含有单宁酸的心脏靶向剂的制作方法

本发明涉及一种含有单宁酸作为有效成分的心脏靶向剂。

背景技术：

迄今为止，已知最方便的递送靶向药物的途径是全身注射，而通过全身注射(systemicinjection)给药的药物可通过被动扩散、增强的通透性和滞留效应(epr,enhancedpermeabilityandretention)以及与靶器官受体的相互作用靶向多种癌症、肝和肺组织。然而，由于心脏不断的动态收缩-松弛循环，伴随着体积的剧烈变化，通过全身注射将药物直接靶向心脏是一个非常困难的问题，而且由于血液交换迅速而广泛，因此所给予的治疗剂对心脏产生长期的影响并不容易。

将治疗剂局部递送至心脏的大多数方法都需要外科手术，例如胸骨切开术(sternotomy)或开胸术(thoracotomy)，这不可避免地涉及患者胸壁和骨头的切口。最有代表性的例子是“细胞片(cell-sheet)”法，该方法直接应用于受损心肌的表面。尽管可以将心肌内(intramyocardial)或心外膜(epicardial)注射视为非手术治疗方法，但由于心脏的动态运动，开放手术对于准确靶向药物是必需的。除了直接进行心脏组织注射以外，还有一些使用静脉注射途径的研究，例如使用腺相关病毒载体进行心脏基因治疗，使用超声对微囊泡进行破坏，基于导管的基因递送以及结合脂质体的心肌梗死特异性靶向肽(scott，r.c.等人，expertopin.drugdeliv.5,459-470(2008)；wang，z.等人，nat.biotechnol.23，321-328(2005)；mayer，c.r.&bekeredjian，r.，adv.drugdeliver.rev.60，1177-1192(2008)；dvir，t.等人，nanolett.11，4411-4414(2011)；beeri，r.等人，circulation106，1756-1759(2002))，但是这种全身递送方法需要精细且困难的化学/生物学实验设置，并且具有必须以高浓度静脉内施用的缺点。

为了通过静脉内注射有效地将蛋白质/肽治疗剂递送至心脏，药物递送赋形剂(vehicle)必须能够识别器官(即，组织)特异性的固有特性。换句话说，静脉注射的赋形剂不应吸附到血管内皮层的糖萼层(glycocalyxlayers)上，而应立即吸附到例如较厚的且富含细胞外基质(ecm)的心肌(主要由弹性蛋白和胶原蛋白组成)心脏组织上。

单宁酸(ta，tannicacid)是在水果、蔬菜、橄榄和可可等植物中发现的富含多酚类物质之一。最近，单宁酸被用作多功能涂层分子。单宁酸也被称为与生物大分子(biomacromolecules)具有优异亲和力的分子，生物大分子包括dna和富含脯氨酸的蛋白质，例如凝血酶、明胶、胶原蛋白和粘蛋白。通过多个氢键以及富含羟基的部分(5个棓酚基(gallolgroup)(与芳环相连的3个-oh基)和5个邻苯二酚基(catecholgroup)(与芳环通过共价键相连的2个-oh基))与目标蛋白之间的疏水相互作用，单宁酸与蛋白质结合。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是提供含有单宁酸作为有效成分的心脏靶向剂。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗心脏病的单宁酸修饰的心脏病治疗剂的用途。

本发明的另一个目的是提供用于心脏靶向的组合物，该组合物包含单宁酸修饰的药物载体作为有效成分。

本发明的另一个目的是提供将心脏病治疗剂高效地靶向心脏的方法，该方法包括单宁酸修饰所述心脏病治疗剂的步骤。

本发明的另一个目的是提供用于治疗心脏病的试剂盒，该试剂盒包括单宁酸和心脏病治疗剂。

解决问题的手段

为了实现上述目的，本发明提供了心脏靶向剂，其包含以下化学式1表示的单宁酸作为有效成分：

[化学式1]

另外，本发明提供了用于预防或治疗心脏病的药物组合物，其包含单宁酸修饰的心脏病治疗剂作为有效成分。

另外，本发明提供了用于心脏靶向的组合物，其包含单宁酸修饰的药物载体作为有效成分。

另外，本发明提供了将心脏病治疗剂高效地靶向心脏的方法，其包括单宁酸修饰心脏病治疗剂的步骤。

另外，本发明提供了用于治疗心脏病的试剂盒，其包括单宁酸和心脏病治疗剂。

另外，本发明提供了预防、改善或治疗心脏病的方法，该方法包括向个体施用单宁酸修饰的心脏病治疗剂。

此外，本发明提供了单宁酸修饰的心脏病治疗剂在制备用于预防、改善或治疗心脏病的药物中的用途。

发明效果

本发明通过单宁酸修饰(tannylation)将被递送至心脏的心脏病治疗剂与心脏心肌结合，从而实现了治疗药物的心脏靶向化和蓄积。与传统的为了能够将药物靶向心脏的的侵入性方法不同，本发明的治疗剂能够以非侵入性静脉内给药就可以高效地将治疗药物靶向心脏。

附图简要说明：

图1是显示制备单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)的方法的示意图。

图2显示了用于确定[ta]/[gfp]的临界化学计量比(criticalstoichiometricratio)的浊度测试的结果(ta：单宁酸)。

图3是根据[ta]/[gfp]的化学计量比对单宁酸修饰的gfp的外观的肉眼观察结果((a)：[ta]/[gfp]＝72；(b)：[ta]/[gfp]＝143；(c)：[ta]/[gfp]＝357)。

图4显示了形成纳米级复合物的[ta]/[gfp]的化学计量比为72和143的单宁酸修饰的gfp的形态(morphology)和尺寸(size)特征分析结果((a)和(b)：[ta]/[gfp]＝72的单宁酸修饰的gfp的dls分析结果和afm分析结果；(c)和(d)：[ta]/[gfp]＝143的单宁酸修饰的gfp的dls分析结果和afm分析结果)。

图5显示了形成微米级复合物的[ta]/[gfp]的化学计量比为214(a)、286(b)和714(c)的单宁酸修饰的gfp的荧光图像。

图6显示了单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)在静脉内注射到小鼠体内后，第3小时和第6小时的单宁酸修饰的gfp的总体脏器分布(hti(heart-targetingindex)：心脏靶向指数；spleen：脾脏；kidney：肾脏；lung：肺；heart：心脏；liver：肝脏)。

图7显示了未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)在静脉内注射到小鼠体内后，第3小时和第6小时的单宁酸修饰的gfp的总体脏器分布(hti(heart-targetingindex)：心脏靶向指数；spleen：脾脏；kidney：肾脏；lung：肺；heart：心脏；liver：肝脏)。

图8显示了单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)和未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)在静脉内注射到小鼠体内后，第1.5小时、第6小时、第48小时和第120小时的心脏蓄积效果。

图9显示了单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)和未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)在静脉内注射到小鼠体内后，第1.5小时、第6小时、第48小时和第120小时的hti值。

图10显示了单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)和未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)在静脉内注射到小鼠体内后，单宁酸修饰的gfp或未经单宁酸修饰的gfp的分布结果((a)：当施用未经单宁酸修饰的gfp时，心肌(上)和血管(下)；(b)：当施用单宁酸修饰的gfp时，心肌(上)和血管(下)；(c)：当施用单宁酸修饰的gfp时心脏总体分布)。

图11显示了单宁酸修饰的gfp和未经单宁酸修饰的gfp在静脉内注射到小鼠后，血流中药代动力学(pharmacokinetics)的结果(蓝色箭头：注射后第6小时gfp在心脏的蓄积)。

图12显示了弹性蛋白(ela)/胶原蛋白(col)和单宁酸(ta)之间或ha(透明质酸)/hs(硫酸肝素)和单宁酸(ta)之间形成的分子间(inter-molecular)复合物引起的溶液浊度的测定结果(ecm：细胞外基质(extracellularmatrix)；glycocalyx：糖萼层)。

图13显示了结合到涂覆有胶原蛋白(collagen)或弹性蛋白(elastin)的金表面的单宁酸的spr分析结果。

图14显示了弹性蛋白和单宁酸结合的itc结果((a)：显示弹性蛋白和单宁酸之间放热键的原始数据；(b)：用弹性蛋白和单宁酸摩尔比(molarratio)的函数重新分析(a)的原始数据得到的数据)。

图15是单宁酸修饰的gfp和细胞外基质(ecm)结合或者单宁酸修饰的gfp和糖萼层结合所引起的溶液浊度的测量结果(un-tannylatedgfp：未经单宁酸修饰的gfp；tannylatedgfp：单宁酸修饰的gfp)。

图16是显示单宁酸修饰的蛋白结合至细胞外基质(em)成分而不是心脏的糖萼层(glycocalyx)的示意图。

图17(a)是单宁酸修饰的sp(substancep,物质p)以及图17(b)是单宁酸修饰的腺相关病毒(aav，adeno-associatedvirus)的示意图。

图18(a)显示了对根据[sp]/[ta]的化学计量比([sp]/[ta]＝0.5、1、5、10和20)单宁酸修饰的sp的外观的肉眼观察结果，图18(b)和图18(c)显示了[sp]/[ta]化学计量比为20和10的单宁酸修饰的sp的尺寸分布。

图19(a)显示了sp和单宁酸修饰的m-cherry-sp(tannylatedsp)复合物的体内心脏蓄积，图19(b)是sp和单宁酸修饰的m-cherry-sp(tannylatedsp)复合物在静脉内注射到小鼠后第6小时的hti值。

图20显示了浊度实验的结果，该浊度实验用于确定制得单宁酸修饰的aav9中单宁酸的最大临界浓度(红色箭头表示随着单宁酸(0.75mm)添加的浊度的变化)。

图21(a)显示了aav和单宁酸修饰的aav(tannylatedaav)复合物的体内心脏蓄积，图21(b)显示了aav和单宁酸修饰的aav复合物(tannylatedaav)在静脉内注射到小鼠后第6小时的hti值。

图22(a)显示了未处理(notreat)、aav、单宁酸修饰的aav(tannylatedaav)复合物在静脉内注射到小鼠后梗塞的心脏组织中gfp表达的图像，图22(b)显示了图22(a)的gfp表达的定量结果。

图23的左图显示了连接到心脏的langendorff系统的实验设置，以确认单宁酸修饰的gfp对大鼠单相动作电位(map，monophasicactionpotentials)的影响(左)，右上图显示了插入的刺激电极(stimulatingelectrodes)，右下图显示了map(probe)探针。

图24和25显示了未处理(notreat)、未过滤(100)或过滤(filt-100)过的单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)处理的小鼠心脏的单相动作电位(map)的测量结果。

(图24中(a)：振幅(amplitude)；(b)：vmax；(c)：心率(heartrate)；

图25中(a)：三角剖分动作电位的形状(triguation)；(b)：短期可变性(shorttermvariability；stv))。

图26显示了使用压力-体积电导导管技术(pressure-volumeconductancecathetertechnique)对大鼠心脏进行的心脏血流动力学实验。

图27分别显示了gfp(对照，6μg/ml)或单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp，500μl/kg)在静脉内注射到小鼠后，第12小时和第24小时的心脏血流动力学实验的结果((a)：心率(heartrates)；(b)：心输出量(cardiacoutput)；(c)：搏出量(strokevolume)；(d)：射血分数(ejectionfraction)；(e)：左心室压力(lvpressure)；(f)：心室收缩率指数(ventricularcontractilityindex(最大/最小dp/dt)；以及(f)：tau值(tauvalue)，根据weiss方法(logp的回归)计算的弛豫(relax)时间常数)。

图28显示了将单独的bfgf(5μg或25μg)或单宁酸修饰的bfgf(tannylatedbfgf，5μg或25μg)静脉内注射到mir(myocardialischemiareperfusion，心肌缺血再灌注)小鼠模型中，第28天的心脏组织的梗塞大小((a)：梗塞大小的定量结果；(b)：梗塞区域的图像；sham：健康心脏组)。

图29显示了将单独的bfgf(5μg或25μg)或单宁酸修饰的bfgf(tannylatedbfgf，5μg或25μg)静脉内注射到mir(myocardialischemiareperfusion，心肌缺血再灌注)小鼠模型中，第28天血流动力学实验的分析结果((a)：左心室压力(lvpressure)；(b)：博出量(strokevolume)；(c)：心输出量(cardiacoutput)；以及(d)：dp/dt(每单位心室压力的变化)；sham：健康心脏组)。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。

本发明提供了心脏靶向剂，其包含以下化学式1表示的单宁酸作为有效成分：

[化学式1]

在本发明中，术语“靶向(targeting)”是指任意物质大量和/或快速地移动到诸如生物体内的特定细胞或特定组织(tissue)或特定器官(organ)之类的靶标。在本发明中，术语“靶向剂(targetingagent)”是指能够通过直接或间接结合将任意其他物质靶向上述特定靶标的物质。所述靶向剂可直接结合至靶组织或靶器官的细胞或可结合至细胞外基质(extracellularmatrix)或可被吸收到细胞中，但不限于此。

本发明的靶向剂可以由单独的单宁酸组成，或者除单宁酸以外还可以包括的例如其他靶向剂；载体；促进或稳定与药物结合的成分；用于制备制剂或制备好的制剂储存过程中保护单宁酸的成分；在空间上分隔单宁酸、载体或药物的间隔物等其他成分。本发明的靶向剂可以与任意载体或药物结合以将所述载体或药物靶向心脏。

对本发明的靶向剂所靶向的物质或对象没有特别限制，但是优选为以能够使生物体从给药部位物理地移动到心脏或心脏附近的大小。因此，本发明的靶向剂不仅可以递送诸如原子、分子、化合物、蛋白质、核酸和蛋白质/核酸复合物等物质，还可以递送由诸如载体、病毒颗粒和细胞中的任何一个以上要素组成的药物释放系统、微机械等物体。所述物质或所述物体可以是例如在心脏组织中标记特定细胞的物质，并且优选地可以是心脏病治疗剂，但不限于此。优选地将所述物质或所述物体被单宁酸修饰(tannylation)。在本发明中，术语“单宁酸修饰”是将单宁酸附着到能够与单宁酸形成氢键或疏水相互作用的物质上的过程，单宁酸具有富含酚羟基的部分(棓酚(gallol)基和邻苯二酚(catechol)基)，通过多个氢键和疏水相互作用使其与要被单宁酸修饰的物质相互作用。被单宁酸修饰的物质可以被靶向并在心脏中蓄积，然后随着单宁酸的酯键逐渐被分解而缓慢释放。

所述单宁酸是由化学式1表示的黄酮类的化合物，并且对心血管内皮层的糖萼层(glycocalyxlayers)表现出微不足道的吸附，但是对富含细胞外基质(ecm)的心肌表现出强烈的吸附。因此，单宁酸可被靶向心脏，更具体地说是心脏的心肌(myocardium)并蓄积在心肌中。

本发明提供了用于预防或治疗心脏病的药物组合物，该药物组合物包含单宁酸修饰的心脏病治疗剂作为有效成分。

所述单宁酸修饰的心脏病治疗剂可以被靶向心脏，优选为心脏的心肌，并蓄积在心肌中。

所述心脏病治疗剂可以是本领域已知的任何心脏病治疗剂，只要它是能够被单宁酸修饰的治疗药物即可，并且所述心脏病可以包括本领域已知的所有心脏病，特别是目标心脏病根据单宁酸修饰的心脏病治疗剂的治疗效果而有所不同。例如，当所述心脏病治疗剂是bfgf时，心脏病可以是缺血性心脏病，并且缺血性心脏病可以是选自由心肌梗塞、心力衰竭和心绞痛组成的组中的任何一种或多种。

所述心脏病治疗剂可以是选自化合物、蛋白质、核酸和蛋白质/核酸复合物中的任何一种或多种，优选bfgf(basicfibroblastgrowthfactor，碱性成纤维细胞生长因子)、sp(substancep，物质p)、egf(epidermalgrowthfactor，表皮生长因子)、vfgf-b(vascularendothelialgrowthfactorb，血管内皮生长因子b)等，但不限于此。

所述bfgf可以由seq.id.no：1的氨基酸序列组成。

所述sp可以由seq.id.no：2的氨基酸序列组成。

[表1]

所述心脏病治疗剂可以使用病毒作为载体。病毒可以被单宁酸修饰，由于存在于病毒表面的蛋白质和单宁酸之间形成氢键和疏水相互作用。使用所述病毒作为载体的心脏病治疗剂可以是当在心脏中表达时具有治疗或预防作用的治疗基因(多核苷酸序列)。所述病毒可以是选自由逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associatedvirus)和慢病毒(lentivirus)组成的组中的任何一种。优选地，所述病毒是腺相关病毒(aav)，更优选地，所述病毒是腺相关病毒血清型9(aav9)。

所述组合物可以口服或非经口给药，非经口给药包括颅内注射、静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、腹膜内注射、透皮给药等，优选静脉内给药。

所述bfgf可以服用的剂量为5至200μg/kg，优选15至120μg/kg。

另外，本发明提供了用于心脏靶向的组合物，该组合物包含单宁酸修饰的药物载体作为有效成分。

在本发明中，“单宁酸修饰”是将单宁酸附着到能够与单宁酸形成氢键或疏水相互作用的物质上的方法，通过该方法，使靶向心脏的药物被单宁酸修饰或含有靶向心脏的药物的药物载体被单宁酸修饰。

可以不受限制地使用所述药物载体，只要其具有能够形成氢键和与单宁酸的疏水相互作用的官能团(functionalgroup)即可。优选地，所述药物载体可以是选自由载体、病毒和细胞组成的组中的任何一种，但不限于此。

所述病毒可以是选自由逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associatedvirus)和慢病毒(lentivirus)组成的组中的任何一种。

所述组合物可以口服或非经口给药，非经口给药包括颅内注射、静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、腹膜内注射、透皮给药等，优选静脉内给药。

另外，本发明提供了将心脏病治疗剂高效地靶向心脏的方法，该方法包括单宁酸修饰所述心脏病治疗剂的步骤。

所述单宁酸修饰可以通过将含有单宁酸的溶液和含有心脏病治疗剂的溶液混合来实现。混合时，考虑到单宁酸修饰过的心脏病治疗剂的大小、形状和稳定性等，可以将单宁酸和心脏病治疗剂以适当的化学计量比混合使用。

另外，本发明提供了用于治疗心脏病的试剂盒，所述试剂盒包括单宁酸和心脏病治疗剂。

通过将所述单宁酸和心脏病治疗剂混合，所述心脏病治疗剂被单宁酸修饰。所述单宁酸和心脏病治疗剂可以溶解在溶液中的状态被提供，或者试剂盒中额外包含所述溶液，但是只要可以通过将单宁酸和心脏病治疗剂混合来单宁酸修饰单宁酸和心脏病治疗剂，单宁酸和心脏病治疗剂的形式不受限制。另外，所述用于治疗心脏病的试剂盒可另外包括在药物组合物中常用的载体、稀释剂、赋形剂或其中两种或更多种的组合，并且可包括一种或多种心脏病治疗剂。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的发明人通过将单宁酸(ta)和gfp以各种化学计量比混合来制备了单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)。然后选择化学计量比[ta]/[gfp]为143的、与体内循环的合理范围内相对应的单宁酸修饰的gfp(参见图1至图5)。

另外，发明人通过将单宁酸修饰的gfp静脉内注射到小鼠中来评估对不同脏器的靶向能力，并且结果证实，与脾脏、肾脏、肺和肝相比，单宁酸修饰的gfp特异性靶向心脏(参见图6和图7)。

另外，发明人通过将单宁酸修饰的gfp静脉内注射到小鼠中来评估随时间推移的心脏靶向能力，结果证实了单宁酸修饰的gfp在静脉内注射后6小时被靶向心脏，并且维持了高达120小时的心脏靶向能力。因此，证实了单宁酸修饰的gfp在心脏中蓄积(参见图8和图9)。

另外，发明人通过将单宁酸修饰的gfp静脉内注射到小鼠中来检查心脏组织中的空间分布，并且发现单宁酸修饰的gfp大部分蓄积在心肌中(参见图10)。

另外，发明人通过将单宁酸修饰的gfp静脉内注射到小鼠中来测量血液循环时间，结果证实了与未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)相比，经单宁酸修饰的gfp血液循环时间更长，并且直到在静脉内注射后120小时仍残留在血液中(参见图11)。

另外，发明人比较了ta结合作为糖萼层(glycocalyx)的主要成分的硫酸肝素(heparinsulfate，hs)和透明质酸(hyaluronan，ha)的能力和ta结合作为细胞外基质的主要成分的弹性蛋白(elastin)以及i型胶原蛋白(collagen)的能力，结果证实了单宁酸与细胞外基质，特别是弹性蛋白的结合更牢固(参见图12至图16)。

另外，发明人单宁酸修饰了已知可在冠状动脉血管扩张有效的肽药物sp(substancep，物质p)或可用作基因治疗剂的递送载体的aav9，然后静脉内注射到小鼠中，结果发现，由于其以与单宁酸修饰的gfp相同的方式被靶向至心脏并在心脏中蓄积，因此证实了单宁酸修饰的要靶向心脏的物质并靶向心脏(参见图17至图22)。

另外，发明人通过体外单相作用电位和体内心脏功能测试证实了单宁酸修饰的gfp未显示毒性(参见图23至图27)。

另外，发明人将作为心脏病治疗剂的碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)用单宁酸修饰，并将其静脉内注射到mir(myocardialischemiareperfusion，心肌缺血再灌注)动物模型，结果证实了，与未经单宁酸修饰的bfgf相比，单宁酸修饰的bfgf减小了心肌梗塞的尺寸，并且将心脏功能改善到与健康心脏(sham组)相似的程度(参见图28至图29)。

因此，本发明通过单宁酸修饰要被递送至心脏的心脏病治疗剂而赋予其与心肌的结合能力，从而能够使心脏靶向和治疗剂蓄积，并且，与用于将传统治疗剂靶向于心脏的常规侵入性方法不同，仅通过非侵入性静脉内给药也能高效地将治疗剂靶向心脏。

本发明的药物组合物还可包含生物制剂中常用的载体、稀释剂、赋形剂或其中两种或更多种的组合。药学上可接受的载体没有特别限制，只要其适合于体内递送活性成分即可，例如，默克索引(merckindex，第13版)，merck&co.公司所记载化合物、食盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液，麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇以及含有这些成分中的一种或多种的混合物，如果需要，可以添加其他常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等。此外，本发明的药物组合物可以通过与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂混合而形成不同剂型，包括注射用的水溶液、悬浮液和乳剂等注入用剂型；丸剂；胶囊剂；颗粒剂或片剂。此外，可优选地通过本领域适当的方法或使用《雷明顿药物科学》(mackpublishingcompany，eastonpa，1990年第18版)中公开的方法根据每种疾病或成分来配制组合物。

本发明的组合物还可包含一种或多种与有效成分表现出相同或相似功能的活性成分。

本发明的组合物通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂，以单位剂量或多剂量容器的形式，由本领域普通技术人员容易地实施的方法制备。在这种情况下，剂型可以是在油或水溶性介质中的溶液、悬浮液或乳剂的形式，或者可以是提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式，并且可以另外包括分散剂或稳定剂。

另外，本发明提供了预防、改善或治疗心脏病的方法，该方法包括向个体施用单宁酸修饰的心脏病治疗剂。

根据本发明的单宁酸修饰的心脏病治疗剂可以具有上述特征。所述个体可以是哺乳动物，特别是人类。

本发明的组合物可以口服或非经口给药，非经口给药包括颅内注射、静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、腹膜内注射、透皮给药等。

本发明组合物的合适剂量根据配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、活性成分在体内的吸收率、失活率、并用药物、排泄速度以及反应感应性等各种因素进行改变。具体而言，本发明的心脏病治疗剂的剂量为每天0.0001ng/kg(体重)至200mg/kg(体重)。

此外，本发明提供了单宁酸修饰的心脏病治疗剂在制备用于预防、改善或治疗心脏病治疗剂中的用途。

根据本发明的单宁酸修饰的心脏病治疗剂可以具有上述特征。

实施发明的方式

在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。然而，以下实施例和实验例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于以下实施例和实验例。

<实施例1>单宁酸修饰的gfp的制备

<1-1>gfp的表达和纯化

将编码gfp的基因克隆到修饰的pet28a_tev载体中，并转化(transformation)到大肠杆菌bl21rilp菌株中后，将该菌株在37℃下培养12小时以上，直到od600值达到0.4-0.8。纯化菌株的培养液，获得n末端融合组氨酸标签(his-tag)的gfp。用ni-nta树脂(resin)纯化gfp，并用tev蛋白酶除去his-tag。通过实施用缓冲液(100mmnacl和50mmtrishcl)平衡的尺寸排阻色谱法(sizeexclusionchromatography)进一步纯化gfp。

<1-2>gfp的单宁酸修饰

为了制备单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)，准备了单宁酸(tannicacid，ta)溶液(10mm)和gfp溶液(ph＝7.4，pbs(phosphatebufferedsaline，磷酸盐缓冲盐水)238μg/ml)。为了单宁酸修饰gfp，混合ta和gfp溶液(体积比为1：1)，以使[ta]/[gfp]的化学计量(stoichiometric)比为14、72、143、214、286、714和1428。混合时，gfp的浓度是固定的，ta溶液使用浓度分别为0.1([ta]/[gfp]＝14)、0.5、1、1.5、2、5和10([ta]/gfp]＝1428)mm在pbs(ph7.4)中连续稀释的。将所有样品在室温下放置30分钟。

对于在体内(invivo)或体外(exvivo)研究中，使用amicon过滤器(3kda，0.5ml容量，millipore，billerica，ma，usa)对单宁酸修饰的gfp离心分离5次以上，完全移除了游离(free)的ta。

<实验例1>单宁酸修饰的gfp的特性分析

<1-1>单宁酸修饰的gfp的胶体稳定性(colloidalstability)

为了根据[ta]/[gfp]的化学计量比确定gfp/ta溶液的胶体稳定性(即稳定或聚集)，对实施例中1制备的化学计量比为14、72、143、214、286、714和1428的gfp/ta溶液进行浊度测试。

当gfp/ta复合物形成微尺度的聚集时，由于溶液的浊度(光散射)，吸光度(a600)增加。测量每种溶液的吸光度。结果是，临界化学计量比[ta]/[gfp]为143(图2中的黑色虚线)，并且在其之下未观察到明显的聚集，并且a600值几乎为0。相反，gfp/ta溶液的浊度在化学计量比超过143时逐渐增加，并在化学计量比为1430时增加到1.4±0.1。

当[ta]/[gfp]之比为72、143和357时，观察溶液的照片，当[ta]/[gfp]之比为72或143时，在gfp/ta溶液中未观察到聚集。这表明形成了纳米级复合物(图3a和图3b)。然而，证实了比临界化学计量比143高的[ta]/[gfp]比为357时出现了gfp/ta复合物的聚集(图3c)。

<1-2>单宁酸修饰的gfp的尺寸和形状

利用原子力显微镜(afm，atomicforcemicroscopy)(nanoman，veeco，美国)和动态光散射(dls，dynamiclightscattering)分析从[ta]/[gfp]化学计量比为72或143的溶液中获得的单宁酸修饰的纳米复合物的尺寸和形态。

[ta]/[gfp]化学计量比为143以下的溶液(50μl)被加载到云母(mica)表面并用去离子水洗涤三次。空气干燥2小时后，测量单宁酸修饰的纳米复合物的尺寸。使用粒度分析仪(particlesizeanalyzer)(zetasizernano-zs，malvern仪器，英国)，并将样品溶液(1ml，[ta]/[gfp]＝72或143)放入一次性比色皿中，平衡时间为120秒后，测量了单宁酸修饰的纳米复合物的尺寸分布。

分析的结果是，以[ta]/[gfp]化学计量比72制备的单宁酸修饰的gfp的dls流体力学直径(hydrodynamicdiameter)为14.8±2.9nm(图4a)。通过afm测量的干燥后的复合物的平均干燥高度(dryheight)约为10nm(图4b)。当[ta]/[gfp]化学计量比为143时，流体动力学直径增加至52.7±21.7nm(图4c)，干燥复合物的平均高度值达到～35nm(图4d)。

另外，使用荧光显微镜(eclipse80i，nikon，日本)在微尺度上确认了单宁酸修饰的gfp的形成。以大于214的化学计量比观察到单宁酸修饰的gfp的微聚集体(图5)。当比率接近714时，复合物的尺寸逐渐增加到～100μm，可以用荧光显微镜清楚地检测到(图5c)，在286的比率下，观察到微复合物的平均大小达到～5μm(图5b)。

发明人选择[ta]/[gfp]化学计量比为143的单宁酸修饰的gfp用于体内(invivo)实验。这是因为单宁酸修饰的gfp的比率为143的尺寸分布在常规胶束纳米载体(micellarnanocarriers)在体内(invivo)循环的合理范围内。

<实验例2>单宁酸修饰的gfp的体内血液循环和分布

<2-1>单宁酸修饰的gfp对不同器官的靶向评价

为了研究单宁酸修饰的蛋白质的体内循环，进行了动物实验。在韩国科学技术院(kaist)的动物实验伦理委员会(ka2016-34)的批准下进行了动物测试程序，研究人员根据韩国保健福祉部推荐的论理规范进行了实验。

首先，为了确认单宁酸修饰的gfp的体内毒性，测量了小鼠体重的变化。根据美国国家癌症研究所(nationalcancerinstitute)对小鼠毒性的标准测量，体重减轻20％或更多的小鼠被认为具有毒性。确认单宁酸修饰的gfp的体内毒性的结果是，注射单宁酸修饰的gfp的小鼠在2天内体重减轻了约6％，但是这可以忽略不计，并且进行了以下实验。

将[ta]/[gfp]化学计量比为143的单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)或未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)静脉内注射(240μg/kg)到小鼠(balbc，8周龄，雄性，24-26g)的尾静脉中。以预定的时间间隔(3小时和6小时)处死被注射的小鼠后，用ivis成像系统(ivis200，xenogen，美国)测量肝、心脏、脾、肾和肺的gfp荧光强度。为了进行免疫组织化学(ihc，immunohistochemistry)分析，将组织(心脏和腔静脉)在室温下用4％甲醛固定48小时，然后将组织用干冰状的oct(optimalcuttingtemperature，最佳切割温度)化合物包埋。使用冷冻切片机(cryo-microtome，leicacm3050s，gmiinc.，美国)将冷冻的组织块切成10μm厚度的切片。用1％bsa(bovineserumalbumin，牛血清白蛋白)封闭切开的切片，然后用抗gfp抗体(ab6556；1：500稀释倍数，abcam，cambridge，英国，12小时，4℃)作为第一抗体处理，山羊抗兔iggflamma488(rsa1241，1：200稀释倍数，bioacts，韩国，1小时，25℃)作为第二抗体处理。使用荧光显微镜(eclipse80i，nikon，日本)进行观察。

在各个小鼠器官(organ)的荧光强度分析中，注射了单宁酸修饰的gfp后，在第3小时时在大多数器官中未观察到荧光发射(图6)，但在第6小时时在心脏中主要观察到了源自gfp的荧光。结果，发现单宁酸修饰的gfp在心脏中高度蓄积：～1.0×10⁷至4.9×10⁸个光子s^-1(图6，由白色虚线表示的圆圈)。当注射未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)作为对照组时，大部分gfp蓄积在肝脏中，甚至在注射后第3小时或第6小时在心脏中也未观察到源自gfp的荧光(图7)。

此外，使用心脏靶向指数(hti,hearttargetingindex)＝[心脏荧光发射]/[肝脏荧光发射]进行单宁酸修饰针对心脏靶向能力的定量分析。结果显示，除了单宁酸修饰的gfp注入6小时后的情况，所有样品均显示出非常低的hti值。具体而言，观察到未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)注射3小时后hti值为0.007，未经单宁酸修饰的gfp注射6小时后hti值为0.0025，单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)注射3小时后hti值为0.0014，单宁酸修饰的gfp注射6小时后hti值为0.135，结果表明单宁酸修饰的gfp被高效地递送至心脏。

<2-2>随时间推移对单宁酸修饰的gfp的心脏靶向性评价

为了确认在注射6小时后心脏中是否仍检测到单宁酸修饰的gfp，以与实验例2-1中所述的相同的方式将gfp或单宁酸修饰的gfp静脉内注射(240μg/kg)到小鼠体内，以预定的时间间隔(1.5、5、48和120小时)处死小鼠后，使用ivis成像系统(ivis200，xenogen，美国)测量心脏的gfp荧光强度，并计算hti值。

结果，在注射单宁酸修饰的gfp后第1.5小时时确认了弱荧光发射(1.7×10⁸±5.5×10⁶光子s^-1)，并且在注射后第6小时时确认了荧光发射增加1.9×10⁸±7.8×10⁶光子s^-1(图8)。该荧光强度直至在注射后第120小时保持在(2.2×10⁸±4.4×10⁷光子s^-1)的相似水平(图8)，并且以上结果表明单宁酸修饰的蛋白质的心脏靶向和心脏蓄积。此外，随着时间的推移，hti值在单宁酸修饰的gfp注射后第6小时时为0.124±0.015，在第120小时时为0.062±0.020(图9，红色柱)，与未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)(图9，黑色柱)注射后结果有显著性差异。在注射后第144小时(7天)时，来自心脏的荧光信号减少到1.2×10⁸±1.7×10⁷。

<2-3>单宁酸修饰的gfp在心脏组织中的分布

为了分析单宁酸修饰的gfp在心脏组织中的空间分布，如实验例2-1中所述进行免疫组织化学分析。

有趣的是，当施用未经单宁酸修饰的gfp时，在心脏的任何区域均未观察到荧光信号，而当施用单宁酸修饰的gfp时，大部分荧光信号从左心肌发出，如虚线和箭头所示(图10b的上方图像)。在血管(即腔静脉)的内壁中也未观察到荧光发射(图10a和图10b中的下方图像)。特别地，如在整个心脏的横截面图像中所见，在靠近左心室的心肌中观察到gfp信号(图10c，白色星号)。这些结果表明单宁酸修饰的蛋白质活跃地蓄积在心肌中。

<2-4>单宁酸修饰的gfp的血液循环时间

为了确定单宁酸修饰的gfp的血液循环时间，在小鼠尾静脉中注射(240μg/kg)[ta]/[gfp]化学计量比为143的单宁酸修饰的gfp，在预定的时间间隔(1.5、5、48和120小时)从每只小鼠的尾巴收集血液(30-50μl)。将收集的血液与0.2wt％的肝素溶液(10μl)混合以防止凝结，然后以13,500rpm离心5分钟以分离血浆并将得到的血浆保存在-20℃。使用gfpelisa试剂盒(cellbiolabs，美国)，利用47.5至380pg/ml的gfp标准曲线测量血浆中gfp的量。

发现单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)的血液循环时间(图11，红色)比未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)的血液循环时间(图11，黑色)长。注射后8小时时(蓝色箭头)，单宁酸修饰的gfp在血流中的gfp浓度为8.3±0.8ng/ml，未经单宁酸修饰的gfp在血流中的浓度为0.8±4.1ng/ml。注射后30分钟，未经单宁酸修饰的gfp大部分被肝脏排泄或过滤。相比之下，单宁酸修饰的gfp注射后在血液中保留了120小时，这与单宁酸修饰的gfp随着时间的推移在心脏中随时间蓄积的结果一致，如图8所示。单宁酸修饰的gfp在注射420小时后，血液中的gfp浓度维持在约0.3ng/ml的可检测水平，但未检测到未经单宁酸修饰的gfp。

<实验例3>单宁酸(ta)与细胞外基质(ecm)成分之间相互作用的分析

为了确认ta和细胞外基质成分之间的相互作用，使用浊度测量法、表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，spr)以及等温滴定量热法(isothermaltitrationcalorimetry,itc)来分析ta结合糖萼层(glycocalyx)的主要成分的硫酸肝素(heparinsulfate,hs)和透明质酸(hyaluronan,ha)的能力以及ta结合细胞外基质的主要成分的弹性蛋白和i型胶原蛋白的能力。上述实验方法已被广泛用于证明生物分子与生物材料之间的相互作用。

<3-1>使用浊度测量法将ta和细胞外基质(ecm)、ta和糖萼层(glycocalyx)结合

为了浊度分析，通过以0.24mg/ml的浓度在pbs中稀释来制备弹性蛋白、i型胶原蛋白、hs和ha溶液。将ta(17mg/ml)以1：1的体积比添加到每种溶液中，并剧烈混合样品。用uv/vis光谱仪(hp8453，hewlett-packard，美国)在600nm下测量浊度。

通常，当两个大分子在分子之间表现出很强的亲和力时，会迅速形成微复合物(microcomplex)，这些微复合物通常会散射可见光以形成浑浊的溶液。如预期的那样，添加ta的胶原蛋白/弹性蛋白溶液的浊度(a600)显着增加，其中弹性蛋白溶液的浊度为1.219±0.022(图12，第一个白柱)，而胶原蛋白溶液的浊度为0.173±0.022(图12，第一个灰柱)。但是，在hs或ha溶液中未观察到浊度变化。

<3-2>使用spr分析的ta和弹性蛋白/i型胶原蛋白的结合

为了spr分析，通过在pbs(ph7.3)中稀释制备弹性蛋白和i型胶原蛋白(10μg/ml)和ta各溶液(2mg/ml)。所有溶液均通过0.2-μm微过滤器(millipore，美国)进行过滤。将每种蛋白(弹性蛋白或i型胶原蛋白)吸附在biacore金(au)传感器芯片上600秒钟，然后将芯片洗涤10分钟以除去吸附较弱的样品。使用pbs作为流动缓冲液，以10μl/min的流速进行spr分析。

spr的改变的响应值(ru)表明ta对弹性蛋白和i型胶原蛋白都具有亲和力(图13)。当ta暴露于胶原蛋白吸附的表面时，δru值为793。当ta暴露于弹性蛋白吸附的表面时，δru值为1319(图13，红色)，这表明ta尤其与弹性蛋白强烈相互作用。

<3-3>使用itc分析的ta和弹性蛋白的结合

弹性蛋白(210μg/ml)和ta溶液(2.5mg/ml)用于itc测量。将弹性蛋白放入样品池中并将ta溶液装入注射器后，通过以每次5μl剂量连续50次注射进样(以350rpm搅拌)在样品池中的弹性蛋白来滴定ta溶液(250μl)。将时间间隔设置为180秒以进行后续注射，并使用microcalorigin(microcalsoftware，northampton，美国)处理原始数据(rawdata)。

作为itc实验的结果，ta与弹性蛋白的结合引起热力学变化(图14)。原始数据中显示的总体负值表明ta和弹性蛋白之间的键发生放热相互作用(图14a)。ta-弹性蛋白结合不同于其他常见抗原-抗体相互作用的热力学图，在该图中，滴定(titration)显示出整体的s形曲线。ta和弹性蛋白之间的结合不是特异性的，但是代表两阶段(two-phase)结合。在第一步中，[ta]/[弹性蛋白]比率高达～20时(图14b，用黑色箭头表示)，ta与弹性蛋白分子间(inter-molecularly)结合。在从约30的[ta]/[弹性蛋白]比率开始的第二结合步骤中，ta/弹性蛋白间的复合物彼此结合。也就是说，ta结合的弹性蛋白可以用作促进与其他ta结合的弹性蛋白相互作用的成核种子(nucleatingseeds)，其被确定为从黑色箭头开始的热力学转变点。在该步骤中，结合亲和力低于ta和弹性蛋白之间的结合亲和力，因此与第一步相比，斜率并不陡峭(图14b)。

<3-4>使用浊度测量法检测单宁酸修饰的gfp和ecm的结合

通过将单宁酸修饰的gfp直接添加到ecm样溶液弹性蛋白/胶原蛋白中，，或直接添加到糖萼层(glycocalyx)样溶液hs/ha混合物中，，测试浊度的变化。以与实验例3-1相同的方式，添加单宁酸修饰的gfp(化学计量比＝143，100μl)代替ta，然后在600nm的波长处测量ecm或糖萼层构成因子(所有构成因子的最终浓度＝0.5mg/ml，100μl)的浊度(图15)。

加入单宁酸修饰的gfp后，ecm溶液显示出a600值从0至0.2的可检测到的浊度变化(图15，红色箭头)。与图12所示的浊度结果相似，在糖萼层(glycocalyx)样溶液中未观察到浊度变化。图16是显示由于ta对弹性蛋白/胶原蛋白的高亲和力，单宁酸修饰的蛋白在心脏的细胞外基质而不是糖萼层中蓄积的图。

<实施例2>单宁酸修饰的物质p(substancep，sp)和单宁酸修饰的mcherry-sp的制备

据报道，当全身施用sp(物质p，seq.id.no：2)时，已知的扩张冠状动脉的肽药物，通过促进内源性干细胞向受损组织的迁移来改善伤口愈合过程。因此，sp给药被认为通过诱导内源性干细胞(endogenousstemcells)向受损心肌的迁移，促进组织再生和血管生成，从而对心肌梗塞(myocardialinfarction)具有治疗和再生作用。因此，试图确认单宁酸修饰的sp是否像单宁酸修饰的gfp一样靶向心脏。

以与实施例1中生产单宁酸修饰的gfp的方法相同的方式制备单宁酸修饰的sp。具体地，制备单宁酸(ta)溶液(10mm)和sp溶液(在pbs(phosphatebufferedsaline，磷酸盐缓冲盐水中的ph＝7.4，0.6mm)，并将ta溶液的浓度稀释至0.05mm、0.1mm、0.5mm和1mm。稀释的ta溶液和sp溶液的[sp]/[ta]化学计量比为10(ta溶液的浓度＝0.05mm)、5、1和0.5(ta溶液的浓度＝1mm)通过以1：1的体积比，强烈混合来制备单宁酸修饰的sp。

此外，为了分析单宁酸修饰sp的体内心脏靶向特性，制备了mcherry-tagged融合蛋白(mcherry-sp)，然后制备了mcherry-sp溶液(mcherry-sp，0.5mm，λexc＝587nm，λemi＝610nm)，并通过与ta溶液混合使得[ta]/[mcherry-sp]化学计量比为2，从而制备单宁酸修饰的mcherry-sp。

<实验例4>单宁酸修饰的sp和单宁酸修饰mcherry-sp的特性

<4-1>单宁酸修饰的sp的尺寸和形状

肉眼观察在实施例2中为了制备单宁酸修饰的sp而以[sp]/[ta]比例为20、10、5、1和0.5混合的溶液后，使用粒度分析仪(zetasizernano-zs，malvern仪器，英国)用于分析单宁酸修饰的sp的尺寸([sp]/[ta]比率＝20和10，溶液体积＝1ml)。

确认单宁酸修饰的sp在[sp]/[ta]的比率为20或10时形成具有～1μm尺寸的复合物(图18)。

<4-2>单宁酸修饰的mcherry-sp的心脏蓄积效果

为了评价单宁酸修饰的sp的体内心脏靶向性，未经单宁酸修饰的mcherry-sp(10μg，0.0031mm，200μl)或实施例2中制备的单宁酸修饰mcherry-sp(200μl)注射到小鼠尾静脉(balbc，8周龄，24-26g)中，注射后第6小时处死小鼠。利用ivis成像系统(ivis200，xenogen，美国)测量肝和心脏mcherry荧光强度。

与gfp的实验结果相似，在注射后第6小时心脏中也蓄积了单宁酸修饰的mcherry-sp(图19a)。hti值从0.062±0.008急剧增加到0.111±0.008(图19b)。

<实施例3>单宁酸修饰的腺相关病毒血清型9(adeno-associatedvirusserotype9，aav9)的制备

<3-1>编码gfp的aav9的制备和纯化

单宁酸修饰可用于基因治疗剂递送的aav9，试图确认单宁酸修饰的aav9是否靶向心脏。aav9是目前在临床试验中使用的fda批准的病毒载体，aav9被选择是因为预测aav9外壳蛋白(coatprotein)的单宁酸修饰可以改善其在心脏中的蓄积。

根据jang,j.-h.etal.,mol.ther.19,667-675(2011)中记载的方法产生了编码由cmv(cytomegalovirus，巨细胞病毒)启动子表达的gfp的aav(血清类型9；aav9)。简而言之，三种类型的等量(17μg)质粒，即腺辅助质粒(phelper；stratagene，lajolla，ca，美国)，编码衣壳9装配体的质粒(paav9)和itr(invertedterminalrepears，末端反向重复序列)围绕的含有cmvgfp的多核苷酸的质粒与磷酸钙结合以产生复合物，并用aav293细胞(agilenttechnologies，paloalto，ca，美国)转染(transfection)。转染2天后，收获导入了gfp表达序列的aav9载体，并在18℃下进行碘克沙醇(iodixanol,optiprep,aleretechnologiesas,oslo，挪威)密度梯度超速离心分离(360,000g；optimal-90k,beckmancoulter,brea,ca,美国)2小时。aav9-gfp载体的基因组滴度(基因组滴度，3.6×10⁹vg/μl)是利用sybrgreenmastermix(thermofisherscientific,waltham,ma)进行定量pcr(qpcr；miniopticon，bio-rad.hercules,ca,美国)而决定。

<3-2>aav9的单宁酸修饰

为了制备单宁酸修饰的aav9，以与实施例1中用于制备单宁酸修饰的gfp的方法相同的方式制备单宁酸修饰的aav。制备实施例3-1中制备的单宁酸(ta)溶液(10mm)和aav9溶液，并将ta溶液的浓度稀释至0.1mm、0.25mm、0.5mm、0.75mm和1mm。通过将稀释的ta溶液和aav9溶液以1：1的体积比例充分混合，来制备单宁酸修饰的aav9。

<实验例5>单宁酸修饰的aav9的胶体稳定性的评价

使用uv/vis光谱法(hp8453，hewlettpackard)测量实施例<3-2>中制备的单宁酸修饰的aav9溶液的吸光度(a600)。

当与0.75mm浓度的ta(图20，绿色)溶液混合时，观察到aav9聚集体形成，因此决定将0.5mm的ta浓度作为aav9(1.1×10¹⁰vg)(图20，粉红色)的最大临界浓度。

<实验例6>单宁酸修饰的aav9的心脏靶向性的评价

<6-1>在非疾病模型中单宁酸修饰的aav9的心脏靶向性的评价

为了确认单宁酸修饰的aav9的体内(invivo)心脏靶向性，未经单宁酸修饰的aav9(1×10¹¹vg，60μl)或单宁酸修饰的aav9(1×10¹¹vg，60μl)注射到小鼠尾静脉(balbc，8周龄，雄性，24-26g)，然后在第21天处死小鼠，采用ivis成像系统(ivis200，xenogen，美国)测量心脏、脾、肺、肾和肝的gfp荧光强度。

为了免疫组织化学(ihc，immunohistochemistry)分析，在室温下将心脏固定在4％甲醛中48小时，然后将组织用干冰状的oct(optimalcuttingtemperature，最佳切割温度)化合物包埋。使用冷冻切片机(leicacm3050s，gmiinc.，美国)将冷冻的组织块切成10μm厚度的切片，然后用0.2％的triton处理以提高抗体的传输效率。用1％bsa(bovineserumalbumin，牛血清白蛋白)封闭切开的切片，然后用抗gfp抗体(ab6556；1：500稀释倍数，abcam，cambridge，英国，12小时，4℃)作为第一抗体处理，山羊抗兔iggflamma488(rsa1241，1：200稀释倍数，bioacts，韩国，1小时，25℃)作为第二抗体处理，之后使用荧光显微镜(eclipse80i，nikon，日本)进行观察。

递送至心脏的aav9诱导了gfp表达，表明克隆至aav9载体的基因通过心脏细胞中的细胞转录和翻译而成功表达(图21)。此外，单宁酸修饰的aav9复合物的hti值(～0.15)比未经单宁酸修饰的aav9的hti值(～0.06)高2.5倍。这些结果表明，单宁酸修饰不影响aav9载体的内在基因转移能力。

<6-2>在mir动物模型中单宁酸修饰的aav的心脏靶向性的评价

研究了mir(myocardialischemiareperfusion，心肌缺血再灌注)动物模型中单宁酸修饰的aav的心脏靶向性。

具体地，在诱导室中，对大鼠(sd大鼠，8周龄，雄性，230-270g)使用异氟烷(isoflurane，3ccmin^-1)+隆朋(rompun，甲苯噻嗪(xylazine)，1mgkg^-1)和氧气的混合物进行麻醉。随后，将大鼠插管，并以1ccmin^-1的速率通入异氟烷和氧气的混合物。大鼠心脏通过左胸廓切开术(thoracotomy)暴露，闭塞10分钟后，缝合线迅速松开，以恢复通过左前降支(lad)的血流。除去缝合线后，立即注入实施例3中得到的单宁酸修饰的aav9或未经单宁酸修饰的aav9(2×10¹¹vg，400μl)。与实验例6-1的正常心脏中的表达测试相似，注射后21天处死所有大鼠，并使用ivis系统确认gfp表达。

结果，如图22a所示，与单独aav9处理或未经处理的相比，单宁酸修饰的aav9在梗塞的心脏组织(白色虚线)中具有改善的基因表达。注射单宁酸修饰的aav9(图22b，绿色柱)后，gfp的表达效率几乎是单独aav9处理(红色柱)或未经处理的对照(黑色柱)的2倍高。

<实验例7>单宁酸修饰的gfp的心脏毒性(cardiocytotoxicity)的评价

为了确认单宁酸修饰的gfp的心脏毒性(cardiocytotoxicity)，测量了体外(exvivo)单相动作电位(map,monophasicactionpotentials)(图23至图25)并进行了体内(invivo)心脏功能实验(图26至图27)。

<7-1>大鼠心脏的map记录

为了切除(excise)大鼠心脏，腹腔内注射(ip)1000iu/kg肝素，然后腹腔内注射50mg/kg戊巴比妥(pentobarbital)进行麻醉。在大鼠镇静并失去踏板反射活动后，迅速解剖心脏，并在一定压力(75-85cmh2o)压力和温度(37.5℃)下，通过连接到langendorff装置中的主动脉将用混合气(95％o2和5％co2，carbozen)饱和的经改良的krebs-henseleit(kh)缓冲液(112mm的氯化钠，5mm的kcl，11.5mm葡萄糖，25mm的nahco3，1.2mm的mgso4，1.2mm的kh2po4，2mm的丙酮酸和1.25mm的cacl2)灌流。

使用改良的franzmap电极记录左心室内膜(endocardium)的map，该电极由特氟隆(teflon)涂层的银线(直径为0.25mm)制成。在初始平衡期(15-30分钟)后，使用脑电图(electroencephalogram，eeg)放大器(module73-1770，eega，德国)连续记录map。使用差分ac放大器1700(a-m系统，wa)和分离的脉冲刺激器2100(a-m系统，wa)对心脏进行电刺激，使用ponemah软件对心率、最大速度(vmax)、振幅和最大复极化为30％、60％或100％的map持续时间(apd30、apd60或apd100)测量并连续监测。这些参数稳定后，将含有赋形剂(vehicle)对照组(仅k-h溶液)或含有单宁酸修饰的gfp(未过滤或通过离心过滤的100μmta+gfp)的k-h溶液灌流15-20分钟。

发现单宁酸修饰的gfp溶液不影响振幅和vmax参数(图24a和24b)。就心率而言，未经过滤的100μm单宁酸修饰的gfp将心率从每分钟180次的正常心率降低至161±16次，但过滤后的单宁酸修饰的gfp对心率的影响没有显着差异(图24c)。据信这是因为已知的有毒的游离(free)单宁酸是通过过滤除去的。

此外，分析了单宁酸修饰的gfp对大鼠心脏apd的不稳定性(instability)和动作电位三角测量(triangulation)的影响。将不稳定性(instability)量化为短期变异性(stv，short-termvariability)，并将短期变异性(stv)定义为与庞加莱图上到识别线(identityline)的平均正交距离。具体地，根据公式stv＝σ|dn+1-dn|/[30√2](其中d为apd100)计算短期变异性(stv)。动作电位形状的三角测量(triangulation)定义为从apd30到apd100的复极化时间(即，动作电位形状的三角测量＝apd100-apd30)。如果在apd100观察到的动作电位持续时间的延长(prolongation)大于在apd30观察到的动作电位持续时间的延长，或在apd30观察到的时间减少大于在apd100观察到的时间减少时，动作电位的整体形状变为三角形。在图25a中，未经过滤的单宁酸修饰的gfp的处理显示了以动作电位形式进行三角测量的局限性，但通过使用过滤的单宁酸修饰的gfp，以动作电位形式进行的三角测量(triangulation)现象恢复到正常水平(图25a，红色方框)。在stv的情况下，与未处理的对照组相似，100μm单宁酸修饰的gfp没有显著影响stv(图25b)。

<7-2>使用压力-体积传导导管技术测量大鼠心脏功能

为了确认过滤的单宁酸修饰的gfp的心脏安全性(cardiosafety)，进行了体内心脏血流动力学分析(图26)。

在连续监测体温的同时，在加热垫上，用3％异氟烷(isoflurane)(汽化器，美国vet设备，2-3cc/min)麻醉大鼠。通过右颈动脉将压力-体积转换器(2.0fr，millarinstruments，tx)引入左心室，并根据已知方法记录信号(hondeghem,l.m.etal.,circulation103,2004-2013(2001))。使用scisenseadv500(transonic，美国)将压力和体积信号记录到labscribe数据采集软件(iworx/cbsciences，美国)。

待记录的参数值稳定后，将大鼠随机分为3组，并向尾静脉注射gfp(对照组)或单宁酸修饰的gfp(12小时组和24小时组)。注射单宁酸修饰的gfp后12和24小时收集并分析数据。

对心率(hr,heartrate)、心输出量(co,cardiacoutput)、搏出量(sv,strokevolume)和射血分数(ef,ejectionfraction)、左心室(lv,leftventricle)压力以及最大压力上升率的最大dp/dt(dp/dtmax)，最大压力下降率的最小dp/dt(dp/dtmin)、收缩末期容积(esv,endsystolicvolume)、舒张末期容积(edv,enddiastolicvolume)、搏出工作量(sw,strokework)、动脉弹性(ea,arterialelastance)和松弛时间常数的tau值(tauvalues)使用分析软件通过以下算法进行分析：

hr：60/平均周期(averagecycleperiod)

esp：收缩末期的心室压(ventricularpressureatend-systole)

edp：舒张末期的心室压力(ventricularpressureatend-diastole)

lv(左心室)压力：选定周期内压力通道的平均最大值(averagemaximumvalueofpressurechanneloverselectedcycles)

dp/dtmax：选定周期内平滑导数的平均值(averagemaximumvalueofsmoothedderivativeoverselectedcycles)

dp/dtmin：选定周期内平滑导数的平均值(averageminimumvalueofsmoothedderivativeoverselectedcycles)

sv＝edv(在选定的周期内舒张末期容积的平均值，averagevalueatend-diastolevolumeoverselectedcycles)-esv(在选定的周期内末期容积的平均值，averagevalueatend-systolevolumeoverselectedcycles)

co＝sv*hr

ef＝100*(sv/edv)

sw：选定心动周期内pv环内的平均面积(areawithinthepvloopaveragedoverselectedcardiaccycles)

ea：esp/sv

使用weiss方法的tau：logp的回归(regressionoflogp)。

因为当与其他分子(即金属配位的ta复合物)配制时ta变得无毒，所以可以认为固定在分子水平上的用于蛋白质单宁酸修饰的ta不会产生有害作用。实际上，与注射未经单宁酸修饰的gfp(un-tannylatedgfp)的情况相比，单宁酸修饰的gfp(tannylatedgfp)在注射后第12小时或第24小时不会影响参数(图27)。因此，通过这些体外和体内测定，发现单宁酸修饰的gfp没有显示出心脏毒性。

<实施例4>单宁酸修饰bfgf的制备

首先，将碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf，seq.id.no：1)溶解于浓度为1mg/ml的磷酸盐缓冲盐水(phosphatebufferedsaline，pbs)中，并以0.14mm或0.7mm的浓度制备单宁酸(tannicacid，以下称为ta)溶液。将ta溶液(100μl)添加到每种bfgf溶液中(5μg为0.14mm，25μg为0.7mm)，制备了化学计量比([ta]/[bfgf])为143的单宁酸修饰的bfgf(tannylatedbfgf)。

<实验例8>单宁酸修饰的bfgf治疗能力的确认

bfgf在形成新血管(neovasculature)以恢复心脏功能中起着至关重要的作用，但是bfgf的静脉注射没有治疗作用，因此需要使用另一种制剂(即水凝胶)进行心肌注射。因此，在心肌缺血再灌注(myocardialischemiareperfusion，mir)的心脏病模型中，我们试图通过静脉注射确认单宁酸修饰的bfgf的治疗效果。

具体地，在诱导室中，对大鼠(sd大鼠，8周龄，雄性，230-270g)使用异氟烷(isoflurane，3ccmin^-1)+隆朋(rompun，甲苯噻嗪(xylazine)，1mgkg^-1)和氧气的混合物进行麻醉。随后，将大鼠插管，并以1ccmin^-1的速率通入异氟烷和氧气的混合物。大鼠心脏通过左胸廓切开术(thoracotomy)暴露，闭塞10分钟后，缝合线迅速松开，以恢复通过左前降支(lad)的血流。除去缝合线后，立即注入实施例4中得到的单宁酸修饰的bfgf或未经单宁酸修饰的bfgf(non-tannylatedbfgf)(5μg或25μg，注射剂量200μl)(n＝7每组)。

注射后第28天，使用scscenseadv500(transonic，美国)对左心室功能进行体内(invivo)血液动力学(hemodynamic)评价，将数据输出到labscribe数据采集软件(iworx/cbsciences，美国)。

血流动力学评价完成后，将心脏分离并浸入温热的(～37℃)pbs中以除去血液残留物。然后将心脏立即在-20℃下冷冻，并将冷冻的心脏从顶点(apex)切成约2mm的纵向切片。将切片置于细胞培养皿中，然后在37℃下用溶于pbs的1％氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride，ttc)处理15分钟。染色后，用扫描仪拍摄心脏切片，以区分红色染色的活组织和白色非染色坏死组织。使用imagej软件以数字方式测量梗塞面积并表示为百分比。

结果，如图28a所示，在注射5μg单宁酸修饰的bfgf(tannylatedbfgf)后第28天，梗塞面积为总心脏的约16％(黑色条)，但是相比之下，未处理对照组梗塞面积为51％(白色条)，而在单独注射bfgf的情况下，梗塞面积为31％(灰色条)。当给予25μgbfgf时，梗死面积与给予5μgbfgf的梗死面积之间无显着差异。

组织学图像还显示在注射单宁酸修饰的bfgf(tannylatedbfgf)后梗塞面积减小(图28b)。尤其是，单宁酸修饰的bfgf(tannylatedbfgf)的输注与健康心脏(sham组)的输注相似，具有所有血流动力学功能值(即左心室压力(leftventricularpressure)、搏出量(strokevolume)、心输出量(cardiacoutput)、心室收缩指数(ventricularcontractilityindex))(图29和表2)。这些结果表明，针对心脏的靶向药物的单宁酸修饰可有效地用于治疗心脏病。

[表2]

(与sham组比较，*p<0.05，**p<0.01；与mir组相比，^#p<0.05，^##p<0.01)

本发明的单宁酸修饰可以简单地通过以适当的化学计量比混合要单宁酸修饰的物质和单宁酸(ta)来进行。单宁酸修饰(tannylation)类似于聚乙二醇修饰(pegylation)，增加了体内血液循环时间。但是，与聚乙二醇修饰不同，单宁酸修饰可以赋予与心脏心肌结合的能力，可以有效地用于单宁酸修饰的物质在心脏中的靶向和蓄积。

在本发明中，已证实将gfp、心脏病治疗剂sp和bfgf以及病毒aav9被单宁酸修饰以靶向并蓄积在心脏的心肌中。特别地，通过将单宁酸修饰的bfgf静脉内施用至mir疾病模型，证实了治疗效果，其可以解决使用侵入性方法将治疗剂局部递送至心脏的现有技术中存在的问题。

<110>韩国化学研究院(korearesearchinstituteofchemicaltechnology)

韩国科学技术院(koreaadvancedinstituteofscienceandtechnology(kaist))

<120>含有单宁酸的心脏靶向剂

<130>gp202000179

<150>kr10-2018-0033156

<151>2018-03-22

<160>2

<170>kopatentin3.0

<210>1

<211>154

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>bfgf(basicfibroblastgrowthfactor)

<400>1

alaalaglyserilethrthrleuproalaleuprogluaspglygly

151015

serglyalapheproproglyhisphelysaspprolysargleutyr

202530

cyslysasnglyglyphepheleuargilehisproaspglyargval

354045

aspglyvalargglulysseraspprohisilelysleuglnleugln

505560

alaglugluargglyvalvalserilelysglyvalcysalaasnarg

65707580

tyrleualametlysgluaspglyargleuleualaserlyscysval

859095

thraspglucysphephephegluargleugluserasnasntyrasn

100105110

thrtyrargserarglystyrthrsertrptyrvalalaleulysarg

115120125

thrglyglntyrlysleuglyserlysthrglyproglyglnlysala

130135140

ileleupheleuprometseralalysser

145150

<210>2

<211>11

<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>sp(substancep)

<400>2

argprolysproglnglnphepheglyleumet

1510