本发明涉及一种健康风险评估方法，尤其涉及一种通过微型核糖核酸(microrna，mirna)表达分析的健康风险评估方法。
背景技术：
微型核醣核酸(microrna)是一个非编码的核醣核酸(non-codingrna)，其长度约为18至25核苷酸，于演化过程中，高度地被保留下来，并且于细胞内的调控中扮演非常重要的角色。于西元1993年，微型核醣核酸首度于线虫(c.elegans)中被发现。陆陆续续，于人类或其它的物种中也发现了越来越多的微型核醣核酸。目前，人类细胞内中约有2,500个已知的微型核醣核酸，这些微型核醣核酸被证实能调控大于百分之五十信息核醣核酸表达量(mrnaexpression)。此外，不正常的微型核醣核酸表达量(micrornaexpression)已被证实与许多疾病的生成息息相关，其中也包括了癌症病变、慢性疾病、自体免疫疾病等。
于过去的数年中，微型核醣核酸已获得广大的推崇，且被看好能当作新型分子检测标靶。目前微型核醣核酸也已被证实能从细胞中分泌到血液，并形成蛋白核醣核酸复合物(protein-rnacomplexes)，确保不会被核糖核酸酶(rnase)降解。这样的特征也变得非常有价值，使得血液中游离微型核醣核酸变得相当容易被取得，并可通过检测游离微型核醣核酸表达量(cellfreemirnaprofiling)来当作疾病初期诊断的依据。举例来说，不同类型的癌症已被证实各自拥有独特的游离微型核醣核酸表达量，或者被称为微型核醣核酸特征(mirnasignature)，可被利用来当作癌症初期诊断的依据。
一直以来，具有便利性及高诊断率的非侵入性疾病检测方法为医学界不断追求的目标。以癌症为例，为了提早找出潜在未发现与早期无症状的癌症，可进行癌症筛检(cancerscreening)来达到此目的。癌症筛检是指利用检查、检验或其他方法，辨别可能罹患癌症或可能未罹患癌症的过程。
目前，病患可经由许多症状或检验结果来检测是否罹患癌症，但诊断恶性肿瘤最确定的方式就是经由病理医师对活体组织进行切片或经手术取得的组织做病理检测来证实癌细胞的存在，属于侵入式的检测方式。
此外，肿瘤标记检测是指通过检测与恶性肿瘤细胞相关的特殊蛋白质的变化来判断是否罹患癌症。然而，肿瘤标记检测的灵敏度及专一性不佳，往往在肿瘤已发展到相当大小或已经转移到其他器官时才能检测到。
基于上述，开发出一种非侵入性、早期评估的健康风险评估方法，对罹患疾病的健康风险进行及早的即时监控，为目前所需研究的重要课题。
技术实现要素：
本发明提供一种健康风险评估方法，通过分析微型核糖核酸的表达量，以即时监控评估健康风险。
本发明的健康风险评估方法包括以下步骤。首先，建立健康族群的微型核糖核酸表达量数据库，之后，分析受检者的血浆样品中的微型核糖核酸表达量。然后，将受检者的微型核糖核酸表达量数据与健康族群的微型核糖核酸数据库的微型核糖核酸表达量进行比较，并找出受检者血浆中表达量过高或过低的微型核糖核酸，以评估受检者的健康风险。
在本发明的一实施例中，健康风险的判别包括癌症或糖尿病。
在本发明的一实施例中，针对健康族群的微型核糖核酸数据库，依据表达量将微型核糖核酸分为h类、m类、l类或cn类，h类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸表达量被检测出的频率为高于60％，m类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸表达量被检测出的频率为20％至60％，l类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸表达量被检测出的频率为低于20％，cn类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸没有检测到表达。
在本发明的一实施例中，针对受检者的微型核糖核酸表达量数据，依据其表达量将微型核糖核酸分为u类、d类、n类或en类，u类代表受检者的此类微型核糖核酸的表达量高于健康族群的此类微型核糖核酸的表达量参考区间，d类代表受检者的此类微型核糖核酸的表达量低于健康族群的此类微型核糖核酸的表达量参考区间，n类代表受检者的此类微型核糖核酸的表达量介于健康族群的此类微型核糖核酸的表达量参考区间，en类代表受检者的此类微型核糖核酸没有检测到表达。
在本发明的一实施例中，针对受检者的各个微型核醣核酸分类为第一族群、第二族群、第三族群、第四族群或第五族群，当各个微型核醣核酸属于第一族群、第二族群、第三族群、第四族群或第五族群，则代表一个红点，第一族群代表此类微型核醣核酸同时属于h类及u类，第二族群代表此类微型核醣核酸同时属于m类及u类，第三族群代表此类微型核醣核酸同时属于cn类及u类，第四族群代表此类微型核醣核酸同时属于h类及d类，第五族群代表此类微型核醣核酸同时属于m类及d类。
在本发明的一实施例中，当红点的数量大于或等于5时，代表受检者可能存在健康风险。
基于上述，提供一种非侵入性、早期评估的健康风险评估方法，分析受检者血浆中的微型核糖核酸表达量，再与健康族群的微型核糖核酸数据库进行比较，因此，能够即时且有效率地对健康风险进行评估，更可改善现有健康风险筛检的便利性及诊出率。
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并作详细说明如下。
具体实施方式
本发明提供一种改良的核酸样品测量方法，包括以下步骤。首先，建立健康族群的微型核糖核酸表达量数据库。之后，分析受检者的血浆样品中的微型核糖核酸表达量。然后，将受检者的微型核糖核酸表达量数据与健康族群的微型核糖核酸数据库的微型核糖核酸表达量进行比较，并找出受检者血浆中表达量过高或过低的微型核糖核酸，以评估受检者的健康风险。
在本实施例中，建立健康族群的微型核糖核酸数据库的方法如下。首先，依据三万多篇文献建立与疾病相关的微型核醣核酸信息库，并筛选出与疾病高度相关的167个微型核醣核酸。招收大于300位健康的受试者(尚未被医师判定已罹患癌症/糖尿病/或其它重大疾病)，经过医师评估没有肿瘤风险后，收集血浆检体，检测血浆检体内167个微型核醣核酸表达量，计算健康族群中每一个微型核醣核酸表达量的平均值和标准差，并据此统计健康族群中每一个微型核醣核酸表达量的正常范围，以建立健康族群对此167个微型核醣核酸表达量的数据库。
在本实施例中，所筛选出的与疾病高度相关的167个微型核醣核酸如下方表1中所示。
表1
在本实施例中，检测血浆中微型核糖核酸的方法包括以下步骤：
1.采集血液样本
将抽血者皮肤以酒精擦拭采血部位，使用止血带用活结方式绑在采血部位上方5公分至15公分处。以19g至22g针头抽取10ml全血至k2edta真空采血管(k2edtabdvacutainertube)，当血液流入采血管后，应立即松开止血带。待抽血完成，立即将采血管轻轻上下颠倒混合5至8次，以确保抗凝剂完全发挥作用。将采血管置于室温下保存，在采血后一小时内须完成血浆分离步骤。
2.血浆分离方法
将采血管置于旋翼式转子(swinging-bucketrotor)，以1200xg于室温下离心10分钟。离心完成后，将上清液取出至新的15ml离心管。将15ml离心管以pipette吸放5次确保混匀，再均分至1.5mldnase/rnase-freeeppendorf，以12,000xg于室温下离心10分钟。离心完成后，取出上清液至新的15ml离心管，避免取到1.5mleppendorf底部的白色沉淀物。将上清液pipette吸放5次确保混匀，分装至1.5mldnalobindtubes(eppendorf,22431021)，立即置于-80摄氏度冰箱保存。
3.微型核糖核酸萃取方法
于-80摄氏度冰箱取出血浆样本，置于冰上解冻，解冻后依照qiagenmirneasyserum/plasmakit所提供的操作手册进行实验，以30μlnuclease-freewater进行回溶。
4.cdna合成
取适量mirna以quarkbiomicrornauniversalrtkit进行逆转录反应合成cdna。
5.qpcr实验
取适量cdna以quarkbiomirscan
在本实施例中，健康风险的判别可包括癌症或糖尿病，但本发明并不以此为限，也可包含其他疾病或可能对健康造成不良影响的风险因子。
在本实施例中，针对健康族群的微型核糖核酸数据库，依据表达量可将微型核糖核酸分为h类、m类、l类或cn类，h类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸表达量被检测出的频率为高于约60％，m类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸表达量被检测出的频率为约20％至60％，l类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸表达量被检测出的频率为低于约20％，cn类代表于健康族群中，此类微型核糖核酸没有检测到表达。
在本实施例中，针对受检者的微型核糖核酸表达量数据，依据其表达量可将微型核糖核酸分为u类、d类、n类或en类，u类代表受检者的此类微型核糖核酸的表达量高于健康族群的此类微型核糖核酸的表达量参考区间，d类代表受检者的此类微型核糖核酸的表达量低于健康族群的此类微型核糖核酸的表达量参考区间，n类代表受检者的此类微型核糖核酸的表达量介于健康族群的此类微型核糖核酸的表达量参考区间，en类代表受检者的此类微型核糖核酸没有检测到表达。
在本实施例中，针对受检者的各个微型核醣核酸分类为第一族群、第二族群、第三族群、第四族群或第五族群，当各个微型核醣核酸属于第一族群、第二族群、第三族群、第四族群或所述第五族群，则代表一个红点，第一族群代表此类微型核醣核酸同时属于h类及u类，第二族群代表此类微型核醣核酸同时属于m类及u类，第三族群代表此类微型核醣核酸同时属于cn类及u类，第四族群代表此类微型核醣核酸同时属于h类及d类，第五族群代表此类微型核醣核酸同时属于m类及d类。当红点的数量大于或等于5时，代表受检者可能存在健康风险。
以下，通过实验例来详细说明上述实施例的健康风险评估方法。然而，下述实验例并非用以限制本发明。
实验例
为了证明本发明所提出的健康风险评估方法能够即时且有效率地对健康风险进行评估，以下特别作此实验例。
实例1：针对癌症风险评估
分析198例已知为低风险族群及癌症族群(经医师判定)的受试者，依上述实施例提到的判别方式判定每位受试者的红点数，得到以下表2所列出的结果。在表2中，低风险族群是指受检者尚未确诊有任何重大疾病，癌症族群皆未经过治疗。在198个测试样品中，成功被认定具有潜在健康风险的高风险族群的准确率为约73％。
表2
实例2：针对糖尿病风险评估
分析56例已知为低风险族群及糖尿病族群(经医师判定)的受试者，依上述实施例提到的判别方式判定每位受试者的红点数，得到以下表3所列出的结果。在表3中，低风险族群是指受检者尚未确诊有任何重大疾病。在56个测试样品中，成功被认定具有潜在健康风险的高风险族群的准确率为约70％。
表3
综上所述，本发明提供一种非侵入性、早期评估的健康风险评估方法，分析受检者血浆中与健康风险因子相关的微型核糖核酸表达量，再与健康族群的微型核糖核酸数据库进行比较，因此，能够即时且有效率地对健康风险进行评估，更可改善现有癌症筛检的便利性及诊出率，提供个人化的专业健康风险监控。
虽然本发明已以实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域中技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更改与润饰，故本发明的保护范围当视所附的权利要求所界定者为准。