一种桔梗汤提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及中药化学领域，具体涉及一种桔梗汤提取物及其制备方法和在抑制金黄色葡萄球菌活性的应用。

背景技术：

急性肺损伤(acutelunginjury，ali)指机体遭受感染或创伤导致肺内皮及上皮细胞屏障被破坏，造成肺间质弥漫性扩散及肺水肿，引起的急性低氧性呼吸功能不全综合征。

细菌感染是引起急性肺损伤的常见原因，细菌感染所致急性肺损伤主要有两种形式：一种是革兰氏阴性杆菌感染，如肺炎克雷伯杆菌，实验中常用lps诱导ali动物模型来模拟革兰氏阴性杆菌感染；另一种是革兰氏阳性球菌感染，如金黄色葡萄球菌，金葡菌是引起感染性肺炎的重要病原体；随着金葡菌耐药性日益增长，耐甲氧西林金葡菌(mrsa)分离率已高达60％以上，社区获得mrsa(ca-mrsa)分离率近年也日渐增高；由于大多数mrsa菌株呈多重耐药，不仅对几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药，而且对其他抗菌药物如氟喹诺酮类、氨基糖苷类等也高度耐药，目前已成为临床抗感染治疗难题之一。

感染性疾病在传统中医理论中属于温、热病的范畴，用清热解毒类中药治疗具有较好疗效，大量现代研究表明中药化学成分具有良好的抗菌活性，由于中药具有不易产生耐药性、与抗生素联用可逆转抗生素的耐药性、不良反应低等优点，从中寻找天然抗生素已成为解决细菌耐药的新途径。

桔梗汤由桔梗和甘草两味中药组成，最早出自张仲景《伤寒论·少阴篇》：“少阴病，二三日，咽痛者，可与甘草汤；不瘥者，与桔梗汤。”《金匮要略·肺瘘肺痈咳嗽》中也有记载：“咳而胸满，振寒脉数，咽干不渴，时而浊唾腥臭，久久吐脓如米粥者，为肺痈，桔梗汤主之。”桔梗辛苦而平，能宣肺利咽，祛痰排脓；甘草甘平，能补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛。二者配伍用于治疗咽喉肿痛及肺痈咳嗽等。

公开号为cn101396425a公开了一种桔梗汤制剂的制备方法，为了回归传统医药治疗疾病的精髓，提出了将桔梗汤经典方按照“遵古”的指导思想，用水提取药物，结合现代的浓缩、制粒工艺，总结出了与桔梗汤制剂最为匹配的制剂工艺参数和适用辅料；其对桔梗汤的制备方法进行了描述，但是并没有涉及桔梗汤在抑制金黄色葡萄球菌活性方面的应用。

公开号为101396425a一种治疗慢性咽喉炎的中药，并将其制成口服含片，桔梗、甘草均为药食同源(可用于保健的中药)类中药材，经过研究发现，将桔梗汤制成含片，具有明显的清热解毒，利咽止痛作用，对少阴病咽痛诸证具有良好的预防和治疗效果；其中主要针对桔梗汤对于咽喉炎的治疗，并没有涉及对于lps诱导的急性肺损伤有保护作用。

技术实现要素：

本发明提供了一种桔梗汤提取物的制备方法，该制备方法中采用水提、非极性大孔树脂纯化、不同醇浓度分级洗脱等操作，得到了功效性成分活性较强的桔梗汤提取物。

一种桔梗汤提取物的制备方法，包括:

(1)将桔梗与甘草混合后粉碎、浸泡，得到混合药物；

(2)将混合药物的水溶液加热回流，过滤，收集滤液；

(3)利用非极性大孔吸附树脂对步骤(2)的滤液进行吸附后用洗脱剂洗脱，得到洗脱液；

(4)将乙腈与水作为流动相，在液相色谱中对浓缩后的洗脱液进行梯度洗脱分离，收集分离液，浓缩，得到桔梗汤提取物。

步骤(1)中，所述的桔梗与甘草的质量比为1:1-5。

为了使桔梗与甘草中的药用成分更好的溶解在溶剂中，所述的浸泡的溶剂为水，所述的浸泡的时间为2-24h，浸泡的温度为25-50℃。

步骤(2)中，所述的加热回流的温度为110-150℃，加热回流的时间为1-12h。

为了使桔梗与甘草中的药用成分在水中充分溶解，步骤(2)中，将混合药物过滤后，药渣重新加入水中，加热回流，所述的加热回流次数为2-4次。

步骤(3)中，所述的非极性大孔吸附树脂为d101、xda-5或hp-10中的一种；由于d101大孔树脂具有相当大的比表面积和适宜的孔径，对植物中的皂苷类物质有较好的选择性，优选的，所述的大孔吸附树脂为d101。

所述的大孔吸附树脂对滤液的吸附时间为2-5h，对滤液中桔梗与甘草的药用成分吸收更加完全。

由于乙醇的水溶液具有较大的极性，在不损伤大孔树脂的前提下，可对吸附的药物进行完全洗脱，所述的洗脱剂为20％-40％的乙醇水溶液，优选为40％的乙醇水溶液。

步骤(4)中，在液相色谱中对浓缩后的洗脱液进行梯度洗脱分离，并收集分离液，所述的分离液为30％-33％的乙腈水溶液。

本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的桔梗汤提取物，所述的桔梗汤提取物包括甘草查尔酮b、甘草皂苷g2、与乌拉尔甘草a；其中甘草查尔酮b(licochalconeb)作为桔梗汤提取物的主要成分，含量为50-60％。

本发明还提供了上述桔梗汤提取物在抑制金黄色葡萄球菌活性中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明所述的桔梗汤提取物的制备方法中采用水提、非极性大孔树脂纯化、不同醇浓度分级洗脱等操作，操作简单，实现性强，得到了功效性成分活性较强的桔梗汤提取物。

(2)本发明所述的桔梗汤提取物包括甘草查尔酮b、甘草皂苷g2、与乌拉尔甘草a；其中甘草查尔酮b作为桔梗汤提取物的主要成分，含量为50-60％。

(3)本发明中通过桔梗汤提取物的动物试验研究和抗菌活性实验研究的证明，桔梗汤提取物具有抑制金黄色葡萄球菌活性的作用。

附图说明

图1为本发明实施例1桔梗汤提取物d1的hplc分析色谱图，其中，1为甘草查尔酮b，2为甘草皂苷g2，3为乌拉尔甘草a。

图2为本发明实施例1桔梗汤提取物d1中甘草查尔酮b的质谱图。

图3为本发明实施例1桔梗汤提取物d1中甘草皂苷g2的质谱图。

图4为本发明实施例1桔梗汤提取物d1中乌拉尔甘草a的质谱图。

图5为本发明中桔梗汤对肺组织病理形态影响图；其中，a为空白对照组雄鼠肺组织切片图；b为模型组雄鼠肺组织切片图；c为桔梗汤不感染组雄鼠肺组织切片图，d为桔梗汤感染组雄鼠肺组织切片图。

图6本发明中雄鼠肺部载菌量统计图；a图为雄鼠肺匀浆的cfu结果统计图；b图为肺泡灌洗液的cfu结果统计图。

具体实施方式

本发明结合附图和下面实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

(1)将66.6g的桔梗和133.3g的甘草粉碎后混合，加入1.2l水浸泡12h，得到药材混合溶液；

(2)将药材混合溶液置于120℃下回流提取3小时，过滤；向滤渣中加入0.8l水120℃回流3h，合并提取液，减压浓缩得到总提取液a1；

(3)取50ml总提取液，置于已装好的d101大孔树脂色谱柱(4.6cm×30cm)，静置吸附3h；分别用体积比为20％、40％乙醇水溶液2.4l洗脱，收集40％乙醇-水洗脱部分；

(4)将40％乙醇水洗脱液减压浓缩至30ml，取其中4ml浓缩液用液相色谱分离，收集30％-33％乙腈水洗脱液，浓缩、冷冻干燥，得到16mg桔梗汤提取物d1；

其中，液相色谱分离的条件为：安捷伦zorbaxsb-c18色谱柱(21.2mm×250mm,7μm)；流动相为水(a相)和乙腈(b相)；流速为10ml/min；梯度洗脱程序为0min，15％b；40min，30％b；55min45％b；60min，80％b；65min，100％b；70min，100％b；紫外检测波长254nm。

桔梗汤提取物a1和d1的抗菌活性评价

将实施例1步骤(2)中的提取液浓缩、冷冻干燥得到未经纯化分离的桔梗汤总提取物a1和步骤(4)中分离得到的桔梗汤提取物d1作为实验组，分别称取等量的a1和d1，溶于dmso中，分别配制成100mg/ml的储备液，在细菌孵育实验中，用tsb培养基将a1和d1的储备液分别稀释至1mg/ml。

从血平板上挑取金黄色葡萄球菌单克隆菌落加入含10mltsb培养基的离心管，于恒温振荡仪中37℃200rpm过夜，共12h；次日取100μl菌液加入到10ml新鲜的tsb培养基中，摇菌4h后2600rpm×10min离心分离，弃去上层清液，加入磷酸缓冲盐溶液(pbs)稀释至浓度为10⁸cfu/ml；用tsb培养基进一步稀释至10⁴cfu/ml作为备用菌液；

取96孔板，为每孔加入190μl配置好的a1或d1的储备液溶液和10μl菌液，使每孔的菌液为100cfu，作为实验组；取96孔板，为每孔加190μltsb培养基和10μl菌液作为对照组；然后将三组孔板置于37℃细菌培养箱中孵育16h。

将96孔板中的菌液吹打均匀，用pbs将菌液10倍稀释8个梯度后，各取5μl点板，于细菌培养箱中孵育24小时后统计cfu，取三孔平均值，实验重复三次，结果取三次平均值；

抑菌率＝(对照组cfu-实验组cfu)/对照组cfu×100％

结果表明，总提取物a1的抑菌率为(68±28)％、提取物d1的抑菌率为(100±0)％，与桔梗汤总提物a1相比，分离后的桔梗汤提取物d1对金黄色葡萄球菌表现出较强的抗菌活性。

桔梗汤提取物d1的hplc-ms分析

称取桔梗汤提取物d1，溶于50％甲醇-水溶液中，配置浓度为1mg/ml的桔梗汤提取物d1溶液，过滤后转移至进样瓶，进行hplc色谱分析，分析结果如图1所示(图中1为甘草查尔酮b，2为甘草皂苷g2，3为乌拉尔甘草a)，其显示桔梗汤提取物d1中主要成分为甘草查尔酮b，含量为54％；图2为甘草查尔酮b的质谱图；桔梗汤提取物d1还包括甘草皂苷g2与乌拉尔甘草a，其中如图3所示为甘草皂苷g2的质谱图；图4为本发明桔梗汤提取物中乌拉尔甘草a的质谱图。

hplc色谱分析条件：美国agilent公司的zorbaxsb-c18快速分析柱(4.6mm×50mm,1.8μm)；流动相：0.05％甲酸水(a相)和乙腈(b相)；流速：0.6ml/min；柱温是30℃；线性梯度：0min，6％b；35min，40％b；60min，100％b；70min，100％b；进样量：10μl；检测波长：254nm。

甘草查尔酮b的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度检测

采用微量肉汤稀释法检测对甘草查尔酮b进行最小抑菌浓度检测，最小杀菌浓度检测：

(1)分别称取甘草查尔酮b及抗生素(苯唑西林钠、盐酸万古霉素、氯霉素、硫酸链霉素)，用dmso分别配制成12.8mg/ml的药物储备液；

(2)96孔板各孔中加入100μltsb培养基；在第1列孔中加入待测样品(药物储备液4μl+96μltsb培养基)，从第一个孔中取100μl加入第二孔，对半稀释至第11列，第12列为对照孔；

(3)每孔加入稀释好的备用菌液100μl(1×10⁵cfu/ml)，此时药物储备液的浓度从第1列至第11列分别为128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml和0.125μg/ml；

(4)将96孔板放入细菌培养箱中孵育24h后，取出观察；肉眼未见细菌生长，孔内培养液澄净的最低药物浓度即为该药的最小抑菌浓度(mic)；

(5)所有抑菌孔中取10μl液体按原来的次序涂于tsb琼脂板上，37℃孵育24h；肉眼未见细菌生长的最低药物浓度为最小杀菌浓度(mbc)。

表1甘草查尔酮b及抗生素的mic及mbc结果

如表1所示，采用微量肉汤稀释法检测对甘草查尔酮b及抗生素进行最小抑菌浓度检测，最小杀菌浓度检测，其中，甘草查尔酮b的最小抑菌浓度为4-8μg/ml；最小杀菌浓度为128μg/ml。

模拟桔梗汤提取物a1治疗金黄色葡萄球菌性肺炎的动物实验

为更好地模拟临床上金葡菌感染性肺炎，本发明首次采用气道滴注金黄色葡萄球菌诱导雄鼠急性肺损伤模型研究桔梗汤提取物a1抗金葡菌致急性肺损伤作用。

动物分组

(1)6-8周龄的c57bl/6雌鼠，体重20g，随机分成4组，即空白对照组、模型组、桔梗汤不感染组、桔梗汤感染组，实验前在实验室适应性饲养一周，期间正常给予饮食，实验前12h禁食，正常给水；

(2)空白对照组：给雄鼠灌胃0.2ml蒸馏水；模型组：给雄鼠灌胃0.2ml蒸馏水，2h后气道滴注50μl的金黄色葡萄球菌液(5×10⁷cfu)；桔梗汤不感染组：给雄鼠灌胃0.2ml桔梗汤提取物a1(2.7g/kg)；桔梗汤感染组：给雄鼠灌胃0.2ml桔梗汤提取物a1(2.7g/kg)，2h后气道滴注50μl的金黄色葡萄球菌液(5×10⁷cfu)。

鼠肺组织病理切片he染色

(1)取材：将雄鼠按上述分为4组，感染24h后，颈椎脱臼处死，打开胸腔，取肺部放入4％多聚甲醛中固定24h以上，将肺部组织修切平整；

(2)脱水：将肺部组织依次用75％酒精脱水4h；85％酒精脱水2h；90％酒精脱水2h；95％酒精脱水1h；无水乙醇脱水30min，连续两次；醇苯脱水10min；二甲苯脱水10min，连续两次；蜡浸1h连续三次；

(3)包埋：将浸好蜡的肺部组织于包埋机内进行包埋，取出后于-20°冰箱冷却，得到包埋肺部组织的蜡块；

(4)切片：将步骤(3)得到的蜡块置于石蜡切片机上切片(厚约4μm)，于60℃烘箱内烤片，得到含有肺部组织的石蜡切片；

(5)石蜡切片脱蜡：依次将石蜡切片浸于二甲苯20min，重复两次；无水乙醇10min，重复两次；95％酒精5min；90％酒精5min；80％酒精5min；70％酒精5min；最后蒸馏水洗；

(6)苏木素染细胞核：harris苏木素染色5min，蒸馏水冲洗；1％的盐酸酒精分化数秒，蒸馏水冲洗；0.6％氨水返蓝，蒸馏水冲洗；

(7)伊红染细胞质：伊红染液染色2min；

(8)脱水封片：将石蜡切片依次放入95％酒精5min两次，无水乙醇5min两次，二甲苯5min两次，最后用中性树胶密封含有肺部组织的石蜡切片。

雄鼠肺部载菌量统计

(1)肺匀浆：将雄鼠按上述分为4组，感染24h后，颈椎脱臼处死，打开胸腔取肺，放入装有1ml无菌pbs的qsp管中，放入磁珠，于匀浆机中65hz、250s研磨至无大块组织；取20μl组织匀浆于96孔板中，加入180μl无菌pbs，10倍稀释4个梯度，于tsb琼脂板上点板，细菌培养箱中过夜，次日统计菌落个数。

(2)肺泡灌洗液：将雄鼠按2.2.2分为4组感染24h后，用1.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，打开胸腔，暴露颈前气管，在会厌软骨处做一t形切口，插入套管；取1mlpbs来回灌洗2次，回收率在80％以上，收集于2mlep管中；取20μl肺泡灌洗液于96孔板中，加入180μl无菌pbs，10倍稀释4个梯度，于tsb琼脂板上点板，细菌培养箱中过夜，次日统计cfu。

桔梗汤对肺组织病理形态的影响

如图5所示，桔梗汤对肺组织病理形态的影响，a为空白对照组雄鼠肺组织切片图，b为模型组雄鼠肺组织切片图，c为桔梗汤不感染组雄鼠肺组织切片图，d为桔梗汤感染组雄鼠肺组织切片图；空白对照组雄鼠肺组织表现正常，肺泡数量丰富，支气管结构完整(如图5a所示)，金黄色葡萄球菌诱发的急性肺损伤在病理变化上常表现为大量中性粒细胞浸润。

本实验模型组雄鼠肺组织血管和支气管外均可见较多中性粒细胞浸润，如箭头1所示；肺泡壁增厚，其中散布有中性粒细胞，如箭头2所示；支气管管腔中可见红细胞，如箭头3所示；血管管腔内可见淋巴细胞贴壁，如箭头4所示，这些变化与ali的病理损伤高度相似，较好地模拟了临床上金葡菌导致的ali病理变化(如图5b所示)。

桔梗汤不感染组雄鼠肺组织表现正常，肺泡数量丰富，支气管结构完整(如图5c所示)，说明桔梗汤不会对雄鼠肺组织产生影响。

桔梗汤感染组雄鼠肺组织部分血管淤血，如黑色箭头所示；组织无其它明显异常，肺泡数量丰富，支气管结构完整(如图5d所示)，说明桔梗汤改善了金黄色葡萄球菌感染雄鼠的肺组织病理形态。

桔梗汤对肺部载菌量的影响

如图6所示，肺部载菌量是检验药物抗菌作用的直接指标，将模型组和桔梗汤感染组雄鼠感染24h后取肺组织制成匀浆，取部分进行稀释点板，如图6a所示，肺匀浆的cfu结果，桔梗汤感染组肺部载菌量与模型组相比显著降低；取模型组和桔梗汤感染组雄鼠的肺泡灌洗液稀释点板，其中模型组雄鼠一只死亡，如图6b所示，肺泡灌洗液的cfu结果，桔梗汤感染组雄鼠肺泡灌洗液的载菌量比模型组显著降低；上述结果说明桔梗汤能有效降低金葡菌感染雄鼠肺部的载菌量，具有体内抗菌作用。

上述结果表明，桔梗汤能有效降低肺部载菌量，改善肺组织病理形态，对金黄色葡萄球菌引起的肺损伤具有治疗作用。