脱髓鞘疾病的治疗的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35u.s.c.§119要求于2018年1月11日提交的美国临时申请62/616,173的优先权，所述美国临时申请的整个内容通过引用并入本文。
本文描述了用于使用类固醇激素和声波刺猬信号传导路径调节剂治疗脱髓鞘疾病的组合物和方法。
背景技术：
髓磷脂是围绕某些神经细胞的轴突从而形成电隔离层的脂肪白色物质。在人体中，大脑的大约40％含有白质，所述白质包括密集堆积的纤维，其中髓磷脂是主要成分(白质的50-60％的干重量)。髓磷脂是由中枢神经系统(cns)中的少突胶质细胞(ol)合成和维持的。少突胶质细胞是神经胶质细胞的一种类型，其起到为cns中的轴突提供支持和隔离的作用。少突胶质细胞是由少突胶质细胞前体细胞(opc)产生的并且仅发现于cns中。
在脱髓鞘疾病中，神经系统的神经元的髓磷脂鞘被损坏。此破坏可能会损害受影响的神经中的信号的传导，从而导致例如感觉、运动、认知和其它功能的缺乏，所述缺乏取决于所涉及的神经。在各种脱髓鞘疾病中，多发性硬化症(ms)是全球年轻成年人中最普遍的致残性神经病状。多发性硬化症基金会(multiplesclerosisfoundation)估计在美国超过400,000人并且全球约250万人患有ms。在美国，每周会诊断出大约200例新病例。其是一种在治疗上昂贵的疾病，并且在美国，直接和间接医疗费用的范围为每名患者每年8528美元到54244美元。
多发性硬化症会破坏部分神经系统通信的能力，从而导致一系列的生理问题、心理问题以及有时的精神问题。对于ms尚无已知治疗方法，但是当前的治疗尝试改善发作后的功能并且防止新发作。用于治疗ms的大多数药物在复发缓解性形式的疾病中可能有效，但是通常在表征为轴突的慢性脱髓鞘的进行性形式中无效。尽管最近显示免疫调节剂奥瑞珠单抗(ocrelizumab)在进行性形式中有效，但奥瑞珠单抗与主要潜在副作用相关联并且耐受性差。参见montalbanx.等人,“原发进行性多发性硬化症中的奥瑞朱单抗对安慰剂”,《新英格兰医药杂志》(newenglandjournalofmedicine)376209-220(2017)。
在另一种方法中，us2013/0226133描述了一种使用硫酸光千金藤碱恢复神经纤维的髓磷脂鞘的方法。在另一种方法中，us2004/0141947公开了一种用于使用集落刺激因子或集落刺激因子样配体，如沙格司亭(sargramostim)(1型干扰素同源物)和至少一种另外的治疗剂治疗脱髓鞘cns疾病的方法。在另一种方法中，us2004/0053850描述了一种通过共同施用三肽gly-pro-glu和ampa(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸)/红藻氨酸拮抗剂化合物来治疗cns的脱髓鞘疾病的方法。在另一种方法中，美国专利第4,760,092号要求保护一种使用秋水仙素或秋水仙碱治疗如多发性硬化症等脱髓鞘疾病的方法。在另一种方法中，us2013/0302410描述了一种在脱髓鞘疾病中使用富马酸二甲酯或富马酸单甲酯进行神经保护的方法。在另一种方法中，us2013/0108643描述了一种使用巨噬细胞清道夫受体1类msr1的抑制剂治疗自身免疫疾病或炎性疾病的方法。在另一种方法中，ep0423943描述了使用哺乳动物的胶原酶家族的成员的抑制剂来治疗脱髓鞘疾病。
尽管有这些提出的方法，但是仍然需要促进患有如ms等脱髓鞘疾病的受试者体内的髓鞘再生的方法。
技术实现要素：
根据一些实施例，提供了促进有需要的受试者体内的髓鞘再生的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂。在一些实施例中，所述类固醇激素为如睾酮等雄激素受体配体、如黄体酮或别孕烯醇酮等黄体酮受体配体、如雌二醇等雌激素受体配体，或为脱氢表雄酮，或为选择性激素受体调节剂，如选择性雄激素受体调节剂、选择性雌激素受体调节剂或选择性黄体酮受体调节剂。在一些实施例中，所述刺猬信号传导路径调节剂为smoothened(smo)激动剂，如3-氯-n-[反式-4-(甲基氨基)环己基]-n-[[3-(4-吡啶基)苯基]甲基]苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(sag)。在一些实施例中，所述刺猬信号传导路径调节剂为刺猬信号传导路径拮抗剂，如gli拮抗剂。在一些实施例中，所述刺猬信号传导路径拮抗剂为2,2'-[[二氢-2-(4-吡啶基)-1,3(2h,4h)-嘧啶二基]双(亚甲基)]双[n,n-二甲基苯胺](gant-61)。在一些实施例中，其中所述方法包括施用smo激动剂和gli拮抗剂两者，如smo激动剂为sag和所述gli拮抗剂gant-61。
在一些实施例中，所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂以单独组合物的形式基本上同时或依序施用。在其它实施例中，所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂以同一组合物的形式施用。
在一些实施例中，所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂中的一种或两种在鼻内以鼻内药物组合物的形式施用，所述鼻内药物组合物进一步包括：(a)以调配物的约60重量％到约98重量％的量存在的至少一种亲脂性或部分亲脂性载剂；(b)以调配物的约1重量％到约20重量％的量存在的至少一种具有表面张力降低活性的化合物；以及(c)以调配物的约0.5重量％到约10重量％的量存在的至少一种粘度调节剂。在一些实施例中，所述鼻内药物组合物包括所述类固醇激素。在一些实施例中，所述鼻内药物组合物包括所述刺猬信号传导路径调节剂。在一些实施例中，所述鼻内药物组合物包括所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂。在一些实施例中，所述鼻内药物组合物包括所述类固醇激素、smo激动剂和gli拮抗剂。
在一些实施例中，所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂中的一种或两种在鼻内以鼻内药物组合物的形式施用，所述鼻内药物组合物包括多孔赋形剂，其中所述类固醇激素和/或所述刺猬信号传导路径调节剂被装载到所述多孔赋形剂的位于所述多孔赋形剂的孔内部的表面上。在一些实施例中，所述类固醇激素被装载到所述多孔赋形剂的位于所述多孔赋形剂的孔内部的表面上。在一些实施例中，所述刺猬信号传导路径调节剂被装载到所述多孔赋形剂的位于所述多孔赋形剂的孔内部的表面上。在一些实施例中，所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂两者被装载到所述多孔赋形剂的位于所述多孔赋形剂的孔内部的表面上。在一些实施例中，所述类固醇激素、smo激动剂和gli拮抗剂被装载到所述多孔赋形剂的位于所述多孔赋形剂的孔内部的表面上。
根据任何实施例，所述受试者可以为人、非人灵长类动物、狗、猫、牛、绵羊、马、兔、小鼠或大鼠。
根据任何实施例，所述受试者可能患有退髓鞘疾病，如中枢神经系统脱髓鞘疾病，所述中枢神经系统脱髓鞘疾病选自多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、德维克病(devic'sdisease)、炎性脱髓鞘疾病、中枢神经系统神经病变、中央脑桥髓鞘溶解症、脊髓病变、脊髓痨、梅毒性脊髓病变、如进行性多灶性脑白质病变等脑白质病变、脑白质营养不良和阿尔茨海默病；或外周神经系脱髓鞘疾病，所述外周神经系脱髓鞘疾病选自格林-巴利综合征(guillain–barrésyndrome)、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、抗mag外周神经病变、夏柯-馬利-杜斯氏病(charcot–marie0toothdisease)、易于压迫性麻痹的遗传性神经病变、外周神经病变、脊髓病、视神经病变和进行性炎性神经病变。
还提供一种如本文所描述的类固醇激素和一种如本文所描述的刺猬信号传导路径调节剂，其用于如本文所描述的用于促进有需要的受试者体内的髓鞘再生的方法中使用。
还提供了一种如本文所描述的类固醇激素和/或如本文所描述的刺猬信号传导路径调节剂在用于治疗有需要的受试者体内的脱髓鞘的药物的制备中的用途，其中所述方法包括向如本文所描述的所述受试者施用所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂。
根据其它实施例，提供了产生少突胶质细胞的方法，所述方法包括在包括如本文所描述的类固醇激素和如本文所描述的smoothened激动剂的培养基中培养原代混合神经胶质细胞。
根据其它实施例，提供了将少突胶质细胞分化为髓磷脂产生性细胞的方法，所述方法包括在包括如本文所描述的类固醇激素和如本文所描述的刺猬信号传导路径拮抗剂的培养基中孵育少突胶质细胞。
附图说明
图1a-1d示出了在早期产后背侧端脑中的最后少突胶质生成波和髓鞘生成过程期间刺猬和雄激素激素信号传导成分被动态转染。图1a示出了编码髓磷脂碱性蛋白(mbp)的转录物的相对表达。图1b示出了刺猬信号传导shh配体的相对表达。图1c示出了刺猬信号传导成分转录因子gli1的相对表达。图1d示出了介导雄激素信号传导(ar)的主要受体的相对表达。表达是相对于如通过在来自年龄为0天、3天、8天或15天的雄性(灰色条)或雌性(黑色条)小鼠幼崽的背侧端脑中进行的定量rt-pcr确定的gapdh报道的。仅检测到ar表达的性别二态性。所报道的值为均值±来自每种性别每个年龄3只幼崽的sem。*,p≤0.05。
图2a-2b示出了针对opc增殖和分化的控制在刺猬和睾酮信号传导路径之间在体外的功能性相互作用。图2a示出了在培养结束之前2小时掺入增殖标志物brdu的olig2+细胞的定量并且显示了sag(0.1μm)和睾酮(1μm)的协同作用。图2a还示出了smo拮抗剂sant-1(sant-1，0.1μm)阻断了睾酮诱导的olig2+brdu+细胞的增加。图2b示出了从原代混合神经胶质细胞分化并且因此共表达在sag、sant-1或睾酮(t)不存在(ctrl)或存在的情况下评估的髓磷脂标志物mbp的plp+gfp+少突胶质细胞的数量。所报道的值为均值±来自3-4个独立培养物的sem。与ctrl相比，*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001。不同药品之间的比较如所指示的：#,p≤0.05；##,p≤0.01；###,p≤0.001；$$$,p≤0.001。
图3a-3d示出了在背侧前脑中的最后少突胶质生成波期间阻断刺猬信号传导增强由睾酮诱导的opc在体内的分化。用smo激动剂sag、smo拮抗剂sant-1、类固醇激素睾酮(t)、sag和t、sant-1和t治疗或作为对照(ctr)用载剂治疗产后10天雄性幼崽。图3a示出了如基于转录因子olig2的免疫染色所指示的对所治疗的小鼠的脑切片中的少突胶质细胞和星形胶质细胞的数量的定量。图3b示出了如基于血小板衍生的生长因子受体a(pdgfrα)的免疫染色所指示的对所治疗的小鼠的脑切片中的少突胶质细胞组细胞(opc)的定量。图3c示出了如基于结肠腺瘤样息肉病(apc)的免疫染色所指示的对所治疗的小鼠的脑切片中的成熟少突胶质细胞(ol)的定量。图3d示出了如所指示的对所治疗的小鼠的脑切片中的表达髓磷脂碱性蛋白(mbp)的髓鞘ol的定量。显著地，成熟为轴突包裹和睾酮诱导的片段伸长所需的mbp+ol通过hedgehog信号传导的阻滞而增强。所报道的值为均值±来自每种病状下3-5只动物的sem。与ctrl相比，*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001。不同药品之间的比较如所指示的：#,p≤0.05。
图4a-4e示出了在中枢神经系统脱髓鞘的小鼠模型中，smo的药理活性增强opc/成熟ol的密度并且特异性促进在小胶质细胞活化中朝促再生表型的性早熟转变。图4a示出了直方图，所述直方图基于衍生自在sag存在(ctrl，白色条)或不存在(黑色条)的情况下将溶血卵磷脂(lpc)注射到胼胝体之后10天的成年雄性小鼠的脑切片的免疫染色使每单元表面的pdgfrα+opc的定量可视化。图4b示出了直方图，所述直方图基于衍生自在sag存在(ctrl，白色条)或不存在(黑色条)的情况下将溶血卵磷脂(lpc)注射到胼胝体之后10天的成年雄性小鼠的脑切片的免疫染色使每单元表面积的olig2+/apc+成熟ol的定量以及共表达apc标志物的olig2+少突胶质细胞谱系细胞的百分比可视化。所报道的值为均值±来自每种病状下n＝4-6只动物的sem。图4c示出了直方图，所述直方图基于衍生自在sag存在(ctrl，白色条)或不存在(黑色条)的情况下将溶血卵磷脂(lpc)注射到胼胝体之后2天的成年雄性小鼠的脑切片的免疫染色对每单元表面积的ki67+/pdgfrα+opc进行定量。图4c基于ki67和pdgfrα免疫染色(左侧图)进一步示出了在经过sag治疗的病状下观察到增殖opc的数量较高，但是pdgfrα+细胞的数量通过在此早期时间点进行sag治疗(右侧图)而未改变。图4d示出了将gfap+星形细胞的量化可视化为总面积的百分比的直方图。图4e示出了直方图，所述直方图基于衍生自在sag存在(ctrl，白色条)或不存在(黑色条)的情况下将溶血卵磷脂(lpc)注射到胼胝体之后2天的成年雄性小鼠的脑切片的免疫染色将每表面单元的iba1+、arg1+细胞(左侧图)和arg1+细胞(右侧图)可视化为iba1+细胞的百分比。图4e进一步示出了在经过sag治疗的动物的病变中检测到arg-1+促再生小胶质细胞的高得多的数量。
图5a-5f示出了基于smo介导的hh信号传导和雄激素信号传导的同时药物活化的组合疗法高度缓解了实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)的进程。图5a示出了相比于媒剂施用在单独或同时使用的sag和睾酮的治疗性施用之后的eae临床评分。图5b示出了来自媒剂(ctrl)、睾酮(t)、sag和经过sag+t治疗的eae小鼠的腰椎脊髓的电子显微照片。除了正常的有髓鞘轴突(最右边的箭头)，还观察到脱髓鞘的轴突(最下面的箭头)和异常轴突(最左边的箭头)在对照病状下处于较高水平。图5c示出了对g比率(轴突直径/轴突+髓磷脂直径)的分析并且指示相比于对照当睾酮和sag单独或同时使用时值显著较低。sag单独或与睾酮一起显示出在g比率方面比睾酮单独更高的作用。图5d示出了异常轴突的定量，所述异常轴突包含展示出髓磷脂仍被压实但脱离轴突的轴突、双髓磷脂鞘或轴突的内侧被梗阻的多层化的髓磷脂。相比于对照，异常在轴突的总数中的百分比在治疗病状下显著降低。图5f-5f示出了基于通过媒剂(ctrl)或通过单独或同时使用的药品睾酮和sag治疗的eae动物的腰椎脊髓的iba和arg1的免疫染色对由iba1+(图5e)和arg1+(图5f)细胞占据的在图像中表达为病变的总面积的百分比的面积的定量。图5g示出了单独或同时利用睾酮和sag治疗的eae动物的脊髓中gfap阳性面积的呈病变面积的百分比形式的量化。图5h示出了单独或同时利用睾酮和sag治疗的eae动物中密封蛋白阳性面积的呈病变面积的百分比形式的量化。所报道的数据为均值±sem(n＝每种病状下10只小鼠)。*,p≤0.05,**,p≤0.01,***,p≤0.001,##,p＝0.001,****,p<0.0001，单向anova与tukey的多重比较测试。
具体实施方式
本文描述了促进有需要的受试者体内的髓鞘再生的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂。在一些实施例中，所述方法用于治疗如ms峰脱髓鞘疾病。还描述了类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂的相关组合物和用途。进一步描述了使用类固醇激素、smoothened激动剂和刺猬信号传导路径拮抗剂。还描述了产生增殖少突胶质细胞的体外方法，所述体外方法涉及在包括类固醇激素和smo激动剂的培养基中培养原代混合神经胶质细胞。还描述了将少突胶质细胞分化为髓磷脂产生性细胞的体外方法，所述体外方法涉及在包括类固醇激素和smo拮抗剂的培养基中孵育少突胶质细胞。
定义
本文所使用的技术术语和科学术语具有本领域的普通技术人员对本发明所涉及的术语通常理解的含义，除非另有定义。除非另有说明，否则在以下描述和实例中参考的材料、试剂等可从商业来源获得。
如本文所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”表示单数和复数两者，除非明确指出仅表示单数。
术语“约”意味着所理解的数字不限于本文所阐述的确切数字，并且旨在指代基本上围绕所述数字的数字，而不脱离本发明的范围。如本文所使用的，“约”将为本领域的普通技术人员所理解，并且在某种程度上将根据使用其的上下文而变化。如果存在本领域的普通技术人员不清楚的术语使用，则考虑到所述术语使用的上下文，“约”意味着特定术语的多达±10％。
如本文所使用的，“smoothened”或“smo”为主要位于细胞内囊泡的膜中或其活化的质膜处的7-跨膜gpcr样受体。smo是声波刺猬(shh)信号传导路径。shh路径充当控制胚胎发育期间少突细胞生成的作用。参见例如traifforte.等人,“刺猬：少突胶质细胞谱系发育中的关键信号传导(hedgehog:akeysignalinginthedevelopmentoftheoligodendrocytelineage)”《发育生物学杂志(dev.biol.)》4:28(2016)；ferent和traiffort,“刺猬：塑造大脑和脊髓中的多重角色的多重路径(hedgehog:multiplepathsformultiplerolesinshapingthebrainandspinalcord,”《神经科学家(neuroscientist)》21:356-71(2015)。
如本文所使用的，“受试者”表示需要治疗脱髓鞘疾病或病状或需要促进髓鞘再生的任何哺乳动物，包含人类。例如，受试者可以患有脱髓鞘疾病或病状或处于患有脱髓鞘疾病或病状的风险中。
如本文所使用的，术语“施用”包含直接向另一个施用，自施用以及如本文所公开的规定或指导药剂的施用。
如本文所使用的，短语“有效量”和“治疗有效量”分别意指受试者体内的活性剂剂量或血浆浓度提供了在需要此类治疗的受试者中施用活性剂的具体药理作用。需要强调的是，活性剂的有效量在治疗本文所述的病状/疾病方面并不总是有效的，即使这种剂量被本领域的技术人员认为是治疗有效量。
如本文所使用的，术语“药物组合物”是指利用药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释液所调配的一种或多种活性剂。
此处采用短语“药学上可接受的”来指代处于合理医学判断的范围内、适用于体内而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
促进髓鞘再生的方法
本文描述的方法基于惊人地发现利用类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂的治疗急剧增加了少突胶质细胞和髓磷脂产生性细胞的数量。尽管已经描述了使用仅类固醇激素或仅刺猬信号传导路径调节剂的疗法(参见，例如，el-etr等人,“多发性硬化症中的激素影响：类固醇的新治疗益处(hormonalinfluencesinmultiplesclerosis:newtherapeuticbenefitsforsteroids)”《欧洲更年期杂志(maturitas)》68:47-51(2011)；bielecki等人,“雄激素受体在髓磷脂自发再生中的意外核心角色(unexpectedcentralroleoftheandrogenreceptorinthespontaneousregenerationofmyelin)”《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)113:14829-14834(2016)；samanta等人,“gli1的抑制调动内源性神经干细胞进行髓鞘再生(inhibitionofgli1mobilizesendogenousneuralstemcellsforremyelination)”《自然(nature)》15:448-52(2015)；us2015/0011610；ferent等人,“超声刺猬信号传导是髓鞘再生期间的积极少突胶质细胞调节剂(sonichedgehogsignalingisapositiveoligodendrocyteregulatorduringdemyelination)”《神经科学杂志(j.neuroscience)33:1759-72(2013))，但是诸位发明人发现，使用类固醇激素与刺猬信号传导路径调节剂一起协同地增强少突胶质细胞和髓磷脂产生细胞的产生，从而导致对髓鞘再生的促进提高并且为脱髓鞘疾病提供更有效的治疗。
在此方面，诸位发明人发现少突胶质细胞的早期发育期间shh信号传导成分和雄激素受体的重叠表达模式。参见实例1，图1。这些表达模式似乎与shh信号传导与类固醇激素之间在髓鞘生成期间的功能性相互作用的首次证明相一致。事实上，发明人发现利用雄激素(如睾酮)进行的治疗如相比于smo激动剂不存在，在smo激动剂存在的情况下较高水平下，可以促进少突胶质细胞前体细胞增殖。另外，发现smo拮抗剂和睾酮的同时使用促进髓磷脂产生细胞以协同方式的分化。参见实例1，图2以及实例1，图3。这些结果支持本文所描述的方法。
诸位发明人还惊人地发现，在髓磷脂修复的上下文中，smo激动剂促进小胶质细胞活化朝促再生表型的性早熟转变，并且可以与类固醇激素(如睾酮)协同作用以促进髓鞘再生，如以下所报道的实例中示出的。这些结果也支持本文所描述的方法。
类固醇激素
用于本文所描述的组合物和方法的类固醇激素包含但不限于孕激素、雌激素和雄激素家族的激素，合成类固醇激素以及选择性激素受体调节剂。
在一些实施例中，类固醇激素为雄激素受体配体(例如，雄激素)。雄激素为通过雄激素受体(ar)的结合和活化介导其作用的类固醇激素组。如本文所使用的，雄激素包含睾酮和双氢睾酮。在具体实施例中，类固醇激素为雄激素睾酮。
在一些实施例中，类固醇激素为孕激素。孕激素为通过孕激素受体(pr)的结合和活化介导其作用的类固醇激素组。在一些具体实施例中，孕激素为黄体酮或别孕烯醇酮，其衍生自黄体酮并且活化γ-氨基丁酸(gaba)受体。
在一些实施例中，类固醇激素为雌激素受体配体(例如，雌激素)。雌激素为通过雌激素受体(er)的结合和活化介导其作用的类固醇激素组。如本文所使用的，雌激素包含雌二醇。
在一些实施例中，类固醇激素为脱氢表雄酮(dhea)。dhea可以充当雄激素类固醇和雌激素类固醇两者的前体。
在一些实施例中，类固醇激素为合成类固醇。
在一些实施例中，选择性激素受体调节剂在本文所描述的方法中用作“类固醇激素”。选择性激素受体调节剂类似地充当类固醇激素的作用，但通常比类固醇本身更具选择性。如本文所使用的，“选择性激素受体调节剂”包含但不限于选择性雄激素受体调节剂、选择性雌激素受体调节剂和选择性孕激素受体调节剂。
刺猬信号传导路径调节剂
用于本文所描述的组合物和方法的刺猬信号传导路径调节剂包含增加shh信号传导的smo激动剂和降低shh信号传导的smo拮抗剂以及gli拮抗剂。
因此，在一些实施例中，刺猬信号传导路径调节剂为smoothened(smo)激动剂。smo激动剂可以与smo受体相互作用以活化下游gli转录因子。参见，例如，hadden等人,“刺猬路径激动：治疗潜力和小分子开发(hedgehogpathwayagonism:therapeuticpotentialandsmall-moleculedevelopment)”《chem.med.chem.》9:27–37(2014)；chen等人,“smoothened活性的小分子调节(smallmoleculemodulationofsmoothenedactivity)”《美国国家科学院院刊》99:14071-14076(2002)。smoothened激动剂的实例包含3-氯-n-[反式-4-(甲基氨基)环己基]-n-[[3-(4-吡啶基)苯基]甲基]苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(sag)、3-氯-4,7-二氟-n-(4-(甲酰胺)环己基)-n-(3-(吡啶-4-基)苄基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(hhag-1.5)、糖皮质激素、9h-嘌呤-6-氨、9-环己基-n-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)(purmorphamine)、丙基4-(1-己基-4-氢氧基-2-氧代-1,2-二氢化氮杂萘-3-甲酰胺)苯甲酸盐(gsa-10)、胆固醇和基于成骨(1h)-喹诺酮的化合物，如gsa-10样化合物20和25(manetti等人,“成骨(1h)-喹诺酮衍生物的新类别的设计、合成和生物表征(design,synthesisandbiologicalcharacterizationofanewclassofosteogenic(1h)-quinolonederivatives)”,《欧洲医药化学杂志(eur.j.med.chem.)》121:747-757(2016))。在具体实施例中，刺猬信号传导路径调节剂为smo激动剂3-氯-n-[反式-4-(甲基氨基)环己基]-n-[[3-(4-吡啶基)苯基]甲基]苯并[b]噻吩-2-甲酰胺(sag)。
在一些实施例中，刺猬信号传导路径调节剂为gli拮抗剂。gli拮抗剂包含但不限于lauth等人,“通过小分子拮抗剂抑制gli介导的转录和肿瘤细胞生长(inhibitionofgli-mediatedtranscriptionandtumorcellgrowthbysmall-moleculeantagonists)”《美国国家科学院院刊》》104:8455-60(2007)中公开的小分子gli1拮抗剂，如2,2'-[[二氢-2-(4-吡啶基)-1,3(2h,4h)-嘧啶二基]双(亚甲基)]双[n,n-二甲基苯胺](gant61)和2,3,4,5-四(4-吡啶基)噻吩、4,4′,4″,4″′-噻吩-2,3,4,5-二甲基嘧啶(gant58)。据信，gant61和gant58两者均在核中起作用以阻断gli功能，并且据信，gant61干扰gli1的dna结合。在具体实施例中，刺猬调节剂为gli拮抗剂gant61。
其它刺猬信号传导路径调节剂为smo拮抗剂，如chen(2002)(同上)和rimkus等人,“靶向声波刺猬信号传导路径：smoothened抑制剂和gli抑制剂综述(targetingthesonichedgehogsignalingpathway:reviewofsmoothenedandgliinhibitors)”《癌症(cancers)8:pii:e22(2016)中公开的，包含(4-苄基-哌嗪-1-基)-(3,5-二甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-基亚甲基)-氨(sant-1)、n-[3-(1h-苯并咪唑-2-基)-4-氯苯基]-3,4,5-三乙氧基苯甲酰胺sant-2和(4-苄基-哌嗪-1-基)-(3,5-二甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-基亚甲基)-氨(sant-3)和sant-4，其具有以下结构：
在一些实施例中，将smo激动剂和gli拮抗剂两者用作刺猬信号传导路径调节剂。也就是说，在一些实施例中，刺猬信号传导路径调节剂包含smo激动剂和gli拮抗剂两者。如此，在一些实施例中，类固醇激素、smo激动剂和gli拮抗剂如本文所描述的使用或施用。
药物组合物
类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂可以以单独组合物的形式施用(基本上同时或依序)，或其可以以同一组合物的形式施用。
一种或多种组合物可以是适用于施用类固醇激素和/或刺猬信号传导路径调节剂的针对任何施用途径调配的任何药物组合物。适合的施用途径可以包含例如口服、直肠、经粘膜，尤其是鼻内、肠或肠胃外递送，包含肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内到例如右或左心室腔中、常见冠状动脉注射中，静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。一些实施例涉及口服施用。一些实施例涉及鼻内施用。
在一些实施例中，类固醇激素和/或刺猬信号传导路径调节剂以鼻内药物组合物的形式施用。如本文所使用的“鼻内组合物”意指适用于、适于鼻内递送的组合物。此类实施例可以提供类固醇激素和/或刺猬信号传导路径调节剂的增强的摄取。
已经在例如，美国专利8,574,622中描述了针对睾酮的示例性油凝胶类鼻内药物组合物，所述美国专利通过引用并入本文。在一些实施例中，类固醇激素和刺猬信号传导路径中的一种或两种被调配为呈如美国专利8,574,622中描述的鼻内药物组合物的形式，如包含一种或多种活性剂并且进一步包括以下的组合物：(a)以调配物的约60重量％到约98重量％的量存在的至少一种亲脂性或部分亲脂性载剂；(b)以调配物的约1重量％到约20重量％的量存在的至少一种具有表面张力降低活性的化合物；以及(c)以调配物的约0.5重量％到约10重量％的量存在的至少一种粘度调节剂。
在此类油凝胶实施例中，亲脂性或部分亲脂性载剂可以是如油等适合作为用于鼻腔药物组合物的载剂或媒剂任何此类载剂，如植物油，如蓖麻油、氢化蓖麻油、大豆油、芝麻油或花生油，或以下讨论的亲脂性或部分亲脂性的任何载剂或任何其它适合的亲脂性或部分亲脂性载剂。
在此类油凝胶实施例中，一种或多种具有表面张力降低活性的化合物可以是一种或多种表面活性剂，如卵磷脂、多价醇、山梨聚糖、聚氧乙烯山梨聚糖、聚氧乙烯、蔗糖、聚甘油的脂肪酸酯；和/或一种增湿剂，如山梨糖醇、甘油、聚乙二醇和聚乙二醇甘油脂肪酸酯或一种或多种油酰基聚乙二醇甘油酯(如可从嘉法狮(gattefosse)(法国)获得的
在此类油凝胶实施例中，一种或多种粘度调节剂可以是选自增稠剂和胶凝剂中的一种或多种，如纤维素和纤维素衍生物、多糖、卡波姆、聚乙烯醇、聚维酮、胶体二氧化硅、鲸蜡醇、硬脂酸、蜂蜡、凡士林、甘油三酸酯和羊毛脂或以下所讨论的任何粘度调节剂或任何其它适合的表面活性剂。
其它示例性鼻内药物组合物包含美国专利申请15/612,454中描述的鼻内药物组合物，所述美国专利申请的整个内容通过引用并入本文。美国专利申请15/612,454描述了其中活性剂被装载到多孔剂上的鼻内药物组合物。因此，在一些实施例中，类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂中的一种或两种被调配为呈如美国专利申请第15/612,454中描述的鼻内药物组合物的形式，如包括多孔剂的组合物，其中类固醇激素和/或刺猬信号传导路径调节剂被装载到多孔剂的位于多孔剂的孔内部的表面上。如u.s.15/612,454中描述的，活性剂装载的多孔剂其本身可以被调配为呈油凝胶组合物的形式，如美国专利8,574,622中描述的那些。
在此类多孔剂实施例中，多孔剂可以包括无机多孔材料，如胶体二氧化硅、微多孔二氧化硅、中孔二氧化硅、大孔二氧化硅、聚有机硅氧烷、药物粘土、二氧化硅纳米管、二氧化硅凝胶、铝硅酸镁(如但不限于：来自范德比尔特矿物有限责任公司(vanderbiltminerals,llc)的
在一些实施例中，多孔剂包括有机-无机杂化物，如金属-有机框架(mof)。示例性杂化材料可以通过多齿桥连配体和金属连接点的自组装形成。
在一些实施例中，多孔剂包括有机聚合物，如微孔有机聚合物、聚苯乙烯、纤维素和/或聚(甲基丙烯酸甲酯)。在一些实施例中，微孔有机聚合物通过碳-碳偶联反应形成并且包含如碳、氢、氧、氮和/或硼等非金属元素。在一些实施例中，有机聚合物通过乳液聚合和超交联、然后通过化学蚀刻牺牲sio2核来产生。在一些实施例中，有机聚合物网络由小有机结构单元构成。
在一些实施例中，多孔剂包括基于络合剂的多孔材料，如离子交换树脂(如但不限于交联聚苯乙烯)或吸附剂(如但不限于基于β-环糊精的多孔氧化硅、基于α-环糊精的多孔二氧化硅、基于羟丙基-β-环糊精的多孔氧化硅和基于其它吸附树脂的多孔材料)。
在一些实施例中，多孔剂的表面-包含内孔表面-被功能化以在一定量的时间之后或响应于刺激而结合一种或多种活性剂和/或控制一种或多种活性剂的释放。
活性剂装载的多孔剂可以被调配为呈适合作为鼻用药物组合物的媒剂的任何媒剂的形式。在一些实施例中，多孔剂的媒剂是亲水媒剂。在一些实施例中，媒剂是亲脂性或部分亲脂性媒剂，如包括一种或多种脂肪、油、蜡、磷脂、类固醇(例如胆固醇)、鞘脂、神经酰胺、鞘氨醇、前列腺素和/或脂肪-油维生素的媒剂。在一些实施例中，媒剂包括：油或油混合物，如植物油、蓖麻油、氢化蓖麻油、大豆油、芝麻油或花生油；脂肪酸酯，如油酸乙酯和油酸油醇酯、肉豆蔻酸异丙酯；中链甘油三酯；甘油脂肪酸酯；聚乙二醇；磷脂；白软石蜡；或其任何两种或更多种的组合。
所述媒剂可以以任何适合的量存在，如对于提供经鼻施用所期望的性质、所期望的物理性质、所期望的释放性质、所期望的药代动力学等有效的量。在一些实施例中，组合物包括基于组合物的总重量的量为以下的媒剂：约15重量％到约98重量％、约30重量％到约98重量％、约50重量％到约95重量％、约75重量％到约95重量％、约80％或约90重量％。在一些实施方案中，组合物包括基于组合物的总重量的量为以下的媒剂：15重量％到98重量％、30重量％到98重量％、50重量％到95重量％、75重量％到95重量％、80重量％或90重量％。
活性剂装载的多孔剂可以利用具有表面降低活性的一种或多种化合物，例如，表面活性剂调配。如果存在，则表面活性剂可以是适于用作鼻用药物组合物中的表面活性剂的任何表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂选自阴离子、阳离子、两性和非离子表面活性剂，包含但不限于卵磷脂、多价醇的脂肪酸酯、山梨糖醇的脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇的脂肪酸酯、脂肪聚氧乙烯的酸酯、蔗糖的脂肪酸酯、聚甘油的脂肪酸酯、油酰聚氧乙烯甘油酯(如但不限于：杏仁油peg-6-酯)、油酰基聚乙二醇甘油酯、和/或保湿剂，如山梨糖醇、甘油、聚乙二醇、聚乙二醇甘油脂肪酸酯以及其任何两种或更多种的组合。在一些实施例中，表面活性剂包括油酰基聚乙二醇甘油酯(
活性剂装载的多孔剂可以用一种或多种粘度调节剂调配，所述一种或多种粘度调节剂可以是适于用作鼻用药物组合物中的粘度调节剂的任何粘度调节剂。在一些实施例中，粘度调节剂包括中孔氧化硅(其可以装载有活性剂或未装载)。在一些实施例中，粘度调节剂包括纤维素、含纤维素的物质、多糖、卡波姆、聚乙烯醇、聚维酮、胶体二氧化硅、鲸蜡醇、硬脂酸、蜂蜡、凡士林、甘油三酯、羊毛脂或任何两种或更多种的组合。在一些实施例中，粘度调节剂包括胶体二氧化硅(如但不限于：
如果存在，则粘度调节剂可以以对于将组合物的粘度调整到所期望水平有效的量存在。在一些实施例中，组合物包括基于组合物的总重量的以下粘度调节剂：约0.5重量％到约20重量％、约0.5重量％到约10重量％、约0.5重量％到约7重量％、约1重量％到约4重量％、约4重量％或约2重量％。在一些实施例中，组合物包括基于组合物的总重量的以下粘度调节剂：0.5重量％到20重量％、0.5重量％到10重量％、0.5重量％到7重量％、1重量％到4重量％、4重量％或2重量％。
无论所使用的具体调配物如何，类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂被调配成以适用于施用途径的剂量提供活性剂的治疗有效量，如适用于向一个或两个鼻孔施用的组合物的体积、适用于口服施用的体积或适用于静脉内、皮下或肌内施用的体积。
使用方法
如上所指出的，根据本文所描述的方法和用途，将类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂施用于有需要的受试者，如需要促进髓鞘再生的受试者和/或需要治疗脱髓鞘疾病或病状的受试者。受试者可以是任何哺乳动物，如人、非人灵长类动物、狗、猫、牛、绵羊、马、兔、小鼠或大鼠。
脱髓鞘疾病可以被分成影响中枢神经系统的疾病和影响外周神经系统的疾病，其呈现了不同的脱髓鞘病状。在一些实施例中，受试者患有cns脱髓鞘疾病，如多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、德维克病、炎性脱髓鞘疾病、中枢神经系统神经病变、中央脑桥髓鞘溶解症、脊髓病变、脊髓痨、梅毒性脊髓病变、脑白质病变(包含进行性多灶性脑白质病变)、脑白质营养不良和阿尔茨海默病。在一些实施例中，受试者患有外周神经系统脱髓鞘病，如格林-巴利综合征(guillain–barrésyndrome)、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、抗髓磷脂相关糖蛋白外周神经病变、夏柯-馬利-杜斯氏病(charcot-marie-toothdisease)、易于压迫性麻痹的遗传性神经病变、外周神经病变、脊髓病、视神经病变和进行性炎性神经病变。
如上所指示的，类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂可以以单独组合物的形式施用(基本上同时或以任何顺序依序)，或可以以同一组合物的形式施用。还如上所指示的，在任何实施例中，类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂可以通过任何适合的施用途径施用，所述施用途径包含鼻内、口服、静脉内、皮下和肌内。当类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂以不同组合物的形式施用时，其可以通过相同或不同的施用途径(如口服或鼻内)施用。在具体实施例中，类固醇激素口服或鼻内施用。独立地，在具体实施例中，刺猬信号传导路径调节剂口服或鼻内施用。
还如上所指示的，类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂以足以促进髓鞘再生的量施用。如本文所使用的，属于“髓鞘再生”是指生成新的髓磷脂鞘。髓鞘再生可以通过如直接确定受试者体内的髓磷脂的状态的方法评估，如通过使用磁共振成像(mri)测量白质质量、使用磁共振波谱测量(mrs)大脑扫描测量髓磷脂纤维的厚度或任何其它直接测量(例如，正电子发射断层扫描(pet)、扩散加权成像(dw-i或dw-mri)、扩散张量成像、脊髓造影、磁化传递等)。另外或可替代地，髓鞘再生可以通过以下评估：检测存在于患者体内的炎性病变(即，硬化症)的大小或数量的减少；针对在例如以下的存在下的减少或其量的减少监测患者的脑脊液(其可以通过例如腰椎穿刺获得)：(i)异常蛋白质，如髓磷脂的微小片段，(ii)淋巴细胞的提升的水平或具体类型，和/或(iii)免疫球蛋白(igg)分子的异常水平；针对神经心理学中的积极变化(例如，各种能力，如记忆力、算数、注意力、判断和推理的状态)对患者进行监测；和/或针对髓磷脂碱性蛋白样材料(mbplm)的水平的降低监测患者的尿液。可以使用这些方法中的任何一个或多个方法来评估髓鞘再生，或者可以使用替代方法。本文描述的方法不限于用于评估髓鞘再生的这些或其它具体方法。
在一些实施例中，类固醇激素为睾酮并且以约0.05mg/天到约0.5mg/天的剂量施用，包含约0.1mg/天到约0.3mg/天，包含约0.2mg/天。在使用不同雄激素受体配体的实施例中，可以使用对应摩尔量的雄激素受体配体。
在一些实施例中，刺猬信号传导路径调节剂为sag并且以受试者的约5mg/kg到约25mg/kg身体重量的剂量施用，包含约10mg/kg到约20mg/kg，包含约15mg/kg。在使用不同smo激动剂的实施例中，可以使用对应摩尔量的smo激动剂。
在一些实施例中，刺猬信号传导路径调节剂为gant-61并且以受试者的约5mg/kg到约25mg/kg身体重量的剂量施用，包含约10mg/kg到约20mg/kg，包含约15mg/kg。在使用不同刺猬信号传导路径拮抗剂的实施例中，可以使用对应摩尔量的刺猬信号传导路径拮抗剂。
在一些实施例中，所施用的类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂中的一种或两种的量对于加强另一种的髓鞘再生促进活性是有效的。因此，在一些实施例中，与给定量的刺猬信号传导路径调节剂一起施用的一定量的类固醇激素在促进髓鞘再生中比相同量的刺猬信号传导路径调节剂单独更有效。另外或可替代地，在一些实施例中，与给定量的类固醇激素一起施用的一定量的刺猬信号传导路径调节剂在促进髓鞘再生中比相同量的类固醇激素单独更有效。
还提供了如本文所描述的类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂，其用于在促进有需要的受试者体内的髓鞘再生的方法中使用，或用于治疗如上所讨论的脱髓鞘疾病或病状。
还提供了如本文所描述的类固醇激素和刺猬信号传导路径调节剂在如本文所描述的药物的制备中的用途，所述类固醇激素和所述刺猬信号传导路径调节剂用于在促进有需要的受试者体内的髓鞘再生的方法中使用，或用于治疗如上所讨论的脱髓鞘疾病或病状。
如上所指示的并且如实例中示出的，诸位发明人发现类固醇激素(如睾酮)和smo激动剂(如sag)的用途协同地促进少突胶质细胞的产生并且减轻实验模型中自身免疫性脑脊髓炎的进程。进一步地，类固醇激素(如睾酮)和gli拮抗剂(如gant61)的用途可以协同地促进髓磷脂产生细胞的产生。
提供了以下实例来说明本发明，但应当理解，本发明不限于这些实例的具体病状或细节。
实例
材料和方法
动物的处理.从janvierlabs育种中心(janvierlabsbreedingcenter)(法国)购买了年龄为8周到12周的野生型性腺完好的或阉割的c57bl/6雄性小鼠。对于体外实验，从购自janvierlabs育种中心的及时交配的c57bl/6雌性中获得凋落物，或对所述凋落物进行室内育种并且将其与从wendymacklin博士(美国科罗拉多大学(universityofcolorado,usa))获得的plp-egfp小鼠交配。参见mallon等人,《神经科学杂志》22:876-885(2002)。在标准条件下饲养所有动物，包含12周明暗循环，其中随意进食和饮水。根据欧共体委员会指令(europeancommunitiescouncildirective)(86/806/eec)针对实验室动物的护理和使用执行所有程序，并且由区域伦理委员会(regionalethicscommittee)ceea26、ministèredel'educationnationale、del'enseignementetdelarecherche对其进行批准。
制备活性剂调配物.所使用的smo激动剂(sag)和拮抗剂(sant)为chen等人,“smoothened活性的小分子调节(smallmoleculemodulationofsmoothenedactivity)”《美国国家科学院院刊》99:14071-14076(2002)中描述的那些，购自东苍化学(d&cchemicals)(中国)。(sag，产品号：dc-8225；sant-1，产品号dc-8327)。将活性剂溶解于二甲基亚砜(10mm)中并且随后在培养基或0.9％nacl中稀释，以达到适当浓度。由西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)提供睾酮。将睾酮溶解于芝麻油(1mg/ml)中并且然后进行稀释，以获得所期望类固醇激素浓度。
免疫染色实验.用于免疫染色的一级抗体如下：寡核糖体转录因子2(olig2)(兔，密理博；小鼠，密理博)，髓磷脂碱性蛋白(mbp)，(兔，密理博)；抗ng2(兔，密理博)；结肠腺瘤样息肉病(apc/cc1)(小鼠，calbiochem)，brdu抗体(大鼠，abcam)；胶质纤维酸性蛋白(gfap)(兔，dako；小鼠，西格玛)；离子化钙结合衔接分子1(iba1，兔，和光(wako))；精氨酸酶-1(山羊，圣克鲁斯(santa-cruz))，蛋白脂质蛋白(plp)，(小鼠，密理博)；血小板衍生的生长因子受体α(pdgfra)，(小鼠，密理博)；神经丝200(nf200)，(鸡，neuromics)；ki67(小鼠单克隆；bdpharmingen)。所使用的二级抗体为：山羊抗兔花青3缀合的(jacksonimmunoresearch)；山羊抗小鼠alexa488、抗兔alexa633、抗鸡alexa546、驴抗山羊alexa546(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))。
图像采集和分析.使用显微镜分析系统axiovision4.2(卡尔·蔡司公司(carlzeiss,inc.))、共焦zeisslsm510-metaconfocor2和配有caseviewer软件的扫描仪成像仪拍摄图像。利用imagej软件执行分析。对每只小鼠至少10个切片进行分析并且数据为3-5只小鼠的均值。对于衍生自经过溶血卵磷脂(lpc)注射的动物的大脑，在每只小鼠的整个脱髓鞘病变中每隔5个切片确定一次免疫荧光阳性细胞或区域，并针对每只动物对其求平均。通过在整个脱髓鞘病变中每隔5个切片测量一次核致密化的区域(与通过mbp或plp染色可视化的髓磷脂损失相关的)确定病变表面。
电子显微镜.使用配备有gatan数码相机的透射电子显微镜(1011jeol)检查腰椎脊髓的超薄切片。通过使用imagej软件测量每个轴突的最小和最大轴突直径和纤维直径来估计g比率(轴突直径与纤维直径之间的对应于髓磷脂鞘+轴突直径的比率)。针对每只动物评估至少300个随机选择的有髓鞘轴突。
rt-qpcr分析.通过断头术处死每个性别和年龄的至少四只动物。对背侧端脑进行解剖并且在液氮中冷冻，以进行进一步处理。通过使用trizol技术(赛默飞世尔科技公司)和rneasy微型试剂盒(凯杰(qiagen))分离总rna。使用高容量cdna逆转录试剂盒(应用生物系统公司(appliedbiosystems))执行逆转录。通过使用taqman基因表达预混液(赛默飞世尔科技公司)执行定量实时pcr，并且利用7300系统sds软件(应用生物系统公司)对相对于参考基因gapdh归一化的基因表达进行分析。taqman探针如下：gapdh，mm99999915_m1；mbp，mm01266402_m1；shh，mm00436528_m1；gli1，mm00494654；ar，mm00442688。
统计分析.数据表示为均值±s.e.m.利用graphpadprism6.0执行统计分析。使用单向anova进行统计学意义评估。显著性水平为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
实例1：
早期产后髓鞘生成期间刺猬与雄激素信号传导之间的功能性相互作用
诸位发明人鉴定了在端脑的产后髓鞘生成的早期阶段期间刺猬(hh)与雄激素信号传导之间的功能性相互作用。在此方面，使用从出生到产后15天(p15)的雄性和雌性小鼠的背侧前脑研究了编码髓磷脂碱性蛋白(mbp)、hh信号传导成分(shh，gli1)和雄激素受体(ar)的转录物的表达谱。此阶段包含新生少突胶质生成波、所产生的少突胶质细胞前体细胞(olp)的成熟以及背侧前脑的髓鞘生成的生理过程。kessaris等人,《自然神经科学(natureneuroscience)》9:173-179(2006)。在p3时检测到mbp转录处于非常低的水平并且然后如图1a中示出的显示出在p8和p15时分别大约10倍和60倍的增加。如图1b中示出的，在达到平台期之前，shhmrna略微增加但直到p8时才显著增加。出乎意料的是，如图1c中示出的，gli1在p0与p15之间逐渐减少。相反，如图1d中示出的，检测到在出生时雄激素受体(ar)转录处于低水平，但是直到p15时才急剧增加，在雄性和雌性中分别达到高于10倍到24倍的水平。根据研究时间点时动物的性别，shh、gli1和mbp的转录没有显著差异。相反，虽然在出生时ar的表达相比于雌性在雄性中显著较高，但是以可比较的方式对ar进行转录，而不论p3和p8时动物的性别如何，并且ar表达在p15时出乎意料地显示出相比于雄性在雌性中略微但显著较高的水平，如图1d所示。这些结果表明雄激素和刺猬信号传导路径可以通信以调节髓鞘生成过程。
sag+t促进使少突胶质细胞在发展性髓鞘生成期间增殖。
sant+t促进髓磷脂产生性少突胶质细胞
在发展性髓鞘生成期间分化。
如先前在feutz等人,《神经细胞学杂志(j.neurocytol)》“培养物中的缺陷性jimpy少突胶质细胞的分离和表征(isolationandcharacterizationofdefectivejimpyoligodendrocytesinculture)”，24:865-877(2001)中所描述的，从新生(p1)雄性小鼠的背侧端脑制备原代神经胶质细胞培养物。简言之，去除脑膜，并且在补充有10％小牛血清、盘尼西林(50u/ml)和链霉素(50μg/ml)(赛默飞世尔科技公司，法国)的dmem中对背侧端脑进行显微解剖和机械解离。将细胞悬浮液铺板在24孔板中，所述板含有涂覆有30μg/ml聚-l-赖氨酸(西格玛-奥德里奇)的0.5ml的经过培养的培养基。然后在5％co2和95％空气中，在加湿的气氛(90％)中在37℃下对含有星形胶质细胞、少突胶质细胞(ol)和小神经胶质细胞的培养物进行孵育。
在体外5天(div)时，由补充有以下之一的新鲜培养基替代混合原代神经胶质细胞的培养基：(i)smo激动剂sag(0.1或1μm)，(ii)sant-1(0.1μm)，(iii)睾酮(t，1μm)，(iv)sag(0.1或1μm)和睾酮(1μm)，(v)sant-1(0.1μm)和睾酮(1μm)或(vi)作为对照的药品载剂。每隔一天用新鲜溶液替代所补充的培养基。在12div时，用4％多聚甲醛(pfa)将细胞固定在pbs中持续20分钟，然后利用0.025％tritonx-100进行透化持续10分钟，并且用海水封闭缓冲液(赛默飞世尔科技公司)封闭1小时。
针对brdu和olig2对细胞进行免疫染色。对于免疫染色，在pbs中清洗3次之后在4℃下利用原初抗体进行过夜孵育之后，用适当的二级抗体对细胞进行孵育，持续2小时，之后利用pbs进行清洗并添加荧光封片剂(vector，clinisciences，法国)作为封固培养基。如上所描述的利用免疫荧光显微镜术获取图像。(数据未示出)。通过针对每种测试病状分析3-4个独立培养物对olig2+brdu+的量化进行评估，并且这些结果在图2a-2b中进行了报道。
图2a示出了在培养结束之前2小时掺入增殖标志物brdu的olig2+细胞的定量并且指示了sag(0.1μm)和睾酮(1μm)的协同作用。图2a还示出了在不存在活性剂的情况下，olig2+brdu+增殖神经胶质细胞表示olig2+细胞的总数的2.0±0.4％，而增殖细胞的百分比相比于具有sag(1μm)或睾酮(1μm)的对照显著增加，分别达到总olig2细胞的8.4±0.5％(p＝6.93e-09)和3.8±0.6％(p＝0.04)。
为了分析髓磷脂产生细胞的分化，从plp-egp小鼠中衍生原代混合神经胶质细胞，并且如上所描述的对其进行培养。通过使用衍生自plp-egp小鼠的原代混合神经胶质细胞并且针对mbp进行免疫染色来执行对共表达mbp的plp+细胞的检测。如上所描述的获取免疫荧光图像，并且评估共表达mbp的plp+细胞的数量。图2b示出了相比于由单独使用的每种活性剂诱导的mbp表达的水平(p＝0.001)，一起施用于原代混合神经胶质细胞的sant和睾酮诱导显著较高水平的mbp表达。免疫染色数据(未示出)揭示了睾酮(1μm)和sant(0.1μm)高度增加共表达mbp的plp+gfp+细胞的数量。smo激动剂sag(0.1μm或1μm)未修改其单独使用时的mbp表达。然而，sag的浓度均诱导略微但显著减少的睾酮介导的ol分化。显著地，睾酮和sant介导的分化作用在药品一起使用时似乎是相加的。由sant(0.1μm)或睾酮(t，1μm)对smo的抑制引起共表达mbp的plp+细胞的百分比如相比于对照病状的4倍增加(对于sant1为12.4±0.8，对于睾酮p＝6.09e-07和11.7±1.5，p＝0.0005)。
图2b进一步示出了当sant和睾酮一起使用时，观察到成熟ol的百分比如相比于对照增加了7倍(22.3±2.1对3.0±0.9；p＝2.22e-06)。另一方面，smo激动剂sag(0.1μm或1μm)未修改其单独使用时的mbp表达。然而，sag的浓度均诱导略微但显著减少的睾酮介导的ol分化。显著地，睾酮和sant介导的分化作用在药品一起使用时似乎是相加的。尽管不受理论的约束，但是这些结果表明刺猬信号传导阻断增强少突胶质细胞组细胞(opc)成为mbp+髓鞘ol的睾酮诱导的成熟。
为了进一步研究sant+t在发展性髓鞘生成期间是否会促进髓磷脂产生性少突胶质细胞的分化，从产后第三天到第十天每隔一天(n＝每组3-5只动物)用sant和/或睾酮对p3雄性幼崽进行皮下治疗。以20μg/g幼崽重量的浓度使用sant，而针对每次施用以20μg/g使用睾酮。从产后第3天每隔一天皮下注射药品。在p10时，对幼崽进行深度麻醉并且利用pfa4％进行灌注。去除大脑，在pfa4％中后固定1小时并且在蔗糖30％中进行冷冻保存，之后进行冷冻和冷冻切片(14μm)。随后，在利用smo激动剂sag、smo拮抗剂sant和类固醇激素睾酮(t)治疗的产后10天雄性幼崽的脑室下区和邻近胼胝体(cc)的水平下，执行针对大脑切片的olig2、olig2/apc、olig2/pdgfrα和mbp/nf200的免疫染色。如上所描述的利用免疫荧光显微镜术获取图像，并且如图3a-3d中示出的对不同细胞群进行量化。
图3d示出了睾酮和sant-1的组合治疗促进p10时雄性幼崽中髓磷脂鞘的产生。在不存在活性剂的情况下，由mbp占领的面积(有髓鞘的面积)对应于由表达神经丝蛋白nf200的轴突占领的总面积的62.4±2.2％。参见图3d。在存在sant或睾酮的情况下，有髓鞘的面积的百分比达到显著较高的值75.1±4.3(sant)(p＝0.04)和78.0±4.1％(t)(p＝0.01)。参见图3d。在向幼崽伴随地注射sant和睾酮时，由有髓鞘的nf200+mbp+轴突占领的面积达到88.9±2.7％，为显著高于利用sant或睾酮单独获得的值的值(p＝0.03对sant，p＝0.05对睾酮)。
因此，这些数据表明刺猬和雄激素信号传导路径在新生少突胶质细胞前体细胞产生波期间并且在这些细胞随后分化为髓鞘少突胶质细胞期间功能性地相互作用。
总体上，结果表明sag和睾酮的组合促进少突胶质细胞前体细胞的增殖，但sag抑制这些细胞成为髓磷脂产生性少突胶质细胞的睾酮诱导的成熟。
实例2：
smo活性通过sag促进了新成熟少突胶质细胞的产生以及促再生性小胶质细胞在脱髓鞘的lpc模型中的性早熟增加。
smo活化通过smo激动剂sag对脱髓鞘的作用研究如下。如先前ferent等人,《神经科学杂志》33:1759-1772(2013)中描述的在存在或不存在sag的情况下，在年轻雄性成年小鼠中执行lpc诱导的脱髓鞘。简言之，借助于通过使用专门用于神经外科手术的汉密尔顿注射器(nhbio，法国)将2μl的含有lpc1％(西格玛-奥德里奇)连同sag(0.2μm)或对应媒剂的溶液立体定位注射到右胼胝体中来单侧诱导脱髓鞘病变。按以下坐标(到前囟)执行注射：前后(ap)+1mm，侧方+1mm，背腹(dv)-2.2mm。从深度麻醉的小鼠中去除大脑，并用4％pfa进行心脏灌注。在新鲜4％pfa溶液中将组织后固定4小时，然后将其冷冻保存在30％蔗糖中，在液氮中冷冻并且进行冷冻切片(14μm)。每个时间点，针对每种治疗病状使用4-5只小鼠。在病变(dpl)后2天和10天时处死小鼠，并且对其进行制备，以用于pdgfrα、olig2/apc、ki67/pdgfrα、gfap和iba1/arg1的免疫染色。使用免疫荧光显微镜术获取免疫染色的图像(数据未示出)并且针对pdgfrα(图4a)、olig2/apc(图4b)、ki67/pdgfrα(图4c)、gfap(图4d)、iba1/arg1(图4e)评估每表面单元细胞的数量对结果进行了量化。
值得注意的是，发现在10dpl时，经过sag治疗的动物显示出在pdgfrα+细胞方面相比于对照2倍的增加(121±11对65±5，p＝0.008，图4a)。此外，发现olig2+apc+成熟ol的密度在sag存在的情况下相比于对照状况显著较高(83±7对59±1，p＝0.027，图4b)。由于成熟ol的比例在经过sag治疗的动物与对照动物之间无显著不同，因此似乎sag不可能促进opc分化。
在较早时间点(2dpl)时，新opc开始被募集并在病变中高度增殖，而组织已经显示出高炎症水平。发现sag治疗引起增殖ki67+pdgfrα+opc的密度相比于对照状况的增加(39±2对28±2，p＝0.007，图4c，左侧图)。有趣的是，pdgfrα+opc的总数保持不变，这表面sag诱导opc进入细胞周期。图4c，右侧图。
为了研究对炎性细胞的可能作用，在同一时间点对星形细胞和小胶质细胞进行了分析。由gfap+星形细胞占领的面积趋向于在sag存在的情况下但是以不显著的方式减少。参见图4d。发现iba1+小胶质细胞也不受sag的存在的影响。然而，发现被称为“促再生性的”并且通过精氨酸酶-1(arg1)的表达表征的小胶质细胞的亚群的密度在经过sag治疗的小鼠中增强了2倍(103±7对54±8，p＝0.035，图4e，左侧图)。此外，共表达arg1的iba1小胶质细胞的比例通过sag治疗增加了两倍(58±5对25±2，p＝0.017；图4e，右侧图)。这些结果表明刺猬信号传导活化通过smo激动剂促进了经过活化的小胶质细胞的促再生潜力。
实例3：
sag+t减轻了实验性自身免疫性脑脊髓炎。
将年龄为9-10周的阉割的雄性小鼠保持一周，以在实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)(n＝每种病状10只动物)之前适应。根据来自提供者(虎克实验室(hookelaboratories)，美国马萨诸塞州(ma,usa))的指导诱导病理。简言之，通过以下对小鼠免疫：在完全弗氏佐剂(completefreund'sadjuvant)中皮下注射mog35-55肽(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白/mbp片段35-55)的乳剂(在两个部位处，针对每个部位使用0.1ml的经过预处理的混合物)，之后在同一天(第0天)首次腹膜内注射pbs形式的百日咳毒素并且之后在第1天进行第二次注射(250ng/剂量)。从免疫后第7天开始直到第30天根据以下比率一天一次对小鼠进行盲目评分：0.0＝运动机能中无明显变化；0.5＝尾部尖端为无力；1.0＝尾部无力；1.5＝尾部无力并且后腿抑制；2.0＝尾部无力并且后腿虚弱或头部倾斜的迹象；2.5＝尾部无力并且后腿拖曳或头部倾斜的迹象；3.0＝尾部无力并且后腿或四肢尾部完全麻痹，其中一条前腿和一条后腿麻痹；3.5＝尾部无力并且后腿完全麻痹并且在将动物放置成横躺时其自身不能够直立；4.0＝尾部无力，完全后腿和部分前腿麻痹，移动和进食很少；4.5＝完全后腿和部分前腿麻痹，在笼子周围无移动，动物似乎不再警觉；5.0＝极端麻痹，需要对动物进行安乐死。
将患有eae的小鼠随机指定为媒剂、sag、睾酮或sag+睾酮治疗组，以构成具类似eae发病时间和类似发病评分的组(n＝每组10只动物)。在临床症状发作之前施用活性剂，直到免疫后第30天为止。通过鼻内途径(0.2mg/天，每个鼻孔中2.5μl的体积)以如上所描述的油凝胶组合物的形式施用睾酮。每隔一天通过强饲法(15μg/g小鼠重量)口服施用sag。
通过氯胺酮过量给药处死动物。去除脊髓/椎骨，并且根据各种组织学程序的要求处理腰椎脊髓/椎骨样品。对于免疫染色，将腰椎脊髓/椎骨片段后固定在pfa4％中，持续24小时。从脊柱中去除脊髓，在乙醇/二甲苯浴中进行处理并且包埋在石蜡块中。然后使用切片机(徕卡(leica))获得7-μm切片，并允许所述切片在载玻片上在37℃下过夜干燥。对于电子显微镜，将脊髓/椎骨片段后固定在pfa2％和戊二醛2％的混合物中，持续5天。从脊柱中去除脊髓，将其后固定在经过卡可酸盐缓冲的1％四氧化锇中在4℃下持续1小时，并且固定在2％乙酸铀酰中在室温下持续1小时，并且然后通过乙醇的连续稀释液脱水并且嵌入在环氧树脂中。将超薄切片与饱和乙酸铀酰溶液对比。
图5a示出了与分别用每种活性剂进行的治疗相比，在用sag和睾酮两者进行治疗后观察到的改进的临床评分。在第18-19天，三组中的动物达到评分均保持为1.0，直至每次治疗的第21天为止。在第21天与第30天之间，经过睾酮治疗的动物显示出了复发并且临床评分达到接近于2.0的值。相反，经过sag治疗的动物稳定在显著低于评分1.0周围。显著地，药品组合在最低临床评分0.5与1.0之间波动，这表明相比于单独使用这些药品，通过sag和睾酮的组合临床评分提高。参见图5a。
为了研究减轻eae所涉及的机制，检查了在eae诱导后的30天时每种病状下的髓磷脂水平和轴突病理学。电子显微镜图像示出，来自单独或联合使用sag和睾酮治疗的动物的脊髓具有高得多的髓鞘轴突密度，并且仅偶尔观察到异常结构。参见图5b。接下来，确定了每只动物(n＝每种病状3只)至少300个小口径轴突(≤2.5μm的)g比率(轴突直径/髓鞘纤维的总外部直径)并且其被示出在图5c中。在衍生自对照eae动物的脊髓中，g比率值(0.834±0.004)显著高于确定的针对通过睾酮(0.773±0.003，p<10-10)、sag(0.737±0.005，p<10-10)或药品组合(0.743±0.005，p<10-10)治疗的动物的值。有趣的是，图5c进一步示出了单独或与睾酮组合施用sag导致相比于睾酮单独显著较低的g比率(p<10-5)；然而，sag单独的作用与由药物组合诱导的作用无显著不同。然后，对异常结构(如上所描述的)的数量进行评估。参见图5d。检测到相比于在经过睾酮(15.8±1.4，p＝0.0004)、sag(14.0±1.7，p＝0.0002)或sag+睾酮(11.8±2.6，p＝0.0001)治疗的小鼠中在对照eae动物(36.4±4.0)的脊髓中检测到较高百分比的异常轴突。
总之，sag和睾酮单独或基本上同时施用会促进与髓磷脂的再生和神经保护相关联的功能恢复。
由于观察到的组合治疗的各种作用倾向于高于sag单独的作用，因此研究了活性剂对小神经胶质细胞的影响。用iba1和arg1抗体分别对来自eae动物的脊髓切片进行免疫染色，这允许整个经过活化的小神经胶质细胞和其促再生表型可视化。使用免疫荧光显微镜术获取图像(数据未示出)，并且对经过活化的小神经胶质细胞面积进行量化并且将其可视化为图5e-f中的直方图。发现对照eae小鼠的脊髓中存在大量经过活化的iba1+小神经胶质细胞，但这些细胞并未朝着其促再生表型极化。如图5e中示出的，未发现睾酮或sag会显著改变脊髓中经过活化的小神经胶质细胞的总密度。然而，如与图5f中示出的对照(4.8±0.5)相比，sag(10.9±1.7，p＝0.03)而非睾酮(6.8±1.4)促进了小神经胶质细胞朝arg1+抗炎性和促再生性表型的极化。出乎意料的是，与对照相比，当同时使用活性剂时，经过活化的小神经胶质细胞整体崩溃(1.8±0.2，p＝0.03，图5f)，这表明所述组合似乎解决了病理性小神经胶质细胞活化。
为了评估睾酮和sag单独或组合在星形胶质细胞中的作用，还利用gfap抗体对来自eae动物的脊髓进行了免疫染色。在免疫荧光显微镜术图像中执行的定量表明，睾酮和sag分别倾向于增加或减少gfap阳性面积。用睾酮、sag或睾酮和sag的组合治疗的eae动物中的gfap阳性面积与对照组中的gfpa阳性面积无显著不同。然而，睾酮(38.8±1.8)诱导的gfap染色显著高于sag(25.1±2.2，p＝0.001)。睾酮和sag的共施用导致gfap阳性面积可与图5g中示出的对照组的gfap阳性面积相比较，这表明睾酮和sag可以调节组合疗法的有益作用中潜在涉及的gfap阳性星形胶质细胞的不同子集。
由于淋巴细胞募集跨血脑屏障的血管内皮细胞进入大脑代表了eae模型和多发性硬化症本身的发病机理中的重要事件，因此对睾酮和sag单独或组合使用对血脑屏障的通透性的影响进行了评估。为了评估血脑屏障的通透性，使用了针对紧密连接蛋白claudin5的抗体，因为此家族的蛋白质赋予了内皮细胞严格调节可溶性和细胞元素在血液与中枢神经系统之间通过的能力。在免疫荧光显微镜术图像中执行的定量表明，相比于治疗之间无显著差异的对照病状(0.65±0.11)，睾酮(2,53±0.09，p<0.0001)、sag(2.35±0.27，p<0.0001)和组合疗法(2.03±0.15，p<0.0003)诱导了claudin5的表达的显著增加，如图5h中示出的。因此，单独或组合使用的睾酮和sag似乎表现出对恢复血脑屏障的效率有益的活性。
总之，结果表明利用smo激动剂和类固醇激素的组合治疗在最相关的模型之一中对ms具有协同治疗作用。
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