含透明质酸的保湿组合物的制作方法

1.本发明属于化妆品领域，具体涉及一种含透明质酸的保湿组合物及其制备与应用。


背景技术：

2.透明质酸(ha)又称玻尿酸，广泛地存在于生物体的结缔组织中，是组成细胞外基质的几种糖胺聚糖之一，在人的皮肤真皮层和关节滑液中含量最多，具有保水、润滑等重要的生理作用。自1934年首次从牛眼玻璃体内分离出以来，透明质酸就以其天然性、无过敏性和与人体组织良好的生物相容性，在化妆品、保健食品、美容手术和医药领域得到广泛的应用。
3.关于透明质酸大小的定义，目前还没有完全统一。一般认为，大于1000kda分子量的透明质酸为高分子量透明质酸，中分子量透明质酸一般介于200kda到1000kda之间，低分子量透明质酸为小于200kda，其中小于10kda的为寡聚透明质酸。
4.透明质酸的大多数特性都和其分子量大小有关。例如，高分子量透明质酸的大分子链的柔顺性而具有较强的成膜能力，可以形成一层保水薄膜；而低分子量透明质酸与之相反，渗透性强，可深入真皮层提升水分含量。人体中，透明质酸通常以大分子形式存在，大小约为104kda，可以通过氢键与自身重量1000倍的水结合，并通过减少水分蒸发及诱导角质层水化的方式达到保湿效果。化妆品可以根据功效选择适当的分子量，但是，单独使用单一分子量的透明质酸往往无法达到全面保湿功效，需要将不同分子量进行复配组成组合物。
5.现有技术亦公开了不少高中低分子量透明质酸复配用于皮肤保湿的组合物。
6.例如，cn106109265b公开了一种透明质酸保湿组合物，是由高、中、寡聚3种分子量透明质酸简单物理组合得到的组合物。3种分子量分别为：1000-1200kda，300-500kda，5-7kda，它们在组合物中最优占比分别为60-62％，18-20％，18-20％。根据该专利对不同透明质酸组合的保湿性能筛选，高分子量透明质酸并非最优。该专利将筛选出的组合物添加甘油、戊二醇等多元醇，或加入乳化配方后验证其皮肤保湿性能的改善。由于配方中有较多具有保湿功效的油脂及保湿剂，可能对测试结果有一定影响。
7.又如，cn106137786b公开了一种涉及透明质酸的抗衰老组合物，是由高、中、寡聚3种分子量透明质酸简单物理组合得到的组合物。3种分子量分别为：1000-1200kda，300-500kda，3-8kda，它们在组合物中最优占比分别为18-20％，18-20％，60-62％。该专利将透明质酸组合物应用于乳液配方后，通过人体临床试验评价实施例和对比例对皮肤保湿性、皮肤皱纹和皮肤弹性的影响，然而乳液配方中的油脂、保湿剂等原料亦有一定保湿、抗衰老功效，较难单独确定其中透明质酸组合物的影响程度。
8.在医美行业中，透明质酸还作为一种美容填充剂风靡全球。但是，由于人体内天然未经修饰的透明质酸极易被透明质酸酶降解，作为医美填充针剂的生产厂家通常还需要对透明质酸进行交联修饰处理，即使用交联剂将透明质酸分子相互连接形成网状结构，从而
减缓透明质酸降解速率并延长其在体内的作用时间。对透明质酸进行交联修饰处理，可得到更高分子量的透明质酸交联聚合物，在临床治疗特别是医疗美容中发挥重要作用。但是，迄今为止没有文献公开或提及可以将交联的透明质酸用于保湿功效的组合物中。
9.因此，本申请中首次将交联的透明质酸聚合物(3000kda)与不同分子量的非交联的透明质酸进行组合，得到的组合物能够促进皮肤表皮细胞线粒体活性，而且在保湿相关基因测定分析中具有上调作用，能够提供一种全方位、全维度的保湿组合物。


技术实现要素：

10.一方面，本发明提供了一种含透明质酸或其盐的保湿组合物，其包含：
11.a)0.01-1重量％的交联的透明质酸或其盐；
12.b)0.01-1重量％的高分子量透明质酸或其盐，所述高分子量透明质酸或其盐的分子量为1000-3000kda；
13.c)0.01-1重量％的小分子量透明质酸或其盐，所述小分子量透明质酸或其盐的分子量小于200kd；以及
14.d)化妆品领域可接受的载体。
15.在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物中交联的透明质酸或其盐的分子量为1000-10000kda。
16.在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物中高分子量透明质酸或其盐的分子量为1200-1500kda。
17.在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物中小分子量透明质酸或其盐的分子量为5-10kda。
18.在优选的实施方式中，以组合物的总重量计，本发明的保湿组合物包含0.05-0.1重量％交联的透明质酸或其盐。
19.在优选的实施方式中，以组合物的总重量计，本发明的保湿组合物包含0.05-0.1重量％的高分子量透明质酸或其盐。
20.在优选的实施方式中，以组合物的总重量计，本发明的保湿组合物包含0.1-0.6重量％的小分子量透明质酸或其盐。
21.在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物不含分子量200kda到1000kda的透明质酸或其盐。
22.在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物中交联的透明质酸或其盐与小分子量透明质酸或其盐的重量比等于或大于1:7。
23.另一方面，本发明还涉及所述保湿组合物在化妆品中的应用。
附图说明
24.图1显示了划痕试验中未处理和用实施例7的组合物处理后对促进表皮层创伤愈合、屏障修复的功效作用。其中，1a和1b分别代表未处理组和用实施例7的组合物处理的组在划痕试验当天的显微镜照片，1c和1d分别代表未处理组和用实施例7的组合物处理的组在24小时后的显微镜照片。采用ckx31型倒置相差显微镜(日本olympus)，放大倍数100倍。
25.图2显示了透明质酸组合物对保湿功效相关基因表达的影响。其中，横坐标为与皮
肤保湿功效相关的四种基因，纵坐标为这些基因的相对表达。
26.发明详述
27.除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但本文描述的是优选的方法和材料。对于本发明的目的，下面定义了以下术语。
28.本文所用术语“约”指与参比品的数量、水平、数值、维度、大小或用量相比，差异可高达30％、20％或10％的数量、水平、数值、维度、大小或用量。本文所使用的百分含量，除非另有说明，均以重量计。
29.在全篇说明书和权利要求书中，除非另有要求，以下词语“包含”和其变体“含有”和“包括”应理解为意指包括所述的整体或步骤，或一组整体或步骤，但不排除任何其它整体或步骤，或其它一组整体或步骤。
30.本发明首次提出一种含透明质酸的保湿组合物。在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物基本上由透明质酸和化妆品领域可接受的载体组成。在优选的实施方式中，化妆品领域可接受的载体是水性载体。例如，所述载体是水，例如，纯水，蒸馏水，去离子水等。
31.如本文所用，术语“基本上由
……
组成”是指组合物包含少于约1％，优选少于约0.5％的除所列的那些之外的成分。术语“基本上由
……
组成”是指所指出的材料以约99.5重量％至约100重量％，优选约99.9重量％至约100重量％，并且更优选99.99重量％至约100重量％的量存在，并且最优选所有其它材料仅作为低于分析可检测的含量的杂质存在。
32.本发明目的在于提供一种含透明质酸的保湿组合物。该组合物具有协同增效的保湿效果，能同时从皮肤细胞保湿的多个维度提升性能，可用于所有形式的护肤品与个人护理品配方中。
33.在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物包含交联的透明质酸聚合物(例如，分子量3000kda的交联透明质酸)、高分子量透明质酸(例如，分子量1200kda的透明质酸)和小分子量透明质酸(例如，分子量5kda的透明质酸)。在优选的实施方式中，本发明的保湿组合物基本上由交联的透明质酸聚合物(例如，分子量3000kda的交联透明质酸)、高分子量透明质酸(例如，分子量1200kda的透明质酸)和小分子量透明质酸(例如，分子量5kda的透明质酸)组成。将交联的透明质酸与非交联的透明质酸按一定比例组合后，不同分子量的透明质酸之间具有协同增效作用，保湿效果显著提升。
34.在一些实施方式中，本发明保湿组合物中的交联透明质酸聚合物的分子量(mw)范围为2000kda-5000kda。在一些实施方式中，本发明保湿组合物中的高分子量透明质酸的分子量范围为1000kda-1800kda。在一些实施方式中，本发明保湿组合物中的寡聚分子量透明质酸的分子量(mw)范围为3kda-8kda。
35.除非另有说明，本申请中聚合物的分子量均为重均分子量。
36.透明质酸
37.透明质酸是一种酸性粘多糖，透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠(sodium hyaluronate,sh)，但习惯上仍称为透明质酸。
38.通常，将分子量大于1000kda的透明质酸称为高分子量透明质酸。在本发明所述具
有保湿功效的组合物中，采用了这种高分子量的透明质酸。例如，在本发明的一些实施方式中，本发明所述具有保湿功效的组合物采用分子量为约1000-3000kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1000-2000kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1000-1500kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1200-1500kda的透明质酸。
39.在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.01-1重量％的高分子量透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.01-0.5重量％的高分子量透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.01-0.1重量％的高分子量透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.05-0.1重量％的高分子量透明质酸。在一个具体的实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.09重量％的高分子量透明质酸。
40.通常，将分子量介于200kda到1000kda之间的透明质酸称为中分子量透明质酸。在本发明所述具有保湿功效的组合物中，基本上不含中分子量透明质酸。例如，在本发明的一些实施方式中，本发明所述具有保湿功效的组合物基本上不含分子量为约200-800kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物基本上不含分子量为约200-500kda的透明质酸。
41.术语“基本上不含”、“大体上不含”或“基本上不含有”是指所指明的材料以0重量％至0.5重量％，或优选0重量％至0.1重量％，或更优选0重量％至0.01重量％的量存在，并且最优选其不以分析可检测的含量存在。
42.通常，将分子量为小于约200kda的透明质酸称为小分子量透明质酸。更具体地，是将分子量小于约10kda的透明质酸称为寡聚透明质酸。在本发明所述具有保湿功效的组合物中，采用了这种小分子量的透明质酸。例如，在本发明的一些实施方式中，本发明所述具有保湿功效的组合物采用分子量为约1-200kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1-100kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1-50kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1-10kda的透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约5-10kda的透明质酸。
43.在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.01-1重量％的小分子量透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.05-1重量％的小分子量透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.1-1重量％的小分子量透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.1-0.8重量％的小分子量透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.1-0.6重量％的小分子量透明质酸。在一个具体的实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.49重量％的小分子量透明质酸。
44.交联的透明质酸
45.对透明质酸进行交联修饰处理，可得到更高分子量的透明质酸交联聚合物，在临床治疗特别是医疗美容中发挥重要作用。因此，交联的透明质酸被广泛使用在修复手术、眼部手术或作为美容产品填充皱纹。然而，它在体内受到透明质酸酶的酶解作用而迅速降解，
存留时间较短，需要重复注射才能达到疗效。交联的透明质酸是透明质酸经交联剂交联修饰得到的具有三维立体结构的高分子凝胶，可以弥补透明质酸钠存留时间短等缺点，同时仍具有良好的生物相容性及效果。使用交联剂将透明质酸分子相互连接形成网状结构，可以减缓透明质酸降解速率并延长其在体内的作用时间。
46.本发明首次将交联的透明质酸聚合物(例如，分子量为约3000kda)应用于化妆品保湿领域。在本发明中，创新性地将交联的透明质酸与不同分子量的非交联透明质酸进行复配，交联的透明质酸聚合物形成的稳定网状结构可将活性成分(例如，低分子量的透明质酸等)吸附在其中，从而形成长效的缓释体系。
47.在本发明所述具有保湿功效的组合物中，采用了这种交联的透明质酸。例如，在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1000-10000kda的交联透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1000-5000kda的交联透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1000-3000kda的交联透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物采用分子量为约1500-3000kda的交联透明质酸。
48.在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.01-1重量％的交联透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.05-1重量％的交联透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.05-0.5重量％的交联透明质酸。在本发明的一些实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.05-0.1重量％的交联透明质酸。在一个具体的实施方式中，具有保湿功效的组合物包含约0.07重量％的交联透明质酸。
49.在本发明的一些实施方式中，组合物中交联的透明质酸与小分子量透明质酸的重量比等于或大于1:7。
50.保湿组合物的功效
51.本发明制备得到的保湿组合物的主要优势包括：
52.1)提高细胞利用活性成分的效率；
53.2)减少潜在刺激性；
54.3)防止透明质酸降解，在皮肤表面更高稳定性，停留时间更长，提供更优秀的皮肤成膜性与保湿性等。
55.在细胞安全性测试中，本发明的保湿组合物对人体表皮细胞线粒体活性有提升效果。因此，本发明的保湿组合物可用于提升细胞利用活性成分(例如，小分子量的透明质酸)的效率。
56.在针对保湿功效相关基因表达的影响实验中，用本发明的保湿组合物处理后，丝聚蛋白、水通道蛋白、紧密连接蛋白和/或透明质酸受体四种基因的表达均有不同程度的上调，表明本发明的组合物能够在不同的维度上提供全方位的保湿功效，表现出显著的协同增效作用。
57.丝聚蛋白
58.丝聚蛋白(filaggrin，flg)是角质层重要的成分，由角质形成细胞合成，分布在角质层的不同部分，并随角质形成细胞迁移过程逐渐被酶降解，降解为天然保湿因子等角质层需要的小分子物质，在保湿、屏障完整性方面发挥重要的作用。
59.水通道蛋白
60.水通道蛋白(aquaporin，aqp3)，又名水孔蛋白，是一种位于细胞膜上的蛋白质(内在膜蛋白)，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出。水通道蛋白作为一种位于细胞膜上的蛋白质，能显著增加细胞膜水的通透性，表皮细胞之间的水通道蛋白构成了细胞间水分输送的主要通路。
61.紧密连接蛋白
62.紧密连接蛋白(claudin-1，cldn1)在皮肤中主要在颗粒层中的角质细胞内表达，紧密连接蛋白在细胞表面形成连续的纤维，将相邻细胞间连接起来，使大分子物质难以通透，而水分子也只能从纤维衔接处的小孔中缓慢透过，紧密连接相关蛋白在维护皮肤屏障、表皮含水量中起到重要作用。
63.透明质酸受体
64.透明质酸受体(cd44)是透明质酸在细胞膜上的受体，研究证明，含水量高的皮肤中透明质酸受体的表达量也高于平均水平，如果在表皮中同时增加cd44和透明质酸的含量就可以更加有效地提高表皮中的含水量，同时有助于保持皮肤的紧密度，达到皮肤充溢饱满的效果。
65.皮肤外用剂
66.在本发明的另一方面，提供了一种具有保湿功效的皮肤外用剂，所述皮肤外用剂包含本发明的保湿组合物及化妆品领域可接受的赋形剂。
67.所述皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆品组合物或药物组合物。所述化妆品组合物中可以是基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品、头发护理用化妆品等，对其剂型无特殊限制，根据不同目的可合理选择。
68.所述化妆品组合物中根据剂型和目的的不同还含有不同的化妆品学层面允许的介质或基质赋形剂。
69.可以用于本发明皮肤外用剂组合物的化妆品、皮肤病学或药学上可接受的赋形剂为水相、油相、凝胶、水包蜡型乳液、水包油型乳液或油包水型乳液的形式。水相为一种或多种水溶性或分散性组分的混合物，其在室温(25℃)下可以为液体、半固体或固体。赋形剂包括或可以为在水或水-醇赋形剂中的混悬液、分散液或溶液的形式，其可以含有增稠剂或凝胶剂。本领域技术人员可以基于本领域技术人员掌握的知识选择合适的产品形式，其中包含的组分。
70.所述的组合物可以包括水相，该水相可以含有水或水与至少一种亲水性有机溶剂的混合物，所述的亲水性有机溶剂诸如醇，尤其是含有2-5个碳原子的直链或支链低级一元醇，如乙醇或丙醇；多元醇，如丙二醇、山梨醇、甘油、泛醇或聚乙二醇及其混合物。
71.当发明的组合物为乳液形式时，该组合物还可以任选包含表面活性剂。
72.所述的组合物还可以包含成膜聚合物，如聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸均聚物或共聚物、聚酯、基于烃的树脂和/或硅氧烷树脂。可以将聚合物溶于或分散于化妆品可接受的赋形剂中并且任选与增塑剂合并。
73.本发明的组合物还可以包含油相，所述的油相含有在室温(25℃)下为液体的油溶性或油分散性组分和/或在室温下为油状或蜡状的物质，如蜡、半固体、树胶及其混合物。该油相还可以含有有机溶剂。
74.通常在室温下为液体，合适的油性物质包括：来源于动物的基于烃的油，如全氢化角鲨烯；基于烃的植物油，如液体的c4-10脂肪酸的甘油三酯类，例如庚酸或辛酸甘油三酯类，或油，例如向日葵油、玉米油、大豆油、葡萄籽油、蓖麻油、鳄梨油、辛酸/癸酸甘油三酯类、霍霍巴油；矿物或合成来源的直链或支链烃类，例如液体石蜡及其衍生物、凡士林；合成酯类和醚类，特别是脂肪醇的酯类，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、硬脂酸2-辛基十二烷基酯、异硬脂酸异硬脂醇酯；羟基化酯类，例如乳酸异硬脂醇酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛酯、羟基硬脂酸辛基十二烷基酯、脂肪醇的庚酸酯类、辛酸酯类和癸酸脂类；多元醇酯类，例如丙二醇二辛酸酯、新戊二醇二庚酸酯、二甘醇二异壬酸酯和季戊四醇酯类；含有c12-26的脂肪醇类，例如辛基十二烷醇、2-丁基辛醇、2-己基癸醇、2-十一烷基十五烷醇、油醇；基于部分烃的氟油和/或氟硅油，硅油，在室温下为液体或半固体的挥发性或非挥发性的直链或环状聚甲基硅氧烷，例如环状聚二甲基硅氧烷和聚二甲基硅氧烷，其任选包含苯基，例如苯基三甲基硅氧烷、硅氧烷及其混合物。
75.本发明的组合物可以进一步包含常用于化妆品领域中的任何组分。这些组分包括防腐剂、水相增稠剂(提取物生物聚合物、合成聚合物)和脂肪相增稠剂、芳香剂、亲水性和亲脂性活性剂及其混合物。
76.本发明的组合物还可以包含另外的颗粒相，所述的颗粒相可以为化妆品组合物中使用的颜料和/或珠光剂和/或填充剂。
77.颜料可以存在于组合物中，合适的无机颜料包括氧化钛、氧化锆和氧化铈以及氧化锌、氧化铁和铁蓝；合适的有机颜料包括钡、锶、钙和铝色淀和碳黑。
78.珠光剂可以存在于组合物中，合适的珠光剂包括涂覆了氧化钛、氧化铁或天然颜料的云母。
79.填充剂可以存在于组合物中，合适的填充剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸锌、云母、高岭土、尼龙粉末、聚乙烯粉末、特氟龙、淀粉、一氮化硼、共聚物微球，例如硅氧烷树脂微珠。
80.本发明组合物的油相可以包含一种或多种蜡、树胶或其混合物。蜡包括基于烃的蜡、氟蜡和/或硅氧烷蜡，并且可以来源于植物、矿物、动物和/或合成来源。合适的蜡包括蜂蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、石蜡、微晶蜡、地蜡；合成蜡包括聚乙烯蜡、含有c16-45的硅氧烷蜡。树胶一般为聚二甲基硅氧烷或羧甲基纤维素钠或提取物类，并且半固体物质一般为基于烃的化合物，如羊毛脂及其衍生物。
81.可以将本发明的组合物配制成任何合适的产品形式。这类产品形式包括，但不限于气溶胶型喷雾剂、霜剂、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、化妆水、摩丝、软膏、粉剂、贴剂、润发油、溶液、手按泵型喷雾剂、棒状物、面膜和湿纸巾。可以将本发明的组合物通过本领域众所周知的各种方法便利地用于制备或作为化妆品、皮肤病学或药物局部施用产品。
82.本发明的皮肤外用剂组合物可以包括一种或多种下列成分：抗过敏剂、抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂去色素剂、润肤剂、乳化剂、表皮脱落剂、成膜剂、香料、保湿剂、昆虫驱避剂、润滑剂、药物活性剂、增湿剂、耐光剂、防腐剂、护肤剂、皮肤渗透增强剂、防晒剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、粘度调节剂、维生素或其任意组合。
具体实施方式
83.以下，通过优选的实施方式对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的范围并不局限于这些实施方式，其旨在说明本发明的技术方案而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。
84.实施例1：含透明质酸的组合物的制备
85.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.11质量份的高分子量透明质酸和0.54质量份的寡聚透明质酸，加入烧杯，快速搅拌至溶解完全，透明液体备用。
86.实施例2：含透明质酸的组合物的制备
87.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.59质量份的寡聚透明质酸，快速搅拌至溶解完全，边快速搅拌边缓慢加入0.06质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
88.实施例3：含透明质酸的组合物的制备
89.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.44质量份的高分子量透明质酸，快速搅拌至溶解完全，边快速搅拌边缓慢加入0.21质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
90.实施例4：含透明质酸的组合物的制备
91.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.49质量份的高分子量透明质酸和0.16质量份的寡聚透明质酸，快速搅拌至溶解完全，透明液体备用。
92.实施例5：含透明质酸的组合物的制备
93.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.14质量份的高分子量透明质酸，，快速搅拌至溶解完全，然后边快速搅拌边缓慢加入0.51质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
94.实施例6：含透明质酸的组合物的制备
95.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.12质量份的寡聚透明质酸，快速搅拌至溶解完全，然后边快速搅拌边缓慢加入0.53质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
96.实施例7：含透明质酸的组合物的制备
97.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.09质量份的高分子量透明质酸和0.49质量份的寡聚透明质酸，快速搅拌至溶解完全，然后边快速搅拌边缓慢加入0.07质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
98.实施例8：含透明质酸的组合物的制备
99.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.46质量份的的高分子量透明质酸和0.06质量份的寡聚透明质酸，快速搅拌至溶解完全，然后边快速搅拌边缓慢加入0.13质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
100.实施例9：含透明质酸的组合物的制备
101.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.06质量份的的高分子量透明质酸和0.12质量份的寡聚透明质酸，快速搅拌至溶解完全，然后边快速搅拌边缓慢加入0.47质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
102.实施例10：含透明质酸的组合物的制备
103.在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.11质量份的高分子量透明质酸和0.47质量份的寡聚透明质酸以及0.06质量份的中分子量透明质酸，快速搅拌至溶解完全，然后边快速搅拌边缓慢加入0.01质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
104.实施例11：含透明质酸的组合物的制备
105.称量0.65质量份的中分子量透明质酸放入研钵中充分研磨，在烧杯中加入99.35％水中快速搅拌的同时投入中分子量透明质酸，搅拌至充分溶解，溶液透明。
106.实施例12：含透明质酸的组合物的制备
107.称量0.65质量份的寡聚透明质酸放入研钵中充分研磨，在烧杯中加入99.35％水中快速搅拌的同时投入寡聚透明质酸，搅拌至充分溶解，溶液透明。
108.实施例13：含透明质酸的组合物的制备
109.称量0.65质量份的高分子量透明质酸放入研钵中充分研磨，在烧杯中加入99.35％水中快速搅拌的同时投入高分子量透明质酸，搅拌至充分溶解，溶液透明。
110.实施例14：含透明质酸的组合物的制备
111.称量0.65质量份的交联透明质酸聚合物，在烧杯中加入99.35％水中快速搅拌的同时投入交联透明质酸聚合物，搅拌至充分溶解，溶液透明。
112.以下表1显示了实施例1-14的透明质酸组合物的组成与含量。
[0113][0114]
对比例1：含透明质酸的组合物的制备
[0115]
在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.08质量份的高分子量透明质酸、
0.53质量份的寡聚透明质酸和0.04质量份的中分子量透明质酸，快速搅拌至溶解完全，透明液体。
[0116]
对比例2：含透明质酸的组合物的制备
[0117]
在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.43质量份的高分子量透明质酸、0.05质量份的寡聚透明质酸和0.17质量份的中分子量透明质酸，快速搅拌至溶解完全，透明液体。
[0118]
对比例3：含透明质酸的组合物的制备
[0119]
在烧杯中加入99.35％去离子水，边搅拌边投入0.11质量份的高分子透明质酸和0.49质量份的中分子透明质酸，，快速搅拌至溶解完全，然后边快速搅拌边缓慢加入0.05质量份的交联透明质酸聚合物，快速搅拌至充分溶解，溶液透明。
[0120]
以下表2显示了对比例1-3的透明质酸组合物的组成与含量。
[0121]
表2
[0122][0123]
测试例1：细胞安全性测试
[0124]
样品：选取实施例1-14、对比例1-3制备的样品为受试样品。
[0125]
cck-8法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。该试剂中含有wst-8，它在电子载体的作用下，能使细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，甲臜的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。cck-8法通过比色测定即可推算出活细胞数量，以酶联免疫检测仪测定其光密度，与对照组比较可得到试验组的增殖率，从而测定受试样品的细胞毒性或促增殖活性。
[0126]
测试步骤与条件：
[0127]
将hacat细胞以1x104/孔的密度接种于96孔板，每个样品铺3个平行孔(包含阴性对照)，培养基为高糖dmem。放入恒温培养箱中培养，培养条件37摄氏度，5％co2。20-24小时后，更换成含样品的培养基，阴性对照为dmem培养基，培养条件37摄氏度，5％co2。培养48小时后，更换成含有cck8溶液的培养基(cck8溶液：培养基＝1:10)110μl，放入恒温培养箱中培养，培养条件37摄氏度，5％co2。2小时后，于酶标仪450nm波长检测吸光度。
[0128]
结果如表3-5所示。
[0129]
表3：对人永生化表皮细胞(hacat)线粒体活性的影响
[0130][0131]
表4：对人永生化表皮细胞(hacat)线粒体活性的影响
[0132][0133]
表5：对人永生化表皮细胞(hacat)线粒体活性的影响
[0134][0135]
加入实施例1-14以及对比例1-3的细胞培养条件同阴性对照相比，提升比例数值越大，代表样品或组合物对人永生化表皮细胞线粒体活性的提升效果越显著，同批次阳性对照(含10％胎牛血清的培养基)的提升比例为35.99％*，“/”代表在所测浓度下，未检出样品对线粒体活性有提升效果。“*”代表t检验，该样品在测试条件下，对线粒体活性的提升效果与阴性对照相比具有显著性差异，*p<0.05。
[0136]
从表3-5的结果可以看到，实施例11-14不同分子量透明质酸单独使用时，未检出对线粒体活性有提升效果。表4的结果显示，实施例1、3、7、8、10和对比例1的透明质酸组合物对人永生化表皮细胞线粒体活性有提升效果。因此，我们筛选出以上6种不同分子量透明质酸的组合物进行后续研究。
[0137]
测试例2：不同分子量透明质酸组合物对保湿功效相关基因表达影响
[0138]
1.样品准备
[0139]
选取实施例1、3、7、8、10、12-14、对比例1制备的样品为受试样品。
[0140]
2.qpcr(实时荧光定量分析)
[0141]
实验原理：实时荧光定量pcr是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定基因表达进行定量分析的方法。通过实验组和对照组的比较，即可分析出特定基因经过某种样品处理后，基因表达是否发生变化，进而推测是否具有潜在影响基因相关蛋白的功效。本方法采用2-δδct
法进行基因表达分析。
[0142]
选择了与皮肤保湿功效相关四大基因(包括丝聚蛋白flg、水通道蛋白(aqp3、紧密连接蛋白cldn1和透明质酸受体cd44)进行检测，这四个基因位于皮肤的不同层次，从不同维度提供保湿作用。
[0143]
将hacat细胞以3x105/孔的密度接种于6孔板，每个样品铺3个平行孔(包含阴性对照)，培养基为高糖dmem+10％fbs。放入恒温培养箱中培养，培养条件37摄氏度，5％co2，20-24小时后，更换成含0.65％样品的培养基，阴性对照为含10％fbs的dmem培养基，培养条件37摄氏度，5％co2。培养24小时后，用1xpbs漂洗2次，每次1ml，然后加入1ml trizol，用1ml的rnase-free的枪头吹打15次，然后转移到1.5ml的rnase-free的eppendorf管，冻存于负
80度超低温冰箱中。24小时后，将样品转移到上海伯豪生物技术有限公司进行实时荧光定量pcr检测，检测基因包括flg、aqp-3、cldn1和cd44，采用2-δδct法进行基因表达分析。
[0144]
结果如表6-7所示。
[0145]
表6
[0146][0147]“/”代表未检出样品对所述基因具有上调作用。
[0148]“*”代表t检验，该样品在测试条件下，对线粒体活性的提升效果与阴性对照相比具有显著性差异，*p<0.05。
[0149]
表7
[0150][0151]“/”代表未检出样品对所述基因具有上调作用。
[0152]“*”代表t检验，该样品在测试条件下，对线粒体活性的提升效果与阴性对照相比具有显著性差异，*p<0.05。
[0153]
从表6-7的结果来看，实施例12(寡聚透明质酸5kda)可以使紧密连接蛋白(claudin-1)基因表达上调28％，实施例13(高分子量透明质酸1200k)可以使紧密连接蛋白(claudin-1)基因表达上调30％，但同时使丝聚蛋白(filaggrin)基因下调23％。实施例14(超高分子交联透明质酸聚合物3000kda)，单独使用时对各保湿相关基因并无上调作用。
[0154]
值得关注的是，从表7所列的5个不同组合物的结果来看，实施例7显著优于其余组合。以实施例7的特定比例，将不同分子量透明质酸以实施例7中的制备方法混合后得到的溶液显示出了协同增效作用，可以同时使透明质酸受体(cd44)、紧密连接蛋白(claudin-1)和水通道蛋白(aqp-3)基因表达显著性上调，对角质层中的丝聚蛋白(filaggrin)，虽然未表现出显著性差异，但是也呈现出了基因上调的趋势。可以说，实施例7的透明质酸溶液可以从真皮层到表皮层的各个维度，对皮肤细胞提供全方位的保湿功效。
[0155]
测试例3：不同分子量透明质酸样品角质细胞划痕实验
[0156]
样品准备：选取实施例7制备的样品为受试样品。
[0157]
使用hacat细胞培养后作统一的划痕处理，通过相差显微镜拍照，观测样品处理后的角质形成细胞(角质细胞)在划痕处的增殖和迁移能力，从而反映样品对促进表皮层创伤愈合、屏障修复的功效作用。
[0158]
将hacat细胞以5
×
104接种至6孔板，12h铺满后用200μl枪头垂直孔板划痕，阴性
对照为dmem培养基，实施例7样品浓度为0.65％。放入37摄氏度，5％co2培养箱。于24h后采集图像，观察细胞迁移情况。
[0159]
结果如图1所示。在划痕实验中与阴性对照相比，以实施例7的比例制备的透明质酸溶液样品观察到了明显的促进细胞迁移和创伤愈合的作用，说明实施例7对促进表皮层创伤愈合、屏障修复的功效作用。