表面修饰的钛及钛合金用于牙髓冠方封闭的应用的制作方法

本发明涉及牙科制剂技术领域，具体涉及表面修饰的钛及钛合金用于牙髓冠方封闭的应用。

背景技术：

目前治疗龋齿、牙外伤等导致的牙体缺损多采用活髓切断术或根管治疗术。活髓切断术是清除部分污染的牙髓组织后，使用盖髓材料覆盖在暴露的牙髓上，防止或消除污染、控制炎症。该诊疗过程繁琐，要求患者就诊次数多，并且费用高、技术敏感性高。常用的盖髓材料有mta和氢氧化钙等。目前的盖髓材料的使用仍存在缺陷：mta和氢氧化钙在凝固过程中ph值上升，呈强碱性，具有细胞毒性，从而导致接触的牙髓组织发生细胞坏死产生炎症反应；盖髓材料诱导牙髓干细胞产生的牙本质桥为骨样牙本质，缺乏生理性牙本质小管的结构，物理机械性能难与正常牙本质相匹配，承受咬合力时，易出现裂纹或细道，牙本质整合性能有待提高。根管治疗术则是彻底清除污染的牙髓组织。已有学者通过将脱落的乳牙牙髓干细胞植入根管，实现了根部带有血管神经的牙髓再生。牙髓再生是未来牙科发展趋势，有望替代根管治疗术，而目前尚未有专门的牙髓封闭材料被研发应用，因此如何实现新生牙髓及活髓切断术后的牙髓的冠方封闭成为亟待解决的问题。

钛来源丰富、价格较低，具有良好的生物相容性，被广泛用于牙种植、义齿支架、冠桥等。纯钛硬度介于牙本质和牙釉质之间，导热系数较低，钛制嵌体、全冠等具有保护牙髓，避免冷热刺激的作用。因此钛有望成为封闭牙髓的理想材料，但还需表面修饰的方法提高钛基底的牙本质诱导性能。目前将表面修饰的钛合金用于牙髓的冠方封闭尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供表面修饰的钛或钛合金及其制备方法和用于牙髓冠方封闭的应用，这种表面修饰的钛或钛合金能够促进牙髓干细胞的粘附、增殖、成牙本质分化。

为了达到上述目的，本发明提供了表面修饰的钛及钛合金用于牙髓冠方封闭的应用，所述的表面修饰用于提高钛及钛合金对牙髓细胞的粘附和分化的诱导性能；所述的表面修饰的钛及钛合金用作活髓切段术或牙髓再生后，覆盖于牙髓组织上，使牙髓形成牙本质整合的材料。

较佳地，所述的钛及钛合金的使用方法包括：颗粒状覆盖、嵌体或高嵌体。

较佳地，所述的表面修饰的方法包括：

利用自组装技术进行表面载药处理；

物理改性方法，其包含：物理气相沉积、离子注入技术和亲水处理；

化学改性方法，其包含：强碱处理、过氧化氢处理、酸蚀处理、溶胶-凝胶处理和化学气相沉积；

激光处理方法，该方法在钛及钛合金表面蚀刻特定的结构或表面熔覆涂层；

机械方法，其包含：打磨、抛光和喷涂，使钛和钛合金表面有特定的粗糙度，并去除污染层；

电化学的方法，其包含：微弧氧化和阳极氧化，该方法改变钛及钛合金的表面形貌，并引入具有生物活性功能的离子。

较佳地，所述的表面修饰的钛及钛合金为微弧氧化复合氧化石墨烯涂层修饰的钛及钛合金。

本发明还提供了一种微弧氧化复合氧化石墨烯涂层修饰的钛及钛合金的制备方法，包含以下步骤：

步骤(1)，将钛或钛合金先进行微弧氧化处理，以使所述的钛或钛合金具有多孔表面；

步骤(2)，将钛或钛合金浸泡于naoh溶液中；

步骤(3)，将钛或钛合金干燥处理后，浸泡于含有偶联剂的溶液中；

步骤(4)，将钛或钛合金浸泡于含有氧化石墨烯的溶液中，使氧化石墨烯负载于钛或钛合金表面的多孔结构内。

较佳地，微弧氧化过程采用的电解液为：0.01mol/l～1mol/l一水乙酸钙、0.01mol/l～0.1mol/l磷酸二氢钠，电参数为200v～500v、50hz。

较佳地，所述的naoh溶液的浓度为5～10mol/l。

较佳地，所述偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。

较佳地，所述的氧化石墨烯的浓度为1mg/ml以上。

较佳地，钛或钛合金浸泡于含有氧化石墨烯的溶液中的时间为1h～24h。

有益效果：

(1)基于钛或钛合金优良的物理、化学性质，本发明将表面修饰的钛或钛合金应用为牙髓冠方封闭材料；

(2)表面修饰的钛或钛合金用于“牙髓封闭”，对于保护新生牙髓活力，促进其行使营养、修复、感觉等功能有重要意义；

(3)微弧氧化复合氧化石墨烯的钛或钛合金可作为一种优秀的牙髓封闭材料，促进牙髓干细胞的粘附、增殖、成牙本质分化，在暴露的牙髓顶部形成生理性的牙本质结构，形成“牙本质整合”，从而起到封闭作用，避免产生细胞毒性、牙髓炎症、牙内吸收。

附图说明

图1为细胞粘附实验integrinβ1免疫荧光结果图。

图2为细胞外基质矿化茜素红染色结果图。

图3为细胞成牙本质分化相关pcr指标。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明提供了表面修饰的钛及钛合金用于牙髓冠方封闭的应用，所述的表面修饰用于提高钛及钛合金对牙髓细胞的粘附和分化的诱导性能；所述的钛及钛合金用于活髓切段术或牙髓再生后，覆盖于牙髓组织上，使牙髓形成牙本质整合。

现有的盖髓材料用于覆盖暴露的牙髓，以防止或消除感染、控制炎症，并不是用于牙髓封闭。本发明提出“牙髓封闭”的概念，旨在保护新生牙髓活力，避免牙髓再感染导致新生牙髓坏死。牙髓封闭选用的材料应具有良好的生物相容性、能够使牙髓形成牙本质整合，并且具有与牙体组织相匹配的机械强度，以在封闭牙髓后，牙齿能够行咀嚼功能，承受咬合力。本发明提出的“牙本质整合”的概念，指牙髓干细胞与材料表面直接接触，粘附、增殖、成牙本质分化，在材料与新生牙髓之间形成新生牙本质，从而达到有效封闭牙髓的作用。

由于钛具有良好的生物相容性，而纯钛硬度介于牙本质和牙釉质之间，未经表面修饰的钛及钛合金诱导牙髓干细胞粘附和分化的能力较差。经表面修饰的方法提高钛基底的牙本质诱导性能，将使钛及钛合金成为封闭牙髓的理想材料。

钛及钛合金的表面修饰的方法有多种。采用物理、化学、机械等方法在钛合金表面制备功能性涂层。表面修饰的方法包括：

(1)利用自组装技术进行表面载药处理；

(2)通过物理改性方法，例如物理气相沉积、离子注入技术、亲水处理；

(3)通过化学改性方法，例如强碱处理、过氧化氢处理、酸蚀处理、溶胶-凝胶处理、化学气相沉积等；

(4)通过激光处理方法，在钛及钛合金表面蚀刻特定的结构或表面熔覆其他涂层；

(5)通过机械方法例如打磨、抛光、喷涂等，使钛和钛合金表面有特定的粗糙度，去除污染层等；

(6)通过电化学的方法，例如微弧氧化、阳极氧化等，改变钛及钛合金的表面形貌，并引入具有生物活性功能的离子。

钛及钛合金的表面修饰的方法并不限于以上方法，能够诱导牙髓干细胞粘附、增殖和分化的方法均可采用。牙髓封闭材料的使用方式可为颗粒状覆盖、嵌体、高嵌体等。

以下实施例中，钛片选择医用钛合金。表面修饰的钛及钛合金选择微弧氧化复合氧化石墨烯涂层修饰的钛及钛合金。

微弧氧化(microarcoxidation,mao)又称等离子体电解氧化(plasmaelectrolyticoxidation,peo)、微等离子体氧化(microplasmaoxidation,mpo)等，该方法是通过用专用的微弧氧化电源在工件上施加高电压，使工件表面的金属与电解质溶液相互作用，达到工件表面强化、硬度大幅度提高、耐磨、耐蚀、耐压、绝缘及抗高温冲击特性得到改善的目的。该技术的基本原理及特点是：在普通阳极氧化的基础上，利用弧光放电增强并激活在阳极上发生的反应，从而在以金属及其合金为材料的工件表面形成优质的强化陶瓷膜的方法。形成的陶瓷膜是一种多孔结构。

实施例1

钛片表面微弧氧化复合氧化石墨烯涂层的制备。

实施例1步骤如下：

1.将规格为20*20*2mm的大小的钛片依次经320、800、1200目砂纸打磨，放置于乙醇溶液、丙醇溶液中各超声清洗1小时。

2.配置含0.1mol/l一水乙酸钙、0.03mol/l磷酸二氢钠的电解液，将钛合金浸没于溶液中，选择合适的电参数即400v、50hz、10min。

3.用去离子水洗净微弧氧化的钛片后，氮气烘干，浸泡于10mol/l的naoh溶液中，60℃24h。naoh的作用是使金属表面羟基化，以便与接下来的溶液发生化学反应，增加亲水性。

4.清洗钛片直至ph为7。氮气烘干，将钛片浸泡于5％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液中2小时，用去离子水洗净。

5.将样本浸没于1mg/ml的go溶液(氧化石墨烯溶液)中24h，真空干燥。

实施例2

微弧氧化复合氧化石墨烯对人牙髓干细胞(hdpscs)体外生物活性的影响

步骤一、人牙髓干细胞的分离培养

(1)收集临床因阻生、正畸需要拔出的牙齿，用无菌pbs溶液冲洗3次；用牙科裂钻切割牙齿颈部，暴露牙髓腔；

(2)用无菌拔髓针将牙髓组织挑出，置于培养皿中；

(3)用无菌眼科剪将牙髓组织剪碎约1*1mm大小；蘸取凡士林于盖玻片四角，覆盖于剪碎的牙髓组织上，防止组织块漂浮；

(4)最后在培养皿中加入含20％胎牛血清、1％双抗的mem培养液，37℃、5％co2培养箱中培养7天观察，待细胞从组织块中爬出至80％融合时，胰蛋白酶消化、传代培养。牙髓细胞从组织块中爬出，形态为长梭形，类似成纤维细胞。

步骤二、微弧氧化复合氧化石墨烯钛合金表面涂层在体外对人牙髓干细胞的作用效果

(1)细胞粘附能力检测：将样本置于6孔板中，接种2ml人牙髓干细胞悬液；4h后，吸弃培养液，pbs洗3遍，吸弃。使用4wt％多聚甲醛溶液固定30分钟；0.1％tritonx-100溶液通透20分钟；pbs洗3遍；bsa封闭液处理1小时，弃溶液；加入integrinβ1抗体，4℃过夜；pbs洗3遍；加入绿色荧光二抗室温下处理1小时；细胞骨架使用tritc-phalloidin(罗丹明标记鬼笔环肽)于37℃染色2小时；dapi溶液复染细胞核5分钟，荧光显微镜下观察。tritc-phalloidin是染细胞骨架的试剂，可以呈现出细胞的形态；dapi是染细胞核的试剂，确定该处染色内容是细胞。integrinβ1是介导细胞早期粘附的重要指标。

实验结果见附图1，图1中ti表示钛片，mao表示微弧氧化的钛片，1.0go表示表面具有微弧氧化复合氧化石墨烯涂层的钛片，制备钛片时go溶液的浓度为1.0mg/ml，其他附图的表示方法与图1相同。actin是指细胞骨架结构。merge代表融合后的图片，融合图片可知细胞内integrin表达水平。由图1可知，微弧氧化复合氧化石墨烯钛合金表面涂层促进了integrinβ1的高表达，促进了细胞早期粘附。

(2)细胞毒性检测

将样本置于6孔板中，接种2ml人牙髓干细胞悬液于孔中，培养24h天后，使用细胞活死试剂盒染色，死细胞染为红色，活细胞染为绿色，荧光显微镜观察，使用imagej软件计算存活细胞比率。

实验结果表明，微弧氧化复合氧化石墨烯钛合金表面涂层无细胞毒性，相比对照组(ti组和mao组)，活细胞比率(viablecells)增加并且促进了细胞增殖。

(3)细胞外基质矿化检测

将样本置于6孔板中，接种2ml人牙髓干细胞悬液于孔中，mem培养液培养14天，每隔5天换液，茜素红试剂盒染色，荧光显微镜下拍照。茜素红染色中，红色代表矿化结节，根据红色区域面积大小和荧光强度可判断矿化结果。

实验结果见附图2，微弧氧化复合氧化石墨烯涂层促进了细胞外基质矿化结节形成。

(4)real-timepcr检测相关基因的表达

将样本置于6孔板中，接种2ml人牙髓干细胞悬液于孔中培养7天后，利用trizol试剂分别收集各组样品的总rna，检测相关基因的表达。紫外分光光度计260nm和280nm下测定提取rna的浓度及纯度，根据逆转录试剂盒说明，合成cdna。之后检测矿化相关基因alp、ocn、dspp、dmp-1的表达。以管家基因磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydephosphatedehydrogenase，gapdh)作为内参。

实验结果见附图3，微弧氧化复合氧化石墨烯涂层上调了alp、ocn、dspp、dmp-1等相关基因的表达。图3中，relativemrnaexpression表示mrna的相对表达量。

综上所述，表面修饰的钛合金有利于提高钛合金的牙本质诱导性能；表面修饰的钛或钛合金可作为一种优秀的牙髓封闭材料，促进牙髓干细胞的粘附、增殖、成牙本质分化。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。