一种植物提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种具镇痛、提高学习和记忆能力及预防或治疗阿尔茨海默症的植物提取物，具体是一种牛筋草提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

疼痛是组织损伤或潜在组织损伤引起的不愉快感觉和情感体验，给患者身体和心理造成严重影响。目前，临床上多用化学药物治疗各种疼痛，根据其作用靶点可大致分为两类：阿片类药物包括杜冷丁、吗啡等，非阿片类药物包括阿司匹林、吲哚美辛等。前者镇痛作用迅速且疗效明显，但由于成瘾和耐受作用，临床使用常常受到限制；而后者对于重度疼痛的效果不佳，仅限于治疗轻度疼痛。因此，亟需寻找和开发不具有耐受性和成瘾性、疗效显著的新型镇痛药。

阿尔茨海默症是一种以记忆功能障碍为主要临床表现的慢性神经退行性疾病，该病多发生于老年期，故又称老年痴呆症。随着老龄化进程加速，阿尔茨海默症已成为老年人致残、致死最严重的疾病之一，其高昂的医护成本也给患者家庭和社会造成沉重的负担。目前，该疾病的发病机制仍不明确，临床用于治疗阿尔茨海默症的药物包括多奈哌齐、加兰他敏、他克林和美金刚等，它们虽然能短期内改善痴呆患者的症状，但不能延缓疾病的进一步发展。此外，有些药物对肝脏具有较强的毒副作用。

近年来，中草药由于具有作用广泛、不良反应少、不易产生耐药和成瘾性低等优点，在疼痛治疗、提高学习和记忆功能、预防和治疗老年痴呆等方面引起了人们的广泛重视。

牛筋草为禾本科稔属植物牛筋草[eleusineindica(l.)gaertn.]的全草，又名牛顿草、千人拔、蟋蟀草、牛古草、牛皮草等。该植物分布于全世界温带和热带地区，我国南北各省区均有生长。牛筋草具有清热解毒、活血散痰等功效，药用价值较高，可用于治疗小儿惊风、乙脑、流脑、黄疸、淋症、小便不利、痢疾、便血、疮疡肿痛及跌打损伤等。

目前为止，尚未见牛筋草及其提取物在镇痛、提高学习和记忆及预防或治疗阿尔茨海默症方面的报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的主要目的在于提供一种具有镇痛、提高学习和记忆能力及预防或治疗阿尔茨海默症的牛筋草提取物的制备方法及其应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种牛筋草提取物，所述提取物包括以下步骤制备：

(1)牛筋草粉碎，用水煎煮或加热回流提取，静置过滤，所得滤液减压回收，浓缩至原体积的1/2～1/10，得流浸膏，将流浸膏加乙醇调至乙醇浓度为50～80％，搅匀，静置过滤，滤液减压浓缩至无醇味；

(2)将步骤(1)所得处理后的浓缩液经大孔吸附树脂富集纯化，水洗脱，合并水洗脱液，减压浓缩干燥，即得牛筋草提取物。

所述牛筋草提取物中含有甜菜碱和胆碱。

本发明还提供牛筋草提取物的制药用途，包括上述牛筋草提取物在制备镇痛、提高学习和记忆、预防或治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。

本发明所采用的大孔吸附树脂选自弱极性大孔吸附树脂或非极性大孔树脂，优选d101树脂、ab-8树脂。

本发明还提供一种药物组合物，包括上述牛筋草提取物和药学可接受的辅料。

所述的药物剂型选自胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液和糖浆剂。

牛筋草提取物通过如下制备方法制得：

将牛筋草粉碎，加5～10倍量水，煎煮或热回流提取1～4次，每次0.5～3h，过滤，合并滤液减压浓缩至原体积的1/2～1/10；加乙醇调至乙醇浓度为50～90％，搅匀，静置过滤，滤液浓缩至无醇味；再经大孔树脂吸附，树脂用量为牛筋草粗粉重量5～20倍，用3～10倍柱体积水洗脱，合并水洗脱液，浓缩干燥，得牛筋草提取物。图1和图2为其指纹图谱。

本发明所提供的牛筋草提取物，可应用于治疗和改善各种原因引起的疼痛、提高学习和记忆及预防或治疗阿尔茨海默症。

所述提取物可采用常规制剂技术，制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液和糖浆剂等口服制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明所述的牛筋草提取物具有明显的镇痛作用，其镇痛活性强于阳性对照药阿司匹林。

(2)本发明所述的牛筋草提取物可显著降低避暗试验中正常小鼠的错误次数，延长第一次进入暗室的潜伏期，具有提高学习和记忆功能的效果。

(3)本发明所述的牛筋草提取物可明显缩短阿尔兹海默症(ad)模型小鼠在水迷宫中的逃避潜伏期，增加其在模板象限中的游泳时间比例；可恢复阿尔兹海默症(ad)模型小鼠对新物体的偏好性，改善物体识别的记忆缺失，具有预防或治疗阿尔茨海默症的效果。

(4)本发明所述的牛筋草提取物在动物体内毒性低。

(5)本发明所述的牛筋草植物资源广泛、价廉，且提取制备工艺简单、易于大规模工业化生产，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为牛筋草提取物的hplc-ms总离子流图

图2为牛筋草提取物的hplc-elsd色谱图

图3为牛筋草提取物对小鼠空间学习和记忆功能改善的影响

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：牛筋草提取物的制备

牛筋草1kg粉碎，加5000ml水热回流提取2次，每次1h，过滤后滤液浓缩至1000ml。再加入乙醇3000ml，搅匀，静置，过滤，滤液浓缩至无醇味。经d101型大孔树脂吸附，树脂用量为10kg，用5000ml去离子水洗脱，合并水洗脱液，浓缩干燥，即得牛筋草提取物172g。

实施例2：牛筋草提取物hplc-ms成分分析

药品：乙腈(北京迈瑞达科技有限公司)，甲酸(广州化学试剂厂)，牛筋草提取物由实施例1-2所述方法制备。

仪器：agilent6210lc/msdtof液质联用仪；色谱柱：cosmosil-5c18-ms-ii(4.6×250mm,5μm)；柱温：30℃；流速：1ml/min；进样量：20μl；流动相：乙腈(b)-0.1％甲酸水(a)；洗脱条件：20％乙腈-80％甲酸水等度洗脱；质谱采集模式：正离子模式；锥孔电压：3000v；离子源温度：350℃；氮气流速：10ml/min；质量范围：50-2000da。

依法测定，测得指纹图谱见图1，所得的牛筋草提取物指纹图谱中含有甜菜碱和胆碱等成分。

实施例3：牛筋草提取物hplc-elsd成分分析

药品：乙腈(北京迈瑞达科技有限公司)，甲酸(广州化学试剂厂)，牛筋草提取物由实施例1-2所述方法制备。

仪器：waterse2695；色谱柱：cosmosil-5c18-ms-ii(4.6×250mm,5μm)；柱温：30℃；流速：1ml/min；进样量：20μl；流动相：乙腈(b)-0.1％甲酸水(a)；洗脱条件：0～10min5％～95％b，10～15min95％b；elsd漂移管温度：80℃；增益：40；气体压力：40psi；模式：冷却。依法测定，测得指纹图谱见图2，所得的牛筋草提取物指纹图谱中含有甜菜碱和胆碱等成分。

实施例4：小鼠急性毒性试验

动物：昆明种小鼠120只，体重18～22g，雌雄各半，购自广东省医学实验动物中心。

药品：牛筋草提取物由实施例1所述方法制备。

实验方法：昆明种小鼠随机分为药物组(动物分别给予20g/kg、10g/kg、5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg浓度的药物)和阴性对照组(灭菌水)，每组20只，雌雄各半。小鼠2次灌胃，间隔2h，观察7d，记录动物中毒症状及死亡情况。

实验结果：试验期间，在各剂量下，雌雄小鼠均未死亡，也无出现其他明显症状，表明牛筋草提取物灌胃给药的ld50大于20g/kg，按急性毒性分级，该受试物属无毒类物质。

实施例5：牛筋草提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

动物：昆明小鼠，雄性，18～22g，购自广东省医学实验动物中心。

药品：阿司匹林(广东九明制药有限公司)，醋酸(广州化学试剂厂)，牛筋草提取物由实施例1所述方法制备。

实验方法：选18～22g健康雄性昆明小鼠50只，随机分为对照组、阿司匹林阳性对照组和牛筋草提取物高、中、低剂量组。动物分组和给药剂量见表1，实验前1h灌胃给予受试药物，对照组给予等容量的生理盐水，给药1h后，以0.2ml/10g后腹腔注射浓度为0.4％醋酸溶液，观察给药小鼠的扭体反应潜伏期及20min内扭体次数，并计算镇痛百分率，实验结果见表1。镇痛百分率(％)＝(对照组扭体均数-药物组扭体均数)/对照组扭体均数×100。

表1牛筋草提取物对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

注：与对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。与阿司匹林组相比，^#p<0.05。

实验结果：牛筋草提取物高、中、低剂量组均可明显延长小鼠扭体反应的潜伏期，并降低扭体次数。与对照组比较，均具有显著性差异(p＜0.05)，表明牛筋草提取物具有较好的镇痛作用。

实施例6：牛筋草提取物对热板法致痛作用的影响动物：昆明小鼠，雄性，18～22g，购自广东省医学实验动物中心。

药品：阿司匹林(广东九明制药有限公司)；牛筋草提取物由实施例1所述方法制备。

主要仪器：rcy-2型热板测痛仪(上海益联医学仪器发展有限公司)

实验方法：选18～22g健康雄性昆明小鼠，预先以55℃热板对小鼠进行筛选，在10～30s内出现舔足反应的为合格小鼠。选取50只合格小鼠，随机分为对照组、阿司匹林阳性对照组和牛筋草提取物高、中、低剂量组。实验分组和动物剂量见表2。实验前1h灌胃给予受试药，对照组给予等容量生理盐水。为避免痛阈周期性波动的影响，实验均在上午9～11时进行，室温25℃。记录各组小鼠痛阈值的变化，并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率(％)＝(给药后痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％。若60s内未出现舔足现象，痛阈记为60s。

表2牛筋草提取物对小鼠热板法致痛的影响

注：与对照组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。与阿司匹林组相比，^#p<0.05。

实验结果：牛筋草提取物高、中、低剂量组的痛阈提高时间和对照组比较，均具有显著性差异(p＜0.05)，表明牛筋草提取物能明显提高小鼠的耐热痛能力，具有较好的镇痛作用。

实施例7：牛筋草提取物对光辐射热致痛作用的影响

动物：昆明小鼠，雄性，18～22g，购自广东省医学实验动物中心。

药品：阿司匹林(广东九明制药有限公司)；牛筋草提取物由实施例1所述方法制备。

主要仪器：jl-f型数显式光热测痛仪(上海益联医学仪器发展有限公司)

实验方法：选18～22g健康雄性昆明小鼠，将小鼠放入光热测痛仪给予热刺激，以小鼠甩尾时间在3～9s者为合格(每只小鼠分别检测三次，每次间隔30min，取三次测量平均值作为基础甩尾阈)。将筛选合格的小鼠随机分为5组，每组10只，分别单剂量灌胃给予不同的受试物，对照组给予同等容量的生理盐水。给药30min以及60min后，分别用光热测痛仪测定其疼痛潜伏期(最长照射时间限定为20s)。痛阈提高百分率(％)＝(给药后痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％。

表3牛筋草提取物对小鼠光辐射致痛作用的影响

实验结果：牛筋草提取物高、中、低剂量组能显著提高痛阈值，表明牛筋草提取物能明显提高小鼠的的耐光辐射致痛能力，具有较好的镇痛作用。

实施例8：牛筋草提取物对正常小鼠学习和记忆功能改善的影响

动物：昆明种小鼠80只，体重18～22g，雌雄各半，购自广东省医学实验动物中心。

药品：牛筋草提取物由实施例1所述方法制备。

实验方法：将小鼠分为生理盐水组和3种不同剂量的牛筋草提取物组，分别单剂量灌胃给予不同的受试物，各组小鼠给药后开始实验。实验装置由明箱和暗箱组成，两个箱子之间有一个洞及有一扇可升降的门。明箱中用灯管照明，照度为290lux，暗箱中为黑暗环境，底部分布有可通电的栅格条。实验分为学习和测试阶段，第一天为学习阶段，两箱之间洞口的门关闭，小鼠背对洞口从明箱中放入，在箱子中适应10s，打开灯管和打开洞口的门，让小鼠自由活动。当小鼠进入暗箱中，把洞口关上，然后通电，给予0.3ma，5s的电击，电击后让小鼠在暗箱中停留10s，让其产生记忆，再放回笼子中饲养。24h后进入测试阶段，操作跟学习阶段一样，小鼠同样从明箱中放入，不过不给予电击，让小鼠自由活动5min。记录小鼠第一次进入暗箱的时间(潜伏时间)和5min内进入的次数(错误次数)，比较不同组间的差异。

表4牛筋草提取物对小鼠学习记忆的影响

注：与生理盐水组相比，^*p<0.05，^**p<0.01，具有显著性差异。

实验结果：与生理盐水组比较，牛筋草提取物高中剂量组的错误次数减少(p<0.05)，高中低剂量组的潜伏期延长(p<0.05)，说明牛筋草提取物可以巩固小鼠在被动回避实验中的记忆，加强小鼠的学习能力。

实施例9：牛筋草提取物对阿尔兹海默症(ad)模型小鼠空间学习和记忆功能改善的影响动物：app/ps1转基因小鼠，6月龄，购自广东省医学实验动物中心。

药品：牛筋草提取物由实施例1所述方法制备。

实验方法：app/ps1转基因小鼠随机分为模型组和给药组，分别单剂量灌胃给予不同的受试物，连续给药2周后，随机选择一象限面将小鼠沿池壁放入水中，计时90s，记录每只小鼠寻找到平台所需时间，若小鼠90s内寻找到平台，让小鼠在平台停留10s，若小鼠无法在90s内寻找到平台，引导小鼠至平台并停留10s。训练5d后，撤去水迷宫中的平台，随机选取象限面将小鼠放入水中，记录90s内小鼠穿过原平台中心的次数，并进行统计，实验结果见图3。

实验结果：牛筋草提取物灌胃给药0.2g/kg和0.4g/kg时，均可明显缩短app/ps1小鼠在morris水迷宫中逃避潜伏期，并增加其在模板象限中的游泳时间比例，具有较好改善ad模型小鼠空间学习记忆和认知功能障碍的作用。

实施例10：牛筋草提取物对阿尔兹海默症(ad)模型小鼠本能学习和记忆功能改善的影响动物：app/ps1转基因小鼠，6月龄，购自广东省医学实验动物中心。

药品：牛筋草提取物由实施例1所述方法制备。

实验方法：app/ps1转基因小鼠随机分为模型组和给药组，分别单剂量灌胃给予不同的受试物，连续给药2周。实验在40×40×40cm的白色塑料箱子中进行，实验分为三个阶段(适应，训练，测试)。第一阶段是适应阶段，将测试小鼠放入实验的箱子适应10分钟放回笼子中，1h后进行训练阶段。在训练阶段，小鼠给予10min自由识别两个大小形状一致的物体(直径是4cm，高2.8cm的白色瓶盖)。24h后，其中一个物体换成另外一个新的物体(乐高积木，长宽高：4.6×2.2×3.5cm)，小鼠放回箱子中给予8min去识别新的和旧的物体。实验结束后通过软件分析测试小鼠在实验过程中的运动距离和在不同阶段嗅不同物体的时间。

表5牛筋草提取物对小鼠新物体识别的影响

注：与模型组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。

实验结果：在适应阶段，不同分组的小鼠运动距离没有变化，表明牛筋草提取物不影响小鼠的正常运动。在训练阶段，不同分组的小鼠对两个相同物体识别度一致，表明小鼠不存在偏好性。在测试阶段，给药组的小鼠(牛筋草提取物灌胃给药)更加偏好新物体，表现出正常的物体偏好记忆，而模型组对新旧物体没有明显的偏好性(p＜0.05)，物体识别记忆缺陷。造模组给药治疗后，小鼠恢复对新物体的偏好性，说明牛筋草提取物可以提高模型小鼠本能学习和记忆功能，改善小鼠造模后导致的物体识别记忆缺陷。

实施例11：牛筋草提取物口服液的制备

取按实施例1方法制备的牛筋草提取物200g，与50g聚乙二醇-6000混合后置于7l蒸馏水-甘油混合溶剂(甘油含量40％)，充分溶解后，制备成溶液(1)。取苯甲酸4g、甘草酸50g混合溶于2l50℃蒸馏水-甘油混合溶剂(甘油含量40％)，冷却至室温后制备成溶液(2)。将溶液(1)与溶液(2)混合，再加入10ml香精，加蒸馏水-甘油混合溶剂(甘油含量40％)至10l，搅拌均匀，调ph至3.8-4.0。经0.22μm微孔滤膜过滤即得牛筋草口服液，灌装，灭菌。每瓶10ml，共1000瓶。每瓶含牛筋草提取物200mg。

实施例12：牛筋草提取物片剂的制备

取按实施例1方法制备的牛筋草提取物200g、淀粉190g混合均匀，用70％乙醇制成软材，制粒，烘干。加入0.9g硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，包薄膜衣，每片含牛筋草提取物200mg。

实施例13：牛筋草提取物胶囊剂的制备

取按实施例1方法制备的牛筋草提取物200g、淀粉75g、羧甲基淀粉9.2g混匀，加65％乙醇制成软材，过筛干燥，整粒，加入0.31g硬脂酸镁，混匀，装入1号胶囊，制成1000粒，抛光，即得牛筋草提取物胶囊。每粒含牛筋草提取物200mg。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。