一种包含Senp表达调节试剂的组合物及其在制备抗肝纤维化药物中的应用的制作方法

本发明属于抗肝纤维化药物技术领域，具体涉及一种抗肝纤维化的组合物及其应用。

背景技术：

肝脏疾病严重危害了人类的身体健康，并且在全世界范围内拥有极高的发病率，其中，病毒性肝炎，脂肪肝病，肝癌等肝病的发生发展都以肝纤维化的发展作为病理基础环节。肝纤维化(fibrosis)是一种病理状态，是指肝脏纤维结缔组织的过渡沉积。肝纤维化是慢性病毒性肝炎、代谢紊乱和慢性酒精性/非酒精性脂肪肝等慢性肝脏疾病进一步向肝硬化发展的中间环节，肝纤维化是慢性肝病的共同重要特征，且25-40％的慢性肝病患者最终发展为肝硬化甚至是肝癌。所以，抑制慢性肝病发生发展的核心环节就是抑制肝纤维化的形成。而肝纤维化的发生部位集中在以肝内的肝星状细胞(hepaticstellatecells，hscs)内，在肝损伤时，肝星状细胞和肝实质细胞，kupffer细胞之间的细胞相互作用产生的细胞因子诱发了肝星状细胞的自身活化，活化分泌产生的细胞外基质(ecm)，引起肝内胶原沉积，并分泌大量促纤维化因子，进而导致纤维化的形成。因此，hscs是肝纤维化发生发展的决定因素，抑制hscs活化是治疗和逆转肝纤维化的重要策略。

抗肝纤维化药物的研发是当前肝药的研发热点，同时也取得了一定的研究进展。当前申报的防治肝纤维化相关的治疗药物主要有以下几类：1)中草药及其提取物，如姜黄、白藜芦醇、水飞蓟宾、别隐品碱及其盐(授权公告号cn10132721b)；2)化学药物及其制剂，如吡非尼酮和肌酐组合物(授权公告号cn103550242b)、闭花木酮cleistanone衍生物(授权公开号cn104095857b)；3)生物制剂，包括重组蛋白和基因药物等，前者包括tgfβ1-抑制肽(授权公告号cn1203091c)、il-4(授权公告号cn101318013b)、单克隆抗体hab18gc2及其重链和轻链可变去基因和多肽(授权公告号cn100586960c)；基因药物包括肝细胞核因子1α基因(授权公告号cn102552935b)、表达肝细胞生成素的基因药物(申请号200610145523.0)、人肝细胞生长因子基因(授权公告号cn1142272c)等。而在其中，法尼醇受体类药物极具研究前景，法尼醇x受体(farnesoidxreceptor，fxr)又称nr1h4(nuclearreceptorsubfamily1，grouph，member4)，是核受体超家族的一员。自1995年被克隆以来，该受体越来越多的功能被认识：fxr不仅在胆汁酸、脂质和糖代谢等生理过程中发挥重要作用，同时对多种病理进程具有调控作用。另外，奥贝胆酸(又称oca)作为一种强fxr激动剂，其抗nash药效已经完成临床iii期研究，作为抗原发性胆汁性肝硬化(pbc)药物已于2016年5月被美国fda批准上市(markhama,keamsj.obeticholicacid:firstglobalapproval.drugs.2016aug；76(12):1221-6.)，成为以fxr为靶点成功上市的第一例药物。尽管前期大量的动物实验结果表明，oca等fxr激动剂对于肝纤维化具有显著的疗效(fioruccis,antonellie,rizzog,etal.thenuclearreceptorshpmediatesinhibitionofhepaticstellatecellsbyfxrandprotectsagainstliverfibrosis.gastroenterology.2004nov；127(5):1497-512.fioruccis1,rizzog,antonellie,etal.afarnesoidxreceptor-smallheterodimerpartnerregulatorycascademodulatestissuemetalloproteinaseinhibitor-1andmatrixmetalloproteaseexpressioninhepaticstellatecellsandpromotesresolutionofliverfibrosis.jpharmacolexpther.2005aug；314(2):584-95.)；然而近期一项临床研究结果显示，与安慰剂相比较，oca对pbc患者的肝纤维化指标并没有显著的改善作用(nevensf,andreonep,mazzellag,etal.aplacebo-controlledtrialofobeticholicacidinprimarybiliarycholangitis.nengljmed.2016aug18；375(7):631-43.)，此外，intercept公司2019年2月完成的奥贝胆酸抗nash的iii期临床实验结果表明，奥贝胆酸对23％的患者可以改善其肝纤维化症状(安慰剂可改善12％)，药效虽然具有统计学差异，但仅仅提高了11％，药效并没有达到预期令人满意的程度。尽管以奥贝胆酸为代表的fxr激动剂有望成为首个获批用于改善脂肪肝伴有的肝纤维化症状的药物，然而其对已经发展形成的肝纤维化中药效并不明显的现象并未得到解释和解决。研究和发现提高fxr激动剂抗纤维化药效的方法也成为了不可争议的研究重点。

sumo(smallubiquitinrelated-modefier)蛋白广泛存在于真核动物体内，是一类由98个氨基酸组成的多肽，在机体内发挥着重要的调节作用。sumo化修饰是以sumo的共价结合作为结构基础，结合靶蛋白的氨基酸残基；而senp家族是特异性降解细胞内sumo修饰完成的蛋白的一类蛋白酶，广泛参与了sumo的降解过程。在目前的研究中发现，对赖氨酸结合位点的突变直接终止sumo进程可以极高的提高钙蛋白的转录活性(yangsh,jaffraye,hayrt,etal.dynamicinterplayofthesumoanderkpathwaysinregulatingelk-1transcriptionalactivity.[j].molecularcell,2003,12(1):63-74.)，并且，过表达了sumo特异性蛋白酶(senp，sentrin/sumo-specificproteases)家族的hdac1蛋白的转录活性也提高了，而同时senp的参与显著降低了此时的hdac1-sumo水平。

在前期的研究中，申请人发现在活化的肝星状细胞中fxr蛋白sumo化水平升高是导致fxr配体生物活性减弱甚至消失的原因(专利申请号201811534024.x)，并提出了sumo抑制剂与fxr激动剂的组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，sumo抑制剂可以显著抑制sumo多肽结合到fxr蛋白上，因此该组合物的抗纤维化药理活性显著提高。然而上述组合物存在一定的局限性，即sumo抑制剂只能阻断sumo结合到fxr蛋白上，而对已经结合了sumo的蛋白却没有作用。然而，肝纤维化患者的肝星状细胞处于活化态，fxr蛋白已经结合了sumo。那么对于已经结合了sumo的fxr蛋白，需要进一步寻找策略以降解该sumo多肽进而提高fxr激动剂的生物活性。

技术实现要素：

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种抗肝纤维化的组合物及其应用，该组合物中包含senp表达调节试剂与fxr激动剂，通过试验证实，senp表达调节试剂与fxr激动剂联用具有显著提高的抗肝纤维化作用。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种抗肝纤维化的组合物，所述组合物中包含senp表达调节试剂和fxr激动剂。

作为优选：

所述senp表达调节试剂为能够诱导(上调)senp7表达或者阻断senp7蛋白降解的各种化学、天然产物或生物制品等，包括：

携带senp7质粒且能够干扰senp7表达的载体，转染细胞或机体后能够使senp7表达(mrna水平和蛋白水平)上调，例如，病毒性载体(慢病毒和腺病毒等)，非病毒性载体(阳离子多聚物载体，纳米颗粒载体，聚乙烯亚胺，脂质体，生物相容性载体材料)，以及对载体表面进行基团修饰得到的多种载体。优选的，在本发明中以脂质体为非病毒性载体的代表。

所述fxr激动剂为能够促进fxr转录激活的激动剂，包括天然来源的、半合成的以及全化学合成的fxr激动剂。例如，选自但不限于奥贝胆酸。

本发明还提供了所述的组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。

本发明还提供了所述的组合物在制备治疗伴有肝纤维化疾病药物中的应用。优选，所述伴有肝纤维化疾病为脂肪肝、药物性肝损伤或病毒性肝损伤等多种肝病。

本发明还提供了所述的组合物在制备减少活化肝星状细胞中fxr蛋白sumo化水平药物中的应用。

所述组合物可以是以senp表达调节试剂与fxr激动剂作为活性成分，加上药学上可接受的辅料所制成的药物。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指制备不同剂型时加入所需的各种常规辅料，例如稀释剂、黏合剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、包合材料、吸附材料等以常规的制剂方法制备成任何一种常用的口服制剂，例如可以是颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、汤剂、滴丸剂等。

本发明提供了一种含有senp表达调节试剂与fxr激动剂的组合物，以及所述组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途。在申请人前期的研究中发现(专利申请号201811534024.x)，在肝星状细胞高度活化状态下，fxr激动剂不具备一直肝星状细胞活化的作用，其原因在于活化的肝星状细胞中fxr蛋白发生sumo化修饰；此外，申请人还在之前项目(专利申请号201811534024.x)中提出了sumo抑制剂与fxr激动剂的组合物；该组合物对肝星状细胞活化的抑制作用以及对肝纤维化的治疗作用显著提高。然而，上述方案存在一定的局限性：即所述sumo抑制剂(包括奇霉素和/或银杏酸等)的作用环节在于抑制sumo多肽连接到被修饰蛋白上，即阻断fxr蛋白的sumo化修饰；而对于已经发生sumo化修饰的fxr蛋白则没有作用；然而在肝星状细胞活化的过程中大部分fxr蛋白已经被sumo化修饰。因此上述方案存在一定的局限性。在本发明中提出的senp7表达调节试剂则是作用于已经发生sumo化修饰的蛋白，将sumo多肽水解后得到未修饰的fxr蛋白。因此，针对前期方案的局限性，本发明创新性的进一步提出了包含senp7表达调节试剂与fxr激动剂的组合物，以及该组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用：活化的肝星状细胞对该复合物具有良好的反应性，同时该复合物可以显著抑制处于活化态的肝星状细胞的活化，进而显著抑制肝纤维化。因此，对于需要用药的肝纤维化患者而言，其肝脏中的肝星状细胞已经处于活化态，且fxr蛋白已经发生sumo化修饰；senp7表达调节试剂与fxr激动剂的联用可以有效的减少fxr蛋白sumo化水平，提高fxr转录活性，增强抑制肝星状细胞活化的作用。

技术效果：相对于现有技术，本发明提供了一种含有senp表达调节试剂与fxr激动剂的组合物，以及该组合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，试验结果表明，senp表达调节试剂与fxr激动剂联用，能够上调senp7表达，有效的减少fxr蛋白sumo化水平，提高fxr转录活性，具有显著提高的抗肝纤维化作用。

附图说明

图1为sumo抑制剂和senp表达调节试剂的作用环节示意图。

图2为活化的hscs中senp的mrna表达水平分析。*p<0.05与静息态hsc比较。

图3为hscs转染senp7表达质粒后senp7mrna表达水平分析。***p<0.001与转染对照质粒比较。

图4为hscs转染senp7表达质粒后fxr蛋白sumo化水平分析。***p<0.001与转染对照质粒比较。

图5为senp7表达质粒与oca联用对fxr靶基因的调控作用(shpmrna水平)。*p<0.05与对照组相比较。

图6为senp7表达质粒与oca联用对hsc活化的影响(acta2mrna水平)。*p<0.05与对照组相比较。

具体实施方式

申请人在前期的研究中通过分离和比较静息态和活化态hscs，发现活化态的hscs内fxr蛋白sumo化水平明显高于静息态；且导致fxr激动剂oca无法抑制hscs细胞活化。在本发明研究中，提出senp表达调节试剂与fxr激动剂的组合物，该组合物可以显著降低活化态hscs细胞中fxr的sumo水平，提高fxr的转录活性以及对hscs活化的抑制作用。

具体的，在体外培养的活化态hscs中，考察了负责降解胞内sumo蛋白的sumo特异性蛋白酶家族，发现senp7的表达显著降低。而转染senp7质粒使其过表达之后，活化态hsc细胞中sumo蛋白降解增多，fxr蛋白的sumo化水平显著下调。senp7表达试剂与奥贝胆酸oca联用，可以显著增强对fxr转录活性的调控作用，显著上调shp的靶基因水平；且显著抑制hscs的活化，抑制acta2基因的表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明实施例中所使用的生物材料(实验动物，质粒，腺病毒等)和试剂，如无特别说明，均可从市售渠道获得。

实施例1hscs活化过程中fxr激动剂奥贝胆酸给药效果降低

1实验材料

本发明使用的实验小鼠(c57bl/6)购自北京维通利华实验动物技术有限公司；

ⅳ型胶原酶,pronasee还有dnasei，histodenz均购自sigma-aldrich公司，实验用缓冲液均按照标准缓冲液配方配置即可；本发明使用的奥贝胆酸购自medchem公司，逆转录试剂购自vazyme公司，trizolrnaisoplus购自takara公司。

其余试剂和材料均可以从市售途径获取。

2实验方法

2.1hscs分离培养

待小鼠用5％水合氯醛麻醉至合适程度后进行腹部消毒，固定在泡沫板上之后用针头固定鼠皮,用大剪刀打开大鼠的腹腔，呈v字开口后，暴露腹腔。

旋即用大镊将肠道和胃部拖拽至体右侧，暴露肝门静脉，用眼科镊小心分离门静脉，保证静脉血管壁湿润光滑，尽量保证没有组织系膜粘连在血管上，影响插针，同时埋线两根于血管下方。

小心用镊柄支撑血管，并同时用留置针缓速插入血管，约1.5cm至2.5cm，与此同时发现有肝脏血管倒流至留置针中。

此时立刻将金属针头抽出，用先前埋好的线将塑料针固定在肝门静脉上，打开恒流泵泵，调节流速至12～15ml/ml,观察肝脏有些微肿胀变黄，立刻打开下腔静脉，让血流快速流出。

保持针头位置相对固定，用预热的d-hanks缓冲液对肝脏的血液进行充分灌流，灌流同时观察肝脏变软，待颜色由深入浅，若存在灌流不良处可有无菌手套或者无菌的棉签进行挤压按摩。

待10min到15min后，肝脏基本瘫软，下腔静脉出血基本消失，用先前配好的灌流酶液进行灌流，流速降低至8ml/min，这个过程不能出现气泡进入泵管，待酶液充分消化肝组织，观察到龟裂的肝脏纹理，且肝脏变得瘫软(全程用棉球吸取血管插管处可能流出的些许液体，保证血管不过分充盈导致针头脱落)。与此同时，迅速用剪刀分离整肝到冰浴的小皿中，用hanks缓冲液浸泡转移。

移至超净台，用无菌镊子进行机械分离。将抖落的肝细胞散落在hanks缓冲液(50ml)中，加入消化酶液必须的消化酶(预先配好在管子中)，转移到50ml离心管之后在180rpm的摇床中37℃剧烈振摇40min(该步骤必须保证高速)。

将细胞取出，细胞悬液呈现土黄浑浊色，用滤膜(亦可用纱布)进行第一次初步分离，将未消化的组织去除，留下的细胞悬液，用500rpm的转速离心8min即可，离心后观察到显著分层。

去除沉淀。并再重复一次该操作。再次去除沉淀，得到间质细胞为主的上层液体，该液体也是土黄色，但是颜色稍微变浅。

使用离心机以1750rpm的转速继续离心8min,离心结束后去除离心管内上清，用4℃的hanks重悬，将所有沉淀定容到10ml体积，补加20ml浓度为18％的histodenz梯度离心液(无菌，现用现配)，充分混悬得到一个混合细胞悬液，总体积为10+20＝30ml

把混合细胞悬液平均分配到4个15ml离心管，每支7.5ml并继续缓速倾斜上覆hanks缓冲液每支2ml即可。该过程保证不破坏细胞混合液的密度为宜，轻柔，缓速。

在进一步配平后继续离心，升降速调节为最低档之后按照3200rpm离心20min，得到中间有白色浑浊细胞带的细胞梯度液，用滴管轻轻吸出，可适当多吸一些后续可以通过离心提纯。

用适量hanks稀释吸出来的浑浊细胞带，1400rpm离心5min得到细胞沉淀后，用含抗培养基dmem进行再次混悬和离心(可多洗几次)，点板培养。约2h至2.5h后可贴壁，次日换液继续培养即可。从次日培养时间24h开始计算培养天数，收集d1和d7的细胞，计作静息态和活化态的肝星状细胞。

2.2rt-pcr

2.2.1肝星状细胞总rna提取

1)pbs清洗细胞，加入1mltrizol试剂后，用组织匀浆机进行匀浆，室温放置5min后12000g离心5min；

2)转上清800μl，并加入160μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置5min后12000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

3)小心转移上层水相300μl到新管中，并加入300μl异丙醇，颠倒混匀后，室温放置10min，而后12000g离心10min，弃去上清；

4)用预冷的75％乙醇1.0ml洗涤rna沉淀，而后12000g离心5min，弃上清得到总rna，并用30μldepc水复溶，定量后稀释至0.5μg/μl.

2.2.2逆转录

按照说明书要求的体系配比将rna溶液和试剂盒成分配制成总体积为20μl的体系并设定程序温度进行逆转录，具体配比要求如下：

2.2.3pcr

pcr体系如下：

pcr使用条件如下：

stage1：预变性95℃1min

stage2：pcr反应95℃15sec；如60℃30secfor40cycles；72℃30sec

stage3：融解曲线分析65-95℃，0.5℃/5s

3实验结果

3.1hscs活化后奥贝胆酸对fxr下游靶基因激动效果降低，对纤维化基因抑制效果降低

通过对细胞样本中纤维化基因和fxr下游靶基因的mrna水平进行考察，发现奥贝胆酸在活化后的hscs呈现出较弱的纤维化药效，且下游靶基因激动效果较差，转录活性降低。

3.2hscs活化后fxr-sumo水平提升

根据针对sumo化水平的elisa试剂盒检测发现(图二)，在造模后高度活化的肝星状细胞中的fxr蛋白sumo化水平会随着培养时间的推进呈现逐渐提升，显示活化态的星状细胞内蛋白sumo化水平会高于静息态。

3.3hscs活化后senp表达水平分析

根据对活化后hscs中senp家族六种亚型的mrna进行考察，发现senp7的mrna表达随着hsc细胞活化而降低(图2)，提示senp7参与了hscs活化过程中的去sumo化，senp7表达水平的降低导致了活化态hsc细胞中蛋白sumo水平的升高。

实施例2senp7过表达质粒可以降低活化态hsc细胞sumo化水平

1实验材料

lipofectamine2000脂质体购自invitrogen公司，opti-mem培养基购自gibco公司，sumo化elisa检测试剂盒(p-8003)购自epigentek公司；

其余实验材料同实施例1。

2实验方法

2.1senp7质粒转染

senp7质粒按照lipofectamine2000标准转染方法进行转染。

2.1.1接种细胞

转染前一天将细胞接种至十二孔板内。细胞接种数量视其生长速度而定，一般为1×10⁶个细胞。转染时要求细胞汇合度大于80％。转染前两小时对细胞进行换液以保证转染效果。

2.1.2转染质粒

将提前计算好的指定质量的质粒dna加至固定体积的opti-mem培基中，混匀。同时将固定体积的lipo2000加至另外同体积的opti-mem中，轻轻混匀，室温静置5分钟。之后将dna悬液和lipo2000悬液混合，总体积250ul/孔(12孔板)，轻轻混匀，室温静置20分钟。最后将dna和lipo2000混合液加至细胞板孔内，补足培养基之后前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养。转染4-6小时后，细胞换液即可。

2.2rt-pcr

具体同实施例1中2.2部分。

2.3hsc细胞fxr蛋白sumo水平分析

按照elisa检测试剂盒说明书要求提取细胞核蛋白之后，将一抗和细胞样本的核蛋白在板孔中共室温孵育60min，按照说明书要求接着补充加入sumo特异检测抗体，进一步加入颜色增敏剂显色，之后迅速读取655nm的吸光度，进行相对定量分析。

3实验结果

3.1细胞senp7表达质粒转染效率验证

经过rt-pcr对转染效果的验证，发现细胞转染senp7表达质粒后，可以显著提高细胞内的senp7的mrna表达水平(图3)。

3.2senp7表达质粒转染后hscs中fxr蛋白sumo水平分析

通过sumokit检测，转染senp7表达质粒的活化态肝星状细胞中fxr蛋白的sumo水平相较于空白转染组显著降低(图4)。

实施例3senp7表达质粒与oca联用对肝星状细胞活化的影响

1实验材料

实验材料同实施例1和2。

2实验方法

2.1senp7表达质粒转染

senp7表达质粒转染方法同实施例2中2.1部分。

细胞转染senp7表达质粒48h后，给予1μm的oca或者等体积溶媒刺激，12h后收集细胞。

2.2rt-pcr

具体同实施例1中2.2部分。

3实验结果

3.1senp7表达质粒与oca组合物对fxr转录活性调控作用研究

hsc细胞转染senp7表达质粒，同时给予oca刺激后，考察hsc细胞fxr转录活性。结果显示，senp7表达质粒与oca的组合物，可以显著提高活化态hsc细胞中fxr靶基因shp的mrna水平(图5)。

3.2senp7表达质粒与oca组合物对hsc细胞活化作用研究

hsc细胞转染senp7表达质粒，同时给予oca刺激后，考察hsc细胞fxr转录活性。结果显示，senp7表达质粒与oca的组合物，可以显著提高活化态hsc细胞中acta2的mrna水平(图6)，抑制hsc的活化水平。