本发明涉及雄性动物繁殖
技术领域：
，更具体地说是涉及fsh和hcg在制备促进睾丸细胞功能恢复的药物中的应用。
背景技术：
：目前，大多数养殖场和养殖户在优秀种公羊出现死精、无精的情况后手无策，只能忍痛将其淘汰。研究发现，其根本原因是公羊睾丸内的一些重要的细胞(支持细胞、间质细胞)的功能出现了问题，则，如何恢复睾丸支持细胞和间质细胞的功能就成了攻克该难题的关键。解剖学上，支持细胞和间质细胞均在睾丸内，它们对精子的生成具有重要作用。支持细胞又名保育细胞，即sertoli细胞，呈锥体形，底部较宽，有规律地排列在睾丸曲细精管的基底膜上，细胞上端伸向管腔的中心部。这种细胞不分裂、不增殖，它们的细胞顶部和侧壁形成许多凹陷，其中镶嵌着生精细胞。支持细胞的主要作用即是支持、营养和保护生精细胞，利于由精原细胞顺利地分化为精子。此外，相邻的支持细胞基部侧突相接，两侧细胞膜形成紧密连接，这种紧密连接位于精原细胞上方，起到屏障作用，因此称为血睾屏障，可阻止间质内的一些大分子物质穿过曲细精管上皮细胞之间的间隙而进入管腔。间质细胞，即leydig细胞，位于睾丸间质内，成群或单个存在。这种细胞主要是在青春期后由睾丸间质内成纤维细胞逐渐演化而成，并随着年龄的增加而数目逐渐下降。leydig细胞具有较强的增殖活性，生理情况下，leydig细胞的凋亡与增殖处于动态的平衡之中，从而维持其数量和质量的稳定，而使机体t(睾酮)水平在一定范围内维持稳定。在遇到损伤、肿瘤等刺激下，会导致leydig细胞凋亡的增加，引起睾酮合成减少。间质细胞的主要功能是分泌雄性激素，包括睾丸酮、双氢睾酮以及雄甾二酮、去氢异雄酮等.这些激素对维持雄性第二特征、促进附属性腺的发育，以及对促进精子的发育和成熟都具有不可或缺的作用，其受垂体分泌的黄体生成素(lh)的调节，并易受温度、放射线和药物的影响。由此可见，支持细胞和间质细胞不论是对精子的发生还是对精子的成熟都具有重要作用，它们的正常形状和功能对精子获得正常生殖功能十分必要。一旦因各种因素(疾病、损伤、药物、营养等)引起支持细胞或间质细胞形态和功能异常，势必会导致睾丸生精功能衰减或者消失，引起公畜不育；然而，目前并没有同时恢复损伤的支持细胞和间质细胞功能的特效药物。人绒毛膜促性腺激素(hcg)与fsh(促卵泡素)主要用于母畜家畜的发情、排卵诱导，目前并未有将两者应用于睾丸细胞恢复中的报道。因此，如何研究hcg和fsh的新用途，并将两者应用于促进睾丸细胞功能恢复的药物中是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明创造性地使用外源性药物(hcg、fsh)刺激睾丸的支持细胞和间质细胞，促进其发育和更新，提供了hcg和fsh的新用途，也达到了提高优秀种公羊繁殖性能的效果。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：fsh和hcg联合应用在制备促进睾丸细胞功能恢复的药物中的应用。作为本发明优选的技术方案，fsh的使用浓度为50-100μg/ml，hcg的使用浓度为100μg/ml。作为本发明优选的技术方案，fsh和hcg联合应用能够恢复间质细胞功能。作为本发明优选的技术方案，fsh和hcg联合应用能够恢复支持细胞功能。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了fsh和hcg联合应用在制备促进睾丸细胞功能恢复的药物中的应用，fsh可促进睾丸支持细胞中camp、scf和gdnf的分泌，而camp、scf和gdnf对精母细胞的分化具有明显的促进作用，所以，fsh可以促进睾丸细胞的生精作用；hcg可以促进间质细胞睾酮的生成，进而促进精子的成熟；因此，fsh和hcg联合应用可以显著恢复睾丸细胞的功能，具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1fsh对支持细胞生精功能的作用实验材料与方法：小鼠睾丸支持细胞系tm4细胞(atcc)，在高糖培养基(dmem添加10％fbs、100iu/ml青霉素、100iu/ml链霉素)中培养。细胞汇合度达60％-70％时换无血清的培养基孵育过夜，次日，换含0.1％bsa无血清培养液继续孵育6h。细胞中fsh(宁波激素厂)浓度分别为25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，200ug/ml处理2小时后分别用elisa法检测细胞camp浓度,qpcr法检测细胞scf，gdnf表达(研究表明camp、scf、gdnf的表达对精母细胞的分化具有关键促进作用)，评价fsh对支持细胞生精功能的作用效果，如表1所示。表1不同浓度fsh处理对睾丸支持细胞生精关键因子表达的影响实验结果：结果显示，fsh浓度在50-100ug/ml时，其促进生精作用更好。实施例2hcg对睾丸间质细胞分泌睾酮的影响实验过材料与方法：小鼠睾丸leydig细胞(tm3细胞)(购自美国)，睾酮试剂盒(北京北方生物技术研究所)，小牛血清(杭州四季青牛物材料有限公司)，rpmi-1640培养基(gibeo公司)，co2培养箱(thermo)，多功能酶标仪(bioteksunergyhm)。将leydig细胞密度调至5×105个/ml，接种于96孔培养板，在16401-640培养基中培养，培养液含10％小牛血清，100万u/l青霉素和100万u/l链霉素，37℃、5％co2饱和湿度细胞培养箱培养，取对数生长期细胞用于实验。更换分别含有0，1，10，100ng/mlhcg的无血清培养液，34℃继续培养24h。吸取上清，1500g离心10min，用elisa法测定睾酮浓度，结果如表2所示；表2hcg处理对小鼠leydig细胞睾酮生成的影响hcg浓度(ng/ml)t含量(ng/ml)017.5±3.261148.91±13.44**10216.49±11.78**100220.12±12.50**由表2可看出，hcg刺激leydig细胞24h后，睾酮生成量表现为明显的剂量依赖性，各分组差异极显著(p<0.01)。特别是当培养液中hcg浓度大于10ng/ml时，leydig细胞睾酮生成量的增加趋于平缓。实施例3临床试验时间：2009-2015年地点；天津市奥群牧业有限公司种羊场(死精2只，无精1只)、山西省右玉县宇种羊场(死精4只，无精2只)、新疆华牛天俊种畜繁育工程有限公司种羊场(死精4只，无精2只)、重庆振兴农牧公司种羊场(死精2只，无精3只)、重庆金泰牧业有限公司酉州乌羊保种场(死精3，无精1只)、重庆旭辉公司种羊场(无精2只)。选取死精症公羊15只、无精症公羊11只按照下述方法进行治疗，结果如表3和表4所示；药物配方：hcg100iu+fsh50iu/天.羊，连续肌肉注射15天。表3死精症公羊处理前后实验结果样本(n＝15)性欲精子活力精子密度处理前差0.21.5亿/ml处理后强0.942.2亿/ml表4无精症公羊处理前后实验结果样本(n＝11)性欲精子活力精子密度处理前无00亿/ml处理后正常0.911.5亿/ml果实施例4fsh与hcg联合处理对公羊血液睾酮及camp、scf、gdnf表达的影响实验材料与方法：选取无精症和死精症公羊各3只，分别按专利方案对其进行fsh与hcg联合处理，采集处理前后公羊外周静脉血10ml,其中5ml分离血清，应用elisa法测定睾酮、camp浓度；剩余5ml全血离心分离白细胞，置于rna保存液(4摄氏度)，采用酚氯仿法提取总rna，应用qpcr法检测scf，gdnf表达。实验结果如下(表5)：表5fsh与hcg联合处理对公羊血液睾酮及camp、scf、gdnf表达的影响实验结果：fsh与hcg联合处理可极显著促进公羊睾酮分泌和关键生精因子camp、scf，gdnf的表达，达到了1+1＞2的效果。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页1 2 3