影响；

图5是长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对自闭症大鼠认知能力的影响；

图6是长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对自闭症大鼠行为绝望(抑郁)状态的影响。

图7是长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对pcbs的吸附能力。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687(bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)为已公开菌株，于2018年6月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmccno：60387。

长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687具有下述生物学特性：

(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成孢子，不运动的细菌。

(2)菌落特征：厌氧培养36小时形成明显的菌落，直径在0.5-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图1。

(3)生长特性：在37℃恒温厌氧的条件下，在mmrs培养基中培养约24小时达到对数末期。

(4)对模拟胃肠液具有较好的耐受能力；

(5)能够显著提升自闭症大鼠的旷场自主探索能力；

(7)能够显著改善自闭症大鼠的社交障碍；

(8)能够缓解自闭症大鼠的重复刻板行为；

(9)能够缓解自闭症大鼠对新物体的认知能力；

(6)能够显著改善自闭症大鼠由自闭症引起的行为绝望(抑郁)状态；

(10)具有良好的pcbs的吸附能力。

实施例1：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对模拟胃肠液具有良好的耐受性

将冷冻保存的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687接种于mmrs培养基(mrs培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐)中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mmrs培养液传代培养2～3次后，取1ml长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687的培养液，与9.0mlph2.5人工模拟胃液(含1％胃蛋白酶、ph＝2.5的mmrs培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用mmrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。

存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。取1ml长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687的培养液加入9ml人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、ph＝8.0的mmrs培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，用mmrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表1和表2所示。结果表明，长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对人工胃肠液具有较好的耐受性。

表1长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687在人工模拟胃液中的耐受性

表2长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687在人工模拟肠液中的耐受性

实施例2：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对wistar大鼠无毒副作用

将长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687菌体重悬于10％脱脂乳中，制成浓度为3.0×10⁸cfu/ml的菌悬液。取体重200g左右的雄性wistar自闭症大鼠6只，适应环境一周后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。

这些试验结果列于表3中。这些结果表明，喂食浓度3.0×10⁸cfu/ml的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687未对大鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。大鼠外观无明显病理症状。

表3小鼠体重的变化及死亡情况

注：-：大鼠无死亡

实施例3：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够显著改善自闭症大鼠的自主探索能力

(1)自闭症幼鼠繁育

健康雌雄wistar大鼠饲养适应环境1周，以雌雄比例2:1于晚5时合笼，次晨8时观察阴栓，若观察不到阴栓即进行阴道涂片，观察到精子则记录为妊娠第1天，雌鼠受孕后分笼饲养，随机分为模型组和对照组。孕后第12.5天给予腹腔注射丙戊酸钠(vpa)600mg/kg(生理盐水配成250mg/ml溶液)作为模型组；同期给予对照组孕鼠注射等量生理盐水，幼鼠出生后21天断乳。

(2)自闭症大鼠实验分组

分为对照组、模型组和干预组。

(3)自闭症大鼠旷场实验

旷场实验主要是观察实验动物在新异环境中的自主行为、探究行为与紧张度。大鼠旷场反应箱高30～40cm，底边长100cm，内壁涂黑，正上方2m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部，对实验全程录像，每只自闭症大鼠进行6分钟测试，以实验动物在新奇环境之中某些行为(单位时间内动物在中央和边缘区域留时间、运动速度，运动距离等)的发生频率和持续时间等，反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为。实验结果如图2所示，与空白组大鼠比，自闭症大鼠在旷场内的中心区域探索累计时间，表现出在陌生环境中的自主探究能力下降，服用长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够显著改善自闭症状导致的自主探索能力下降，这表明本发明筛选的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够提高在陌生环境中的自主行为与探究行为。

实施例4：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够显著改善自闭症大鼠的社交能力

实验造模、分组及处理方法同实施例3。

三箱动物社交行为实验是最常用的评估自闭症社交障碍的实验。检测鼠均为雄性，出生时间相差不超过1d，体质量差别小于15g，分笼饲养。检测在大小为60cmx60cmx60cm的透明三室箱内进行。实验前1d，所有被检测鼠放入检测室适应环境。实验时将1只被测鼠放入中间小室先适应10min。然后在左侧小室放置陌生大鼠，用空铁丝笼子罩住，右侧小室放入同笼大鼠并用同样的铁丝笼子罩住。打开中间小室进入左、右小室的通道，摄像记录10min内被检测鼠的行为，通过软件计算被测动物接近某个钢丝笼的时间、接触次数等指标，来评估动物的社交行为能力。实验结果如图3所示，自闭症大鼠与陌生鼠的接触时间明显低于空白组大鼠，表明本发明筛选的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够提高自闭症大鼠的社交能力。

实施例5：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够显著改善自闭症大鼠的重复刻板行为

实验造模、分组及处理方法同实施例3。

大理石埋珠实验是评价自闭症重复刻板行为的经典实验，在大鼠笼盒里铺上5cm厚玉米芯垫料，铺平，放入20个玻璃珠(直径15mm)，分五排，每排4个，规律排布。将老鼠放入笼中15min，统计所埋玻璃珠的数量(被埋体积大于50％)。实验结果如图4所示，自闭症大鼠埋珠数量明显高于空白组大鼠，表明本发明筛选的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能有效缓解自闭症大鼠的重复刻板行为。

实施例6：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够显著改善自闭症大鼠的认知能力

实验造模、分组及处理方法同实施例3。

大鼠物体识别实验的基本程序主要有3个阶段组成：(1)适应期时将大鼠依次放入没有任何物体的实验装置中，使其自由探索以便适应进行实验的环境，尽量减少动物进行实验时的应激性。(2)熟悉期时在实验装置底板的相邻或相对位置放入两个完全相同的物体(a1和a2)，将大鼠以背对两个物体的方式放入实验装置中，10min后将动物取出放回动物饲养笼中。间隔相应时间后，进行测试期实验。(3)测试期和熟悉期过程类似，只是将两个完全相同的物体中的一个换成另一个不同物体，相对于熟悉期的两个物体测试期时的物体分别被称为熟悉物体(a3)和新奇物体(b)。通过软件计算被测动物接近熟悉物体和新奇物体的时间和次数，来评估动物的认知能力。实验结果如图5所示，自闭症大鼠在新奇物体的停留时间和次数明显低于空白组和ccfm687喂养组，表明长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687更能缓解自闭症大鼠的认知能力。

实施例7：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687能够显著改善自闭症大鼠的行为绝望(抑郁)态

实验造模、分组及处理方法同实施例3。

强迫游泳实验是一种行为绝望实验法。是用于评价药物抗抑郁作用的经典实验模型。实验桶内装入大约40cm高的清水，水温在24±1℃左右，在正式实验前24h，每只大鼠均进行15min的游泳训练测试。正式实验时，每只大鼠进行6min测试。使用摄像头对实验全程录像。记录不动(漂浮)时间，即四肢不动或仅后肢轻微运动。实验结果如图6所示，自闭症大鼠在水中的游泳时间显著降低，不动时间更多，表现出行为绝望的特点。长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687游泳时间更多，不动时间更少，表明长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687更能缓解由自闭症引起的抑郁状态。

实施例8：长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对pcbs具有良好的吸附作用

取处于对数生长后期的长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687的菌液3ml(1.0×10¹⁰cfu/ml)于4℃、8000r/min离心15min，然后去除上清液，用不含碳源的合成液体培养基洗涤菌泥，进一步离心，取菌泥，加入3mlaroclor1242/1254/1260(1:1:1)混合物，pcbs浓度为3.0mg/l，37℃孵育24h，通过液相检测pcbs的剩余量，实验结果如图7所示，结果表明长双歧杆菌婴儿亚种ccfm687对aroclor1242、1254、1260的降解能力分别为73.3％、57.2％、25.1％。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。