一种组织工程软骨支架的制备方法与流程

针对目前临床关节软骨组织修复长期效果不理想的问题，本发明涉及丝蛋白冷冻解冻凝胶-化学交联相结合的技术，即将丝蛋白(sf)、化学交联剂乙二醇二缩水甘油醚(egde)和引发剂四甲基乙二胺(temed)的共混溶液置于低温环境下，利用共混溶液中的水结晶形成冰，将sf、egde和temed排挤到冰的周围，使丝蛋白溶液处于高浓度状态，从而使sf分子之间形成物理交联，同时使sf分子与egde分子之间形成化学交联，进而促进sf共混溶液的凝胶；随后将冰在室温条件下解冻，最终得到丝蛋白软骨支架。属于软骨组织工程技术领域。

背景技术：

目前，关节软骨组织修复对于研究者和临床医生都是一项非常大的挑战。基于软骨组织工程技术是非常有前景的软骨组织再生和功能恢复策略，相对于常用的治疗方法，如关节清创、微骨折、自体软骨移植和自体软骨细胞移植方法，软骨组织工程技术能够极大的延长修复后的效果，其潜在的治疗应用价值已经得到了极大的关注。因此，开发新型软骨组织再生的生物活性支架已成为当代生物医学材料的发展方向。

丝蛋白是一种天然纤维蛋白，主要由18种氨基酸组成。其优点在于具有良好的机械性能和可控的生物可降解性，丝蛋白可以制备成膜、凝胶、多孔支架等不同形态。同时，丝蛋白支架的制备方法繁多，可控性强，是一种应用十分广泛的生物材料，在应用于多种组织缺损修复中，具体较突出的生物学优势，可获得组织结构和功能上的完整重建。

国际市场尽管已有少量的基于胶原的生物支架产品上市，但要提高其临床疗效、扩大临床适用范围，还需要进一步优化材料设计，改进生产工艺技术，完善材料评价体系。基于胶原生物支架目前具有的局限性，包括在体内环境下力学强度下降、力学保持性降低以及支架体外与细胞不能动态力学培养等问题。本项目根据生物支架的临床应用和产业化需求，通过冷冻凝胶和化学交联技术，建立具有反复循环压缩的天然丝蛋白多孔支架，提高其动态加载的力学功能。

所选取丝蛋白为fda批准的蚕丝蛋白，丝蛋白已在临床上被用作手术缝合线多年，相比于其他天然聚合物，丝蛋白有着卓越的力学性能，良好的生物相容性，可控降解及可吸收性，容易加工，且来源广。本发明涉及丝蛋白冷冻解冻凝胶-化学交联相结合的技术，利用sf分子之间形成物理交联，同时使sf分子与egde分子之间形成化学交联，进而促进sf共混溶液的凝胶，最后在室温解冻凝胶，最终得到丝蛋白软骨支架。

技术实现要素：

本发明内容针对现有软骨组织修复材料存在的问题和不足，提供一种新型软骨组织修复材料。该复合材料具有良好的生物活性、力学性能、可控降解性，安全无毒。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明一种组织工程软骨支架的制备方法，其实施步骤如下：

步骤(一)：丝蛋白溶液的制备

所述的“丝蛋白”是一种天然纤维蛋白，该丝蛋白来源于蚕茧；该丝蛋白溶液通过以下方法制备得到：

1)10gnahco3溶解在2升(l)超纯水中配成0.5％的nahco3溶液，加热至沸腾；

2)10g剪碎的蚕茧投入到沸腾的nahco3溶液中，投入的时间是按规定所需时间；

3)将已经按规定所需时间煮沸腾的蚕丝捞出，在超纯水中进行冲洗一定次数；

4)捞出蚕丝，展开放于干净的托盘上，放置在规定温度的烘箱中烘干；

5)称一定量干燥的蚕茧溶于一定量的libr(9.3mol/l)，水浴锅中在预定温度下煮至溶解，时间在规定所需时间后终止；

6)双层纱布过滤溶好的丝蛋白溶液至锥形瓶中；

7)将过滤好的丝蛋白溶液装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，在超纯水中透析3天；

8)将透析好的丝蛋白溶液装入离心管中同时放入离心机中，以12000转/min的转速在离心机中旋转一定时间；

9)将在离心机中旋好的丝蛋白溶液装入截留分子量为4500的透析袋中，再将透析袋放入重量体积百分浓度为10％w/v的聚乙二醇(peg)溶液中反透析，将丝蛋白浓度浓缩至5-6％w/v，得到所需要的丝蛋白溶液；

步骤(二)：组织工程软骨支架的制备，包括：丝蛋白支架的制备，

其步骤如下：

1)将重量体积百分浓度为(5-6)％w/v的sf溶液与(1-3)mmol/gegde和(0-0.5)v/v％temed共混搅拌，使其均匀混合规定所需时间；

2)将混合好的共混溶液装入2.5毫升(ml)的针管内，将针管放置在4℃冰箱内预冷1小时；

3)随后将针管放置在-10℃的恒温反应器中，放置24小时；

4)随后将针管取出在室温水中放置12小时；

5)将针管内的含水支架取出，放置在-40℃冰箱内规定所需时间；

随后在冷冻干燥机中冻干规定所需时间，最终得到需要的丝蛋白支架。

其中，在步骤(一)2)中所述的“10g剪碎的蚕茧投入到沸腾的nahco3溶液中”，投入的时间是1小时；

其中，在步骤(一)3)中所述的“将已经按规定所需时间煮沸腾的蚕丝捞出，在超纯水中进行冲洗一定次数”，该煮沸腾时间是1小时；在超纯水中进行冲洗5次；

其中，在步骤(一)4)中所述的“捞出蚕丝，展开放于干净的托盘上，放置在规定温度的烘箱中烘干”，该烘箱内规定的温度是45℃；

其中，在步骤(一)5)中所述的“称一定量干燥的蚕茧溶于一定量的libr(9.3mol/l)”，该一定量干燥的蚕茧是8g，溶于100ml的libr(9.3mol/l)水浴锅中在40℃温度下煮至溶解，时间在3小时后终止；

其中，在步骤(一)8)中所述的“以12000转/min的转速在离心机中旋转一定时间”，该旋转一定时间是15分钟。

其中，在步骤(二)1)中所述的“将重量体积百分浓度为(5-6)％w/v的sf溶液与(1-3)mmol/gegde和(0-0.5)v/v％temed共混搅拌，使其均匀混合规定所需时间”，该均匀混合规定所需时间为30分钟；

其中，在步骤(二)5)中所述的“5)将针管内的含水支架取出，放置在-40℃冰箱内规定所需时间；随后在冷冻干燥机中冻干规定所需时间，最终得到需要的丝蛋白支架”，该放置在-40℃冰箱内规定所需时间为24小时，随后在冷冻干燥机中冻干规定所需时间为24小时。

通过以上步骤，制备了具有内通孔结构、力学性能优异、可生物降解、生物相容性好的组织工程支架；力学性能具体表面为，含水支架极限拉伸应变为120％、极限拉伸强度为160kpa、动态剪切扭转失稳应变为50％、动态1000次30％应变循环压缩；丝蛋白支架优异的力学性能为软骨组织工程细胞与支架体外动态培养提供了新的材料体系。

本发明的有益效果为：

1)力学性能优异。由于丝蛋白自身的分级结构，力学性能优越，所以经冷冻解冻凝胶和化学交联后，整体力学加强。化学交联后的丝蛋白分子链之间形成稳定的交联网络，并且丝蛋白内β-sheet结构的形成，起到物理交联的作用，对整体的力学性能又起到加强的作用。

2)生物活性和生物相容性较好。丝蛋白材料的成分由天然组分构成。丝蛋白已在临床上被用作手术缝合线多年。

3)防快速降解。化学交联的丝蛋白支架内部形成更多更小的β-sheet晶体区域以及物理交联点。降解酶对该区域的降解能力下降，降低了降解速度。

4)降解速率可控。生物材料的降解应该以可控的速率以满足新组织的生成。丝蛋白冷冻解冻凝胶-化学交联支架后的降解，可通过不溶于水的silkii和溶于水的silki的含量控制，而丝蛋白化学交联后，会增加silkii的含量，silkii里含有β-sheet结构，β-sheet结构的产生，会增加silk的降解时间；而这种β-sheet结构，可通过加热或者缓慢的干燥而减少，从而减少silk的降解时间。

5)安全无毒。本丝蛋白多孔支架材料是天然来源的材料，且降解产物安全无毒，制作过程中虽然加入了egde和temed。但支架制备之后用超纯水清洗支架内部残留的egde和temed分子，再利用傅里叶红外光谱表征分析证明，支架内部基本无残留egde和temed分子。

6)制作工艺简洁，成本低廉。本复合材料制作工艺简单，便于生产，且用于支架的丝蛋白来源广泛，成本低。

附图说明

图1本发明所述的“一种组织工程软骨支架的制备方法”流程图；

图中序号、符号、代号说明如下：

sf表示丝蛋白、egde表示乙二醇二缩水甘油醚、teme表示四甲基乙二胺、min代表分钟、h表示小时、℃表示摄氏度。

具体实施方式

本发明一种组织工程软骨支架的制备方法，见图1所示，其实施步骤如下：

步骤(一)：丝蛋白溶液的制备

所述的“丝蛋白”是一种天然纤维蛋白，该丝蛋白来源于蚕茧；该丝蛋白溶液通过以下方法制备得到：

1)10gnahco3溶解在2升(l)超纯水中配成0.5％的nahco3溶液，加热至沸腾；

2)10g剪碎的蚕茧投入nahco3溶液中(沸腾)，煮1小时(h)；

3)将已经煮了1h的蚕丝捞出，在超纯水中冲洗5次；

4)捞出蚕丝，展开放于干净的托盘上，放置在45℃烘箱中，烘干；

5)称8g干燥的蚕茧溶于100mllibr(9.3mol/l)，水浴锅40℃煮(3h)至溶解；

6)双层纱布过滤溶好的丝蛋白溶液至锥形瓶中；

7)将过滤好的丝蛋白溶液装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，在超纯水中透析3天；

8)将透析好的丝蛋白溶液装入离心管中同时放入离心机中，以12000转/min的转速转离心15分钟；

9)将离心好的丝蛋白溶液装入截留分子量为4500的透析袋中，再将透析袋放入重量体积百分浓度为10％w/v的聚乙二醇(peg)溶液中反透析，将丝蛋白浓度浓缩至5-6％w/v，得到所需要的丝蛋白溶液。

步骤(二)：本发明一种组织工程软骨支架的制备，包括：丝蛋白支架的制备，

其步骤如下：

1)将重量体积百分浓度为(5-6)％w/v的sf溶液与(1-3)mmol/gegde和(0-0.5)v/v％temed共混搅拌，使其均匀混合30分钟(min)；

2)将混合好的共混溶液装入2.5毫升(ml)的针管内，将针管放置在4℃冰箱内预冷1h；

3)随后将针管放置在-10℃的恒温反应器中，放置24h；

4)随后将针管取出在室温水中放置12h；

5)将针管内的含水支架取出，放置-40℃冰箱24小时，随后在冷冻干燥机中冻干24h，最终得到需要的丝蛋白支架。

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例(一)：丝蛋白溶液的制备

所述的“丝蛋白”是一种天然纤维蛋白，该丝蛋白来源于蚕茧；该丝蛋白溶液通过以下方法制备得到：

1)10gnahco3溶解在2l超纯水中配成0.5％的nahco3溶液，加热至沸腾；

2)10g剪碎的蚕茧投入nahco3溶液中(沸腾)，煮1h；

3)将已经煮了1h的蚕丝捞出，在超纯水中冲洗5次；

4)捞出蚕丝，展开放于干净的托盘上，放置在45℃烘箱中，烘干；

5)称8g干燥的蚕茧溶于100mllibr(9.3mol/l)，水浴锅40℃煮(3h)至溶解；

6)双层纱布过滤溶好的丝蛋白溶液至锥形瓶中；

7)将过滤好的丝蛋白溶液装入截留分子量为8000-14000的透析袋中，在超纯水中透析3天；

8)将透析好的蚕丝蛋白溶液装入离心管中同时放入离心机中，以12000转/min的转速转离心15分钟；

9)将离心好的蚕丝蛋白溶液装入截留分子量为4500的透析袋中，再将透析袋放入重量体积百分浓度为10％w/v的聚乙二醇(peg)溶液中反透析，将蚕丝蛋白浓度浓缩至5-6％w/v，得到所需要的蚕丝蛋白溶液；

10)将重量体积百分浓度为5.5％w/v的sf溶液与1mmol/g乙二醇二缩水甘油醚(egde)和0.25v/v％四甲基乙二胺(temed)搅拌，使其均匀混合30min；

11)将混合好的溶液装入2.5ml的针管内，将针管放置在4℃冰箱内预冷1h；

12)随后将针管放置在-10℃的恒温反应器中，放置24h；

13)随后将针管取出，放在室温水中解冻12h；

14)将针管内的含水支架取出，放置-40℃冰箱24小时，随后在冷冻干燥机中冻干24h，最终得到需要的蚕丝蛋白支架。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。