一种中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法与流程

本发明属于中药制备技术领域，涉及以中药原材料为基础制备抗肿瘤多肽，更具体涉及一种中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法。

背景技术：

中药在我国有千年历史，由于传统中药炮制工艺落后，特别是中医大夫开的中药方，基本上是在家庭中熬制，其实熬制的过程就是把中药材中的有效成分用水煮的方法溶解释放出来。但家庭熬制中药的时间、温度、压力等都难以统一，因此很难确定将药材中的有效成分完全释放，究竟能够溶解释放出多少，难以确定。因此传统家庭熬制的中药汤剂就会出现治疗效果慢、疗效不确切的问题。并且患者服用的汤剂或者中成药，都不是直接进入血液发挥药物效果的最终成分，而只是中间物质。这些中间物质进入体内后，还要通过人体肠胃系统的益生菌进行再消化和分解，才能转化为最终起作用的有效成分从而进入血液，发挥药物的治疗作用。

“菌药”从上世纪90年代就开始风靡世界，各种理论研究和生物实验层出不穷，然而我国的中药发酵技术却是近几年才发展起来，以传统中草药物作为原料，通过不同的微生物在分子水平上的代谢转化、修饰得到全新的结构，不但增加了新适应症，从而扩大了治疗范围；另一方面通过微生物的发酵转化，增加了药物的活性，从而使药效大大增强。是将中药提取液或者中药细粉和经过优选的人体内有益菌(主要乳酸菌，酵母菌)作为菌种，依据中医药学，微生物学和仿生学理论，通过生物嫁接方式，在模拟人体胃肠环境的条件下对中药提取物进行生物转化而成的新型中药。利用现代生物科技技术使传统中药与有益菌完美结合，形成新兴的中药制剂。

传统中药原料基本以植物的根茎叶为主，我们在外加复合酶制剂(如纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶等)情况下它可以使中药材根茎叶复杂的纤维素，半纤维素，蛋白质，以及植物中的活性多糖，生物碱，黄酮类等，在特定条件下迅速完成释放并为微生物在生长过程中提供碳源和氮源。

我们现发明的一种中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液及其制备方法，就是将中药原料通过复合菌种发酵的基础条件下产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法，该方法中微生物以中药的有效成分为前体，经微生物发酵代谢形成新的化合物，微生物在生长过程中还能产生丰富的次生代谢产物，有些次生代谢产物自身就是功效良好的药物；或微生物的次生代谢产物和中药中的某些物质发生化学反应生成新的化合物。本发明中通过复合微生物菌群发酵产生多种多肽，且形成的多肽复合物具有抗肿瘤功效。

本发明中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法如下：多种中药原料先后通过多种不同微生物菌种发酵，而后再通过合并后熟共同发酵而生成多种活性多肽和氨基酸。

更具体中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法为：(一)原料一蒸煮；(二)原料二蒸煮；(三)合并后熟；(四)调配灌装。

其中上述原料一蒸煮具体制备方法如下：

1、物料准备：称取所需中药原料

灵芝15-45份、青稞10-30份、红豆杉提取物20-55份、枸杞子10-20份、蜂蜜10-25份、葛仙米25-50份、大麦15-50份、香菇13-55份、山药15-45份、山楂20-55份，粉碎机粉碎，倒入蒸煮罐1；

2、按料：水＝1：6-12加入纯水，添加所需的淀粉酶、糖化酶和纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度50-80℃，酶解1-6h，搅拌转速50-300r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸10-30min后将料液泵入酵母发酵罐，待温度降至25-35℃，按2％-8％加入酵母菌，20-35℃恒温发酵60-96h，之后再进行醋酸发酵按2％-8％加入醋酸菌，20-40℃恒温发酵48-80h。

其中上述淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和复合蛋白酶比例为0.5-10：1.5-15：1-13:2-20。

其中上述原料二蒸煮具体制备方法如下：

在原料一进行酵母发酵罐加入醋酸菌当天准备原料二蒸煮，制备方法如下：

1、物料准备：称取所需中药原料灵芝12-48份、青稞13-45份、红豆杉提取物25-65份、枸杞子15-40份、蜂蜜10-25份、葛仙米16-48份、螺旋藻18-50份、山药25-60份，粉碎机粉碎，混合倒入蒸煮罐2；

2、按料：水＝1：6-12加入纯水，添加所需的淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度50-60℃，酶解2-4h，搅拌转速50-300r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸10-30min后将料液泵入乳酸发酵罐，待温度降至25-35℃，按2％-8％加入乳酸菌，20-35℃恒温发酵60-80h。

其中上述的合并后熟制备方法如下：

1、待酵母发酵罐和乳酸发酵罐内发酵结束后，将二者合并至混合发酵罐，在25-35℃恒温培养发酵5-8天。

其中上述的酵母菌为酿酒酵母菌、汉逊酵母、葡萄汁酵母其中的一种或多种。

其中上述的醋酸菌为醋酸杆菌属，葡萄糖杆菌属、葡糖酸杆菌属中的一种或多种。

其中上述的乳酸菌为植物乳酸杆菌中的一种或多种。

四、调配灌装

1、混合发酵结束后，发酵液经离心机去除不溶性物质，离心清液补加所需的木糖醇、蜂蜜、甜菊糖苷、cmc、柠檬酸钠，搅拌混合均匀，高温杀菌处理后灌装，即得所需的口服液。

其中上述的高温杀菌后的调配液经浓缩，干燥还可以制备成乳剂、糖浆，颗粒剂、片剂、或胶囊剂、散剂等。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)微生物以中药的有效成分为前体，经微生物的代谢形成新的化合物；

(2)微生物在生长过程中还能产生丰富的次生代谢产物，有些次生代谢产物自身就是功效良好的药物；或微生物的次生代谢产物和中药中的某些物质发生化学反应生成新的化合物；

(3)微生物的分解作用可将中药中的有毒物质进行分解，从而降低药物的毒副作用，利用微生物的生长代谢来炮制中药，比—般的物理或化学的炮制方法更具优越性，可较大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症。(微生物结构简单，单细胞，对人体有一定的毒性的物质，对益生菌而言，就是致命的，微生物为了生长，会分泌特定的消化酶，将有害物质进行降解，降解为无毒的物质。)

(4)通过微生物发酵中药材制备而成的药物有效成分可直接制备成多种药物剂型，更利于生物体代谢吸收。

(5)本发明中的中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法，工艺简单稳定高效，适合工业化生产，成本低。

附图说明

图1是本发明中药发酵抗肿瘤活性多肽口服液的制备方法流程图；

图2是本发明中药发酵抗肿瘤活性多肽lc-ms检测图；

图3是本发明中药发酵抗肿瘤活性多肽中多种氨基酸检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1

一、原料一蒸煮

1、物料准备：称取所需中药原料

灵芝15份、青稞30份、红豆杉提取物25份、枸杞子14份、蜂蜜15份、葛仙米35份、大麦25份、香菇18份、山药20份、山楂25份，粉碎机粉碎，倒入蒸煮罐1；

3、按料：水＝1-6加入纯水，添加所需的淀粉酶、糖化酶和纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度55℃，酶解5h，搅拌转速200r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸30min后将料液泵入酵母发酵罐，待温度降至28℃，按6％加入酵母菌，28℃恒温发酵84h，之后再进行醋酸发酵按8％加入醋酸菌，28℃恒温发酵48h。

其中上述淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和复合蛋白酶比例为2：5：5:4。

二、原料二蒸煮

在原料一进行酵母发酵罐加入醋酸菌当天准备原料二蒸煮，制备方法如下：

1、物料准备：称取所需中药原料灵芝28份、青稞35份、红豆杉提取物35份、枸杞子20份、蜂蜜15份、葛仙米18份、螺旋藻38份、山药40份，粉碎机粉碎，混合倒入蒸煮罐2；

2、按料：水＝1：8加入纯水，添加所需的诺维信淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度50℃，酶解4h，搅拌转速200r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸30min后将料液泵入乳酸发酵罐，待温度降至28℃，按8％加入乳酸菌，28℃恒温发酵80h。

三、合并后熟

1、待酵母发酵罐和乳酸发酵罐内发酵结束后，将二者合并至混合发酵罐，在28℃恒温培养发酵6天。

其中上述的酵母菌为酿酒酵母菌一种。

其中上述的醋酸菌为醋酸杆菌属一种。

其中上述的乳酸菌为植物乳酸杆菌。

四、调配灌装

1、混合发酵结束后，发酵液经离心机去除不溶性物质，离心清液补加所需的木糖醇、蜂蜜、甜菊糖苷、cmc、柠檬酸钠，搅拌混合均匀，高温杀菌处理后灌装，即得所需的口服液。

实施例2

一、原料一蒸煮

1、物料准备：称取所需中药原料

灵芝45份、青稞18份、红豆杉提取物35份、枸杞子14份、蜂蜜16份、葛仙米40份、大麦25份、香菇20份、山药25份、山楂35份，粉碎机粉碎，倒入蒸煮罐1；

4、按料：水＝1：5加入纯水，添加所需的淀粉酶、糖化酶和纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度65℃，酶解5h，搅拌转速250r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸25min后将料液泵入酵母发酵罐，待温度降至30℃，按8％加入酵母菌，30℃恒温发酵66h，之后再进行醋酸发酵按6％加入醋酸菌，30℃恒温发酵48h。

其中上述淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和复合蛋白酶比例为3：6：5：5。

二、原料二蒸煮

在原料一进行酵母发酵罐加入醋酸菌当天准备原料二蒸煮，制备方法如下：

1、物料准备：称取所需中药原料灵芝48份、青稞25份、红豆杉提取物45份、枸杞子33份、蜂蜜20份、葛仙米28份、螺旋藻27份、山药35份，粉碎机粉碎，混合倒入蒸煮罐2；

2、按料：水＝1：8加入纯水，添加所需的诺维信淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度55℃，酶解4h，搅拌转速200r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸30min后将料液泵入乳酸发酵罐，待温度降至30℃，按8％加入乳酸菌，30℃恒温发酵75h。

三、合并后熟

1、待酵母发酵罐和乳酸发酵罐内发酵结束后，将二者合并至混合发酵罐，在20℃恒温培养发酵7天。

其中上述的酵母菌为酿酒酵母菌、汉逊酵母、葡萄汁酵母三种。

其中上述的醋酸菌为醋酸杆菌属，葡萄糖杆菌属两种。

其中上述的乳酸菌为植物乳酸杆菌。

四、调配灌装

1、混合发酵结束后，发酵液经离心机去除不溶性物质，离心清液补加所需的木糖醇、蜂蜜、甜菊糖苷、cmc、柠檬酸钠，搅拌混合均匀，高温杀菌处理后灌装，即得所需的口服液。

实施例3

一、原料一蒸煮

1、物料准备：称取所需中药原料

灵芝38份、青稞20份、红豆杉提取物40份、枸杞子12份、蜂蜜15份、葛仙米38份、大麦42份、香菇36份、山药30份、山楂25份，粉碎机粉碎，倒入蒸煮罐1；

5、按料：水＝1：7加入纯水，添加所需的淀粉酶、糖化酶和纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度65℃，酶解4h，搅拌转速100r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸30min后将料液泵入酵母发酵罐，待温度降至28℃，按5％加入酵母菌，28℃恒温发酵96h，之后再进行醋酸发酵6％加入醋酸菌，28℃恒温发酵48h。

其中上述淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和复合蛋白酶比例为5：5：6:4。

二、原料二蒸煮

在原料一进行酵母发酵罐加入醋酸菌当天准备原料二蒸煮，制备方法如下：

1、物料准备：称取所需中药原料灵芝48份、青稞45份、红豆杉提取物65份、枸杞子40份、蜂蜜25份、葛仙米48份、螺旋藻50份、山药60份，粉碎机粉碎，混合倒入蒸煮罐2；

2、按料：水＝1：10加入纯水，添加所需的诺维信淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、复合蛋白酶，维持温度60℃，酶解4h，搅拌转速125r/min，酶解结束后，升温至100℃，保沸30min后将料液泵入乳酸发酵罐，待温度降至28℃，按8％加入乳酸菌，28℃恒温发酵65h。

三、合并后熟

1、待酵母发酵罐和乳酸发酵罐内发酵结束后，将二者合并至混合发酵罐，在28℃恒温培养发酵6天。

其中上述的酵母菌为酿酒酵母菌一种。

其中上述的醋酸菌为葡萄糖杆菌属、葡糖酸杆菌属两种。

其中上述的乳酸菌为植物乳酸杆菌。

四、调配灌装

1、混合发酵结束后，发酵液经离心机去除不溶性物质，离心清液补加所需的木糖醇、蜂蜜、甜菊糖苷、cmc、柠檬酸钠，搅拌混合均匀，高温杀菌处理后灌装，即得所需的口服液。

其中上述的高温杀菌后的调配液经干燥后再制备成胶囊剂。

实施例4中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液lc-ms检测

1、仪器与条件

仪器：hp1290高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；agilent6460lc-qqq质谱仪(美国安捷伦公司)

色谱柱：以acquityuplcbehamide柱为色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)；

微孔滤膜：0.22μm有机膜；

流动相：甲醇-水-乙腈：其中甲醇与水的体积比为6-8：2-4；

流速：0.25ml/min；柱温：40℃；进样量：1μl。

流动相：0.1％甲醇水和乙腈；梯度洗脱程序：0min时80％乙腈；0.5～4min，线性减小至50％乙腈；4～5min，线性减小至40％乙腈；5.5min，增至80％乙腈，之后进行系统平衡。

其质谱条件如下：电喷雾(esi)离子源，正离子扫描模式；毛细管电压：4.0kv；干燥气温度：300℃；干燥气流速：8l/min；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11l/min；光电倍增器电压：300v。监测模式采用多反应检测模式(mrm)。应用masshunter软件进行数据分析

2、实验步骤

取中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液10ml于100ml容量瓶中，以甲醇-水(70:30)溶液定容至刻度，摇匀作为备用液。吸取备用液1ml于另一100ml容量瓶中，用甲醇-水(70:30)溶液定容至刻度，摇匀后用0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液待上机检测；按上述色谱条件进行lc-ms分析，记录色谱图，结果见图2。

由图2可知该条件下中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液中有多种多肽存在，说明本方法通过中药发酵可以有效得到多种多肽。

实施例5中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液中氨基酸检测

仪器：移液器(吉尔森)、超声波、试管浓缩仪、氨基酸自动分析仪(德国sykam)；0.45um滤膜。

试剂：去离子水、盐酸(分析纯)、样品稀释液(德国sykam)、不同ph和离子强度的洗脱液、茚三酮溶液、混合氨基酸标准溶液。

仪器分析条件：柱温：37℃；反应管温度：130℃；进样量：50ul；缓冲溶液：不同ph值的柠檬酸锂缓冲溶液。

试验方法：移取中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液10ml溶液至三角瓶中，后加入50ml一定浓度的盐酸溶液，塞上塞子、超声、过滤。准确移取2ml滤液浓缩蒸干(温度不超过60℃)，加入1ml样品稀释液，混匀。溶液经0.45um滤膜过滤后上机分析。

如图3所示，中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液样品的氨基酸分析色谱图，由色谱图可以看出，中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液中分析检测出17种氨基酸，分别为：asp、glu、ser、his、gly、thr、arg、ala、tyr、cys、val、met、phe、leu、lys、pro、ile。

由图3可知该条件下中药发酵抗肿瘤活性多肽溶液中有多种氨基酸存在，说明本方法通过中药发酵可以有效得到多种氨基酸。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。