蓝布正提取物在用于制备防治自身免疫疾病药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，具体是一种蓝布正提取物在用于制备防治自身免疫疾病药物中的应用。
背景技术：
：溃疡性结肠炎，是一种多发于20～30岁年龄段的，局限于结肠粘膜及粘膜下层的炎症过程。病灶多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。病理漫长，常反复发作。肠道粘膜呈弥漫性炎症，基本看不到正常的粘膜，呈连续性的病变，肠壁的固有肌层没有明显受累。因而溃疡一般不深，不会引起穿孔、瘘管或狭窄、梗阻。该病病因不明，但被认为与遗传因素(某些特定家族有易感性)、免疫功能障碍(自身免疫性疾病)、感染及精神因素等有关。溃疡性结肠炎没有特效方法，但是可通过水杨酸类、糖皮质激素药物、免疫抑制剂通过抑制机体的免疫系统来控制炎症的继续发展。治疗的两个基本的目标就是缓解临床症状和维持无症状的状态。当内科药物治疗无效时，手术治疗可能是一种希望。类风湿性关节炎，是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。临床症状多为晨僵、对称性关节肿痛(掌指关节、腕关节、肩关节、趾间关节、踝关节及膝关节)类风湿结节、类风湿性血管炎、类风湿性心脏病、类风湿性肺病、肾脏损害、角膜炎、干燥综合征、消化道损害、felty综合征、雷诺氏现象等等。关节的滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。血管炎病变累及全身各个器官。类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，仍停留于对炎症及后遗症的治疗。现行治疗的目的在于控制关节及其它组织的炎症，缓解症状；保持关节功能和防止畸形；修复受损关节以减轻疼痛和恢复功能等等对症治疗。类风湿性关节炎的病因不明，认为与感染因子(如eb病毒或链球菌自身免疫性疾病)的感染有关。约65％～93％的类风湿性关节炎患者血清中有eb病毒核心抗体。该病在某些家族中发病率较高。到现在为止，对该病没有特异有效的治疗。常用的对症治疗药物中主要有：水杨酸盐，非类固醇抗炎药，皮质激素，青霉胺，免疫抑制剂等。对药物不能治疗者，有的也可以采用手术治疗。虽然，目前对于这些与自身免疫病有关的疾病的预防和治疗已经取得长足显著的进步。但是，遭受各种自身免疫病和上述疾病侵扰的人数依然惊人地高。而且，目前可用的治疗方案、药物和方法基本是支持和对症治疗，其不能提供可以改善病理学病变的治疗。因此，对于溃疡性结肠和类风湿性关节炎等自身免疫疾病，研究开发有效的新治疗策略势在必行。技术实现要素：本发明实施例的目的在于提供一种蓝布正提取物在用于制备防治自身免疫疾病药物中的应用，以解决上述
背景技术：
中提出的问题。为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种蓝布正提取物在用于制备防治自身免疫疾病药物中的应用，所述蓝布正提取物的活性成分包括多糖类化合物和鞣质类化合物；所述多糖类化合物的质量含量为35％～55％，所述鞣质类化合物的质量含量为20％～40％。作为本发明实施例的一个优选方案，所述自身免疫疾病为溃疡性结肠炎、局限性肠炎、细菌性痢疾、直肠炎、肠炎、胃溃疡和类风湿性关节炎中的一种或多种。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述自身免疫疾病为溃疡性结肠炎和/或类风湿性关节炎。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述蓝布正提取物的制备方法包括以下步骤：将蓝布正置于第一醇中进行浸泡提取后，再添加水继续进行浸泡提取，得到醇提取液；将醇提取液进行减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末；将固体粉末溶于水中，先用乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液后，再用第二醇进行萃取，得到醇萃取液；将醇萃取液进行减压干燥处理后，再依次进行冷冻干燥处理和粉磨处理，得到所述蓝布正提取物。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将蓝布正置于第一醇中进行浸泡提取后，再添加水继续进行浸泡提取，得到醇提取液的步骤中，蓝布正与第一醇的质量体积比以kg/l计为1:(2～4)；第一醇与水的体积比为1:(0.5～1.5)。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述第一醇和所述第二醇分别独立地为c1～c4醇。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述第一醇为乙醇；所述第二醇为正丁醇。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将醇提取液进行减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末的步骤中，减压浓缩处理的温度为40～60℃。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将醇萃取液进行减压干燥处理后，再依次进行冷冻干燥处理和粉磨处理，得到所述蓝布正提取物的步骤中，减压干燥处理的温度为40～60℃。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述将醇萃取液进行减压干燥处理后，再依次进行冷冻干燥处理和粉磨处理，得到所述蓝布正提取物的步骤中，冷冻干燥处理的温度为-80～-70℃。与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：本发明实施例制得的蓝布正提取物中的鞣质类化合物等活性成分可以治疗细菌感染、自身免疫病。特别是对溃疡性结肠炎、局限性肠炎(克罗恩病)、直肠炎、细菌性痢疾、肠炎、胃溃疡、类风湿性关节炎等疾病或病症状态具有显著的预防和治疗作用，这些作用包括对结肠和直肠粘膜，以及粘膜下组织和结构的保护作用，刺激由于溃疡性结肠炎、局限性肠炎(克罗恩病)、直肠炎、细菌性痢疾、肠炎、胃溃疡、类风湿性关节炎而导致的受损结肠粘膜、直肠粘膜、关节囊组织，关节软骨微架构的修复和结构重建，帮助恢复受损器官和组织的功能。附图说明图1为实施例3制得的蓝布正提取物的反相色谱层析分离图谱。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1该实施例提供了一种蓝布正提取物的制备方法，其包括以下步骤：(1)在7月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。(2)取50kg上述处理后的蓝布正置于100l的甲醇中进行浸泡提取6h后，再添加50l的水继续进行浸泡提取6h，重复上述步骤2次，合并提取液，得到醇提取液。(3)将上述醇提取液置于40℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。(4)将上述固体粉末溶于50l的水中，先用100l的乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液后，再用50l的正丙醇进行萃取，得到醇萃取液。(5)将上述醇萃取液置于40℃温度下进行减压干燥处理得到胶状物后，再将胶状物用少量的水进行溶解，然后置于-70℃的冰箱过夜，进行冷冻干燥处理后，取出，再进行粉磨处理，即可得到蓝布正提取物。实施例2该实施例提供了一种蓝布正提取物的制备方法，其包括以下步骤：(1)在7月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。(2)取50kg上述处理后的蓝布正置于200l的正丙醇中进行浸泡提取6h后，再添加300l的水继续进行浸泡提取6h，重复上述步骤3次，合并提取液，得到醇提取液。(3)将上述醇提取液置于60℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。(4)将上述固体粉末溶于50l的水中，先用100l的乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液后，再用50l的正丁醇进行萃取，得到醇萃取液。(5)将上述醇萃取液置于60℃温度下进行减压干燥处理得到胶状物后，再将胶状物用少量的水进行溶解，然后置于-75℃的冰箱过夜，进行冷冻干燥处理后，取出，再进行粉磨处理，即可得到蓝布正提取物。实施例3该实施例提供了一种蓝布正提取物的制备方法，其包括以下步骤：(1)在7月份，从中国贵州省采集蓝布正，并经蓝布正进行通风阴干处理，备用。(2)取50kg上述处理后的蓝布正置于150l的乙醇中进行浸泡提取6h后，再添加150l的水继续进行浸泡提取6h，重复上述步骤3次，合并提取液，得到醇提取液。(3)将上述醇提取液置于50℃温度下进行恒温减压浓缩处理后，再进行喷雾干燥处理，得到固体粉末。(4)将上述固体粉末溶于50l的水中，先用100l的乙酸乙酯进行萃取，并去除乙酸乙酯萃取液后，再用50l的正丁醇进行萃取，得到醇萃取液。(5)将上述醇萃取液置于50℃温度下进行减压干燥处理得到胶状物后，再将胶状物用少量的水进行溶解，然后置于-80℃的冰箱过夜，进行冷冻干燥处理后，取出，再进行粉磨处理，即可得到蓝布正提取物。实验例：一、应用安捷伦高压液相色谱，反相柱层析法对该实施例3得到的蓝布正提取物进行反相色谱分析，其得到的色谱图如附图1所示。从图中可以看出，蓝布正提取物主要含有三大组份：水不溶物：该活性部位粉末用水溶解，过滤或离心，得到沉淀，冷冻干燥或105℃干燥过夜，称重得含量为17.5％。作为杂质对待。多糖类化合物(p1)：该活性部位的水溶液过滤后，过hp20柱层析，水洗两个柱体积，水洗液蒸干，105℃干燥过夜，称重得含量为47.9％。多酚类化合物(鞣质类化合物)：水洗后的hp20柱，用70％乙醇洗脱至浅色，醇洗液蒸干得红棕色固体，称重得含量为30.5％。其中，p1、木麻黄鞣宁(casuarinin)、水杨梅鞣质(gemina)、蛇含鞣质(potentillin)和鞣花酸等成分的特征峰如附图1所示。其中，上述反相色谱分析所采用的仪器、试剂及参数设定如下：自动进样器：waters2767samplemanager；泵：waters2545binarygradientmodule；紫外检测器：waters2998photodiodearraydetector；质谱仪：waters3100massdetector。试剂：乙腈，色谱纯fisher批号：133472；纯水：milliq；液相条件：流动相，a：纯水，b:乙腈；流速：0.4ml/min；进样量：5l；柱温：35℃；色谱柱：unitaryc182.8μm，3.0x50mmcolumn，acchrom；梯度洗脱程序如下表1：表1时间/min流动相a(％)流动相b(％)010002100067030770307.011000101000质谱条件：mode：esi+/esi-，fullscan；capillary：3.2kv；sourcetemperature：120℃；desolvationtemperature：350℃；desolvationgasflow：600l/hr；conegasflow：50l/hr；conevoltage：30v；mass(m/z)：85-2000；样品配制：取2μl上述实施例3得到的蓝布正提取物的水溶液直接进样分析。二、探索蓝布正提取物对成纤维细胞和结肠上皮细胞的作用：分离昆明小鼠尾巴成纤维细胞进行培养，用人脐静脉内皮细胞(huvec)和肌肉卫星细胞(c2c12)作为非成纤维细胞的对照细胞，来评估上述实施例3得到的蓝布正提取物特异性抑制成纤维细胞的作用。具体的，取昆明小鼠尾组织，剪碎，用加入抗生素(100u/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素)的磷酸缓冲盐溶液(pbs)冲洗后将组织加入到含有0.1％胰蛋白酶和0.1％胶原酶的培养液中，36℃培养20分钟，然后将培养液中悬浮的细胞通过离心将其沉淀，然后再将沉淀的细胞重新悬浮于含有10％小牛血清(fcs)和抗生素(100u/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素)的dmem培养液中。然后将悬浮的细胞种到24孔培养板，在37°恒温箱、5％co2/95％空气下培养。培养2h后、悬浮的细胞被丢弃，贴壁的细胞在含有10％fcs的dmem培养基中继续培养两天。然后用pbs冲洗培养的细胞，收集用酶消化(0.25％胰蛋白酶)的细胞，离心，将细胞沉淀再悬浮在含有10％fcs的dmem培养基中，细胞浓度为105细胞/毫升。另外，为了证明该蓝布正提取物对结肠上皮细胞的作用，分离sd新生鼠正常结肠上皮细胞进行实验。具体的，取出生后3天幼鼠的结肠组织，剪碎，用加入抗生素(100u/ml的青霉素、100mg/ml的链霉素)的pbs充分冲洗后(至少5遍)将组织加入到含有0.1％i，iv型胶原酶和透明质酸酶的培养液中，培养液为高糖dmem培养基，加入10％胎牛血清，20mgegf/升，37℃培养30分钟。消化完毕后，用吸管用力吹打5分钟，转移至25ml无菌离心管中，室温静置1分钟后，小心转移上清至另一个离心管中，重复该步骤3次。然后加入10ml培养液到收集的上清中，慢速离心(500rpm)2分钟。弃上清。沉淀加入10ml培养基吹打，再以上述同样速度离心3分钟，重复该步骤5次。上清部分主要是单个结肠上皮细胞和细胞碎片，沉淀部分主要是消化下来的结肠粘膜组织小块。将后者加入适量培养基重悬，然后将重悬的细胞加入到6孔板的培养皿中，置于37℃，5％co2/95％空气培养箱中培养，每两天换液。细胞接种后一般3-5小时就能贴壁，6-7天可形成单层贴壁细胞层。细胞鉴定用单克隆抗体ck-19细胞免疫化学方法。贴壁的形成单层的细胞用pbs冲洗培养的细胞，收集用酶消化(0.25％胰蛋白酶)的细胞，离心，将细胞沉淀再悬浮在含有10％fcs的dmem培养基中，细胞浓度为105细胞/毫升。然后，分别将上述分离的成纤维细胞、结肠上皮细胞种到96孔板，并用含有不同梯度浓度的上述实施例3得到的蓝布正提取物的培养基(5～100μg/毫升培养基，蓝布正提取物溶解在5％dmso中)处理培养的细胞。另外，用同样浓度梯度的蓝布正提取物处理平行培养的huvec)和c2c12细胞。结果表明，该蓝布正提取物可以剂量依赖性抑制培养的成纤维细胞的增长率，当培养基中的活性部位浓度达到100μg/毫升时，培养的成纤维细胞几乎没有增长。相比之下，同样浓度的活性部位对培养的结肠上皮细胞、huvec和c2c12细胞并未观察到生长抑制作用，并且有促进三者的生长作用。其说明该蓝布正提取物对成纤维细胞的生长有特异的抑制作用，而对结肠上皮细胞、血管内皮细胞和肌细胞有促进生长的作用。这些结果表面该蓝布正提取物有可能可以减缓或抑制结肠溃疡纤维化的进展，并且有促进损伤愈合的作用。三、蓝布正提取物对溃疡性结肠炎的治疗临床案例：临床病人12人，表现为有腹痛、里急后重、频繁血性腹泻，还伴随有体重减轻、贫血表现。腹部检查时多数有结肠部位触痛，肛周皮肤有发红、擦伤、肛周炎症。结肠镜检查发现有8例患者，可见患者直肠和乙状结肠有黏膜充血、水肿、变脆触之易出血，黏膜多发性浅表溃疡。病变多从直肠开始，呈弥漫性分布；黏膜粗糙呈细颗粒状，并形成沿肠纵轴的椭圆浅表溃疡，有的融成较大不规则溃疡。黏膜质脆易出血，有3例病例见到假息肉形成，结肠袋消失、肠壁增厚以及直肠和乙状结肠腔明显缩小等表现。病灶处活组织检查主要呈慢性炎症表现。病变主要集中在黏膜层或黏膜下层，黏膜下水肿、纤维化。炎性细胞浸润，肠腺体紊乱、破坏、萎缩、基底膜断裂、消失。实验室检查发现粪便以糊状黏液脓血便最为常见，镜下检查有大量的红细胞、脓细胞、多核巨噬细胞。免疫学检查显示溃疡结肠黏膜内有igg、igm、补体与纤维蛋白原沉积的免疫复合物。用肾上腺皮质激素和免疫抑制药治疗可以缓解病情。根据临床症状，结肠镜检查和实验室检查，其中8位患者确诊为溃疡性结肠炎。针对上述其中的6位溃疡性结肠炎患者，应用含10％的上述实施例3得到的蓝布正提取物的生理盐水进行灌肠治疗，作为试验组；另2位溃疡性结肠炎患者，应用生理盐水进行灌肠治疗，作为对照组；试验组和对照组均灌肠保留一个小时，2次/天，疗程一个月。灌肠治疗一周后，试验组的6位患者的临床症状，如腹痛、里急后重、频繁血性腹泻等变现显著减轻，体重也有所恢复。而对照组的2位患者，则没有任何改善的迹象。治疗一个月后，试验组的6位患者的临床症状(包括腹痛、里急后重、频繁血性腹泻)基本完全消失，基本恢复正常；结肠镜检查发现所有患者直肠和乙状结肠的黏膜充血和水肿显著改善，多发性浅表溃疡基本全部愈合；患者的全身状态显著改善，体重也回升。而对照组的2位患者基本没有任何明显改善。此外，对对照组的2位患者采用与试验组一样的治疗方法进行治疗一个月后，该2位患者的临床症状和全身状况，结肠镜检查，得到了明显的改善。四、蓝布正提取物对类风湿性关节炎的治疗临床案例：临床病人8人，患者陈述首先表现为晨僵，早上起来发现有对称性单个至多个关节不灵活，适量活动后晨僵现象显著减轻或消失。受累关节有游走性疼痛、压痛、肿胀及部分活动受限。有5位患者述说有乏力、疲劳、和发烧等感冒症状。有4位患者可见指关节的畸形，和类风湿结节。实验室检查发现患者的类风湿因子高，关节液检查在受损关节中抽出的关节液混浊，无菌，镜检显示关节液内无结晶物。有3位患者发现皮下结节，多见于关节突起部，质韧，无明显压痛。x线检查发现，受累关节周围软组织肿胀，关节囊阴影增大，关节间隙变窄，受累关节周围骨质疏松。以上患者虽然经过抗炎、外敷中药控制疼痛，甚至激素等治疗，但是治疗效果不明显。针对上述其中的6位类风湿性关节炎患者，应用口服3g上述实施例3得到的蓝布正提取物/天进行治疗，作为试验组；另外2位类风湿性关节炎患者，应用每天口服安慰剂进行治疗，作为对照组；试验组和对照组均持续治疗6个月。治疗2个月后，试验组6位患者的临床症状(如晨僵、关节疼痛、活动受限、关节肿胀等症状)显著减轻。而对照组的2例患者，则没有任何改善的迹象。治疗6个月后，试验组6位患者的临床症状进一步减轻，基本恢复正常感觉。实验室检查发现患者的类风湿因子显著降低，关节液检查在受损关节中抽出的关节液已经恢复正常，无菌，关节液的黏度也恢复正常。x线检查发现，受累关节周围肿胀的软组织消失，关节囊阴影正常大小，并且受累关节周围骨质密度显著增加。而对照组2例患者的症状没有明显的改善。以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。当前第1页12