双特异性抗体CAR细胞免疫疗法的制作方法

相关申请的交叉引用本申请根据35u.s.c.§119(d)要求2018年3月16日提交的美国临时申请62/644,343号的优先权，通过引用将其内容结合到本公开中。本公开总体上涉及人类免疫学领域，特别是癌症免疫疗法。
背景技术：
：：仅提供以下对本发明背景的讨论以辅助本发明的技术。当前的癌症治疗方案包括化学疗法、免疫调节药物14、单克隆抗体15以及自体或异体移植。这些疗法通常导致疾病缓解，但是几乎所有患者最终都会复发并由于疾病的复发而死亡。因此，对新疗法的需求未得到满足，包括针对复发和/或难治性疾病的新的组合免疫疗法。本公开解决了这些限制并且还提供了相关的优点。技术实现要素：嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，car)t细胞已在临床上成功用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤，最近已被美国fda批准1-4。双特异性抗体(bispecificantibody，bsab)也已被fda批准用于癌症治疗，并被用作cart细胞疗法的替代免疫疗法5。但是，基于car和bsab的癌症免疫疗法仍需改进，重要原因有五个。第一，在某些情况下，cart细胞无法在体内扩增，也无法存活足够长的时间来启动患者的肿瘤溶解6。据报道，cart细胞的功效与体内cart细胞存在的数量和持续时间有关6-8。第二，肿瘤细胞可以脱落靶抗原以逃避治疗，尤其是当仅靶向单个抗原时。第三，bsab除了昂贵且制造费时外，还具有较短的半衰期，迄今为止尚未显示出有疗效9,10。第四，cart细胞与针对两种不同的肿瘤相关抗原的bsab联合治疗可能是一个好方法；然而，对每一种进行单独离体生产将是劳动密集型的并且成本高；尚未报道过对t细胞进行工程改造以在单个构建体中同时表达car和bsab，其中bsab结合所有溶细胞效应细胞，或尚未证明其具有累加或协同作用，或会提高体内t细胞的存活率。最后，当前的car免疫疗法方法主要集中于一种免疫细胞类型，即t细胞，不包括免疫系统的先天和适应性臂(arm)中的所有其他溶细胞效应细胞。nkg2d是一种c-凝集素类型的受体，其实际上在免疫系统的先天和适应性臂中的所有溶细胞效应细胞上都表达11,12。本公开提供了一种平台，其通过对用单一载体感染的t细胞进行工程改造来部分或全部解决这些问题，所述载体递送这两种治疗模式，即产生其car靶向一种特定的肿瘤相关抗原的t细胞。因此，在一方面，本文提供了嵌合抗原受体(car)，其包含以下结构域、或基本上由以下结构域组成、或由以下结构域组成：(a)癌症或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；以及(d)细胞内结构域。本公开的其他方面涉及一种嵌合抗原受体(car)，其包含以下结构域、或基本上由以下结构域组成、或由以下结构域组成：(a)肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域；(b)cd8α铰链结构域；(c)cd8α跨膜结构域；(d)cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域；以及(e)cd3ζ信号传导结构域。在某些实施方案中，肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域包含任选地通过接头肽连接的重链可变区和轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，重链和/或轻链可变区包含针对b细胞成熟抗原(b-cellmaturationantigen，bcma)和/或slamf7(也称为cs1或cd319)中的任一个和/或其每一个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，肿瘤靶向抗体靶向bcma。在一些实施方案中，重链和/或轻链可变区包含针对b细胞成熟抗原(bcma)和/或slamf7(也称为cs1或cd319)中的任一个和/或其每一个的等效物的抗体的氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，car进一步包含位于重链可变区和轻链可变区之间的接头多肽，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，所述接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在其他实施方案中，所述接头多肽包含序列(甘氨酸-丝氨酸)n，其中n是1至6的整数，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，car进一步包含与car连接的可检测标记和/或纯化标记，或基本上由其组成，或由其组成。本公开内容的其他方面涉及一种分离的核酸序列，其编码如上所述的car、或其互补序列、或其每一个的等效物。在某些实施方案中，所述分离的核酸序列进一步包含位于编码癌症或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域的多核苷酸上游的kozak共有序列，或基本上由其组成，或由其组成。在某些方面，所述分离的核酸进一步包含编码与该分离的核酸可操作地连接的抗生素抗性多肽的多核苷酸、启动子和/或增强子元件，或基本上由其组成，或由其组成。本文还提供了一种编码识别和结合nkg2d的双特异性抗体的分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码双特异性抗体，该双特异性抗体包含任选地由密码子最优化的nkg2d配体和任选的salmf7(也称为cd319的cs1)配体，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，所述分离的核酸编码双特异性抗体，该双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)或其每一个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，所述核酸编码双特异性抗体，该双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，所述核酸编码双特异性抗体，该双特异性抗体包含衍生自针对nkg2d的抗体的单链可变片段(scfv)、以及任选的衍生自salmf7(也称为cd319的cs1)的单链可变片段(scfv)(任选地由密码子最优化)和/或其每一个的等效物。在某些实施方案中，所述分离的核酸进一步包含编码抗生素抗性基因的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，本文提供了分离的核酸，其在一个构建体中编码如上所述的car和双特异性抗体(“bsab-car构建体”)。在一方面，所述分离的核酸编码靶向bcma的抗原结合片段和双特异性抗体，所述双特异性抗体包含例如来自抗cs1抗体的一个scfv和来自抗nkg2d抗体的一个scfv，其通过编码非免疫原性蛋白质接头(例如来自人肌肉醛糖)的核酸连接在一起。示例性的bsab-car载体在图3a中示出。所述载体任选地包含调节序列，例如启动子、增强子和病毒ltr。本公开的方面涉及一种载体，其包含一种或多种上述分离的核酸。在某些实施方案中，所述载体是选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体的质粒或病毒载体。所述分离的核酸和包含它们的载体可用于制备本文所述的car。本公开的其他方面涉及一种分离的细胞，其包含一种或多种上述组分、或基本上由其组成、或由其组成：car，编码car或其互补序列的分离的核酸，编码car/bsa构建体的分离的核酸，或包含所述分离的核酸的载体。在一些实施方案中，car在分离的细胞的表面上表达。在某些实施方案中，所述分离的细胞进一步包含分离的核酸、或基本上由其组成、或由其组成，所述分离的核酸包含编码双特异性抗体的多核苷酸、或基本上由其组成、或由其组成，该双特异性抗体任选地识别并结合nkg2d。在一些实施方案中，双特异性抗体包含nkg2d配体或抗nkg2抗体的抗nkg2抗原结合片段和任选的salmf7(也称为cd319的cs1)配体，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)或其每一个的等效物的抗体的相关轻链和重链区或cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含衍生自针对nkg2d的抗体的单链可变片段(scfv)、以及任选的衍生自salmf7(也称为cd319的cs1)的单链可变片段(scfv)(任选地由密码子最优化)和/或其每一个的等效物。在某些实施方案中，所述分离的核酸进一步包含编码抗生素抗性基因的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。分离的细胞的非限制性实例是原核细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌)或真核细胞。在一些实施方案中，分离的真核细胞选自动物细胞、哺乳动物细胞、牛细胞、猫细胞、犬细胞、鼠细胞、马细胞或人细胞。在进一步的实施方案中，分离的细胞是t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、其任何亚群、或来自本文所公开的物种的任一个的任何其他免疫细胞。本公开的方面涉及一种组合物，其包含一种或多种上述组分、或基本上由其组成、或由其组成，该组分例如是car、分离的核酸、细胞、或vector载体和carrier载体。在某些实施方案中，所述组合物进一步包含任选地识别并结合nkg2d的双特异性抗体和/或包含编码任选地识别并结合nkg2d的双特异性抗体的多核苷酸的分离的核酸，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含nkg2d配体和任选的salmf7(也称为cd319的cs1)配体，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对nkg2d和任选的slamf7(也称为cs1或cd319)或其每一个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对nkg2d和任选的slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含衍生自针对nkg2d的抗体的单链可变片段(scfv)、以及任选的衍生自salmf7(也称为cd319的cs1)的单链可变片段(scfv)和/或其每一个的等效物。本公开的方面涉及一种分离的复合物，其包含：与癌症或肿瘤抗原或其片段结合的car或包含car的细胞，和/或表达所述癌症或肿瘤抗原的细胞。在一方面，抗原结合结构域在细胞的表面上表达。在另一方面，癌症或肿瘤抗原是b细胞成熟抗原(bcma)、slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物。在一方面，包含或表达car的细胞是t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、其任何亚群、或任何其他免疫细胞。肿瘤或细胞可以来自任何动物，例如哺乳动物，例如人细胞。本公开的一些方面涉及一种产生分泌bsa的表达car的细胞或表达car的细胞的方法，该方法包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：用如本文所述的编码car和bsa的核酸序列或编码bsab-car的分离的核酸转导分离的细胞。在另一方面，所述方法进一步包括：选择和分离表达car或bsab-car的细胞。在另一方面，所述细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，例如人细胞，例如t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、其任何亚群、或任何其他免疫细胞。可以使用本文所述的病毒载体或使用在标题为“用嵌合抗原受体瞬时修饰t细胞以进行过继治疗的非病毒rna转染”的rietetal.(2013)meth.mol.biol.969:187-201中描述的技术来转导细胞。在某些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：用分离的核酸转导细胞，所述分离的核酸包含编码双特异性抗体的多核苷酸、或基本上由其组成、或由其组成，该双特异性抗体任选地识别并结合nkg2d。在一些实施方案中，双特异性抗体包含nkg2d配体和任选的salmf7(也称为cd319的cs1)配体(其每个都由密码子最优化)，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)或其每一个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含衍生自针对nkg2d的抗体的单链可变片段(scfv)、以及任选的衍生自salmf7(也称为cd319的cs1)的单链可变片段(scfv)(任选地由密码子最优化)和/或其每一个的等效物。可以使用本文所述的病毒载体(例如慢病毒载体)或使用在标题为“用嵌合抗原受体瞬时修饰t细胞以进行过继治疗的非病毒rna转染”的rietetal.(2013)meth.mol.biol.969:187-201中描述的技术来转导细胞。在某些实施方案中，产生表达car或bsab-car的细胞的方法进一步包括以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：激活和扩增表达car的细胞的群体。本公开的某些方面涉及一种分离的、活化的细胞群，其包含car或bsab-car，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，所述细胞是t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、其任何亚群、或任何其他免疫细胞中的一种或多种。本公开的方面涉及通过使肿瘤与有效量的上述分离的细胞或组合物接触来抑制表达癌症或肿瘤抗原的肿瘤的生长的方法。所述接触可以是体外或体内的。在体外接触时，该方法可以被用来针对患者肿瘤测试个性化疗法或被用来检测联合疗法。在体内接触时，该方法可用于抑制有需要的对象(例如患有癌症的人类患者)的肿瘤或癌细胞的生长，并且该患者接受有效量的所述细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。有效量可以单独施用或与本文所述的其他疗法组合施用。在某些实施方案中，靶向的癌症/肿瘤是实体瘤或影响血液和/或骨髓的癌症，例如多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)。在某些实施方案中，分离的细胞对于所治疗的对象是自体同源的。在另一方面，所述细胞对被治疗的对象是同种异体的。在另一方面，该方法进一步包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：向对象施用有效量的细胞减少疗法。在另一方面，该方法进一步包括以下步骤：分离待施用至对象的细胞，用有效量的如本文所述的编码car或bsab-car的分离的核酸转导细胞，培养该细胞以获得编码car或bsab-car的细胞群(其任选地被扩增和激活)，然后将细胞施用至患者。本文还公开了试剂盒，其包含一种或多种上述组合物、以及用于它们在本文公开的方法中使用的说明书。上述组合物和方法是独特的，并克服了现有技术的局限性，因为它们提供了同时分泌靶向第二种肿瘤相关抗原的基于nkg2d的bsab的car细胞。所公开的基于carnkgd2d的bsab仅是示例性的。如本领域中已知的，可以针对任何数量的肿瘤抗原来修改该方法，例如egfrviii；cd70、间皮素、cd123、cd19、cea、cd133、her2，参见townsendetal.(2018)j.exp.&clinicalcancerres.37:163。在多发性骨髓瘤(mm)模型中测试了示例性构建体。mm是一种恶性肿瘤，其特征是克隆浆细胞的聚集13。如上所述，当前的治疗方案包括化学疗法、免疫调节药物14、单克隆抗体15和自体或异体移植，通常会导致疾病缓解，但是几乎所有患者最终都会复发并由于疾病的复发而死亡。因此，对新疗法的需求未得到满足，包括针对复发和/或难治性mm的新的组合免疫疗法。作为先天免疫系统的组成部分，自然杀伤(nk)细胞在防止肿瘤生长中起着重要的作用16，但已发现nk细胞抗肿瘤活性在许多mm患者中受到抑制17。在许多血液系统恶性肿瘤(包括mm)和实体瘤的治疗中，活化或同种异体nk细胞的过继转移产生有效的抗肿瘤反应18,19。但是，在许多情况下，nk细胞介导的抗肿瘤反应较弱，这可能是由于抑制性受体的nk细胞表达、存活能力差、或效应细胞向肿瘤部位的迁移受限20-22。同时，作为适应性免疫的一部分，t细胞可以有效地迁移到各种组织中，并且倾向于响应抗原刺激而良好增殖。但是，t细胞具有由抗原特异性t细胞受体(tcr)决定的严格特异性。因此，使t细胞和nk细胞都参与并因此克服其自身局限性的方法对于癌症免疫治疗将是非常有益的。本公开提供了这种好处。附图说明图1a-1d显示了工程化t细胞以单独或组合地表达bcmacar和抗nkg2d-抗cs1双特异性融合蛋白的结果。(a)包含与cd28和cd3ζ胞内结构域连接的针对bcma的scfv的bcmacar慢病毒构建体的示意图。通过ef1α启动子驱动的gfp表达来追踪转基因的表达。ltr，长末端重复；sp，信号肽；vh，可变h链；l，接头；vl，可变l链；myc，myc标签；h，铰链；cd28，一种t细胞共刺激分子；cd3ζ，cd3ζ链。(b)用于抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体(bsab)的哺乳动物表达的慢病毒构建体的示意图。抗nkg2d-抗cs1bsab由抗nkg2dscfv(由通过接头(l)连接在一起的vh和vl组成)和抗cs1scfv组成。bsab的表达由慢病毒ltr侧翼的cmv启动子驱动。(c)用cd3和cd28珠激活健康供体的pbmc(外周血单核细胞)，并用pcdh空载体(ev)、bcmacar、抗nkg2d-抗cs1bsab进行转导。活化的t细胞也依次用bsab和bcma-car转导，这些转导的细胞称为“bsab-bcmaseq.trans.t”。筛选gfp阳性细胞，并用生物素标记的山羊抗小鼠fab特异性抗体或同种型匹配的对照抗体对细胞进行染色，然后用链霉亲和素和cd3抗体进行染色。(d)收集未经修饰的t细胞、bsabt细胞或bsab-bcmaseq.trans.t细胞的上清液，以及单独细胞裂解物使用抗6xhis-标签抗体进行免疫印迹分析。图2a-2e显示了在应答中与bcma-cart细胞或bsabt细胞相比，bsab-bcmaseq.trans.t细胞具有更高的细胞毒性和ifn-γ产生能力。(a)mm细胞系表面bcma和cs1表达的流式细胞仪分析。用抗cs1mab抗体(上图)或抗bcmamab(下图)对三个mm细胞系(mm1.s、h929和rpmi-8226)和一个慢性骨髓性白血病细胞系(k562)进行染色，使用不同的颜色来区分mm.1s(绿色)、h929(红色)和rpmi-8226(灰色)这三个mm细胞系、以及k562细胞系(蓝色)或同种型匹配的对照抗体(黑色实线和开放区域)。(b)将51cr标记的mm1.s、h929、rpmi-8226mm细胞系和k562细胞系(每个细胞系5×103个)与未经修饰的t细胞(t，黑色实线)、空载体转导的t细胞(evt，黑色虚线)、表达抗nkg2d-抗cs1bsab的t细胞(bsabt，红色实线)、bcmacar(bcmacart，绿色实线)和bsab-bcmaseq.trans.t细胞(蓝色实线)以所示的e:t比率共培养4小时，并测量目标裂解(51cr释放)。bsab-bcmaseq.trans.tvsbcmacart,*p<0.05,**p<0.01；seq.trans.tvsbsabt,#p<0.05,##p<0.01。k562细胞作为bcma-cs1-阴性对照。(c)2×105个未经修饰的t细胞(白色方形)、evt细胞(灰色阴影方形)、bsabt细胞(红色方形)、bcmacart细胞(绿色方形)或bsab-bcmaseq.trans.t细胞(蓝色方形)单独培养(无靶标)或用表达不同水平cs1和bcma的mm.1s、h929或rpmi-8226mm细胞或bcma-cs1-k562细胞刺激24小时，收集上清液以通过elisa测量ifn-γ的分泌。*p<0.05,**p<0.01，n.s无明显差异。(d和e)按照(c)中所述地处理细胞，并通过elisa分别测定无细胞上清液中的il-2或tnf-α分泌。**p<0.01，n.s无明显差异。图3a-3h显示了在同一构建体中同时包含bcmacar和抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体(bsab)的bsab-car载体的产生，以及用该构建体转导的t细胞的功能检查。(a)所产生的同时表达bcmacar和抗nkg2d-抗cs1bsab(此后称为bsab-car)的慢病毒载体的示意图。t2a，一种自我切割的2a基因。(b)用抗6xhis-标签抗体对空载体(ev)转导的t细胞或bsab-cart细胞的上清液和细胞裂解液进行免疫印迹分析。(c)将51cr标记的mm1.s细胞(5×103)与未经修饰的t细胞(t，黑色实线)、空载体转导的t细胞(evt，黑色虚线)或bsab-cart细胞(紫色线)在所示的e:t比率下共培养4小时，然后测量目标裂解(51cr释放)。(d)将从健康供体中分离的未经修饰的(黑色实线)、ev(黑色虚线)、bsab(红色线)、bcmacar(绿色实线)或bsab-car(紫色实线)转导的cd8(+)t细胞与51cr标记的mm1.smm细胞(5×103)以所示的e:t比率共培养4小时，并测量目标裂解(51cr释放)。(e)用mm.1smm细胞以10:1的e:t比率进行4小时51cr释放测定。为了评估在不同数量的正常(未感染)人pbmc存在下的抗肿瘤作用，以mm.1smm靶细胞的1倍、10倍、100倍和200倍的量添加pbmc。(f)以5:1的e:t比率进行的未经修饰的t细胞(黑色方形)、evt细胞(图案方形)、bsabt细胞(红色方形)、bcma-cart细胞(绿色方形)或bsab-cart细胞(紫色方形)针对mm.1smm目标细胞的51cr释放测定。如图所示，效应细胞和mm.1smm靶细胞的孵育时间对于pbmc、nk和nkt细胞为4小时(左图)，对于cd3+t细胞、cd8+t细胞、vγ9vδ2t细胞或cd4+t细胞为16小时。*p<0.05,**p<0.01,n.s.无明显差异。(g)evt细胞(gfp，绿色)和mm.1smm细胞(红色)共培养1小时后的对照，对突触进行共聚焦显微镜分析(比例尺10μl，上图；比例尺20μl，下图)；即使在下图所示的更高能量下，也没有注意到突触。(h)bsab-cart细胞(e：gfp，绿色)和mm.1smm细胞(t：红色)共培养一小时；在所有方框中均观察到e/t突触并由箭头指示(s1示出了在每个方框中从左向右移动的相同的共轭e/t对，s2和s3同样如此)。左上方的方框显示了亮场(bf，比例尺10μl)；顶部中间的方框显示了bsab-cart细胞(gfp，绿色)和mm.1smm细胞(红色)共培养(的免疫荧光图像比例尺10μl)。右上方的方框是合并的图像，其中额外的抗6x-his标签识别bsab(蓝色，比例尺10μl)。最下面的三行显示了在放大的区域(比例尺20μl)中可视化的三个单独的e/t共轭物(s1、s2和s3)。图4a-4d显示，在被bsab-cart细胞识别后，k562细胞中bcma和cs1的过表达触发增强的细胞毒性和细胞因子分泌。(a)用cs1(左图)或bcma(右图)或igg同种型对照(每个图上的黑色虚线)抗体染色细胞之后，过表达cs1和bcma(k562-cs1-bcma，灰色阴影)或空载体对照(k562-pcdh，黑色实线)的k562细胞的流式细胞仪分析。(b)空载体(ev)转导的或bsab-car转导的t细胞对k562-cs1-bcma和k562-pcdh细胞的细胞毒性，通过4小时51cr释放测定来确定。将k562-cs1-bcma或k562-pcdh细胞与evt细胞或bsab-cart细胞以所示的e:t比率进行孵育。**p<0.01(k562-cs1-bcma+bsabt细胞vs.k562-pcdh+bsabt细胞)。(c)对evt细胞或bsab-cart细胞(1×105)进行单独培养或用相等数量的k562-cs1-bcma或k562-pcdh细胞刺激。来自培养物的上清液用于通过elisa确定ifn-γ分泌。**p<0.01。(d)按照(c)中所述地处理细胞，并通过elisa测定无细胞上清液中的il-2分泌。**p<0.01。图5a-5e显示了分泌的抗nkg2d-抗cs1bsab通过nkg2d信号传导增强了cart细胞的增殖。(a)未经修饰的t细胞(1)、2-evt细胞(2)、bsabt细胞(3)、bcmacart细胞(4)、bsab-cart细胞(5)或幼稚t细胞(6)(非增殖对照)培养之后的介质颜色显示在上方小图中。条形图提供了总细胞数的统计分析，每组包括6个独立样本。**p<0.01(第5组vs.第1、2、4组和第3组vs.第1、2、4组)。为了记录t细胞增殖或t细胞增殖的缺乏，使用了紫染料(violet)细胞追踪器，并显示为v450稀释度，在下方小图中以直方图显示。(b)在存在或不存在来自(a)的bsab-cart细胞的无细胞上清液的情况下，未经修饰的t细胞、evt细胞和bcmacart细胞的五日龄培养基(分别示出为1+、2+、4+或1、2、4)。对细胞进行计数，数据以条形图显示(顶部)。**p<0.01(4+vs.4,2+vs.2,1+vs.1)。紫染料细胞追踪器显示为v450稀释度，由下方小图中的直方图显示(底部)。(c)显示了两日龄的培养基。1a-未经修饰的t细胞，2a-evt细胞，3a-bsabt细胞，4a-bcmacart细胞，以及5a-bsab-cart细胞。在第0天，将nkg2d阻断抗体(20μg/ml)添加到1b、2b、3b、4b和5b的培养物中，同时将非反应性同种型对照抗体(20μg/ml)添加到1a、2a、3a、4a和5a)。在这些孔下面是cd3、nkg2d、f(ab)2(用“fab”表示，代表car的表达)和ki67的流式细胞仪染色，以测量细胞增殖。(d)进行了免疫印迹分析以确定akt蛋白的磷酸化(p)，以及1a---未经修饰的t、2a---evt、3a---bsabt、4a---bcma-cart和5a---bsab-cart以及1b-未经修饰的t细胞+nkg2d阻断剂、2a---evt+nkg2d阻断剂、3a---bsab-t+nkg2d阻断剂、4a---bcma-cart+nkg2d阻断剂、以及5a---bsab-cart+nkg2d阻断剂的总akt蛋白。(e)将(c)中所示的相同细胞(1a、2a、3a、4a和5a)也与mm.1smm细胞共培养48小时。如上文(c)中所述地进行流式细胞术分析以评估细胞增殖。图6a-6c显示了分泌的抗nkg2d-抗cs1bsab体外通过nkg2d信号传导提高了cart细胞存活。(a)显示了1---未经修饰的t+il-2、2---evt+il-2、3---bsabt+il-2、4---bcma-cart+il-2、5---bsab-cart+il-2的五日龄培养基。cd3(第一列)、f(ab)2(第二列)和ki67流式细胞仪染色以观察细胞增殖(第三列)，annexinv/sytoxblue以观察细胞存活(第四列)。(b)在上方小图显示了1---未经修饰的t、2---evt、3---bsabt、4---bcma-cart和5---bsab-cart的五日龄培养基(无il-2)。cd3(第一列)和ki67(第二列)的流式细胞仪染色以检测细胞增殖。包括annexinv/sytoxblue以检测细胞存活(第三列)。(c)显示了cd3、ki67增殖细胞、annexinv(-)sytoxblue(-)活细胞、annexinv(+)凋亡细胞、以及annexinv(+)sytoxblue(+)死细胞的百分比的统计分析。多重t检验，比较各组。**p<0.01。图7a-7d显示了体内bsab-car转导的t细胞比bcma-cart细胞和对照t细胞具有更好的增殖和存活能力。(a)将未经修饰的t细胞、evt细胞、bcma-cart细胞和bsab-cart细胞静脉内(i.v.)注射到免疫缺陷的nsg小鼠中(a，上)的设计。3d直方图(下图，第一列)表示已注射的人类cd3t细胞的百分比。蓝色直方图表示的是在第-1天未注射t细胞的小鼠，橙色直方图表示注射t细胞后1天，黑色直方图表示注射t细胞后14天(红色箭头表示bsab-cart组)。等高线表示cd69表达(橙色表示静脉内注射后1天，黑色表示静脉内注射后14天)。紫色直方图(第4列)表示静脉内注射后35天经注射的cd3t细胞的百分比。紫色等高线是4组的ki67和cd69染色的组合，以显示细胞增殖。红色等高线是sytoxblue和annexinv染色的组合，以显示细胞凋亡和细胞死亡。s-/a-表示sytoxblue(-)/annexinv(-)，s-/a+表示sytoxblue-/annexinv+，s+/a+表示sytoxblue+/annexinv+。(b，c)(a)中显示的人cd3+(b)和cd69+(c)细胞的统计分析。未经修饰的t(空心矩形)、evt(图案填充的矩形)、bcma-cart(灰色阴影矩形)和bsab-cart(黑色矩形)。多重t检验，比较各组。.**p<0.01,n.s.无明显差异，每组n＝5只小鼠。(d)ki67+cd69+增殖细胞、annexinv(-)sytoxblue(-)活细胞、annexinv(+)sytoxblue(-)凋亡细胞和annexinv(+)sytoxblue(+)死细胞的百分比的统计分析。多重t检验，比较各组。**p<0.01,n.s.无显著性差异，n＝5/组。图8a-8c显示了bsab-cart细胞特异性地离体识别和消除表达cs1或/和bcma的人原发性多发性骨髓瘤细胞。(a)从mm患者骨髓中分离出的cd138+多发性骨髓瘤肿瘤细胞中cs1和bcma蛋白的流式细胞仪表面染色。显示了来自8名患者的结果。八名患者的mm细胞用pe结合的抗cs1mab抗体(左图)或apc结合的抗生蛋白链菌素和生物素标记的抗bcmamab(右图)染色。各种颜色用于指示8位患者或同种型匹配的对照抗体(灰色阴影)中的每一个。(b)将5×103cd138+个多发性骨髓瘤肿瘤细胞与evt细胞(黑色虚线)、bsabt细胞(红色线)、bcma-cart细胞(绿色线)或bsab-cart细胞(紫色线)以所示的e:t比率共培养4小时，然后使用标准51cr释放测定法确定特异性裂解。显示了来自患者样本1和患者样本4的代表性数据。分析了八名患者的数据，并显示为每个患者的单独值(右图)。(c)将所示的转导的t细胞与cd138+多发性骨髓瘤肿瘤细胞以1:1的e:t比率共培养24小时，并通过elisa在无细胞的上清液中测量ifn-γ的分泌。图9a-9c显示，bsab-cart细胞在抑制体内mm生长和延长带有mm或被肿瘤细胞再次攻击的小鼠的存活方面是优越的。(a)显示了来自每个所示的组的五只具有mm.1s肿瘤的代表性小鼠的生物发光成像。nsg小鼠静脉内接种表达荧光素酶的8×106个mm.1s细胞(第0天)。在肿瘤植入后第10、17和24天，每只小鼠分别静脉内注射生理盐水(对照组)或10×106个evt细胞、bsabt细胞、bsmacart细胞、bsab-bcmaseq.trans.t细胞或bsab-cart细胞(上方小图，实验时间表)。该行的图像是在肿瘤植入后第10天，即在注入工程化t细胞或对照t细胞之前拍摄的。在小鼠已经接受了两次治疗后(第10、17天)并且就在第三次治疗之前，在第24天拍摄的中间一行的图像。最下面一行的图像显示了经过3轮治疗(第10、17和24天)的第31天的小鼠。(b)在肿瘤植入后第80天，从存活的小鼠(3只bcmacart细胞治疗组小鼠，4只bcmaseq.trans.t细胞治疗组小鼠和5只bsab-cart细胞治疗组小鼠)中收集外周血(pbl)。计算了pbl的总细胞数(左图)。fitc结合的抗人cd45mab抗体和apc结合的抗生蛋白链菌素与生物素标记的山羊抗小鼠(fab)2多克隆抗体或正常的多克隆山羊免疫球蛋白g(igg)抗体的流式细胞仪染色。如中间图所示，计算fab(+)细胞的百分比和数量。(c)用各种转导的t细胞，生理盐水(黑色实线)、evt细胞(黑色虚线)、bsabt细胞(红色线)、bcmacart细胞(绿色线)、bcmaseq.trans.t细胞(蓝色线)和bsab-cart细胞(紫色虚线)处理的mm.1s荷瘤小鼠的kaplan-meier生存曲线。带有箭头的灰色虚线垂直线表示在第80天用4×106个mm.1s细胞再次攻击小鼠。图10a-10d显示，在过继转移的人pbmc的存在下，bsab-cart细胞比bcma-cart细胞更有效地抑制体内mm生长并延长了携带mm肿瘤的小鼠的存活。(a)显示了来自每个所示组的三只具有mm.1s肿瘤的代表性小鼠的生物发光成像。nsg小鼠静脉内接种表达荧光素酶的8×106个mm.1s细胞(第0天)。在肿瘤植入后第10、17和24天，每只小鼠静脉内注射生理盐水(对照组)、bsma-cart细胞或bsab-cart细胞。在肿瘤植入后第10天将来自同一供体的骨髓细胞耗尽的pbmc静脉内注射给小鼠(上方小图，实验时间表)。就在输注工程化t细胞或对照t细胞之前，在肿瘤植入后第10天拍摄第一列图像。在小鼠已经接受了两次治疗后(第10、17天)并且就在施用第三次治疗之前，在第19天拍摄第二列中的图像。第三列中的图像显示了经过3轮治疗(第10、17和24天)的第28天的小鼠。第四列中的图像显示了在第37天的小鼠。(b)从存活的注射了bsab-cart细胞的小鼠(n＝5)和未治疗的nsg小鼠(无，n＝5)收集血液。cd19/20(+)人浆细胞、cd56(+)nk细胞和cd3(+)t细胞的流式细胞仪染色。设门(gate)在人cd3(+)f(ab)2(+)上的绿色等高线表示存活的人t细胞中car表达的百分比。(c)对人类cd19/20(+)浆细胞、cd56(+)nk细胞、cd3(+)t细胞和cd3(+)f(ab)2(+)存活的cart细胞的百分比的统计分析。(d)用生理盐水(黑色实线)、bcma-cart细胞(绿色线)或bsab-cart细胞(紫色虚线)等各种转导的t细胞处理的带有mm.1s的小鼠的kaplan-meier生存曲线。p<0.0001,bsab-cart细胞vs.bcma-cart细胞。图11a-11c。(a)3d彩虹点流式细胞仪图(基于cd3染色，cd3阳性细胞显示黄色和绿色，而cd3阴性细胞显示深蓝色和紫色)显示cd3(+)t细胞(黑色圈，黄色和绿色)、γδt细胞(仅黄色)、nkt细胞(橙色圈，黄色和绿色)和nk细胞(蓝色圈，深蓝色和紫色)的百分比。2d等高线图显示3d图的详细信息。(b)t细胞、cd8+t细胞、panγδt细胞、vγ9vδ2t细胞、nkt细胞和nk细胞中nkg2d表面表达的流式细胞仪染色。所提供的数据代表了来自10个健康供体的pbmc。(c)(b)中nkg2d+细胞的百分比的统计分析。n＝10。图12a-12b。(a)以10:1的e:t比率进行4小时51cr释放测定[e，未经修饰的t细胞(黑色实线)或ev转导的(黑色虚线)、bsab转导的(红色线)、bcma-car转导的(绿色线)或bsab-car转导的t细胞(紫色线)的效应细胞]。相对于靶细胞的1倍、10倍、100倍或200倍的不同量的人类pbmc。在a中示出了三个代表性实验中的一个的特异性裂解曲线，在b中示出了三个实验的总结数据。(b)(a)的51cr释放分析结果的统计分析，多重t检验，*p<0.05,**p<0.01,n.s.无明显差异，重复3次。图13a-13d。(a)从订购自美国红十字会的leukopack中分离出cd3(+)t细胞、cd8(+)细胞毒性t细胞、cd4(+)t细胞、γδt细胞、nkt细胞和nk细胞。初免(prime)的t细胞的黑色等高线图显示了cd3和panαβtcr的组合染色。棕色和绿色等高线图分别显示了分选的cd8(+)和cd4(+)t细胞。(b)用cd3和cd56抑制活化的人nk细胞。(c)用cd3和panγδτcr抗体对分选的panγδτ细胞进行染色。通过cd3、cd56、vγ9和vδ2的结合染色，绘制了活化的vγ9γδ2tcrt细胞的黑色等高线图。(d)将新鲜的facs分选的人cd3(+)cd56(+)nkt细胞用cd3和cd56进行染色。图14a-14e。(a)未经修饰的t细胞(黑色实线)、evt细胞(黑色虚线)、bsabt细胞(红色线)、bcma-cart细胞(绿色线)或bsab-cart细胞(紫色线)在不同时间点(包括2h、4h、8h和16h)以5:1的e:t比率的51cr释放测定。没有添加其他pbmc。(b，c，d，e)在存在或不存在大量t细胞或单个t细胞亚群(包括初免的cd3(+)t细胞、cd8(+)t细胞、cd4(+)t细胞、以及vγ9vδ2t细胞的情况下，重复上述细胞毒性测定。对于所有实验，效应细胞与靶mm.1s细胞的比例为5:1。图15a-15j显示了bsab-cart细胞(绿色)或evt细胞(绿色)与mm.1smm细胞(红色)共培养24小时后的共聚焦显微镜分析。(a-f)bsab-cart细胞与mm.1smm细胞共培养24小时显示mm.1smm细胞消失。(g-j)evt细胞与mm.1smm细胞共培养24小时显示mm.1smm细胞的持久性。bf＝明场；比例尺，10μl。图16显示了稳定地表达cs1和bcma基因的k562细胞的产生。左边的伪彩色流式细胞图显示未转导的k562细胞的控制。中间的伪彩色流式细胞图显示facs分选的pcdh-cs1-gfp慢病毒感染的k562细胞。第三个伪彩色流式细胞图显示facs分选的cs1(+)bcma(+)k562细胞。图17a-17d。(a)48小时的培养基。1a-未经修饰的t细胞、2a-evt细胞、3a-bsabt细胞、4a-bcmacart细胞和5a-bsab-cart细胞。cd3和nkg2d的流式细胞仪染色以观察cd3(+)群体(蓝色方框)、cd3(+)nkg2d(+)群体(红色方框)和cd3(+)nkg2d(-)群体(绿色方框)。(b)在第0天，将nkg2d阻断抗体(20μg/ml)加入(a)培养物中，并命名为1b、2b、3b、4b和5b。48小时后，对cd3和f(ab)2进行流式细胞术染色以观察细胞群。cd3(+)群体(蓝色方框)。(c)显示了来自(a)的48小时的培养基。在第0天，将cs1阻断抗体(20μg/ml)加入(a)培养物中，并命名为1c、2c、3c、4c和5c。48小时后，用抗cd3、抗f(ab)2、抗nkg2d和抗ki67染色细胞后进行流式细胞仪分析以观察细胞增殖。将细胞设门于cd3(+)上，并示出了cd3(+)nkg2d(+)群体(红色方框)、cd3(+)nkg2d(-)群体(绿色方框)。红色点流式细胞图显示nkg2d(+)fab(+)(上方三个)或nkg2d(+)fab(-)(下方两个)细胞的增殖。绿色点流式细胞图显示nkg2d(-)fab(+)(上方三个)或nkg2d(-)fab(-)(下方两个)细胞的增殖。fab表示针对car表达的抗f(ab)2染色。(d)将来自(a)中1a、2a、3a、4a和5a的细胞与mm.1s肿瘤细胞共培养48小时。用抗cd3抗体、抗f(ab)2抗体和抗nkg2d抗体对细胞染色后，进行流式细胞仪分析。fab表示f(ab)2染色，其指示car表达。图18提供对图7中的数据的补充数据。在图7中，显示了人类cd3t细胞百分比的3d直方图(第一列)。这些是原始的伪彩色流式细胞图。蓝色方框表示第-1天未注射t细胞的小鼠的人类cd3百分比(第一列)。橙色方框表示注射t细胞后一天在小鼠中的抗人cd3(+)细胞，并在用抗f(ab)2染色后通过流式细胞术分析检测到car表达(第二列、第三列)。黑色方框显示在注入工程化或对照人t细胞后第14天小鼠中的抗人cd3(+)细胞(第四列)。紫色方框显示在注入工程化或对照人t细胞后第35天小鼠中的抗人cd3(+)细胞(第五列)。cd3(+)人类细胞的统计分析如图7所示。图19a-19b显示了人类健康供体的pbmc中骨髓细胞耗尽的影响，以避免将其注射到nsg小鼠体内后的gvhd。(a)将ficoll-paqueplus分离的人pbmc染色。数字1表示淋巴细胞百分比，数字2表示粒细胞百分比，而数字3表示单核细胞百分比。在进行facs分选之前，对cd11c、cd14、cd33和cd66b进行染色以检查健康供体pbmc中骨髓细胞的百分比。(b)分选后，如上所述将cd11c、cd14、cd33和cd66b染色，显示伪彩色流式细胞图。图20提供了通过标准的4h-51cr释放测定法进行的人bsab-cart细胞对自体pbmc、t细胞、nk细胞和浆细胞的细胞毒性的评估。通过ficoll-paqueplus梯度离心分离pbmc。cd3(+)t细胞、cd56(+)nk细胞和cd19/20(+)浆细胞从pbmc进行了facs分选。evt细胞在细胞毒性试验中用作对照。图21a-21d。(a)受bsabbcma-car(bsab-cart)慢病毒感染的健康供体的初免t细胞的不同时间点(12h、24h、48h、72h和96h)。显示了bf(亮场)gfp(绿色)的相同视图。(b)使用抗his标签的免疫印迹以显示bsab-cart细胞的上清液中bsab的分泌。(c)bsab-cart慢病毒感染的初免t细胞的流式细胞仪染色。分选gfp阳性细胞，并用生物素标记的山羊抗小鼠fab特异性抗体或同种型匹配的对照抗体对细胞进行染色，然后进行链霉亲和素和cd3抗体染色。(d)将51cr标记的h929、rpmi-8226和k562靶细胞系(5×103)与未经修饰的t细胞(黑色实线)、空载体转导的t细胞(evt，黑色虚线)、或bsab-cart细胞(紫色线)以所示的e:t比率共培养4小时。测量了目标裂解(51cr释放)。bsab-cart与未经修饰的t或evt对比，**p<0.01，重复3次。bcma(-)cs1(-)阴性k562用作阴性对照靶细胞。详细描述应该理解，本公开不限于所描述的特定方面，因为它们当然可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而无意于进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限定。在整个本公开中，用阿拉伯数字引用了各种技术出版物。这些出版物的完整引用可以在权利要求书的前面找到，并通过引用并入本文。已经显示b细胞成熟抗原(bcma)和slamf7(cs1或cd319)都是出色的mm肿瘤抗原靶标，而nkg2d是极好的免疫细胞靶标。nkg2d(一种受体)几乎在所有溶细胞免疫细胞上表达，包括nk细胞、nkt细胞、cd8(+)t细胞和γδt细胞23。bcma是肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf17或cd269)的成员，是在浆细胞分化过程中被选择性诱导的，在幼稚和记忆b细胞中几乎不存在24,25。已经报道过表达抗bcma-car的t细胞的过继转移是治疗mm的有希望的新策略26-28。cs1是mm中另一个有吸引力的与肿瘤相关的靶抗原，因为cs1在mm细胞的表面上高度且普遍地表达29,30。cs1在nk细胞上和活化的cd8(+)t细胞的子集上低水平表达，但在髓样细胞和正常造血干细胞上几乎无法检测到31。针对cs1的治疗性单克隆抗体已被fda批准用于治疗mm32。申请人已发表的研究表明，向cs1重定向的t细胞或nk细胞的基因修饰增强了对骨髓瘤细胞的消灭作用29,30。最近的一项临床前研究表明，接受cs1cart细胞治疗的患者mm细胞被有效根除，而cs1表达水平较低的正常nk和t细胞未受到影响(gogishvili,2017blood.2017dec28；130(26):2838-2847.doi:10.1182/blood-2017-04-778423.epub2017oct31)。nkg2d是一种活化受体，如上所述在多种先天和适应性溶细胞中表达11,33。触发nkg2d可以导致先天和适应性细胞免疫的激活34。如本文所公开的，申请人对t细胞进行工程改造以(1)表达bcma特异性的第二代car，并且(2)同时分泌抗nkg2d-抗cs1bsab。这些数据表明，这些细胞(以下称为bsab-cart细胞)代表了复发和/或难治性mm的有前途的疗法，并且可能是生产下一代基于car的癌症免疫疗法的合适平台。car和基于抗nkg2d的双特异性抗体的这种组合作为转导到t细胞中的单一载体尚未在文献中描述。申请人已经证明，该方法产生t细胞(bsabcart细胞)，其充当针对肿瘤的有效的细胞溶解效应细胞。本文提供的是针对多发性骨髓瘤(mm)中众所周知的靶标(称为bcma)的t细胞car的代表性实例，并且基于抗nkg2d的双特异性抗体可识别引起该疾病的mm肿瘤抗原cs1，其使得它与任何带有nkg2d抗原的先天性或适应性溶细胞效应细胞紧密相邻。然而，本文考虑将互补的car和基于抗nkg2d的双特异性抗体的多种扩展到单个载体中，然后感染t和nk细胞以获得抗肿瘤功效。可以针对任何数量的本领域中已知的肿瘤抗原来修改该方法，例如egfrviii；cd70、间皮素、cd123、cd19、cea、cd133、her2，参见townsendetal.(2018)j.exp.&clinicalcancerres.37:163。如以下实施例所示，递送针对mm细胞上两种不同的肿瘤相关抗原的两种互补方式的单个载体优于单独的任一种方式，并且优于用两种分开的构建体(一种编码car，另一种编码基于抗nkg2d的双特异性抗体)依次感染的t细胞的应用。此外，当t细胞(感染了同时编码car和基于抗nkg2d的双特异性抗体的实验载体)遇到表达两种抗原的mm细胞时，bsabcart细胞通过nkg2d介导的活化在体外和体内均增殖并提高存活率。这样的结果是完全出乎意料的。总之，申请人构建了还分泌抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体的bcmacart细胞；这些细胞有效靶向bcma(+)和/或cs1(+)多发性骨髓瘤(mm)细胞。bcmacart细胞分泌抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体可通过nkg2d介导的激活增强体外cart细胞增殖以及体内cart细胞存活和增殖。与仅使用bcmacart或使用分泌抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体的t细胞的单一疗法相比，分泌抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体的bcmacart细胞在体内和体外表现出明显更好的针对肿瘤细胞靶点的功效。这些结果可以推广到以相同方式使用的各种car。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与该技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本技术的实践或测试中，但是现在描述优选的方法、装置和材料。本文引用的所有技术和专利出版物均通过引用全文并入本文。本文中的任何内容均不应解释为承认本技术无权借助在先发明而早于这种公开。除非另有说明，否则本技术的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。参见例如greenandsambrookeds.(2012)molecularcloning:alaboratorymanual，第四版；ausubeletal.eds.(2015)currentprotocolsinmolecularbiology系列；methodsinenzymology(academicpress,inc.,n.y.)系列；macphersonetal.(2015)pcr1:apracticalapproach(irlpressatoxforduniversitypress)；macphersonetal.(1995)pcr2:apracticalapproach；mcphersonetal.(2006)pcr:thebasics(garlandscience)；harlowandlaneeds.(1999)antibodies,alaboratorymanual；greenfielded.(2014)antibodies,alaboratorymanual；freshney(2010)cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique，第六版；gaited.(1984)oligonucleotidesynthesis；美国专利号4,683,195；hamesandhigginseds.(1984)nucleicacidhybridization；anderson(1999)nucleicacidhybridization；herdewijned.(2005)oligonucleotidesynthesis:methodsandapplications；hamesandhigginseds.(1984)transcriptionandtranslation；buzdinandlukyanoved.(2007)nucleicacidshybridization:modernapplications；immobilizedcellsandenzymes(irlpress(1986))；grandied.(2007)invitrotranscriptionandtranslationprotocols，第二版；guisaned.(2006)immobilizationofenzymesandcells；perbal(1988)apracticalguidetomolecularcloning，第二版；millerandcaloseds,(1987)genetransfervectorsformammaliancells(coldspringharborlaboratory)；makridesed.(2003)genetransferandexpressioninmammaliancells；mayerandwalkereds.(1987)immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(academicpress,london)；lundbladandmacdonaldeds.(2010)handbookofbiochemistryandmolecularbiology，第四版；以及herzenbergetal.eds(1996)weir'shandbookofexperimentalimmunology，第五版；以及可在提交时获得的每个版本的最新版本。所有数值(包括范围)，例如ph、温度、时间、浓度和分子量，都是近似值，适当时可上(+)或下(-)浮动1.0或0.1，或者变化+/-15％、或者10％、或者5％、或者2％。应当理解，尽管并不总是明确指出，但所有数值之前均带有术语“约”。还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，其等效物是本领域已知的。不需明确指出，除非另有说明，否则推定当本发明涉及多肽、蛋白质、多核苷酸或抗体时，它们的等效物或生物等效物也预期在本发明的范围内。定义如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。如本文所用的，术语“动物”表示活的多细胞脊椎动物生物，是包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人类哺乳动物和非人类哺乳动物。术语“受试者/对象”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指人类和兽医学对象，例如人类、动物、非人类灵长类动物、狗、猫、羊、鼠、马和牛。在一些实施方案中，所述对象是人类。如本文所用，术语“抗体”统一指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括但不限于，例如iga、igd、ige、igg和igm、其组合，以及在任何脊椎动物中在免疫过程期间产生的类似分子，所述脊椎动物例如是哺乳动物(例如人、山羊、兔和小鼠)以及非哺乳动物物种(例如鲨鱼免疫球蛋白)。除非另有特别说明，否则术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”，它们与目标分子(或一组高度相似的目标分子)特异性结合至实质上排除与其他分子结合(例如，抗体和抗体片段与目标分子的结合常数比与生物样品中的其他分子的结合常数大至少103m-1、至少104m-1或至少105m-1)。术语“抗体”还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如鼠或人源化的非灵长类抗体)、异源偶联抗体(例如双特异性抗体)。还参见piercecatalogandhandbook,1994-1995(piercechemicalco.,rockford,ill.)；owenetal.,kubyimmunology,7thed.,w.h.freeman&co.,2013；murphy,janeway’simmunobiology,8thed.,garlandscience,2014；maleetal.,immunology(roitt),8thed.,saunders,2012；parham,theimmunesystem,4thed.,garlandscience,2014。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由b淋巴细胞的单个克隆或由已经转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。就抗体结构而言，免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(h)链和轻(l)链。存在两种类型的轻链：λ和κ。存在决定抗体分子的功能活性的五种主要的重链类型(或同种型)：igm、igd、igg、iga和ige。每个重链和轻链都包括恒定区域和可变区域(所述区域也被称为“结构域”)。结合起来，重链和轻链可变区域特异性地结合抗原。重链和轻链可变区域包括被三个高度可变区域打断的“框架”区域，所述高度可变区域也被称为“互补决定区域”或“cdr”。框架区域和cdr的范围已经被确定(参见kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1991，其以引用的方式合并入本文中)。kabat数据库现在在线维护。不同的轻链或重链的框架区域的序列在物种之内是相对保守的。抗体的框架区域，即组成的轻链和重链的结合的框架区域，主要采用β折叠构象，而cdr形成环，该环连接所述β折叠结构或者在一些情况中形成所述β折叠的一部分。因此，框架区域作用来形成支架，其用来通过互链、非共价相互作用将cdr定位在正确的朝向中。cdr主要负责结合至抗原的表位。每个链的cdr通常被称为cdr1、cdr2和cdr3，这是从n末端开始依次进行编号，并且也通常由该特定的cdr所位于的链而确定(重链区域标记为cdhr而轻链区域标记为cdlr)。因此，cdhr3是来自位于发现其的抗体的重链的可变结构域的cdr3，而cdlr1是来自发现其的抗体的轻链的可变结构域的cdr1。例如，tnt抗体将具有对tnt相关抗原独特的特异性的vh区域和vl区域序列，并因此具有特异性的cdr序列。具有不同的特异性(即对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的cdr。虽然抗体与抗体之间不同的是cdr，但是在cdr之内只有数量有限的氨基酸位置直接涉及抗原结合。在cdr之内的这些位置被称为特异性决定残基(sdr)。如本文使用的，术语“抗原”是指可以被特异性的体液或细胞免疫的产物(例如抗体分子或t细胞受体)特异性地结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子(例如复合碳水化合物(例如多糖))、磷脂和蛋白质。常见的抗原的类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、涉及自身免疫性疾病的抗原、过敏和移植物排斥、毒素和其他杂项抗原。如本文使用的，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性地结合至抗原靶标的任何蛋白或多肽结构域。如本文使用的，术语“自体同源的”在涉及细胞时是指，被分离并且被灌注回相同的对象(受体或宿主)的细胞。“同种异体的”是指非自体同源的细胞。如本文使用的，术语“b细胞”是指在适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。b细胞主要作用来制造抗体、用作抗原呈递细胞、释放细胞因子、以及在抗原相互作用引起的刺激之后开发记忆b细胞。b细胞与其他淋巴细胞(例如t细胞)的不同点在于细胞表面上存在b细胞受体。b细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业上可获得的b细胞系的非限制性例子包括ahh-1(crl-8146tm)、bc-1(crl-2230tm)、bc-2(crl-2231tm)、bc-3(crl-2277tm)、ca46(crl-1648tm)、dg-75[d.g.-75](crl-2625tm)、ds-1(crl-11102tm)、eb-3[eb3](ccl-85tm)、z-138(atcc#crl-3001)、db(atcccrl-2289)、toledo(atcccrl-2631)、pfiffer(atcccrl-2632)、sr(atcccrl-2262)、jm-1(atcccrl-10421)、nfs-5c-1(atcccrl-1693)；nfs-70c10(atcccrl-1694)、nfs-25c-3(atcccrl-1695)、以及sup-b15(atcccrl-1929)细胞系。进一步的例子包括但不限于衍生自间变性和大细胞淋巴瘤的细胞系，例如del、dl-40、fe-pd、jb6,karpas299、ki-jk、mac-2aply1、sr-786、su-dhl-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、dohh-2、nu-dhl-1、u-937、granda519、usc-dhl-1、rl；霍奇金淋巴瘤，例如dev、hd-70、hdlm-2、hd-myz、hkb-1、km-h2、l428、l540、l1236、sbh-1、sup-hd1、su/rh-hd-l。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括americantypeculturecollection或atcc(http://www.atcc.org/)以及germancollectionofmicroorganismsandcellcultures(https://www.dsmz.de/)。如本文使用的，“癌症”是特征在于对象中存在表现出异常的不受控制的复制的细胞的疾病状态，并且在某些方面，该术语可以与术语“肿瘤”互换使用。术语“癌症或肿瘤抗原”是指已知与癌细胞或肿瘤细胞或组织相关并在表面上表达的抗原，术语“癌症或肿瘤靶向抗体”是指靶向这种抗原的抗体。如本文使用的，术语“嵌合抗原受体”(car)是指这样的融合蛋白，其包括能够结合至抗原的细胞外结构域、衍生自与该细胞外结构域衍生自的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个细胞内结构域。“嵌合抗原受体(car)”有时被称为“嵌合受体”、“t-体(t-body)”或“嵌合免疫受体(cir)”。“能够结合至抗原的细胞外结构域”是指能够结合至某个抗原的任何寡肽或多肽。“细胞内结构域”或“细胞内信号传导结构域”是指已知用作发送信号来引起细胞内的生物过程的激活或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。在一些实施方式中，除了主信号传导结构域之外，细胞内结构域可以包括一个或多个共刺激信号传导结构域、或基本上由其组成、或由其组成。“跨膜结构域”是指已知跨越细胞膜并且能够作用来连接细胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合抗原受体可以任选地包括“铰链(hinge)结构域”，其用作细胞外结构域和跨膜结构域之间的接头。本文提供了其非限制性的例子，例如：铰链结构域：igg1重链铰链编码序列：ctcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccg如本领域中已知的，另外的非限制性实例包括igg4铰链区、igd和cd8结构域。跨膜结构域：cd28跨膜区域编码序列：ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg细胞内结构域：4-1bb共刺激信号传导区域编码序列：aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg细胞内结构域：cd28共刺激信号传导区域编码序列：aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc细胞内结构域：cd3ζ信号传导区域编码序列：agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。每个示例性域组分的其他实施方案包括具有相似生物学功能的其他蛋白质，其与由以上公开的核酸序列编码的蛋白质具有至少70％或至少80％的氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性。此外，本文提供了此类结构域的非限制性实例。如本文使用的，术语“cd8α铰链结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd8α铰链结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在pinto,r.d.etal.(2006)vet.immunol.immunopathol.110:169-177中提供了人类、小鼠和其他物种的cd8α铰链结构域的示例性序列。在pinto,r.d.etal.(2006)vet.immunol.immunopathol.110:169-177中提供了与cd8α铰链结构域相关的序列。其非限制性的例子包括：人类cd8α铰链结构域：pakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiy小鼠cd8α铰链结构域：kvnstttkpvlrtpspvhptgtsqpqrpedcrprgsvkgtgldfacdiy猫cd8α铰链结构域：pvkptttpaprpptqapittsqrvslrpgtcqpsagstveasgldlscdiy。如本文使用的，术语“cd8α跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd8α跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与人类t细胞表面糖蛋白cd8α链的183至203位氨基酸(genbank登录号：np_001759.3)、或者小鼠t细胞表面糖蛋白cd8α链的197至217位氨基酸(genbank登录号：np_001074579.1)、以及大鼠t细胞表面糖蛋白cd8α链的190至210位氨基酸(genbank登录号：np_113726.1)相关的片段序列，提供了cd8α跨膜结构域的其他的示例性序列。与列出的ncbi的每一个相关的序列提供如下：人类cd8α跨膜结构域：iyiwaplagtcgvlllslvit小鼠cd8α跨膜结构域：iwaplagicvalllsliitli大鼠cd8α跨膜结构域：iwaplagicavlllslvitli。如本文使用的，术语“cd28跨膜结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd28跨膜结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。与genbank登录号xm_006712862.2和xm_009444056.1相关的片段序列，提供了cd28跨膜结构域的其他的非限制性的示例性序列。本文提供了与每个列出的登录号相关的序列。如本文使用的，术语“4-1bb共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的4-1bb共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号20130266551a1(作为美国申请号us13/826,258提交)中提供了4-1bb共刺激信号传导区域的示例性序列，例如下面提供的示例性序列：4-1bb共刺激信号传导区域：krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel。如本文使用的，术语“cd28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd28共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；geiger,t.l.etal.,blood98:2364-2371(2001)；hombach,a.etal.,jimmunol167:6123-6131(2001)；maher,j.etal.natbiotechnol20:70-75(2002)；haynes,n.m.etal.,jimmunol169:5780-5786(2002)；haynes,n.m.etal.,blood100:3155-3163(2002)中提供了示例性的cd28共刺激信号传导区域。非限制性的例子包括以下cd28序列的114-220残基：mlrlllalnlfpsiqvtgnkilvkqspmlvaydnavnlsckysynlfsrefraslhkgldsavevcvvygnysqqlqvysktgfncdgklgnesvtfylqnlyvnqtdiyfckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs；及其等效物。如本文使用的，术语“icos共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的icos共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2015/0017141a1中提供了icos共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列。示例性的多核苷酸序列提供如下：icos共刺激信号传导区域编码序列：acaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcagtgaacacagccaaaaaatccagactcacagatgtgacccta。如本文使用的，术语“ox40共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的ox40共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国公开号2012/20148552a1中公开了ox40共刺激信号传导区域的非限制性的示例性序列，其包括以下提供的示例性序列。ox40共刺激信号传导区域编码序列：agggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatc及其等效物。如本文使用的，术语“cd28共刺激信号传导区域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd28共刺激信号传导区域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国专利号5,686,281；geiger,t.l.etal.(2001)blood98:2364-2371；hombach,a.etal.(2001)jimmunol.167:6123-6131；maher,j.etal.(2002)natbiotechnol.20:70-75；haynes,n.m.etal.(2002)jimmunol.169:5780-5786；haynes,n.m.etal.(2002)blood100:3155-3163中提供了示例性的cd28共刺激信号传导结构域序列。非限制性实例包括下面的残基114-220和编码的序列：cd28序列：mlrlllalnlfpsiqvtgnkilvkqspmlvaydnavnlsckysynlfsrefraslhkgldsavevcvvygnysqqlqvysktgfncdgklgnesvtfylqnlyvnqtdiyfckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs及其等效物。如本文使用的，术语“cd3ζ信号传导结构域”是指与该名称相关的特定的蛋白片段，以及与本文所示的cd3ζ信号传导结构域序列具有至少70％、或替代地至少80％氨基酸序列同一性、优选90％序列同一性、更优选至少95％序列同一性的具有类似的生物功能的任何其他分子。在美国申请号us13/826,258中提供了cd3ζ信号传导结构域的非限制性示例序列，例如：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。如本文所用，术语nkg2d是指最近引起极大关注的活化受体。已经鉴定出许多nkg2d靶配体。这些中最引人注目的是一对紧密相关的蛋白质，称为mica和micb(主要组织相容性复合物(mhc)i类链相关)。如本文所用，术语ulbp是指eul16结合蛋白家族的成员。“组合物”通常是指活性剂(例如化合物或组合物)和天然存在或非天然存在的载体的组合，所述载体是惰性的，例如可检测试剂或标签，或者是活性的，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等，并且包括药学上可接受的载体。载体还包括药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二寡糖、三寡糖、四寡糖和寡糖；衍生的糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存在，以重量或体积计单独地或组合地包括1-99.99％。示例性的蛋白赋形剂包括血清白蛋白(例如人血清白蛋白(hsa)、重组人白蛋白(rha))、明胶、酪蛋白等。还具有缓冲能力的代表性的氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也旨在位于本技术的范围之内，其例子包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡萄糖醇)和肌醇。如本文使用的，术语“包括/包含/含有”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素。“基本上由……组成”当被用来定义组合物和方法时，应该表示排除对于预期用途的组合来说具有任何实质性作用的其他元素。例如，如本文定义的基本上由该元素组成的组合物，将不会从分离和纯化方法和药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等)中排除微量污染物。“由……组成”应该表示排除多于微量元素的其他成分和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。通过这些过渡性术语的每一个进行定义的方面都在本发明的范围之内。如本文所用，术语“共有序列”是指这样的氨基酸或核酸序列，其是通过比对一系列多个序列而确定的，并定义了代表在多个序列的每个对应位置的主要氨基酸或碱基选择的理想序列。取决于一系列多个序列的序列，该系列的共有序列可以与每个序列相差零个、一个、几个或多个取代。而且，取决于一系列多个序列的序列，可以为该系列确定一个以上的共有序列。共有序列的产生已经过深入的数学分析。各种软件程序可用于确定共有序列。如本文所用，术语“crispr”是指依赖于聚集的规则间隔的短回文重复途径的序列特异性遗传操作技术。crispr可用于执行基因编辑和/或基因调节，以及简单地将蛋白质靶向特定的基因组位置。基因编辑是指一种基因工程，其中通过将缺失、插入或碱基取代引入多核苷酸序列来改变靶多核苷酸的核苷酸序列。在某些方面，crispr介导的基因编辑利用非同源末端连接(nhej)或同源重组的途径进行编辑。基因调节是指增加或减少特定基因产物(例如蛋白质或rna)的产生。如本文所用，术语“grna”或“指导rna”是指用于靶向特定基因以利用crispr技术进行校正的指导rna序列。设计用于靶标特异性的grna和供体治疗性多核苷酸的技术是本领域众所周知的。例如，doench,j.,etal.naturebiotechnology2014；32(12):1262-7,mohr,s.etal.(2016)febsjournal283:3232-38和graham,d.,etal.genomebiol.2015；16:260。grna包含以下多核苷酸、或基本上由其组成、或由其组成：融合多核苷酸，其包含crisprrna(crrna)和反式激活cripsprrna(tracrrna)；或多核苷酸，其包含crisprrna(crrna)和反式激活cripsprrna(tracrrna)。在一些方面，grna是合成的(kelley,m.etal.(2016)jofbiotechnology233(2016)74-83)。如本文所用，grna的生物学等效物包括但不限于可以将cas9或其等效物引导至特定核苷酸序列(例如细胞基因组的特定区域)的多核苷酸或靶向分子。如本文所用，“细胞还原疗法”包括但不限于化学疗法、冷冻疗法和放射疗法。起到减少细胞增殖作用的试剂是本领域已知的并且被广泛使用。仅在其分裂时杀死癌细胞的化学疗法药物称为细胞周期特异性。这些药物包括在s期起作用的药物，包括拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(拓扑异构酶i和ii)的作用的药物。在化学治疗过程中，拓扑异构酶控制复制所需的dna结构的操纵，因此具有细胞周期特异性。拓扑异构酶i抑制剂的实例包括上面列出的喜树碱类似物、伊立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan)。拓扑异构酶ii抑制剂的例子包括安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷磷酸酯和替尼泊苷(teniposide)。抗代谢物通常是正常代谢底物的类似物，通常会干扰染色体复制过程。它们在周期的非常特定的阶段攻击细胞。抗代谢药物包括：叶酸拮抗剂，例如甲氨蝶呤；嘧啶拮抗剂，例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷(foxuridine)、阿糖胞苷、卡培他滨(capecitabine)和吉西他滨(gemcitabine)；嘌呤拮抗剂，例如6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤；腺苷脱氨酶抑制剂，例如克拉屈滨(cladribine)、氟达拉滨(fludarabine)、奈拉拉滨(nelarabine)和喷司他丁(pentostatin)；等等。植物生物碱衍生自某些类型的植物。长春花生物碱由长春花植物(catharanthusrosea)制成。紫杉烷由太平洋紫杉树(taxus)的树皮制成。长春花生物碱和紫杉烷类也被称为抗微管剂。鬼臼毒素来自五月苹果植物。喜树碱类似物源自亚洲的“快乐树”(camptothecaacuminata)。鬼臼毒素和喜树碱类似物也被分类为拓扑异构酶抑制剂。植物生物碱通常是细胞周期特异性的。这些试剂的实例包括长春花生物碱，例如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)和长春瑞滨(vinorelbine)；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；鬼臼毒素，例如依托泊苷和替尼索德(tenisopide)；以及喜树碱类似物，例如伊立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan)。冷冻疗法包括但不限于涉及降低温度的疗法，例如低温疗法。辐射疗法包括但不限于暴露于辐射，例如本领域已知的辐射，例如电离辐射、uv辐射。示例性剂量包括但不限于至少约2gy至不超过约10gy的电离辐射剂量和/或至少约5j/m2至不大于约50j/m2(通常约10j/m2)的紫外辐射剂量。如本文使用的，术语“可检测的标记物”是指能够直接或间接制造可检测的信号的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括酶，其例如通过比色、荧光、发光制造可检测的信号，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、发色团(例如荧光剂、发光染料)、带有通过电子显微镜或通过其电性质(例如电导率、电流分析、伏安法、阻抗)检测的电子密度的基团、可检测的基团，例如其分子具有足够的大小来诱导其物理和/或化学性质上的可检测的修饰，这样的检测可以通过任选的方法完成，例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化或物理方法(例如原子力谱、隧道效应)、或放射性分子(例如32p、35s或125i)。“有效量”是指该量的试剂或合并的量的两种或多种试剂在被施用来治疗哺乳动物或其他对象时，足以影响对疾病的这种治疗。“有效量”将会根据试剂、疾病及其严重程度和要被治疗的对象的年龄、体重等而发生变化。术语“编码”在被应用至核酸序列时是指，被陈述来“编码”多肽的多核苷酸，以其天然状态或者在通过本领域技术人员熟知的方法操纵时，可以被转录和/或翻译来产生用于该多肽和/或其片段的mrna。反义链是这样的核酸的互补序列，并且编码序列可以由此导出。如本文使用的，术语“增强子”是指不管其相对于要被表达的氨基酸序列的位置和朝向，都增强、改善或改良氨基酸序列的转录的序列元件。增强子可以增强来自单一启动子的转录，或者同时增强来自一个以上的启动子的转录。只要保留或基本上保留该改善转录的功能(例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的野生型活性，即全长序列的活性)，则野生型增强子序列的任何截断的、突变的或修饰的变体都同样在上述定义之内。在一个方面，术语抗体的“等效物”或“生物等效物”表示抗体如通过elisa或其他合适的方法测定地选择性地结合其表位蛋白或其片段的能力。生物等效的抗体包括但不限于与参照抗体结合至相同的表位的抗体、肽、抗体片段、抗体变体、抗体衍生物和抗体模拟物。在没有明确描述的情况下应该推断、并且除非另有说明，否则当本技术涉及多肽、蛋白、多核苷酸或抗体时，这样的等效物或生物等效物旨在落入本技术的范围之内。如本文使用的，在指示参考蛋白、抗体、多肽或核苷酸时，术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”是同义的，是指具有最小的同源性，同时仍然保持期望的结构或功能。除非本文具体说明，否则可以预期的是，本文提及的任何多核苷酸、多肽或蛋白还包括其等效物。例如，等效物是指与参照蛋白、多肽或核苷酸具有至少约70％同源性或同一性、或至少80％同源性或同一性和替代地、或至少约85％、或替代地至少约90％、或替代地至少约95％、或替代地98％百分比同源性或同一性并且表现出基本上等效的生物活性。替代地，当指示多核苷酸时，其等效物是在严格条件下与参照多核苷酸或其互补序列杂交的多核苷酸。多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”是指，当被对齐时，该百分比的碱基(或氨基酸)在两个序列的比较中是相同的。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.1987)supplement30,section7.7.18,table7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是blast，使用默认参数。特别地，优选的程序是blastn和blastp，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序＝highscore；数据库＝不重复的，genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast。如本文使用的，术语“表达”是指多核苷酸被转录成mrna的过程和/或被转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白的过程。如果多核苷酸衍生自基因组dna，则表达可以包括mrna在真核细胞中的剪接。可以通过测量细胞或组织样品中mrna或蛋白的量确定基因的表达水平。在一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以直接与来自对照或参照样品的基因的表达水平进行比较。在另一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以在施用化合物之后直接与来自相同样品的该基因的表达水平进行比较。短语“一线”或“二线”或“三线”是指患者接受的治疗的顺序。一线治疗方案是首先给出的治疗，而二线或三线疗法是分别在一线疗法之后或在二线疗法之后给出的。美国国家癌症研究所将一线疗法定义为“用于疾病或病症的第一治疗”。在患有癌症的患者中，主要的治疗可以是手术、化疗、放射治疗或这些疗法的组合。一线疗法还被本领域技术人员称为“主要疗法和主要治疗”。参见美国国家癌症研究所的网站www.cancer.gov，最后一次访问是在2008年5月1日。通常，患者被给予后续的化疗方案，因为患者对一线疗法没有显示出阳性的临床或亚临床反应，或者一线疗法已经停止。如本文使用的，当被用在两个或更多个核酸或多肽序列的内容中时，“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比是指，两个或更多个序列或子序列是相同的，或者在特定的区域(例如编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列)上特定百分比的核苷酸或氨基酸残基是相同的，例如至少60％同一性、优选地至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。可以通过比较为了进行比较而被对齐的每个序列中的位置，确定同源性。当被比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则这些分子在该位置是同源的。序列之间的同源性的程度是这些序列享有的匹配的或同源的位置的数目的函数。可以使用本领域已知的软件程序来确定对齐和同源性或序列同一性百分比，例如在currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.1987)supplement30,section7.7.18,table7.7.1中描述的软件程序。优选地，使用默认参数进行对齐。优选的对齐程序是blast，使用默认参数。特别地，优选的程序是blastn和blastp，使用以下默认参数：遗传密码＝标准；筛选＝无；链＝两个；截点＝60；预期＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序＝highscore；数据库＝不重复的，genbank+embl+ddbj+pdb+genbankcdstranslations+swissprotein+spupdate+pir。这些程序的详情可以在以下网址找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/blast。术语“同源性”或“相同的”、“同一性”或“相似性”百分比还表示、或者可以被应用至测试序列的互补序列。所述术语还包括具有缺失和/或添加、以及具有取代基的序列。如本文描述的，优选的算法可以解释间隙等。优选地，在长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上、或者更优选地在长度至少为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的序列中的一个享有少于40％的同一性、或者替代地少于25％的同一性。“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应来形成复合物，并且该复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键结合而被稳定的反应。可以通过watson-crick碱基配对、hoogstein结合或通过任何其他序列特异性的方式来发生氢键结合。所述复合物可以包括形成双螺旋结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单一的自我杂交的链、或这些的任何组合。杂交反应可以由在更广泛的过程中的步骤组成，例如pcr过程的起始步骤、或者通过核酶进行的多核苷酸的酶裂解步骤。严格杂交条件的例子包括：约25℃至约37℃的孵育温度；约6xssc至约10xssc的杂交缓冲液浓度；约0％至约25％的甲酰胺浓度；以及约4xssc至约8xssc的洗涤溶液。中度杂交条件的例子包括：约40℃至约50℃的孵育温度；约9xssc至约2xssc的缓冲液浓度；约30％至约50％的甲酰胺浓度；以及约5xssc至约2xssc的洗涤溶液。高严格杂交条件的例子包括：约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc至约0.1xssc的洗涤溶液、或去离子水。一般来说，杂交孵育时间为5分钟至24小时，具有1、2、或更多个洗涤步骤，并且洗涤孵育时间为约1、2或15分钟。ssc是0.15mnacl和15mm柠檬酸缓冲液。应该理解的是，可以采用使用其他缓冲系统的ssc的等效物。如本文使用的，术语“分离的”是指，分子或生物体或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指，核酸(例如dna或rna)或蛋白或多肽(例如抗体或其衍生物)或细胞或细胞器、或组织或器官与存在于自然来源中的其他dna或rna、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离。术语“分离的”还指，核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料、或培养基(当通过重组dna技术生产时)、或化学前体或其他化学品(当化学合成时)。再者，“分离的核酸”旨在包括天然地不形成为片段并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞蛋白分离的多肽，并且旨在包括纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中还被用来指从其他细胞分离的细胞或组织，并且旨在包括培养的和工程化的细胞或组织。如本文使用的，术语“分离的细胞”通常是指细胞基本上和组织的其他细胞分离。“免疫细胞”包括衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(hsc)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞)和骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。如本文使用的，术语“接头序列”是指任何这样的氨基酸序列，其包括可以被重复1至10、或替代地至约8、或替代地至约6、或替代地约5、或4或替代地3、或替代地2次的1至10个、或替代地8个氨基酸、或替代地6个氨基酸、或替代地5个氨基酸。例如，接头可以包括由重复三次的五肽组成的多达15个氨基酸残基。在一个方面，接头序列是包括gly-gly-gly-gly-ser的三个拷贝的(甘氨酸4丝氨酸)3柔性多肽接头。“对应于肿瘤组织类型的正常细胞”是指来自与肿瘤组织相同组织类型的正常细胞。非限制性实例是患有肺肿瘤的患者的正常肺细胞、或患有结肠肿瘤的患者的正常结肠细胞。如本文使用的，术语“t细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。t细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞(例如b细胞)的不同点在于细胞表面上存在t细胞受体。t细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。“t细胞”包括表达cd3的所有类型的免疫细胞，包括t辅助细胞(cd4+细胞)、细胞毒性t细胞(cd8+细胞)、自然杀伤t细胞、t调节细胞(treg)和γ-δt细胞。“细胞毒性细胞”包括cd8+t细胞、自然杀伤(nk)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。商业上可获得的t细胞系的非限制性例子包括bcl2(aaa)jurkat(crl-2902tm)、bcl2(s70a)jurkat(crl-2900tm)、bcl2(s87a)jurkat(crl-2901tm)、bcl2jurkat(crl-2899tm)、neojurkat(crl-2898tm)、tall-104细胞毒性人类t细胞系(atcc#crl-11386)细胞系。进一步的例子包括但不限于成熟的t细胞系，例如deglis、ebt-8、hpb-mlp-w、hut78、hut102、karpas384、ki225、my-la、se-ax、skw-3、smz-1和t34；以及未成熟的t细胞系，例如all-sil、be13、ccrf-cem、cml-t1、dnd-41、du.528、eu-9、hd-mar、hpb-all、h-sb2、ht-1、jk-t1、jurkat、karpas45、ke-37、kopt-k1、k-t1、l-kaw、loucy、mat、molt-1、molt3、molt-4、molt13、molt-16、mt-1、mt-all、p12/ichikawa、peer、per0117、per-255、pf-382、pfi-285、rpmi-8402、st-4、sup-t1至t14、tall-1、tall-101、tall-103/2、tall-104、tall-105、tall-106、tall-107、tall-197、tk-6、tlbr-1、-2、-3和-4、ccrf-hsb-2(ccl-120.1)、j.rt3-t3.5(atcctib-153)、j45.01(atcccrl-1990)、j.cam1.6(atcccrl-2063)、rs4；11(atcccrl-1873)、ccrf-cem(atcccrm-ccl-119)；以及皮肤t细胞淋巴瘤细胞系，例如hut78(atcccrm-tib-161)、mj[g11](atcccrl-8294)、hut102(atcctib-162)。无白血病(nullleukemia)细胞系，包括但不限于reh、nall-1、km-3、l92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如k562红白血病、thp-1单核细胞白血病、u937淋巴瘤、hel红白血病、hl60白血病、hmc-1白血病、kg-1白血病、u266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括americantypeculturecollection或atcc(http://www.atcc.org/)以及germancollectionofmicroorganismsandcellcultures(https://www.dsmz.de/)。如本文使用的，术语“nk细胞”(也被称为自然杀伤细胞)是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。nk细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。nk细胞可以是被分离的，也可以从商业上可获得的来源得到。商业性的nk细胞系的非限制性例子包括nk-92(crl-2407tm)、nk-92mi(crl-2408tm)细胞系。进一步的例子包括但不限于hank1、khyg-1、nkl、nk-ys、noi-90和ytnk细胞系。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括americantypeculturecollection或atcc(http://www.atcc.org/)以及germancollectionofmicroorganismsandcellcultures(https://www.dsmz.de/)。如本文所用，涉及调节性多核苷酸，术语“可操作地连接”是指调节性多核苷酸和其所连接的多核苷酸序列之间的连接，使得当特定蛋白质结合至调节性多核苷酸时，连接的多核苷酸被转录。如本文所用，相对于细胞、组织或器官的术语“过表达”表达蛋白质的量大于对照细胞、对照组织或器官中产生的量。过表达的蛋白质可以是宿主细胞内源的或宿主细胞外源的。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”被可互换地使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构并且可以进行已知或未知的任何作用。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(例如探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、rnai、核酶、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的dna、分离的任何序列的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以被施加在多核苷酸的组装之前或之前。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合之后被进一步修饰，例如与标签组分偶联。该术语还指双链分子和单链分子。除非另有说明或者需要，否则本技术的涉及多核苷酸任何方面都包括双链形式以及已知或预测形成双链形式的两个互补的单链形式中的每一个。如本文使用的，术语“核酸序列”和“多核苷酸”被可互换地使用来指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、dna基因组、cdna、dna-rna杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学的或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。如本文使用的，术语“启动子”是指调节编码序列(例如基因)的表达的任何序列。启动子可以例如是组成型的、可诱导的、可抑制的或组织特异性的。“启动子”是这样的控制序列，它是多核苷酸序列的一个区域，在此控制转录的起始和速率。它可以包括遗传性元件，在此调节蛋白和分子可以结合例如rna聚合酶和其他转录因子。启动子的非限制性实例包括ef1α启动子和cmv启动子。ef1α序列是本领域已知的(参见，例如addgene.org/11154/sequences/；ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/j04617，每个最后访问于2019年3月13日，以及zhengandbaum(2014)int’l.j.med.sci.11(5):404-408)。cmv启动子序列是本领域已知的(参见，例如，snapgene.com/resources/plasmid-files/？set＝basic_cloning_vectors&plasmid＝cmv_promoter，最后于2019年3月13日访问，以及zhengandbaum(2014)，同上)。术语“蛋白”、“肽”和“多肽”被可互换地使用，并且以其最广泛的意义来指两个或更多个氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物子单元的化合物。所述子单元可以通过肽键而被连接。在另一个方面，所述子单元可以通过其他键(例如酯键、醚键等)而被连接。蛋白或肽必须包括至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。如本文使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及d和l光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。如本文使用的，术语“纯化的”不要求绝对的纯度；相反，它旨在作为相对性的的术语。因此，例如，纯化的核酸、肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物是整体地或部分地与蛋白或其他污染物分离的。通常，用于在本发明中使用的基本上纯化的肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物，在该肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收促进剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其它辅助成分在用于治疗性给药的完整的药物制剂中混合或制备之前，包括多于80％的存在于制剂中的所有大分子物种。更一般地，在与其他制剂成分混合之前，所述肽、蛋白、生物复合物或其他活性化合物被纯化，以代表大于90％、通常大于95％的存在于纯化制剂中的所有大分子物种。在其他情况中，纯化制剂可以是基本上均质的，其中其他大分子物种不能通过常规技术而被检测到。如本发明使用的，术语“纯化标记物”是指可用于纯化或鉴定的至少一个标记物。该标记物的非穷举性的列表包括his、lacz、gst、麦芽糖结合蛋白、nusa、bccp、c-myc、cam、flag、gfp、yfp、樱桃、硫氧还蛋白、聚(nanp)、v5，snap、ha、几丁质结合蛋白、softag1、softag3、strep或s蛋白。合适的直接或间接荧光标记物包括flag、gfp、yfp、rfp、dtomato、樱桃、cy3、cy5、cy5.5、cy7、dnp、amca、生物素、地高辛、tamra、得克萨斯红、罗丹明、alexa荧光、fitc、tritc或任何其他荧光染料或半抗原。如本文使用的，术语“重组蛋白”是指通过重组dna技术制造的多肽，其中通常编码该多肽的dna被插入进合适的表达载体，该表达载体被用来转化宿主细胞以产生异源蛋白。如本文使用的，术语“特异性结合”是指抗体和抗原之间的接触具有的结合亲和力为至少10-6m。在一些方面，抗体结合具有的亲和力为至少约10-7m，并且优选10-8m、10-9m、10-10m、10-11m或10-12m。“实体肿瘤”是通常不包括囊肿或液体区域的异常的组织块。实体肿瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们的细胞的类型命名。实体肿瘤的例子包括肉瘤、癌和淋巴瘤。如本文所用，术语“自杀基因”是能够诱导细胞凋亡的基因；非限制性实例包括hsv-tk(单纯疱疹病毒胸苷激酶)、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、羧酸酯酶、细胞色素p450或pnp(嘌呤核苷磷酸化酶)、截短的egfr、或诱导型胱天蛋白酶(“icasp”)。自杀基因可能沿多种途径起作用，并且在某些情况下，可以由诱导剂(例如小分子)诱导。例如，icasp自杀基因包括与优化地结合诱导剂的蛋白质可操作地连接的半胱天冬酶蛋白质的一部分；将诱导剂引入包含自杀基因的细胞中导致胱天蛋白酶的活化和随后所述细胞的凋亡。术语“转导”在其被应用至生产嵌合抗原受体细胞时是指，外来核酸序列被引入细胞中的过程。在一些实施方式中，该转导是通过载体完成的。如本文使用的，“治疗”在对象中的疾病是指(1)防止症状或疾病在预先有倾向的或尚未显示疾病症状的对象中发生；(2)抑制疾病或阻止其发展；或者(3)改善或消退疾病或疾病的症状。如本领域中理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。对于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于以下中的一种或多种：一个或多个症状的缓解或改善，病症(包括疾病)的程度的降低，病症(包括疾病)的稳定化(即不恶化)状态，病症(包括疾病)的延迟或减缓，病症(包括疾病)、状态和缓解(无论是部分还是全部)的进展、改善或缓解，无论是可检测的还是不可检测的。包含所公开的组合物和方法的治疗可以是第一线、第二线、第三线、第四线、第五线疗法，并且旨在用作单独疗法或与其他合适的疗法组合。在一方面，术语“治疗”不包括防止或预防。如本文使用的，术语“载体(vector)”是指被设计来用于在不同的宿主之间传送的核酸构建体，其包括但不限于质粒、病毒、粘粒、噬菌体、bac、yac等。在一些实施方式中，可以从商业上可获得的载体制备质粒载体。在其他实施方式中，可以根据本领域已知的技术从杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、aav等制造病毒载体。在一个实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。如本文所用，术语“nkg2d”是指这样的跨膜蛋白，其属于c型凝集素样受体的cd94/nkg2家族，并且由位于nk基因复合体和/或其生物等效物中的基因klrk1基因编码。该蛋白质或基础基因的非限制性示例性序列可以在基因卡id:gc12m011728、hgnc:18788、entrezgene:22914、ensembl:ensg00000213809、omim:611817、以及uniprotkb:p26718中找到，其通过引用并入本文。如本文所用，术语“bcma”和“b细胞成熟抗原”可互换使用，是指属于tnf超家族的蛋白质，其识别b细胞活化因子(baff)并由tnfrsf17基因编码。该蛋白质或基础基因的非限制性示例性序列可以在基因卡id:gc16p012058、hgnc:11913、entrezgene:608、ensembl:ensg00000048462、omim:109545、以及uniprotkb:q02223中找到，其通过引用并入本文。如本文所用，术语“slamf7”、“cs1”和“cd319”可互换使用，是指已知是多发性骨髓瘤中正常浆细胞和恶性浆细胞的有力标记并由slamf7基因编码的蛋白质。该蛋白质或基础基因的非限制性示例性序列可以在基因卡id:gc01p160709、hgnc:21394、entrezgene:57823、ensembl:ensg00000026751、omim:606625、以及uniprotkb:q9nq25中找到，其通过引用并入本文。与上面列出的genbank登录号和参考文献中的每一个相关联的序列通过引用并入本文。用于实施本发明的方式免疫调节分子的施用已经被寻求作为癌症治疗剂。然而，由于与全身性给药相关的严重副作用(giovarelli,m.etal.(2000)jimmunol.164:3200-3206；lasek,w.etal.(2014)cancerimmunolimmunother.63:419-435)，在相关肿瘤中获得高浓度的这些免疫调节分子以实现有效的免疫应答是困难的。由于最近在b细胞淋巴瘤和白血病中利用基因工程嵌合抗原受体(car)t细胞进行自体治疗而获得了前所未有的结果(maude,s.l.etal.(2014)newengl.j.med.371:1507-1517；porter,d.l.etal.(2011)newengl.j.med.365:725-733)，许多实验室已经开始将这种方法应用于实体肿瘤，包括卵巢癌、前列腺癌和胰腺肿瘤。car修饰的t细胞将单克隆抗体的hla非依赖性靶向特异性与活化的t细胞的细胞毒活性、增殖性及归巢特性相结合，但对检查站抑制不响应。由于其直接杀死抗原表达靶点的能力，cart细胞对任何抗原阳性细胞或组织都具有很高的毒性，因此有必要利用高度肿瘤特异性的抗体来构建car。到目前为止，已构建出了应用至人体实体肿瘤靶向α-叶酸受体、间皮素和muc-cd、psma及其他靶标的car修饰的t细胞，但大多数在正常组织中具有偏离靶标的抗原表达。这些构建体在患者中没有显示出同样的超常结果，所以需要进行更多的研究，以确定可用于抗实体肿瘤的cart细胞构建体的新靶点和方法。因此，本公开提供了包含对癌症或肿瘤抗原具有特异性的结合结构域的嵌合抗原受体(car)(在某些方面，该结合结构域是抗bcma抗体的抗原结合域)、编码靶向肿瘤或癌症抗原并分泌可溶性抗体片段的bsa-car细胞的载体、以及涉及其用途和生产的方法和组合物。嵌合抗原受体及其用途组合物本公开提供了与癌症或肿瘤抗原结合的嵌合抗原受体(car)，该car包含含有细胞外、跨膜和细胞内结构域的细胞活化部分，或基本上由其组成，或由其组成。细胞外结构域包含靶标特异性结合元件，其也被称为抗原结合结构域。细胞内结构域或细胞质结构域包含共刺激信号传导区域和ζ链部分。car可以任选地进一步包含至多300个氨基酸、优选10至100个氨基酸、更优选25至50个氨基酸的间隔域。间隔域。car可以任选地进一步包含至多300个氨基酸、优选10至100个氨基酸、更优选25至50个氨基酸的间隔域。例如，间隔子可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47，48、49或50个氨基酸。间隔域可以包括例如人fc域、ch3域或任何免疫球蛋白(例如iga，igd，ige，igg或igm或其变体)的铰链区的一部分。例如，一些实施方案可以包含具有或不具有s228p、l235e和/或n297q突变(根据kabat编号)的igg4铰链。其他间隔子包括但不限于cd4、cd8和cd28铰链区。抗原结合结构域。在某些方面，本公开提供了一种car，其包含对癌症或肿瘤抗原具有特异性的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成。抗原结合结构域可以来自任何合适的物种，例如鼠、人或人源化序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗bcma抗体或结合bcma相关抗原的抗体的抗原结合结构域，或基本上由其组成，或由其组成。特异性结合这些抗原的单克隆抗体是可商购的。抗原结合结构域可以来自任何合适的物种，例如鼠、人或人源化序列。在一方面，抗原结合结构域包含针对b细胞成熟抗原(bcma)和/或slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每个的等效物的抗体的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含靶特异性抗体(即，针对b细胞成熟抗原(bcma)和/或slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每个的等效物的抗体)的片段(例如scfv)，或基本上由其组成，或由其组成。scfv区可以包含与短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区。接头肽可以是1至50个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一些实施方案中，接头也富含甘氨酸，尽管它也可以含有丝氨酸或苏氨酸。在本公开的另一方面，癌症或肿瘤抗体的抗原结合结构域包括以下特征中的一个或多个：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域的cdr至少80％相同的一个或多个cdr；(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列包括与公开的重链序列中的任一个的重链可变结构域的cdr至少80％相同的一个或多个cdr；(c)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的轻链可变结构域至少80％相同；(d)hc免疫球蛋白可变结构域序列与公开的轻链序列中的任一个的重链可变结构域至少80％相同；以及(e)所述抗体结合的表位与由公开的序列中的任一个结合的表位有重叠。等效物的其他实例包括与该肽具有至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％氨基酸同一性的肽，或者由在高严格条件下与编码抗原结合域的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，其中高严格条件包括约55℃至约68℃的孵育温度；约1xssc至约0.1xssc的缓冲液浓度；约55％至约75％的甲酰胺浓度；以及约1xssc、0.1xssc或去离子水的洗涤溶液。跨膜结构域。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。在所述来源是天然的情况中，所述结构域可以衍生自任何膜结合或者跨膜蛋白。具有在本发明中的特定用途的跨膜区域可以衍生自cd8、cd28、cd3、cd45、cd4、cd5、cds、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、tcr。替代地，所述跨膜结构域可以是合成的，在该情况中它将主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可以形成car的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸二联体提供了特别合适的接头。细胞质结构域。car的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域负责在其中置有car的免疫细胞的传统效应器功能中的至少一个的激活。细胞内信号传导结构域是指蛋白的转导效应器功能信号并引导免疫细胞来进行其特异性功能的一部分。可以使用整个信号传导结构域或其截断的部分，只要该截断的部分足够来转导效应器功能信号。tcr和共受体的细胞质序列以及其衍生物或变体能够作用为细胞内信号传导结构域以在car中使用。具有在本发明中的特定用途的细胞内信号传导结构域可以衍生自fcr、tcr、cd3、cds、cd22、cd79a、cd79b、cd66d。在一些实施方案中，car的信号传导结构域可以包含cd3ζ信号传导结构域。因为通过tcr产生的信号单独不足以进行t细胞的完全激活，所以还可能需要二级或共刺激信号。因此，共刺激信号传导分子的细胞内区域包括但不限于cd27、cd28、4-ibb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关的抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3蛋白的细胞内结构域，或特异性地与cd83结合的配体也可以被包括在car的细胞质结构域中。例如，除了信号传导结构域(例如cd3ζ信号传导结构域)之外，car还可以包含一个、两个或多个共刺激结构域。在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是t细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段、或基本上由其组成、或由其组成：cd8蛋白、cd28蛋白、4-1bb蛋白、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、lfa-1、cd2、cd7、cd27、light、nkg2c、b7-h3和cd3-ζ蛋白。在一些实施方式中，嵌合抗原受体的细胞激活部分是t细胞信号传导结构域，其包括以下中的一个或多个蛋白或其片段、或基本上由其组成、或由其组成：cd8蛋白、cd28蛋白、4-1bb蛋白、和cd3-ζ蛋白。在具体的实施方式中，所述car包括以下结构域、或基本上由以下结构域组成、或由以下结构域组成：癌或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域、cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和cd3ζ信号传导结构域。在进一步的实施方案中，该共刺激信号传导区域包括cd28共刺激信号传导区域和4-1bb共刺激信号传导区域中的一个或两者。在一些实施方案中，car可以进一步包含可检测标记或纯化标记。在另一方面，本文所述的car包含在组合物中，例如用于诊断或治疗的药学上可接受的载体。开关机构。在一些实施例中，car还可以包括用于控制car的表达和/或激活的开关机构。例如，car可以包含细胞外、跨膜和细胞内结构域，或基本上由其组成，或由其组成，其中细胞外结构域包含靶标特异性结合元件，该元件结合对不同于在靶细胞上或由靶细胞表达的靶抗原的分子具有特异性的标记、结合结构域或标签。在此类实施方案中，car的特异性由第二构建体提供，该第二构建体包含靶抗原结合结构域和被car上的标记、结合结构域或标签识别或结合的结构域，或由其组成，或基本上由其组成。参见例如wo2013/044225、wo2016/000304、wo2015/057834、wo2015/057852、wo2016/070061、us9,233,125、us2016/0129109。以此方式，可以将表达car的t细胞施用至对象，但是在施用包含bcma特异性结合结构域的第二组合物之前，它不能结合其靶抗原(即bcma)。本公开的car可能同样需要多聚化以激活其功能(参见例如us2015/0368342、us2016/0175359、us2015/0368360)和/或外源信号，例如小分子药物(us2016/0166613，yungetal.,science,2015)，以引起t细胞应答。此外，所公开的car可以包含“自杀开关”(也称为“自杀基因”)，以在治疗后诱导car细胞的细胞死亡(buddeeetal.,plosone,2013)或下调与靶抗原结合后car的表达(wo2016/011210)。非限制性示例性自杀开关或自杀基因是icasp。在一些实施方案中，car可以进一步包含可检测标记或纯化标记。在另一方面，本文所述的car包含在组合物中，例如用于诊断或治疗的药学上可接受的载体。在某些实施方案中，car的肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域包含任选地通过接头肽连接的重链可变区和轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，重链和/或轻链可变区包含针对b细胞成熟抗原(bcma)和/或slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物中的任一个的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，肿瘤靶向抗体靶向bcma。在某些实施方案中，car进一步包含位于重链可变区和轻链可变区之间的接头多肽，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，所述接头是甘氨酸-丝氨酸接头。在其他实施方案中，所述接头多肽包含序列(甘氨酸-丝氨酸)n，其中n是1至6的整数，或基本上由其组成，或由其组成。本文还提供了编码car构建体的分离的核酸。所述核酸可以进一步包含必需的调控序列，例如用于在宿主细胞(例如哺乳动物或人宿主细胞)(例如t细胞)中表达的启动子。在一方面，启动子是cmv、mnd或ef1α启动子。在另一方面，car多核苷酸还包含可以由位于编码多核苷酸的5’的第二启动子元件(例如cmv、mnd和ef1a启动子)调节的标记物肽(例如gfp)。在一方面，第二启动子包含ef1α启动子。如对本领域技术人员显而易见的，选择用于宿主表达系统的启动子，并且随宿主和表达载体以及预期用途而变化。分离的核酸可以插入表达载体，例如慢病毒载体或逆转录病毒载体(在5’和3’ltr之间)或腺病毒载体或可以从其表达基因的任何其他载体。图1a是本公开的示例性构建体。显而易见，当在人类患者中临床使用时，标记或纯化标签将从构建体中省略。用于制备抗体的方法可以使用本领域已知的并且在本文中简要描述的方法购买或制备用于本公开的抗体。如果发现新的抗原，则有必要制造抗体和抗体的抗原结合结构域。它们的制造和用途是众所周知的，并且公开在例如e.andlane,d.,antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1999。可以使用本领域已知的标准方法产生抗体。抗体的实例包括(但不限于)抗体的单克隆、单链和功能片段。可以在一定范围的宿主(例如山羊、兔、大鼠、小鼠、人类等)内制造抗体。可以通过使用具有免疫原性特性的靶标抗原或其片段或寡肽(例如癌症或肿瘤相关抗原的c末端片段或分离的多肽，例如bcma或nkg2d)进行的注射来使它们免疫。根据宿主种类，可以加入和使用各种佐剂，以提高免疫反应。这样的佐剂包括但不限于弗氏(freund's)试剂、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、以及表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔血蓝蛋白、以及二硝基苯酚。在用于人类的佐剂中，bcg(bacillecalmette-guerin，卡介苗)和小棒杆菌(corynebacteriumparvum)是特别有用的。本发明还提供了分离的多肽和佐剂。在一些方面，本发明的抗体是多克隆抗体，即具有不同的氨基酸序列的多个类型的抗体的混合物。在一个方面，所述多克隆抗体包括具有不同的cdr的多个类型的抗体的混合物。因此，培养制造不同的抗体的细胞的混合物，并且可以使用从得到的培养物纯化的抗体(参见国际专利申请公开号wo2004/061104)。单克隆抗体生产。可以使用能够通过培养物中的连续细胞系来生产抗体分子的任何技术来制备癌症或肿瘤抗原的单克隆抗体。这样的技术包括但不限于杂交瘤技术(参见例如kohler&milstein,nature256:495-497(1975))；三肿瘤技术；人类b细胞杂交瘤技术(参见例如kozboretal.,immunol.today4:72(1983))以及ebv杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见例如coleetal.,in:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,pp.77-96(1985))。人单克隆抗体可以被用在本技术的实践中，并且可以使用人类杂交瘤(参见例如coteetal.,proc.natl.acad.sci.80:2026-2030(1983))或者通过用epsteinbarr病毒体外转染人类b细胞(参见例如coleetal.,in:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,pp.77-96(1985))来生产。例如，可以分离编码抗体的区域的核酸的群体。使用采用衍生自编码抗体的保守区域的序列的引物的pcr，来扩增抗体的来自该群体的部分的序列，然后重建编码来自该被扩增的序列的抗体或其片段(例如可变结构域)的dna。这样的被扩增的序列也可以被融合至编码其他蛋白(例如噬菌体外壳、或细菌细胞表面蛋白)的dna，用于表达和展示噬菌体或细菌上的融合多肽。然后可以根据例如被表达的抗体或其片段对于存在于bcma相关抗原多肽上的抗原或表位的亲和力，表达和进一步选择或分离被扩增的序列。替代地，可以通过例如使用包括相关抗原的氨基酸序列或其片段、或基本上由其组成、或由其组成的分离的多肽，使对象免疫，然后使用常规方法来从所述对象的脾分离杂交瘤，来制备表达单克隆抗体的杂交瘤。参见例如milsteinetal.,(galfreandmilstein,methodsenzymol73:3-46(1981)。使用标准方法来筛选杂交瘤将制造不同特异性(即对不同表位的特异性)和亲和力的单克隆抗体。具有期望的特性(例如相关抗原结合)的选择的单克隆抗体可以(i)被用作通过杂交瘤来表达，(ii)被结合至例如聚乙二醇(peg)的分子以改变其特性，或(iii)可以通过各种方法来分离、序列化和操纵编码所述单克隆抗体的cdna。在一个方面，通过杂交瘤来生产单克隆抗体，该杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的b细胞，其中该转基因非人动物具有包括被融合至永生化细胞的人类重链转基因和轻链转基因的基因组。杂交瘤技术包括本领域已知的技术，以及在harlowetal.,antibodies:alaboratorymanualcoldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.,349(1988)；hammerlingetal.,monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas,563-681(1981)中教导的技术。噬菌体展示技术。如上所述，可以通过应用重组dna和噬菌体展示技术来生产本发明的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备bcma抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在携带编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。通过直接使用抗原进行选择，通常是被结合或者被捕获至固体表面或珠粒的抗原，从全部的或组合的抗体文库(例如人类或鼠类)中选择具有期望的结合特性的噬菌体。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括具有fab、fv的fd和m13，或者二硫化稳定化的fv抗体结构域被重组地融合至噬菌体基因iii或基因viii蛋白。此外，方法可以适用于构建fab表达文库(参见例如huseetal.,science246:1275-1281,1989)，以允许具有相关抗原多肽(例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同系物)的所需的特异性的单克隆fab片段的快速和有效的识别。可以被用来制造本发明的分离的抗体的噬菌体展示方法的其他例子包括在以下文献中公开的方法：hustonetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85:5879-5883(1988)；chaudharyetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,87:1066-1070(1990)；brinkmanetal.,j.immunol.methods182:41-50(1995)；amesetal.,j.immunol.methods184:177-186(1995)；kettleboroughetal.,eur.j.immunol.24:952-958(1994)；persicetal.,gene187:9-18(1997)；burtonetal.,advancesinimmunology57:191-280(1994)；pct/gb91/01134；wo90/02809；wo91/10737；wo92/01047；wo92/18619；wo93/11236；wo95/15982；wo95/20401；wo96/06213；wo92/01047(medicalresearchcounciletal.)；wo97/08320(morphosys)；wo92/01047(cat/mrc)；wo91/17271(affymax)；以及美国专利号5,698,426,5,223,409,5,403,484,5,580,717,5,427,908,5,750,753,5,821,047,5,571,698,5,427,908,5,516,637,5,780,225,5,658,727和5,733,743。洛宁(lohning)的美国专利号6,753,136已经描述了可用于通过经由二硫键来连接多肽而在噬菌体颗粒的表面上显示多肽的方法。如在以上参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，编码来自噬菌体的区域的抗体可以被分离并且被用来产生整个抗体(包括人类抗体、或任何其他期望的抗原结合片段)，并且被表达在任何期望的宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中。例如，还可以使用本领域中已知的方法来采用重组地产生fab、fab′和f(ab′)2片段的技术，例如在国际专利申请公开号wo92/22324；mullinaxetal.,biotechniques12:864-869(1992)；sawaietal.,ajri34:26-34(1995)；以及betteretal.,science240:1041-1043(1988)中公开的。通常，可以针对合适的抗体来选择被克隆进显示载体的杂交抗体或杂交抗体片段，从而识别维持了良好的结合活性的变体，因为所述抗体或抗体片段将会被呈现在噬菌体或噬菌粒颗粒的表面。参见例如barbasiiietal.,phagedisplay,alaboratorymanual(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2001)。但是，其他载体形式可以被用于该方法，例如将抗体片段文库克隆进溶解性噬菌体载体(被修饰的t7或lambdazap系统)以用于选择和/或筛选。抗体生产的替代性方法。还可以通过诱导淋巴细胞群体中的体内产生，或者通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或面板，从而产生抗体(orlandietal.,pnas86:3833-3837(1989)；winter,g.etal.,nature,349:293-299(1991))。替代地，可以使用用于生产单链抗体的技术。单链抗体(scfv)包括通过接头肽(通常长度为5至25个氨基酸)连接的重链可变区域和轻链可变区域。在scfv中，重链和轻链的可变区域可以衍生自相同的抗体或不同的抗体。可以使用重组技术来合成scfv，例如通过编码该scfv的载体在宿主生物(例如e.coli)中的表达。可以通过以下方法获得编码scfv的dna：使用部分dna作为模板进行扩增，其中该部分dna编码选自编码上述抗体的重链或重链的可变区域的dna和编码其轻链或轻链的可变区域的dna的dna的整个或所需的氨基酸序列，通过使用定义其两个末端的引物对的pcr，并且进一步结合编码多肽接头部分的dna和定义其两个末端的引物对来进行扩增，从而将接头的两个末端分别连接至重链和轻链。可以根据本领域已知的常规方法来获得含有编码scfv的dna的表达载体和由该表达载体转化的宿主。还可以产生抗原结合片段，例如f(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生，而fab片段可以通过减少f(ab′)2片段的二硫键而产生。替代地，可以构建fab表达文库来进行具有期望的特异性的单克隆fab片段的快速和简单的识别(huseetal.,science,256:1275-1281(1989))。抗体修饰。本发明的抗体可以被多聚化来提高对抗原的亲和力。要被多聚化的抗体可以是一种抗体或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体的多聚化的方法，例如可以是将iggch3结构域结合至两个scfv分子、结合至链霉亲和素、引入螺旋-转角-螺旋基序等。本文公开的抗体组合物可以是在这些抗体中的任一个和另一个试剂(免疫偶联物)之间形成的偶联物的形式。在一个方面，本文公开的抗体被偶联至放射性物质。在另一个方面，本文公开的抗体可以被结合至多种分子，例如聚乙二醇(peg)。抗体筛选。可以使用多种免疫测试来进行筛选，以识别具有期望的特异性的抗体。使用具有已建立的特异性的多克隆或单克隆抗体进行竞争性结合或免疫放射测试的许多程序在本领域中是已知的。这些免疫测试通常涉及测量在相关抗体、或其任何片段或寡肽和其特异性抗体之间的复合物形成。可以使用采用对两个非干扰的相关抗体表位特异的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测试，但是也可以采用竞争性结合测试(maddoxetal.,j.exp.med.,158:1211-1216(1983))。抗体纯化。可以将本文公开的抗体纯化至同质化。可以采用常规的蛋白分离和纯化方法，进行抗体的分离和纯化。仅仅作为例子，可以通过色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等的适当选择和组合使用，分离和纯化抗体。strategiesforproteinpurificationandcharacterization:alaboratorycoursemanual,danielr.marshaketal.eds.,coldspringharborlaboratorypress(1996)；antibodies:alaboratorymanual.edharlowanddavidlane,coldspringharborlaboratory(1988)。色谱法的例子包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、以及吸附色谱。在一个方面，可以采用液体色谱(例如hplc或fplc)进行色谱。在一个方面，在亲和色谱中可以使用proteina柱或proteing。其他示例性的柱包括proteina柱、hyperd、poros、sepharosef.f.(pharmacia)等。双特异性抗体本文还提供了双特异性抗体构建体，其包含nkg2d的或肿瘤抗原的任何抗体，例如抗nkg2d抗体的抗原结合结构域和抗体的肿瘤靶向抗原结合结构域。抗原结合结构域可以来自任何合适的物种，例如鼠、人或人源化序列。在一方面，肿瘤靶向抗体包含抗cs1或抗bcma。它还包括与这两种蛋白质结合的任何分子。例如，mica、micb和ulbp。在一方面，car可以是cs1car，并且双特异性部分可以被抗bcmascfv代替。在一方面，肿瘤靶向抗体包含抗cs1或抗bcma。这样的例子在2016年2月22日提交的pct/us2016/018955中描述，该文献通过引用特别地并入本文，其包括多核苷酸和氨基酸序列。在一方面，两个抗原结合结构域中的至少一个对与预定的第一抗原共表达的抗原具有特异性。例如，在mm的情况下，bcma和cs1在mm上共表达，并且选择cs1以补充car构建体的bcma抗原结合结构域。另外，bcma可以补充抗cs1car。在另一方面，抗原结合结构域包含任选地经密码子优化的scfv片段，或基本上由其组成，或由其组成。在另一方面，双特异性抗原结合结构域是通过肽接头连接的可变重链和轻链。通常，抗原结合结构域可以通过肽接头(例如源自人肌肉醛糖的非免疫原性蛋白接头35)连接在一起。本文还提供了编码双特异性抗体的分离的核酸。核酸可进一步包含必需的调控序列，例如在宿主细胞(例如哺乳动物或人宿主细胞，例如t细胞)中表达的启动子和/或增强子。在一方面，启动子是cmv或ef1α启动子。分离的核酸可以进一步包含编码可检测标记物(例如gfp)的多核苷酸，其可以位于编码bsab的多核苷酸的下游并且由单独的启动子元件(例如ef1α启动子)调节。如对本领域技术人员显而易见的，为宿主表达系统选择启动子。分离的核酸可以在5’和3’ltr之间插入表达载体，例如慢病毒载体。图1b是本公开的示例性慢病毒载体构建体。对技术人员显而易见的是，构建体可以不包含标记物肽或纯化标记物。bsab-car构建体在另一方面，本文提供了分离的核酸，其在一个构建体中编码如上所述的car构建体和双特异性抗体(“bsab-car构建体”)。抗原结合结构域可以来自任何合适的物种，例如鼠、人或人源化序列。在一方面，分离的核酸编码靶向bcma和双特异性抗体的抗原结合片段，所述双特异性抗体例如是来自抗cs1抗体的一个scfv和来自抗nkg2d抗体的一个scfv，其通过编码非免疫原性蛋白质接头(例如来自人肌肉醛糖)的核酸连接在一起。在一方面，编码car构建体的核酸位于编码bsab的核酸的5’端。在一方面，t2a元件位于5’端的car多核苷酸和3’端的bsab之间。核酸可以进一步包含必需的调控序列，例如用于在宿主细胞(例如哺乳动物或人宿主细胞，例如t细胞)中表达的启动子。在一方面，启动子是位于编码car的多核苷酸的5’端的ef1a或cmv启动子。在另一方面，分离的核酸可以进一步包含编码可检测的标记物(例如gfp)的多核苷酸，其可以在bsab多核苷酸的下游并且在单独的启动子元件(例如ef1α启动子)的控制下。如对本领域技术人员显而易见的，为宿主表达系统选择启动子。分离的核酸可以在5’和3’ltr之间插入表达载体，例如慢病毒载体。图3a是本公开的示例性慢病毒载体构建体。对技术人员显而易见的是，构建体可以不包含标记物肽或纯化标记物。宿主细胞和制备car的过程本公开的方面涉及包含car、bsab和bsabcar的分离的细胞，以及产生这种细胞的方法。该细胞是原核或真核细胞。在一方面，细胞是t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、其任何亚群、或任何其他免疫细胞。真核细胞可以来自任何优选的物种，例如动物细胞、哺乳动物细胞，例如人、猫或犬细胞。这些细胞可以来自患者、供体或细胞系，例如现成的细胞。所述细胞对于所治疗的对象可以是自体同源的或同种异体的。在具体的实施方案中，分离的细胞包含外源car或bsabcar，或基本上由其组成，或由其组成，所述外源car或bsabcar包含以下结构域、或基本上由以下结构域组成，或由以下结构域组成：癌症或肿瘤抗体的抗原结合结构域，cd8α铰链结构域，cd8α跨膜结构域，cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域，以及cd3ζ信号传导区域。在一个独立的实施方案中，分离的细胞还包含本文公开的bsab。在另一个方面，所述细胞包含本文公开的bsab。在某些实施方案中，分离的细胞是t细胞，例如动物t细胞、哺乳动物t细胞、猫t细胞、犬t细胞或人t细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是nk细胞，例如动物nk细胞、哺乳动物nk细胞、猫nk细胞、犬nk细胞或人nk细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是b细胞，例如动物b细胞、哺乳动物b细胞、猫b细胞、犬b细胞或人b细胞。应当理解，对于树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、这些的任何亚群或所述的t细胞、nk细胞和b细胞、和/或任何其他免疫细胞，每种物种的相同或相似实施方案均适用。在一方面，该细胞是已经使用基因编辑技术(例如crispr或talen)被修饰以去除cd52表达的t细胞。在某些实施方案中，本文公开了产生表达bsab、car和/或bsabcar的细胞的方法，该方法包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：用编码bsab、car、bsab和car和/或bsabcar的核酸序列转导分离的细胞的群体。在另一方面，选择已经被核酸序列成功转导的细胞亚群。在一些实施方案中，分离的细胞是t细胞、动物t细胞、哺乳动物t细胞、猫t细胞、犬t细胞或人t细胞，从而产生bsab、car、bsab和car、和/或bsabcart细胞。在某些实施方案中，分离的细胞是nk细胞，例如动物nk细胞、哺乳动物nk细胞、猫nk细胞、犬nk细胞或人nk细胞，从而产生bsab、car、bsab和car、和/或bsabcarnk细胞。在一些实施方案中，分离的细胞是b细胞、动物b细胞、哺乳动物b细胞、猫b细胞、犬b细胞或人b细胞，从而产生bsab、car、bsab和car、和/或bsabcarb细胞。应当理解，对于树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞、这些的任何亚群或所述的t细胞、nk细胞和b细胞、和/或任何其他免疫细胞，每种物种的相同或相似实施方案均适用。在一方面，该细胞是已经使用基因编辑技术(例如crispr或talen)被修饰以去除cd52表达的t细胞。在一个方面，所述细胞对于所治疗的对象是自体同源的或同种异体的。分离的细胞的来源。在扩增和遗传修饰本文所公开的细胞之前，可以从对象(例如，在涉及自体治疗的实施方案中)或商购可得的细胞系或培养物、或干细胞(例如诱导性多能干细胞(ipsc))获得细胞。细胞可以获得自对象中的许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。分离相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于lifetechnologies系统；stemcelltechnologieseasyseptm、roboseptm、rosetteseptm、sepmatetm；miltenyibiotecmacstm细胞分离试剂盒、以及其他商业上可获得的细胞分离和分隔试剂盒。可以通过使用在对独特的细胞表面标记物特异的这样的试剂盒中可用的珠粒或其他结合试剂，分离免疫细胞的特定的亚群体。例如，macstmcd4+和cd8+microbeads可以被用来分离cd4+和cd8+t细胞。可以根据已知技术分离的细胞的非限制性非限制性实例包括大量的t细胞、nkt细胞和γ-δt细胞。替代地，细胞可以通过商业上可用的细胞培养物而获得，其包括但不限于：对于t细胞，bcl2(aaa)jurkat(crl-2902tm)、bcl2(s70a)jurkat(crl-2900tm)、bcl2(s87a)jurkat(crl-2901tm)、bcl2jurkatcrl-2899tm)、neojurkat(crl-2898tm)细胞系；对于b细胞，ahh-1(crl-8146tm)、bc-1crl-2230tm)、bc-2crl-2231tm)、bc-3(crl-2277tm)、ca46(crl-1648tm)、dg-75[d.g.-75](crl-2625tm)、ds-1(crl-11102tm)、eb-3[eb3](ccl-85tm)、z-138(atcc#crl-3001)、db(atcccrl-2289)、toledo(atcccrl-2631)、pfiffer(atcccrl-2632)、sr(atcccrl-2262)、jm-1(atcccrl-10421)、nfs-5c-1(atcccrl-1693)；nfs-70c10(atcccrl-1694)、nfs-25c-3(atcccrl-1695)和sup-b15(atcccrl-1929)细胞系；以及对于nk细胞，nk-92(crl-2407tm)、nk-92mi(crl-2408tm)细胞系。进一步的例子包括但不限于：成熟的t细胞系，例如deglis、ebt-8、hpb-mlp-w、hut78、hut102、karpas384、ki225、my-la、se-ax、skw-3、smz-1和t34；未成熟的t细胞系，例如all-sil、be13、ccrf-cem、cml-t1、dnd-41、du.528、eu-9、hd-mar、hpb-all、h-sb2、ht-1、jk-t1、jurkat、karpas45、ke-37、kopt-k1、k-t1、l-kaw、loucy、mat、molt-1、molt3、molt-4、molt13、molt-16、mt-1、mt-all、p12/ichikawa、peer、per0117、per-255、pf-382、pfi-285、rpmi-8402、st-4、sup-t1至t14、tall-1、tall-101、tall-103/2、tall-104、tall-105、tall-106、tall-107、tall-197、tk-6、tlbr-1、-2、-3和-4、ccrf-hsb-2(ccl-120.1)、j.rt3-t3.5(atcctib-153)、j45.01(atcccrl-1990)、j.cam1.6(atcccrl-2063)、rs4；11(atcccrl-1873)、ccrf-cem(atcccrm-ccl-119)；皮肤t细胞淋巴瘤细胞系，例如hut78(atcccrm-tib-161)、mj[g11](atcccrl-8294)、hut102(atcctib-162)；来自间变性和大细胞淋巴瘤的b细胞系，例如del、dl-40、fe-pd、jb6、karpas299、ki-jk、mac-2aply1、sr-786、su-dhl-1、-2、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10和-16、dohh-2、nu-dhl-1、u-937、granda519、usc-dhl-1、rl；霍奇金淋巴瘤，例如dev、hd-70、hdlm-2、hd-myz、hkb-1、km-h2、l428、l540、l1236、sbh-1、sup-hd1和su/rh-hd-l；以及nk细胞系，例如hank1、khyg-1、nkl、nk-ys、noi-90和yt。无白血病细胞系，包括但不限于reh、nall-1、km-3、l92-221，是免疫细胞的另一种商业上可获得的来源，同样的是衍生自其他白血病和淋巴瘤的细胞系，例如k562红白血病、thp-1单核细胞白血病、u937淋巴瘤、hel红白血病、hl60白血病、hmc-1白血病、kg-1白血病、u266骨髓瘤。这样的商业上可获得的细胞系的非限制性示例性来源包括americantypeculturecollection或atcc(atcc.org/)以及germancollectionofmicroorganismsandcellcultures(dsmz.de/)。在一些实施方案中，表达所公开的car的t细胞可以被进一步修饰以减少或消除内源tcr的表达。减少或消除内源性tcr可以减少脱靶效应并提高t细胞的有效性。可以使用多种方法来产生稳定缺乏功能性tcr表达的t细胞。t细胞以复合物的形式内在化、分选和降解整个t细胞受体，在静止t细胞中的半衰期约为10小时，在受激t细胞中的半衰期为3小时(vonessen,m.etal.2004.j.immunol.173:384-393)。tcr复合物的正确功能需要组成tcr复合物的蛋白质的化学计量比正确。tcr功能还需要两个具有itam基序的功能正常的tcrζ蛋白。tcr与其mhc肽配体结合后的激活需要在同一t细胞上结合多个tcr，所有tcr都必须正确发出信号。因此，如果tcr复合物被无法正确结合或无法最佳信号传递的蛋白质所破坏，则t细胞将无法充分激活以开始细胞反应。因此，在一些实施方案中，可以使用rna干扰(例如shrna、sirna、mirna等)、crispr、或靶向编码特异性tcr(例如tcr-α和tcr-β)和/或原代t细胞中的cd3链的核酸的其他方法消除tcr表达。通过阻断一种或多种这些蛋白质的表达，t细胞将不再产生tcr复合物的一种或多种关键成分，从而使tcr复合物不稳定并阻止功能性tcr的细胞表面表达。即使当使用rna干扰时某些tcr复合物可以回收到细胞表面，rna(例如shrna、sirna、mirna等)也会阻止tcr蛋白的新产生，从而导致整个tcr复合物降解和去除，结果产生功能性tcr表达稳定缺乏的t细胞。可以使用任何常规的表达系统(例如慢病毒表达系统)来实现抑制性rna(例如shrna、sirna、mirna等)在原代t细胞中的表达。尽管慢病毒可用于靶向静止的原代t细胞，但并非所有t细胞都会表达shrna。这些t细胞中的某些可能无法表达足够数量的rna，从而无法充分抑制tcr表达，从而改变t细胞的功能活性。因此，可以去除病毒转导后保留中等至高tcr表达的t细胞，例如通过细胞分选或分离技术，从而使其余t细胞的细胞表面tcr或cd3不足，从而使缺乏功能性tcr或cd3表达的t细胞分离种群得以扩增。可以使用常规的crispr/cas系统和针对靶tcr特异的指导rna来实现crispr在原代t细胞中的表达。合适的表达系统(例如慢病毒或腺病毒表达系统)是本领域已知的。类似于抑制剂rna的递送，crispr系统可用于特异性靶向静止的原代t细胞或其他适合car细胞治疗的免疫细胞。此外，就crispr编辑不成功的程度而言，可以根据上述方法选择成功的细胞。例如，如上所述，可以例如通过细胞分选或分离技术除去在病毒转导后保留中等至高tcr表达的t细胞，从而使剩余的t细胞在细胞表面中缺乏tcr或cd3，从而能够扩增缺乏功能性tcr或cd3表达的分离的t细胞群体。还应理解，crispr编辑构建体可用于敲除内源tcr和敲入本文公开的car构建体。因此，应当理解，可以将crispr系统设计用于实现这些目的之一或全部。载体。可以使用载体制备car。本发明的一些方面涉及编码(i)car或(ii)编码免疫调节分子的多核苷酸的分离的核酸序列以及载体，所述载体包括这些核酸中的一个或两个和/或它们的每个的互补序列和/或等效物、或基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列编码car，该car包含以下组分、或基本上由以下组分组成、或由以下组分组成：癌症或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域、cd8α铰链结构域、cd8α跨膜结构域、cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域、以及cd3ζ信号传导结构域。在具体的实施方式中，所述分离的核酸序列包括编码以下组分的序列、或基本上由该序列组成、或由该序列组成：(a)癌症或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域、随后的(b)cd8α铰链结构域、(c)cd8α跨膜结构域、随后的(d)cd28共刺激信号传导区域和/或4-1bb共刺激信号传导区域、随后的(e)cd3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列编码car并且包括位于编码抗癌症或肿瘤靶向抗体的抗原结合结构域的序列的上游的kozak共有序列，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，所述抗原结合结构域靶向bcma。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码双特异性抗体的多核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的slamf7(也称为cs1或cd319)或其每一个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的slamf7(也称为cs1或cd319)或其每一个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对任选地由密码子最优化的nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含衍生自针对nkg2d的抗体的单链可变片段(scfv)、以及任选的衍生自salmf7(也称为cd319的cs1)的单链可变片段(scfv)(任选地由密码子最优化)和/或其每一个的等效物。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码根据上述方法产生的可以与启动子可操作地连接的双特异性抗体的多核苷酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，分离的核酸包含赋予抗生素抗性的可检测标记和/或多核苷酸。在一方面，所述标记或多核苷酸可用于选择成功地用分离的核酸转导的细胞。在一些实施方式中，所述分离的核酸序列被包括在载体中。在一些实施方式中，所述载体是质粒。在其他实施方式中，所述载体是病毒载体。这样的非限制性实例包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在具体的实施方式中，所述载体是慢病毒载体。在以下例子中详细地讨论了使用所述载体来制备示例性的载体和生产表达car的细胞。总的来说，通常通过将编码car多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体结合进表达载体，实现编码car的天然的或合成的核酸的表达。可以使用类似的方法来构建包含编码免疫调节分子的多核苷酸的分离的核酸序列。所述载体可以适于复制和整合真核生物。用于生产包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如sambrooketal.(2001,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)。在一个方面，术语“载体”是指这样的重组载体，其保留了感染和转导不分裂和/或缓慢分裂的细胞并整合到靶细胞的基因组中的能力。在一些方面，所述载体衍生自或者基于野生型病毒。在进一步的方面。所述载体衍生自或者基于野生型慢病毒。这样的例子包括但不限于人类免疫缺陷病毒(hiv)、马传染性贫血病毒(eiav)、猿猴免疫缺陷病毒(siv)和猫免疫缺陷病毒(fiv)。替代地，应该理解的是，其他逆转录病毒可以被用作载体骨架的基础，例如鼠白血病病毒(mlv)。很明显，根据本发明的病毒载体不必被局限于特定病毒的组件。所述病毒载体可以包括衍生自两种或更多种不同病毒的组件，并且还可以包括合成的组件。载体组件可以被操纵来获得所需的特性，例如靶细胞特异性。本发明的重组载体衍生自灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的例子包括人类免疫缺陷病毒(hiv)、人类获得性免疫缺陷综合征(aids)的致病因子、以及猿猴免疫缺陷病毒(siv)。非灵长类慢病毒群组包括“慢病毒”原型visna/maedi病毒(vmv)、以及相关的山羊关节炎脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)和更近期地被描述的猫免疫缺陷病毒(fiv)和牛免疫缺陷病毒(biv)。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如参见美国专利号6,924,123；7,056,699；7,419,829和7,442,551，其以引用的方式合并入本文中。美国专利号6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进整合进靶细胞基因组。该专利教导了每个逆转录病毒包括被称为gag、pol和env的基因，其编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因通过被称为长末端重复(ltr)的区域而被处于两个末端的侧翼。所述ltr负责前病毒整合和转录。它们也用作增强子-启动子序列。换句话说，ltr能够控制病毒基因的表达。逆转录病毒rna的封装通过位于病毒基因组的5'末端的psi序列而发生。ltr自身是可以被分为三种元件的相同的序列，其被称为u3、r和u5。u3衍生自对rna的3'末端独特的序列。r衍生自在rna的两个末端重复的序列，而u5衍生自rna的5'末端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间这三种元件的尺寸可以发生较大的变化。对于病毒基因组，聚合(a)加成(终止)的位点是在lrt右手边的r和u5之间的边界处。u3含有前病毒的大多数转录控制元件，其包括启动子和多重增强子序列，它们响应细胞(在某些情况下为病毒)转录激活蛋白。关于结构基因gag、pol和env自身，gag编码病毒的内部结构蛋白。gag蛋白被蛋白水解地处理成成熟蛋白ma(基质)、ca(衣壳)和nc(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(rt)，其包括dna聚合酶、相关的rna酶h和整合酶(in)，它们介导基因组的复制。对于病毒载体颗粒的生产，载体rna基因组被表达自在宿主细胞中的编码它的dna构建体。通过在宿主细胞中表达的其他核酸序列(“包装系统”，其通常包括gag/pol和env中的一个或两个)，以反式的形式提供不被所述载体基因组编码的颗粒的部件。可以通过瞬时转染将生产病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞，或者它们可以被整合进宿主细胞基因组、或者它们可以以混合物的方式而被提供。涉及的技术对于本领域技术人员来说是已知的。用于在本发明中使用的逆转录病毒载体包括但不限于：invitrogen的plenti系列版本4、6和6.2“virapower”系统，由lentigencorp.制造；phiv-7-gfp，由cityofhoperesearchinstitute实验室生成和使用；“lenti-x”慢病毒载体，plvx，由clontech制造；plko.1-puro，由sigma-aldrich制造；plemir，由openbiosystems制造；以及plv，由virology(cbf),berlin,germany的charitémedicalschool,institute实验室生成和使用。将外源核酸引入本领域的其他方法是已知的，包括但不限于使用rna电穿孔、纳米技术、睡眠美容载体、逆转录病毒和/或腺病毒中的一种或多种进行基因递送。不管被用来将外源性核酸引入宿主细胞或将细胞暴露至本发明的抑制剂的方法如何，为了确认重组dna序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测试。这样的测试包括：例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，例如检测特定的肽是否存在，例如通过免疫学手段(ellsa和蛋白质印迹)或者通过本文描述的测试来识别落入本发明的范围之内的试剂。包装载体和细胞系。可以通过使用包装载体和细胞系，将car包装进逆转录病毒包装系统。包装质粒包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。包装载体包括促进遗传物质递送进细胞的元件和序列。例如，逆转录病毒构建体是这样的包装质粒，其包括至少一种逆转录病毒辅助dna序列，其衍生自复制缺陷型逆转录病毒基因组，其以反式的方式编码包装复制缺陷型逆转录病毒载体所需的所有病毒粒子蛋白，并且用于生产能够以高滴度包装复制缺陷型逆转录病毒载体而不会产生复制完整型辅助病毒的病毒粒子蛋白。逆转录病毒dna序列缺少编码病毒的病毒性5′ltr的天然增强子和/或启动子的区域，并且缺少负责包装辅助基因组的psi功能序列和3′ltr，但是编码外来的聚腺苷酸化位点(例如sv40聚腺苷酸化位点)、以及引导其中需要病毒生产的细胞类型中的有效转录的外来增强子和/或启动子。所述逆转录病毒是白血病病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、或长臂猿白血病病毒(galv)。所述外来增强子和/或启动子可以是人类巨细胞病毒(hcmv)即刻早期(ie)增强子和启动子、莫洛尼鼠肉瘤病毒(mmsv)的增强子和启动子(u3区域)、rous肉瘤病毒(rsv)的u3区域、脾病灶形成病毒(sffv)的u3区域、或连接到天然莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)启动子的hcmvie增强子。逆转录病毒包装质粒可以由两个逆转录病毒辅助dna序列组成，它们由基于质粒的表达载体编码，例如其中第一辅助序列包括编码嗜亲性mmlv或galv的gag和pol蛋白的cdna，并且第二辅助序列包括编码env蛋白的cdna。env基因，其确定宿主范围，可以衍生自编码以下的基因：嗜异性的、双嗜性的、嗜亲性、多嗜性的(貂病灶形成)或10a1鼠白血病病毒env蛋白、或长臂猿白血病病毒(galv)env蛋白、人类免疫缺陷病毒env(gp160)蛋白、水泡性口炎病毒(vsv)g蛋白、人类t细胞白血病(htlv)i型和ii型env基因产物，或嵌合包膜基因，其衍生自前述env基因或编码前述env基因产物的细胞质和跨膜结构域的嵌合包膜基因中的一个或多个以及针对在所需的靶细胞上的特异性表面分子的单克隆抗体的组合。在包装过程中，包装质粒和逆转录病毒载体被瞬时地共转染进能够产生病毒的哺乳动物细胞的第一群体中，该细胞例如是人类胚胎肾细胞，例如293细胞(atccno.crl1573,atcc,rockville,md.)，从而生产高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。在本发明的另一种方法中，该细胞的瞬时转染的第一群体然后与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞)共培养，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在本发明的另一种方法中，来自上述细胞的瞬时转染的第一群体的上清液与哺乳动物靶细胞(例如人类淋巴细胞或造血干细胞)一起孵育，从而以高效率转导具有外来基因的靶细胞。在另一个方面，在能够产生病毒的哺乳动物细胞(例如人类胚胎肾细胞，例如293细胞)的第一群体中稳定地表达包装质粒。通过使用可选择的标记物进行共转染或者使用假型病毒进行感染，将逆转录病毒或慢病毒载体引入细胞中。在两种情况中，载体都发生整合。替代地，载体可以被引入游离基因地(episomally)维持的质粒中。生产了高滴度的含有重组逆转录病毒的上清液。car细胞的激活和扩增。无论是在表达所需的car的细胞的遗传修饰之前还是之后，都可以使用通常已知的方法来通常地激活和扩增细胞，这些方法例如是在美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041以及诸如lapatevaetal.(2014)critrevoncog19(1-2):121-32；tametal.(2003)cytotherapy5(3):259-72；garcia-marquezetal.(2014)cytotherapy16(11):1537-44的文献中描述的方法。使用肿瘤相关抗原离体刺激能够激活并扩增表达细胞亚群体的所选的car。替代地，可以通过与肿瘤相关抗原相互作用，体内激活细胞。在某些免疫细胞的情况下，可能需要另外的细胞群、可溶性配体和/或细胞因子、或刺激剂来活化和扩增细胞。相关试剂是本领域公知的，并且根据已知的免疫学原理进行选择。例如，可溶性cd-40配体可能有助于激活和扩增某些b细胞群体。类似地，辐照的饲养细胞可以用于激活和扩增nk细胞的程序中。激活相关细胞的方法在本领域中是熟知的并且可以容易地适用至本申请；在以下例子中描述了示例性的方法。用于与本发明相关的用途的分离方法包括但不限于lifetechnologies系统激活和扩增试剂盒；bdbiosciencesphosflowtm激活试剂盒、miltenyibiotecmacstm激活/扩增试剂盒、以及对相关细胞的激活部分特异性的其他商业上可获得的细胞试剂盒。可以通过使用在这样的试剂盒中可用的珠粒或其他试剂，激活或扩增免疫细胞的特定的亚群体。例如，α-cd3/α-cd28可以被用来激活和扩增分离的t细胞的群体。使用方法治疗应用。本公开的方法方面涉及用于在体外或体内抑制肿瘤或癌细胞(例如mm细胞)生长和/或用于治疗有需要的癌症患者的方法。在一些实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症是影响血液和/或骨髓的癌症，例如mm。在一些实施方案中，癌症或肿瘤细胞表达或过表达癌症或肿瘤抗原，例如bcma和/或cs1。当在体外实践时，这些方法提供了用于精密医学应用的体外测定法，以及用于测试新组合和疗法的有用测定法。在某些实施方案中，这些方法包括以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：向对象或患者施用有效量的包含car的分离的细胞。在进一步的实施方案中，该分离的细胞包含或表达car和/或双特异性抗体。在一些实施方案中，car的抗原结合结构域包含针对b细胞成熟抗原(bcma)和/或slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物中的任一个的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，car的抗原结合结构域包含针对b细胞成熟抗原(bcma)和/或slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每一个的等效物中的任一个的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在其他实施方案中，分离的细胞是t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，双特异性抗体包含nkg2d配体和任选的salmf7(也称为cd319的cs1)配体，或基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对nkg2d和任选的slamf7(也称为cs1或cd319)或其每个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对nkg2d和任选的slamf7(也称为cs1或cd319)和/或其每个的等效物的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含衍生自针对nkg2d的抗体的单链可变片段(scfv)和任选的衍生自salmf7(也称为cd319的cs1)的单链可变片段(scfv)，和/或其每个的等效物。在一些实施方案中，分离的细胞对于所治疗的对象或患者是自体同源的。在另一方面，肿瘤表达癌症或肿瘤抗原，并且已经通过诊断选择对象用于治疗，例如使用识别和结合由car靶向的肿瘤或癌症相关抗原的抗体。所述对象是动物、哺乳动物、犬、猫、牛、马、鼠或人类患者。本文公开的car细胞可以被单独地施用，或者与本文公开的双特异性抗体、稀释剂、已知的抗癌治疗剂、和/或与其他组分(例如细胞因子或免疫调节的其他细胞群体)一起施用。它们可以作为一线治疗、二线治疗、三线治疗或进一步治疗进行施用。其他疗法的非限制性实例包括细胞还原疗法，例如放射疗法、冷冻疗法或化学疗法或生物制剂。其他非限制性实例包括其他相关的细胞类型，例如未经修饰的免疫细胞、包含表达一种或多种免疫调节分子的载体的修饰的免疫细胞、或对不同于本文公开的抗原的抗原具有特异性的car细胞。与本公开的car细胞一样，在一些实施方案中，这些细胞可以是自体同源的或同种异体的。适当的治疗方案将由主治医师或兽医确定。可以以适于要被治疗或预防的疾病的方式，施用包括本发明的药物组合物。虽然可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的量和频率将由例如患者的情况、以及患者的疾病的种类和严重性等因素确定。在一方面，它们通过直接注射或全身性(例如静脉内)注射直接给药。本公开的各方面提供了用于确定患者是有可能还是不太可能对car治疗作出反应的示例性方法。该方法包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：确定从患者中分离的肿瘤样品中是否存在坏死，并对表达癌症或肿瘤抗原的癌症或肿瘤细胞的量进行定量。在某些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤、或基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：向确定为有可能对car疗法作出反应的患者施用有效量的car疗法。car疗法对于患者可以是自体同源的或同种异体的，并且患者可以是患有实体瘤的动物或人对象。用于坏死的组织学染色的技术是本领域众所周知的。例如，苏木精和曙红染色(也称为“h&e染色”)是鉴定组织中、特别是致癌或癌性生长中坏死的存在的常用技术。细胞质h&e染色显示嗜酸性粒细胞增多，部分归因于细胞质rna的损失，部分归因于变性的细胞质蛋白质。在坏死的组织染色中，由于细胞质细胞器的酶消化，细胞质经常出现“被蚕食”的现象。髓鞘形态、钙化以及吞噬其他细胞的证据也是坏死组织的标志，可以通过组织学染色检测到。坏死组织在核染色中也具有特殊的标志，通常表现出细胞死亡导致的核溶解、致死性和核溢血。使用显微镜检查以及这些坏死标志的手动或自动定量，可以确定car治疗的相关性。通常，检测致癌或癌性生长或坏死组织的其他方法包括但不限于基于生物标记物或基于影像学的诊断方法，它们也与确定患者是否会对某些类型的car治疗有反应同样重要，可以相应地使用。载体本公开的其他方面涉及组合物，其包含载体和在本文公开的实施方式中描述的产品中的一种或多种，或基本上由其组成，或由其组成，例如car、包含car分离的细胞、分离的核酸、载体、包含所述car和本文公开的双特异性抗体的分离的细胞和/或编码其的核酸。在其他方面，所述组合物可以额外地包含免疫调节分子和/或包含编码双特异性抗体的多核苷酸的分离的核酸。在某些实施方案中，双特异性抗体包含针对bcma和/或nkg2d和任选的slamf7(也称为cs1或cd319)或其每一个的等效物的抗体的相关cdr区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含针对nkg2d和任选的salmf7(也称为cs1或cd319)(任选地由密码子最优化)和/或其每一个的等效物的抗体的重链和/或轻链可变区，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，双特异性抗体包含衍生自针对nkg2d的抗体的单链可变片段(scfv)，以及任选的衍生自salmf7(也称为cd319的cs1)的单链可变片段(scfv)(任选地由密码子最优化)和/或其每一个的等效物。简单来说，包括但不限于本发明的组合物中的任何一种的本发明的药物组合物，联合一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物可以被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外给药。在一些实施方式中，本发明的组合物被配制用于静脉给药。细胞或组合物的施用可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行，并且提供了实现所需治疗益处的有效量。确定最有效的给药方式和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将根据用于治疗的组合物、治疗的目的和所治疗的对象而变化。可以通过治疗医师选择剂量水平和方式进行单次或多次给药。合适的剂型和施用试剂的方法是本领域已知的。在另一方面，本公开的细胞和组合物可以与其他治疗组合施用。使用本领域已知的并且例如在pct/us2011/064191中描述的方法，将细胞和细胞群施用于宿主。可以进行本公开的细胞或组合物的这种施用，以产生用于实验和筛选测定的所需疾病、病症或病状的动物模型。联合疗法如本文所述的组合物可以作为第一线、第二线、第三线、第四线或其他疗法施用，并且可以与细胞减少性干预措施组合。可以按照治疗医师的决定按顺序或同时给药。在一方面，它们可以与可以上调car和/或bsab结合的肿瘤或其他抗原的表达的疗法组合。在一方面，某些临床药物可以增加靶向抗原。例如，可以通过来那度胺(lenalidomide)来提高cs1的表面表达，来那度胺是一种经fda批准的多发性骨髓瘤的免疫调节剂，请参见wangetal.(2018)clin.cancerres.jan1；24(1):106-119。另一个示例是fda批准的药物米哚妥林(midostaurin)，它在car-bsab靶向flt3抗原时增加flt3表达。试剂盒如本文所述，本公开提供了用于产生和施用car和/或bsabcar细胞的方法。在一个特定方面，本公开提供了用于执行这些方法的试剂盒以及用于执行本公开的方法的说明书，例如收集细胞和/或组织、和/或进行筛选/转导等、和/或分析结果。在一方面，试剂盒包含以下组件、或基本上由以下组件组成、或由以下组件组成：本文公开的任何一种分离的核酸和/或包含所述核酸的载体和/或分离的同种异体细胞(优选t细胞或nk细胞)，和/或关于从患者获取自体同源细胞的说明。这样的试剂盒还可以包含以下组件、或基本上由以下组件组成、或由以下组件组成：适合于car和/或bsabcar表达细胞的转导和/或选择和/或活化和/或扩增的培养基和其他试剂，例如在此公开的。在一方面，所述试剂盒包含分离的表达car和/或bsabcar的细胞或其群体，或基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，该试剂盒的细胞在施用于需要其的对象之前可能需要活化和/或扩增。在另外的实施方案中，试剂盒可以进一步包含培养基和试剂(例如上文公开内容所涵盖的)、或基本上由其组成、或由其组成，以活化和/或扩增分离的表达car和/或bsabcar的细胞。在一些实施方案中，该细胞将用于car疗法。在进一步的实施方案中，试剂盒包括关于将分离的细胞施用至需要car疗法的患者的说明书。本公开的试剂盒还可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可以进一步包含检测可检测标记所必需的组分，例如酶或底物。试剂盒还可以包含对照样品或一系列对照样品，可以对其进行分析并与测试样品进行比较。试剂盒的每个组件都可以封装在一个单独的容器中，所有各种容器都可以与用于解释使用该试剂盒进行的测定结果的说明处于单一的包装中。本公开的试剂盒可以包含位于试剂盒容器之上或之中的书面产品。该书面产品介绍了如何使用试剂盒中包含的试剂。适当地，这些建议的试剂盒组件可以以本领域技术人员惯用的方式包装。例如，这些建议的试剂盒组件可以以溶液或液体分散体等形式提供。以下实施例说明了可以在使公开内容生效的各种情况下使用的过程。实施例1-bsabcart细胞的产生和功效嵌合抗原受体(car)t细胞和双特异性抗体(bsab)是fda批准的疗法，显示出令人信服的治愈癌症的潜力。但是，在大多数情况下，无一显示出有疗效。这可能部分归因于治疗的持续时间，即cart细胞在体内可能无法存活足够长的时间，并且bsab的半衰期非常短，且制造过程昂贵且耗时，因此限制了它们的功效和广泛的应用。在这里，申请人成功创建了一个平台，将cart细胞疗法与bsab疗法相结合，两者均具有持久作用的潜力。申请人在多发性骨髓瘤(mm)的背景下测试了该平台，多发性骨髓瘤是目前通过fda批准的治疗方法后复发率很高的无法治愈的癌症。申请人验证了利用两种mm靶抗原cs1和bcma的概念，并创建了一种新颖有效的单一慢病毒构建体，以生成表达bcmacar并分泌可溶性抗nkg2d-抗cs1bsab的bsab-cart细胞，前者攻击bcma(+)mm肿瘤细胞，后者结合所有nkg2d(+)细胞溶解细胞(包括cd8(+)t细胞、t细胞、自然杀伤(nk)t细胞和nk细胞)，目的是促进其针对cs1(+)mm的细胞毒性活性。这种一体化(allinone)的多方面免疫方式可同时提供两种“活体药物”(即cart细胞和bsab)，捕获针对同一恶性群体中不同靶抗原的先天性和适应性免疫效应细胞。申请人发现，与bcmacart细胞或bsab转导的t细胞相比，bsab-cart细胞分泌更多的ifn-γ并显示出更高的脱粒能力，同时通过靶向mm肿瘤细胞(包括mm细胞系和原发性mm肿瘤细胞)在体外显示出增强的细胞毒性。在缺少这两种抗原的内源性表达的靶细胞中异位强制表达bcma和cs1增强了靶细胞裂解。重要的是，从bcmacart细胞分泌的抗nkg2d-抗cs1bsab以自分泌的方式作用，从而通过激活nkg2d信号来触发bcmacart细胞在体外的增殖以及它们在体内的增殖和存活增强。这些多方面的作用导致体内强烈的抗肿瘤活性。总的来说，本文提供了产生下一代癌症免疫疗法的证据，其具有将cart细胞疗法和抗nkg2d双特异性抗体疗法结合到单一平台以增加持续时间和增强功效的能力，以及捕获先天和适应性溶细胞效应细胞的特异性抗肿瘤活性的能力。细胞培养：细胞系mm.1s、h929、rpmi-8226(人多发性骨髓瘤细胞系)和k562(人红血球细胞系)购自atcc(manassas,va,usa)。这些细胞用包含10％胎牛血清(fbs)(invitrogen,ca,usa)和1％抗生素-抗真菌药(invitrogen)的rpmi1640培养基(sigma,st.louis,usa)培养。从atcc购买并用于慢病毒生产的293t细胞系在dmem(sigma)和与rpmi1640中相同的补充物中培养。根据制造商的说明，通过ficoll-paqueplus(gehealthcarebio-sciences,pittsburgh,pa)密度梯度离心分离了来自健康供体和mm患者的人外周血单个核细胞(pbmc)。根据制造商的说明，分别使用人类nk、nkt和细胞分离试剂盒(macs,miltenyibiotech,auburn,ca,usa)分离出人类cd56+nk细胞、cd3+cd56+nkt细胞和细胞。osu综合癌症中心和詹姆斯癌症医院的白血病组织库共享资源提供了主要的mm患者样本。对人类对象的所有工作均根据俄亥俄州立大学机构审查委员会批准的协议进行。小鼠：六至八周龄的nsg(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)小鼠购自jacksonlaboratories(barharbor,me,usa)，并用于所有体内研究。根据俄亥俄州立大学动物保健和使用委员会批准的方案进行所有动物工作。密切监测mm疾病的进展，并记录生存数据。在观察到后肢麻痹、嗜睡和明显的体重减轻后，处死小鼠。bcma-car、抗nkg2d-抗cs1bsab和bsab-bcmacar-慢病毒构建体的产生：对于bcmacar，用于重(vh)和轻(vl)链可变区的bcma编码结构域序列来源于杂交瘤并使用接头重组。vh-接头-vl片段与cd28–cd3ζ部分整合在框架中。将抗bcma-scfv-cd28-cd3ζ片段亚克隆到慢病毒载体pcdh中，以创建第二代pcdh-bcmacar构建体。为了制备抗nkg2d-抗cs1bsab慢病毒构建体，将通过来自人肌肉醛糖的非免疫原性蛋白接头35连接在一起的抗cs1单克隆抗体29和抗nkg2d抗体的两个密码子优化的单链可变片段(scfv)，克隆到pcdh慢病毒载体中。对于“一体化”的bsab-bcmacar，将抗bcma-scfv-cd28-cd3ζ-t2a盒整合到pcdh抗cs1-nkg2dbsab-ef1a-gfp中，以构建完整的pcdh-bcmacar-t2a-bsab-ef1a-gfp慢病毒构建体。t细胞的病毒产生和转导：如先前报道的方案中所述地进行慢病毒转染和感染36,37。稳定地表达cs1和bcma基因的k562细胞的产生：先前报道了30包含人cs1编码序列的全长pcdh-cmv-cs1-ef1α-gfp构建体。为了产生慢病毒，使用2000(invitrogen)将293t细胞与pcdh-cs1质粒或pcdh空载体质粒以及包装质粒pcmv-vsvg和pcmv-δr9共转染。然后收集慢病毒上清液，并使用先前公布的方案36,38感染k562细胞。然后使用facsariaii细胞分选仪(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)对gfp阳性细胞进行分选。bcma-k562是用携带全长bcmacdna的载体转导的k562细胞。使用上述方法进行慢病毒的产生、感染和分选。通过将pcdh-cmv-bcma-ef1α-gfp慢病毒构建体转导至上述cs1-k562细胞，从而产生cs1+bcma+k562细胞。将双重转导的细胞用apc-抗bcmamab染色，然后分选gfp+bcma+群体。在用于实验之前，这些gfp+bcma+双阳性细胞在培养物中经过了数次传代，以确保抗bcmamab结合的细胞丢失。流式细胞术分析：如先前报道地30进行细胞表面上car表达的检测。该研究中使用的抗体包括：fitc和生物素标记的山羊抗小鼠(fab)2多克隆抗体或正常的多克隆山羊免疫球蛋白g(igg)抗体(jacksonimmunoresearch)，结合有藻蓝蛋白(apc)的抗生蛋白链菌素(jacksonimmunoresearch)，结合有percp/cy5.5的抗生蛋白链菌素(biolegend)，pe、percp/cy5.5和bv421抗人cd3(hcd3，克隆ucht1和sk7，bdbiosciences)，apc和pe抗hcd56(克隆tuly56和cmssb，ebioscience)，fitc和pc5.5抗tcrpanγ/δ(克隆immu510，beckmancoulter,inc.ca,usa)，pc5抗-tcrpanα/β(克隆ip26a，beckman)，fitc抗tcrvγ9(克隆immu360，beckman)和pacificblue抗tcrvδ2(克隆immu389，beckman)，未结合的和apc抗hnkg2d(克隆1d11bdbiosciences)，pe-cy7抗hcd8(克隆sk1，bdbiosciences)，apc-cy7抗hcd4(克隆sk3，bdbiosciences)，bv421抗人cd1d(克隆cd1d42，bdoptibuild)，v450抗hcd11c(克隆b-ly6，bdhorizon)，apc-h7抗hcd19(克隆hib19，bdpharmingen)，apc-h7抗hcd20(克隆2h7，bdbiosciences)，fitc抗hcd45(克隆j.33，beckman)，生物素和fitc抗hcd14(克隆63d3和m5e2，biolegend)，生物素和pe抗hcd33(克隆p67.6，biolegend和wm53,bdpharmingen)，生物素抗hcd66b(克隆g10f5，biolegend)，未结合的和pe抗hcs1(克隆162，ebioscience)，apc抗hbcma(克隆19f2，biolegend)，pe抗ki67(sola15克隆，bdbiosciences)，pe-hcd69(fn50克隆，bdbiosciences)。细胞用含有4％牛血清白蛋白的pbs洗涤一次，在室温下用抗体染色20分钟，并用lsrii流式细胞仪(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)进行分析。免疫印迹：为了检测双特异性抗体的细胞内表达和分泌，收集来自这些细胞培养物的bsab转导的t细胞或bsab-cart细胞和无细胞的上清液，用于使用6x-his标记的mab(克隆4a12e4，invitrogen)进行免疫印迹。根据申请人先前报告的标准免疫印迹方案30,37进行免疫印迹。为了检测car的表达，裂解car转导的t细胞，提取蛋白质进行免疫印迹，如先前报道地30,37用小鼠抗人cd3ζmab(bdpharmingen)进行探测。细胞毒性测定：将细胞用51cr进行标记，并与转导的t细胞以不同的效应子：靶标比率(e:t)在96孔v型底板的孔中于37℃共培养4h，然后收集上清液以通过使用topcount计数器(canberrapackard)测量51cr从靶细胞中的释放。在研究bsab与pbmc结合的能力时，从订购自美国红十字会的leukopack中分离出cd3+t细胞、cd8+细胞毒性t细胞、γδt细胞、nkt细胞和nk细胞。用含有il-2(500u/ml)和il-15(500u/ml)的dynabeadstm人类t-活化剂cd3/cd28(4×104/μl,珠粒:t＝1:1)灌注t细胞5-14天，然后进行上述的标准4小时51cr释放测定。在细胞毒性试验之前，将人nk细胞通过il-2(500u/ml)激活。分离的人cd3+cd56+nkt细胞通过α-galcer(α-半乳糖神经酰胺,krn7000,enzobiocheminc.ny,usa.100ng/ml)与il-2(100u/ml)39活化7-10天。为了激活cd3+γδtcr+t细胞，使用hmbpp((e)-1-羟基-2-甲基-2-丁烯基4-焦磷酸酯,sigma.10nm)和il-2(100u/ml)40,41并培养14天。从leukopack中分离这些细胞的方案已获得俄亥俄州立大学机构审查委员会的批准。elisa：根据制造商的方案，使用购自r&dsystems(minneapolis,mn,usa)的试剂盒，通过酶联免疫吸附测定(elisa)测定培养上清液中人ifn-γ的存在。还通过elisa试剂盒(thermofisherscientific,ma,usa)测定培养物上清液中人il-2和tnf-α的水平。对于这些elisa分析，将来自患者的骨髓瘤细胞系或原代mm细胞的2.5×105个细胞与2.5×105个工程化或对照t细胞在96孔v底板中孵育24小时。使用synergyht酶标仪(biotek,winooski,vt,usa)在450nm读取数据。对具有mm的小鼠的体内治疗和生物发光成像：先前已经描述了30表达萤火虫荧光素酶基因的mm.1s骨髓瘤细胞mm.1s-gl3。为了建立异种移植原位mm模型，在第0天通过尾静脉静脉内注射向nsg小鼠(雄性)注入200μl盐水中的8×106个mm.1s-gl3细胞。第10、17和24天，给小鼠施用(1)媒介物对照(盐水)或10×106个效应细胞，包括(2)空载体转导的t细胞、(3)bsab转导的t细胞、(4)bcma–car转导的t细胞、(5)bsab和bcma-car依次转导的t细胞、或(6)bsab-car转导的t细胞，通过尾静脉静脉内注射，每次都溶于200μl生理盐水。接种mm.1s-gl3细胞后10天、24天、31天，将d-荧光素(150mg/kg体重；goldbiotechnology)腹膜内注射给所有小鼠。使用带有livingimage软件(perkinelmer)的体内成像系统(ivis)进行成像。在第80天，我们通过尾静脉向每只小鼠静脉内注射200μl生理盐水中的4×106个mm1.s细胞，从而攻击存活的小鼠。收集存活数据并在第140天关闭。为研究bsab的作用，在存在耗尽了人骨髓细胞的pbmc的情况下重复进行上述实验。为此，在第0天通过尾静脉向nsg小鼠静脉内注射在200ml生理盐水中的8×106个mm.1s-gl3细胞。在第10天，对小鼠施用3×106个各种转导t细胞，然后给予3×106cd33─cd14─cd66b─人类pbmc，全部都静脉内注射。在第17和24天，小鼠静脉内注射接受了由同一供体产生的3×106个工程改造的t细胞。在第10天、第19天、第28天和第37天，给小鼠注入d-荧光素并如上所述进行成像。通过免疫荧光显微镜法检测的免疫突触：主要是为了标记分泌的抗nkg2d-抗cs1bsab，收集来自bsabcart细胞的上清液，并用6x-histagmab(克隆4e3d10h2/e3，invitrogen)染色在37℃下以1：500的稀释比例温育1小时，然后用alexa350(蓝色，thermofisherscientific,ma,usa)进行标记。收获mm.1s细胞，并在生长条件下与celltrackertm深红染料(20μm,thermofisherscientific)一起孵育45分钟。为了观察免疫突触，将bsab-cart细胞(gfp，绿色)或空载体转导的对照t细胞(gfp，绿色)与mm.1s细胞(红色)和histag标记的上清液共培养1h或24小时。通过蔡司显微镜系统(zeissaxioobserverz1,carlzeissinc.,ny,usa)观察活细胞荧光成像。为了进行视频拍摄，将bsab-cart细胞(gfp，绿色)或空载体转导的t细胞(gfp，绿色)与mm.1s细胞(红色)共培养1h，并在2小时内用显微镜观察免疫突触。结果：表达bcma特异性car和/或抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体的原代t细胞的产生：申请人产生了具有慢病毒载体骨架的特异性bcma-car构建体，其依次由信号肽(sp)、重链可变区(vh)、甘氨酸-丝氨酸(gs)接头、轻链可变区(vl)、myc标签、铰链、cd28和cd3ζ组成(图1a)。接下来，申请人设计了具有慢病毒载体骨架的抗nkg2d-抗cs1双特异性抗体(称为“bsab”)构建体。它由来自抗nkg2d抗体和抗cs1单克隆抗体的两个密码子优化的单链可变片段(scfv)组成，它们通过衍生自人肌肉醛糖的非免疫原性蛋白质接头连接在一起。每个scfv包含通过甘氨酸-丝氨酸(gs)接头连接的相应的重链(vh)和轻链(vl)(图1b)。从健康供体中分离并被抗人cd3/cd28抗体珠激活的相同的供体t细胞用空载体(ev)、bsab构建体、bcma-car构建体转导，或先用bsab构建体转导后用bcma-car构建体进行转导(此后称为bsab-bcmaseq.trans.t构建体)。通过用抗fab染色转导的t细胞来证明bcmacar在细胞表面的表达，其在用bcmacar构建体或bsab-bcmaseq.trans.t细胞构建体转导的80％以上的facs富集的t细胞上检测到scfv的表达，而在未经修饰的t细胞、ev转导的t细胞和bsabt细胞上的表达几乎不可检测(图1c)。为了确定是否成功转导了bsabt细胞和bsab-bcmaseq.trans.t细胞，收获了来自4天培养物的无细胞上清液，并裂解了来自4天培养物的细胞沉淀。然后使用6x-his标记的ab对上清液和细胞裂解物进行免疫印迹。结果显示bsab-t细胞和bsab-bcmaseq.trans.t细胞产生细胞的和分泌的bsab，而未经修饰的t细胞上清液和裂解液的对照则不产生bsab(图1d)。与单独用每种载体在体外转导的t细胞相比，bsab-bcmaseq.trans.t细胞是更有效的mm杀伤剂：由于bsab包含抗nkg2d受体部分和抗cs1部分，因此申请人尝试在nkg2d+溶细胞免疫细胞上触发nkg2d激活，并且测试了它是否同时通过mm相关抗原cs1与mm细胞结合。申请人首先通过流式细胞术分析评估了三种常用的mm细胞系mm.1s、h929、rpmi-8226和人红白血病细胞系k562中cs1和bcma的表面表达。结果显示在四个mm细胞系上的bcma和cs1表达水平不同。mm1.smm细胞系同时具有bcma和cs1的高水平表达；h929mm细胞系具有高水平的bcma和中等(int)水平的cs1表达；而rpmi-8226mm细胞系具有中等水平的bcma表达，而其cs1表达非常低。作为阴性对照，k562红白血病细胞系在细胞表面上既不表达cs1也不表达bcma(图2a)。为了确定上述bsab-bcmaseq.trans.t细胞(用bcmacar和抗nkg2d-抗cs1bsab依次转导)是否可导致mm细胞系更有效的肿瘤细胞裂解，使用k562红白血病细胞系作为阴性目标对照进行了标准的4小时51cr释放测定。在产生单个构建体工程改造的bsab-cart细胞之前，申请人比较了五组t细胞中的mm肿瘤细胞杀伤情况：(1)未经修饰的t细胞，(2)空载体(ev)转导的t细胞(evt)(3)抗nkg2d-抗cs1-bsab转导的t细胞(以下简称bsabt)，(4)bcma-car转化的t细胞(以下称为bcma-cart)和(5)抗nkg2d-抗cs1bsab和bcma-car依次转导的t细胞(称为bsab-bcmaseq.trans.t)。对于目标mm细胞系bcmahighcs1highmm.1s和bcmahighcs1inth929，bsab-bcmaseq.trans.t细胞的杀伤力明显优于bsabt细胞或bcma-cart细胞。对于目标mm细胞系bcmaintcs1lowrpmi-8226，bsab-bcmaseq.trans.t细胞的性能优于bsabt细胞，但不优于bcma-cart细胞。重要的是，单一或组合抗原靶向都没有针对阴性对照k562红白血病靶细胞系的活性(图2b)。值得注意的是，与bsabt细胞、evt细胞和未经修饰的t细胞的作用相比，bcma-cart细胞在裂解mm目标细胞方面更有效。统计分析表明，当目标mm细胞系表达中等至高水平的cs1和bcma(即mm1.s和h929)时，对于用效应细胞的bsab-bcmaseq.trans.t细胞群进行的细胞毒性试验观察到协同效应，而当目标细胞表达中低水平的两种抗原(即rpmi-8226)时则未观察到这种效应(图2b)。为了进一步确定在识别内源表达cs1和bcma的mm细胞后上述转导的t细胞的活化，申请人测量了未经修饰的t细胞、evt细胞、bcma-cart细胞、bsabt细胞和bsab-bcmaseq.trans.t细胞上清液中ifn-α、il-2和tnf-α的分泌。在与bcmahighcs1highmm.1s或bcmahighcs1inth929mm细胞系共培养时，bsab-bcmaseq.trans.t细胞的ifn-γ分泌明显高于单独的bsabt细胞或bcmacart细胞。在与bcmaintcs1lowrpmi-8226mm细胞系共培养的条件下，bsab-bcmaseq.trans.t细胞的ifn-γ分泌显著高于bsabt细胞，但与bcmat细胞相比并不显著更高。在与cs1─bcma─k562红白血病细胞系或无肿瘤靶细胞的共培养条件下，bsab-bcmaseq.trans.t细胞不优于bsabt细胞或bcma-cart细胞的单一抗原靶向(图2c)。在与mm.1s、h929或rpmi-8226mm细胞系共培养时，bsabt细胞、bcma-cart细胞或bsab-bcmaseq.trans.t细胞中il-2的产生显著高于未经修饰的t细胞或evt细胞(图2d)。有趣的是，即使在与阴性对照k562红白血病细胞系或无靶细胞共培养的情况下，bsabt细胞和bsab-bcmaseq.trans.t细胞分泌高水平的il-2，该水平显著高于bcmacart细胞中所见的il-2分泌(图2d)，这表明至少在这种情况下，这种作用似乎是由于存在分泌的bsab本身，而不是来自mm靶标细胞。tnf-α的分泌与ifn-γ的分泌一致(图2e)。总体而言，这些结果表明，与bsabt细胞或bcma-cart细胞相比，bsab-bcmaseq.trans.t细胞可以更特异性地识别mm靶细胞，并且在识别这些mm细胞后变得更加活化。此外，与其他条件相比，申请人还注意到，从bsabt细胞或bsab-bcmaseq.trans.t细胞分泌的bsab似乎触发t细胞活化，而不管是否存在mm细胞，这是通过与不表达bsab构建体的t细胞相比其高度丰富的il-2产生来证明的(图2d)。这表明在细胞毒性cd8(+)t细胞上表达的nkg2d受体被分泌的bsab激活。生成单一构建体工程改造的bsab-cart细胞以同时靶向mm中的bcma和cs1：申请人指出，与表达bcma-car或bsab的t细胞相比，由两个单独的构建体递送的共表达bcma-car和抗nkg2d-抗cs1bsab的t细胞(即bsab-bcmaseq.trans.t细胞)在杀死mm细胞方面表现优异。同时表达bsab和car的单一构建体(以下称为bsab-car)在以下方面更为实用：(1)在单个t细胞中产生两种构建体的有效表达；(2)降低制造成本；以及(3)节省时间。因此，申请人产生了单一的bsab-car构建体，该构建体在慢病毒载体主链中包含通过t2a连接的两个部分(图3a)。为了产生表达bsab-car的原代t细胞，申请人利用上述相同的方法，然后确定bsab-car转导的t细胞是否被成功转导。通过流式细胞术分析证实了car的表面表达(图21c)。在第4天，使用6x-his标记的ab在细胞裂解液和无血清培养基中成功检测到bsab融合蛋白(图3b)。另外，为了动态测量bsab分泌，申请人在第5天将bsab-cart细胞重新接种到无血清培养基中，然后在12h、24h、48h、72h和96h收集无细胞上清液。结果表明，bsab分泌很有效，因为表达在12h之前开始并以时间依赖性方式持续增加(图21a-b)。申请人随后证明，与evt细胞和未经修饰的t细胞的杀伤作用相比，未分级的bsab-cart细胞对bcmahighcs1highmm细胞系mm.1s的杀伤作用明显更好(图3c)。针对bcmahighcs1inth929和bcmaintcs1lowrpmi-8226mm靶细胞系获得了相似的结果，而对阴性对照k562红白血病细胞系没有杀伤力(图21d)。由于大约80％的cd8+t细胞具有高的nkg2d表面密度表达(vs.未分级的t细胞的30％；图11a)，因此申请人用bsab-car构建体转导至高度富集的cd8+t细胞。也许可以预见，申请人发现对于bcmahighcs1highmm.1smm细胞系，这些细胞具有比cd8+bsabt细胞和cd8+bcma-cart细胞更高的细胞毒性，以及比两个阴性对照(未经修饰的t细胞和evt细胞)更高的细胞毒性(图3d)。cart细胞分泌的bsab需要两种抗原才能起作用：在肿瘤细胞上表达的cs1和在免疫细胞上表达的nkg2d。申请人首先评估了pbmc中tcrpanα/βcd3+t、tcrpanγ/δcd3+t、cd3+cd56+nkt和cd3-cd56+nk细胞的百分比，其分别占pbmc的约50％、1％、8％和15％(图11a)。此外，申请人证实，nkg2d在大约30％的t细胞、80％的cd8+t细胞、70％的γδt细胞、60％的nkt细胞和90％的nk细胞上表达。值得注意的是，近90％的vγ9vδ2t细胞(γδt细胞的一个亚群)表达了nkg2d(图11b和11c)。为了确定抗nkg2d-抗cs1bsab是否触发nkg2d+免疫细胞，申请人以10个效应物(转导或未经修饰的t细胞)比1个靶细胞(mm.1s)的比率进行了如上所述的4小时铬51释放测定，但添加了不同数量(即肿瘤细胞的1倍、10倍、100倍或200倍)的人pbmc。申请人假设，如果从bsabt细胞和/或bsab-cart细胞分泌的bsab正在将未转导的nkg2d+细胞溶解效应细胞募集到cs1+mm细胞系靶标中，则靶标的杀伤作用会由添加非转导的pbmc而随着稀释度的增加而增加。为了支持其假设，随着非转导的pbmc的增加，只有含有分泌bsab的经转导的t细胞(即bsabt细胞和bsab-cart细胞)的培养物显示出对bcmahighcs1highmm.1smm细胞系的细胞毒性增加(图3e)。可以预见，与mm.1smm细胞系相比，对cs1表达较低的bcmahighcs1inth929细胞系的影响较小，而对bcmaintcs1lowrpmi-8226mm目标细胞系则没有影响(图12a、12b)。申请人接下来将pbmc的每个亚群(即nk细胞、nkt细胞、cd8+t细胞和γ9vδ2t细胞)富集至接近98％的纯度(图13)，并对其分别用il-2、calcer加上il-2、cd3/cd28dynabeads加上il-2、以及hmbpp加上il-2进行初免，并分别用对照或实验载体之一进行转导，然后对每个都以5:1的e:t比率针对bcmahighcs1highmm.1smm细胞系进行4h(图3f，左)或16h(图3f，右)51cr释放细胞毒性试验。在孵育四个或更多个小时后，结果表明，bsabcart细胞的细胞毒性明显高于其他构建体转导的相同细胞，而不管t细胞亚群或激活方法(图3f和14)。重要的是，在所检查的bsabcart细胞群中，与对照细胞相比，活化的cd4+bsabcart细胞的细胞毒活性增加最少(图3f右侧和图14)，这可能至少部分是由于该群体上nkg2d表达的表面密度较低。为了确定由bsab-cart细胞分泌的bsab是否可以诱导bsab-cart细胞和mm.1smm细胞之间的突触形成，在共孵育一小时后进行了共聚焦显微镜分析。当观察evt细胞和mm.1smm细胞共培养的对照时，未观察到突触(图3g)。相反，在bsab-cart细胞和mm.1smm细胞共培养期间观察到突触(图3h)。此外，当观察bsabcar-t细胞(绿色)与靶mm.1smm细胞(红色)共培养24小时时，申请人注意到，仅存在bsabcar-t细胞群(绿色)(图15a-f)；然而，在evt细胞和mm.1smm细胞的共培养中，靶mm.1smm细胞和效应evt细胞(绿色)仍然存在(图15g-m)。bsab-cart细胞在功能上增强的识别和激活是cs1和bcma依赖性的：为了证明bsab-cart细胞的增强的细胞毒性作用依赖于靶向肿瘤抗原，接下来申请人探索了bsab-cart细胞抗性k562细胞系中cs1和bcma的强制过表达是否可以降低其针对该效应群体裂解的阈值。为此，申请人用编码人cs1和bcma的慢病毒(或空载体pcdh作为对照)依次转导k562细胞，以产生异位表达cs1和bcma的k562细胞系(图16)。在确认成功产生靶细胞系后(图4a)，申请人进行了51cr释放测定，结果表明k562红白血病细胞系中cs1和bcma的过表达导致与使用evt细胞的细胞毒性相比，bsab-cart细胞对该k562细胞系的细胞毒性活性显著增加(图4b，紫色线)。申请人接下来进行了elisa分析，显示出与evt细胞和k562-cs1-bcma细胞的共培养相比，bsab-cart细胞和k562-cs1-bcma细胞的共培养中ifn-γ和il-2分泌增加(图4c，4d)。但是，将bsab-cart细胞和evt细胞与k562-pcdh孵育后，在两种细胞之间在细胞毒性、ifn-γ和il-2产生方面没有差异(图4b-d)。总体而言，这些数据表明，bsab-cart细胞对靶细胞的识别、杀伤和细胞因子分泌的增加以cs1和bcma依赖性方式发生。分泌的抗nkg2d-抗cs1bsab通过nkg2d信号传导增强体外cart细胞增殖以及体内存活和增殖：在某些患者中，由于有限的扩增和存活能力，cart细胞不能存活很长时间，这可能会限制这些细胞的效力42。出乎意料的是，申请人发现，bsab转导的t细胞和bsab-cart细胞的培养基在相同时间点与没有bsab的其他条件相比酸性更强，表明细胞代谢率更高(图5a，顶部)。该观察结果与上述数据一致，即即使没有靶细胞或有bcma-cs1-靶细胞，这些bsab转导的细胞也可以分泌更多的细胞因子(图2d)。申请人推测，bsab的表达和分泌可以诱导t细胞增殖、存活和/或其活化。细胞计数证实，与其他培养条件相比，含有用bsab或bsab-car构建体转导的t细胞的培养条件确实包含显著更大量的细胞(图5a，条形图)，这是由如通过紫染料细胞追踪器所记录的t细胞增殖所致，并以v450稀释度显示在下方小图的直方图中(图5a，直方图)。为了证实这些出乎意料的结果，申请人将来自图5a所示的bsab-cart细胞培养物的上清液添加到没有bsab的细胞培养条件下(即bcmacart细胞、evt细胞和未经修饰的t细胞)。实际上，如细胞周转时培养基的黄色所证实的，与未添加bsab-cart细胞培养基上清液的bcmacart细胞、evt细胞和未经修饰t细胞的培养物(未显示)相比，添加bsab-cart细胞培养物的上清液可在培养5天后导致细胞代谢程度显著提高。细胞计数证实，与其他培养条件相比，补充有bsab-cart细胞培养的培养条件的确包含显著更大量的细胞(图5b，顶部)，这是由如紫染料细胞追踪器所记录的t细胞增殖所致，并以v450稀释度显示在下方小图的直方图中(图5b，底部)。ki67染色表明，在含有bsabt细胞或bsab-cart细胞的培养物中，绝大多数nkg2d+细胞正在增殖，近一半的nkg2d-细胞也在增殖(图5c和图17a)，表明bsab活化的nkg2d+细胞可以反过来活化nkg2d-细胞，尽管程度较小。此外，nkg2d阻断抗体减轻了分泌的bsab的增殖作用(图5c蓝色方框，图17b)。进行了免疫印迹分析以确定akt蛋白的磷酸化(p)，证实了分泌的bsab在bsabt和bsab-cart细胞培养条件下可以触发nkg2d+细胞增殖和激活，因为这些条件具有较高的p-akt水平(图5d)。迄今为止，所提供的数据支持以下观点：bsab激活nkg2d+免疫细胞是通过nkg2d途径进行的。申请人接着询问激活是否通过cs1发生，cs1不仅在mm细胞上表达，而且在nk、nkt、cd8+t和b细胞或其亚群上表达。(veilletteandguocritrevoncolhematol.2013oct；88(1):168-77.doi:10.1016/j.critrevonc.2013.04.003.epub2013jun2；gogishvilietal.blood.2017dec28；130(26):2838-2847.doi:10.1182/blood-2017-04-778423.epub2017oct31.)。为了确定分泌的bsab是否也通过其cs1的表达以及通过cs1+信号传导途径刺激nkg2d+免疫细胞，申请人接着使用抗cs1阻断抗体阻断了该途径。申请人发现cs1阻断并不影响免疫细胞的激活状态(图17c)。此外，申请人进行了nkg2d和cs1双重阻断，结果表明与nkg2d单一阻断相比没有差异(数据未显示)。总体而言，这些数据表明分泌bsab的免疫细胞的激活仅通过nkg2d信号传导途径发生。基于以上发现，申请人已经预期，在t细胞与靶群体mm.1smm细胞的共培养中，免疫激活将不严格依赖于nkg2d，也不限于t细胞的nkg2d+亚群。例如，当将bsabt和bsab-cart细胞与mm.1smm细胞共培养时，如通过ki67染色所测量的，cd3+t细胞的nkg2d+(图5e中的红色；83％至94％)和nkg2d-(图5e中的绿色；79％至87％)级分均显示出广泛的增殖。同样，对于仅表达bcmacar的cd3+t细胞(在图5e中表示为fab+)，如ki67染色所测量的，cd3+t细胞的nkg2d+(红色；90.4％)和nkg2d-(绿色；85.8％)级分均显示出广泛的增殖，尽管比nkg2d+和nkg2d-bsab-cart细胞所见略少。为了研究转导的t细胞在体外存活的能力，申请人在存在或不存在il-2的情况下培养了各种转导的t细胞。在il-2条件下，所有细胞均显示高的ki67表达和低的膜联蛋白v和/或sytoxblue表达(图6a)。有趣的是，在缺乏il-2的条件下(图6b)，只有bsabt细胞和bsab-cart细胞(它们分泌bsab并通过nkg2d激活t细胞)显示出更好的增殖能力，大约80％的ki67表达，这与图2d中显示的数据一致，并且与如annexinv和/或sytoxblue染色的低表达所说明的细胞凋亡和死亡减少一致(图6b)。将这些结果与其他三组(未经修饰的t细胞、evt细胞和bcma-cart细胞，也在图6c中)进行了比较。因此，bsab-cart具有增强的细胞增殖和增强的细胞存活，这很可能是通过nkg2d信号传导通路。为了比较未经修饰的t细胞、evt细胞、bcmacart细胞和bsab-cart细胞在体内的存活和增殖，申请人将这些人类细胞注射(静脉内(i.v.))到免疫缺陷的nsg小鼠中(图7a，上)。在第-1天也评估了在静脉内注射人细胞之前的背景染色(图7a和图18)。在第+1天，接受每次人t细胞注射的小鼠显示出相等的人cd3表达，并且两个cart细胞群也通过其f(ab)2表达来鉴定。此外，在从nsg小鼠中分离出的全部四个t细胞群中的97％上检测到了激活标记cd69(图7a和图18)。有趣的是，在输注t细胞后14天，只有bsab-cart细胞组保留了其cd3和cd69的高共表达，而其他三组中cd69的表达却大大降低(图7a和图18)。统计分析表明，bsab-cart细胞组中的cd3和cd3+cd69+t细胞的第+14天的百分比显著高于其他3组(图7b和7c)。各种转导的t细胞注射后第35天，直方图显示，只有注射bsab-cart细胞的小鼠仍具有高百分比的hcd3t细胞(图7b)。体内增殖数据显示，ki67+cd69+百分比约为61.1％，显著高于接受非转导或转导t细胞的其他三个组(图7a紫色等高线小图，图7c)。此外，申请人还确定了bsab-cart细胞在体内的存活率，并观察到活的(annexinv-sytoxblue-)bsab-cart细胞的百分比约为87％，而死亡的(annexinv+sytoxblue+)bsab-cart细胞的百分比约为5％。统计分析表明，与其他三组相比，bsab-cart细胞拥有更高比例的活细胞和更低比例的死细胞(图7d)。综上所述，与其他注射细胞组(包括bcmacart细胞)相比，bsab-cart细胞不仅在体外通过nkg2d信号传导通路显示出增强的细胞增殖，而且在体内显示出增强的增殖和存活。体外bsab-cart细胞对原发性骨髓瘤细胞的识别和杀伤力的改善：为了评估bsab-cart细胞的临床相关性，申请人研究了它们是否可以有效地识别和杀死从患者分离的mm细胞并增强ifn-γ离体生产。使用正磁选择分离了从八名患者的骨髓中获得的原代cd138+mm细胞，并使用流式细胞仪评估了bcma和cs1的表面表达(图8a)。使用在没有自体pbmc的情况下进行的51cr释放测定，申请人观察到，来自患者的mm细胞在所有八名患者中均对ev转导的t细胞介导的裂解具有高度抗性。与bcmacart细胞或bsabt细胞相比，bsab-cart细胞在所有八名接受测试的患者中均表现出明显更高的细胞毒性，其中包括其肿瘤细胞表面cs1表达极低的患者1。在bsab-cart细胞和bsab-bcmaseq.trans.t细胞之间在溶细胞活性上没有显著差异(图8b)。申请人还在类似的共培养试验中24小时后测量了ifn-γ。与ev转导的t细胞、bsabt细胞或bcma-cart细胞相比，bsab-cart细胞还分泌出更高水平的ifn-γ(图8c)。这些发现表明，bsab-cart细胞具有极好的能力以在体外根除患者的mm细胞。在原位异种移植mm模型中，bsab-cart细胞抑制mm肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的存活：为了进一步解决bsab-cart细胞的潜在治疗应用，申请人检查了它们在mm.1smm移植的nsg小鼠模型中的抗肿瘤活性。静脉内注射mm.1smm细胞已被广泛用于建立mm小鼠异种移植模型，因为它可以导致骨髓移植以及一致建立多焦点溶骨性病变，从而密切概括了人类mm43,44。为了促进对肿瘤生长的监测，申请人改造了mm.1smm细胞以通过逆转录病毒感染来表达gfp和萤火虫荧光素酶，并在如先前报道的30，在第0天使用8x106个这些mm细胞的静脉内注射来植入nsg小鼠。然后，在3种场合下(第10天、第17天和第24天)对这些小鼠进行静脉内输注盐水或1x107evt细胞、1x107bsabt细胞、1x107bcmacart细胞、1x107bsab-bcmaseq.trans.t细胞、或1x107bsab-cart细胞。对于存活至80天的小鼠，申请人收集了外周血淋巴细胞，并用1x104mm.1smm细胞再次攻击了小鼠。使用生物发光成像来监测mm.1smm的生长，并显示所有六个治疗组中直至31天的早期疾病进展(图9a)。使用抗f(ab)2抗体来鉴定bcmacart细胞，申请人在第80天注意到，mm.1smm小鼠血液中bsab-bcmaseq.trans.t细胞和bsab-cart细胞的百分比显著高于bcmacart(图9b)，而每只小鼠的总淋巴细胞计数相似(数据未显示)。免疫印迹表明，bsab-bcmaseq.trans.t细胞或bsab-cart细胞治疗的第80天的mm.1smm小鼠的血清中仍含有分泌的bsab(未显示)。到第80天，与用盐水对照、evt细胞或bsabt细胞治疗的类似小鼠相比，用bsab-bcmaseq.trans.t细胞或bsab-cart细胞治疗的mm.1smm小鼠的存活时间显著延长。接受bcmacart细胞治疗的mm.1smm小鼠比接受bsab-bcmaseq.trans.t细胞或bsab-cart细胞治疗的mm.1smm小鼠稍差(图9d)。在第140天(第一次肿瘤再攻击后60天)，接受bsab-cart组治疗的mm.1smm小鼠中的全部五只均存活(图9d)。肿瘤再攻击后的这些存活数据可能表明，以上图7中指出的bsab-cart细胞的体内存活率提高和体内增殖增强。总体而言，这些结果表明，bsab-cart细胞在原位异种mm模型中抑制mm肿瘤生长和延长荷瘤小鼠存活的能力优于其他非转导或转导的t细胞群体。为了确定人非转导的nkg2d+淋巴细胞在原位异种移植mm模型中的相关性(即，图3e中所示的体外实验的体内对应物)，接下来，申请人检查了盐水对照、evt细胞、bcmacart细胞、或bsab-cart细胞在携带mm.1smm的nsg小鼠中的抗肿瘤功效，同时共注射了从同一供体中分离的骨髓细胞耗尽的pbmc。通过分选去除骨髓细胞以避免gvhd(图10a、10b)。注射mm.1smm细胞、正常人淋巴细胞和各种转导的t细胞的方案如图10a所示，该图也是记录了mm在第37天的进展成像过程。图10b和10c说明了这些小鼠的血液中检测到的人类淋巴细胞的百分比。在这些条件下经过额外的时间，申请人发现，在使用bcmacart细胞(不分泌bsab；到第100天存活率为0％)治疗的小鼠与使用bsab-cart细胞(确实分泌bsab；在第140天存活率为100％；图10d)治疗的小鼠之间存在显著差异。这些数据表明，涉及的nkg2d+免疫细胞越多，则bsab-cart细胞对根除肿瘤的功效就越好。等效物除非另有定义，否则本文所用的所有的技术和科学的术语都具有如本发明的所属领域中的普通技术人员中的一个通常所理解的相同的含义。可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本技术。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术的范围之内各种变化都是可能的。因此，应该理解的是，在此提供的材料、方法和例子是优选的方面的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。本文广泛地和一般地描述了本技术。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本技术的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本技术的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。此外，在以马库什组描述本技术的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本技术。在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。在以下权利要求中阐述了其他方面。参考文献1.grupp,s.a.,etal.chimericantigenreceptor-modifiedtcellsforacutelymphoidleukemia.thenewenglandjournalofmedicine368,1509-1518(2013).2.maude,s.l.,etal.chimericantigenreceptortcellsforsustainedremissionsinleukemia.nengljmed371,1507-1517(2014).3.porter,d.l.,levine,b.l.,kalos,m.,bagg,a.&june,c.h.chimericantigenreceptor-modifiedtcellsinchroniclymphoidleukemia.thenewenglandjournalofmedicine365,725-733(2011).4.brown,c.e.,etal.regressionofglioblastomaafterchimericantigenreceptort-celltherapy.nengljmed375,2561-2569(2016).5.velasquez,m.p.,bonifant,c.l.&gottschalk,s.redirectingtcellstohematologicalmalignancieswithbispecificantibodies.blood131,30-38(2018).6.maude,s.&barrett,d.m.currentstatusofchimericantigenreceptortherapyforhaematologicalmalignancies.brjhaematol172,11-22(2016).7.brentjens,r.j.,etal.cd19-targetedtcellsrapidlyinducemolecularremissionsinadultswithchemotherapy-refractoryacutelymphoblasticleukemia.scitranslmed5,177ra138(2013).8.porter,d.l.,etal.chimericantigenreceptortcellspersistandinducesustainedremissionsinrelapsedrefractorychroniclymphocyticleukemia.scitranslmed7,303ra139(2015).9.oak,e.&bartlett,n.l.blinatumomabforthetreatmentofb-celllymphoma.expertopininvestigdrugs24,715-724(2015).10.vonstackelberg,a.,etal.phasei/phaseiistudyofblinatumomabinpediatricpatientswithrelapsed/refractoryacutelymphoblasticleukemia.jclinoncol34,4381-4389(2016).11.raulet,d.h.rolesofthenkg2dimmunoreceptoranditsligands.natrevimmunol3,781-790(2003).12.groh,v.,etal.costimulationofcd8alphabetatcellsbynkg2dviaengagementbymicinducedonvirus-infectedcells.natimmunol2,255-260(2001).13.palumbo,a.&anderson,k.multiplemyeloma.nengljmed364,1046-1060(2011).14.dimopoulos,m.a.,etal.daratumumab,lenalidomide,anddexamethasoneformultiplemyeloma.nengljmed375,1319-1331(2016).15.vandedonk,n.w.,kamps,s.,mutis,t.&lokhorst,h.m.monoclonalantibody-basedtherapyasanewtreatmentstrategyinmultiplemyeloma.leukemia26,199-213(2012).16.caligiuri,m.a.humannaturalkillercells.blood112,461-469(2008).17.benson,d.m.,etal.thepd-1/pd-l1axismodulatesthenaturalkillercellversusmultiplemyelomaeffect:atherapeutictargetforct-011,anovelmonoclonalanti-pd-1antibody.blood116,2286-2294(2010).18.godfrey,j.&benson,d.m.theroleofnaturalkillercellsinimmunityagainstmultiplemyeloma.leuklymphoma53,1666-1676(2012).19.szmania,s.,etal.exvivo-expandednaturalkillercellsdemonstraterobustproliferationinvivoinhigh-riskrelapsedmultiplemyelomapatients.jimmunother38,24-36(2015).20.ruggeri,l.,mancusi,a.,capanni,m.,martelli,m.f.&velardi,a.exploitationofalloreactivenkcellsinadoptiveimmunotherapyofcancer.currentopinioninimmunology17,211-217(2005).21.felgar,r.e.&hiserodt,j.c.invivomigrationandtissuelocalizationofhighlypurifiedlymphokine-activatedkillercells(a-lakcells)intumor-bearingrats.cellimmunol129,288-298(1990).22.brand,j.m.,etal.kineticsandorgandistributionofallogeneicnaturalkillerlymphocytestransfusedintopatientssufferingfromrenalcellcarcinoma.stemcellsdev13,307-314(2004).23.champsaur,m.&lanier,l.l.effectofnkg2dligandexpressiononhostimmuneresponses.immunologicalreviews235,267-285(2010).24.avery,d.t.,etal.baffselectivelyenhancesthesurvivalofplasmablastsgeneratedfromhumanmemorybcells.jclininvest112,286-297(2003).25.chiu,a.,etal.hodgkinlymphomacellsexpresstaciandbcmareceptorsandgeneratesurvivalandproliferationsignalsinresponsetobaffandapril.blood1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