包含可溶性包封抗原的聚合物囊泡以及其制备方法和用途与流程
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序列表
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本申请涉及包括氧化稳定的聚合物囊泡的聚合物囊泡，所述聚合物囊泡包含可溶性或增溶的(solubilized)包封抗原，其中所述可溶性或增溶的包封抗原选自：多肽、碳水化合物、多核苷酸以及它们的组合。
背景技术：
虽然免疫是一个确立已久的过程，但是不同免疫原或抗原引发的应答水平存在差异。例如，膜蛋白形成一类产生低应答水平的抗原，这又意味着需要大量的膜蛋白来产生或引发所需水平的免疫应答。众所周知，膜蛋白很难合成，并且在没有去污剂的情况下膜蛋白不溶于水。这使得获得足够量的用于免疫的膜蛋白不仅昂贵而且困难。此外，膜蛋白需要适当折叠才能正常发挥其功能。通常，正确折叠的天然膜蛋白的免疫原性比不能以生理相关的方式折叠的膜蛋白的增溶形式的免疫原性要好得多。因此，即使可以使用佐剂来增强此类增溶的抗原的免疫原性，但这也是一种效率低下且没有太多优势的方法(如wo2014/077781a1)。
尽管已将转染的细胞和基于脂质的系统用来呈递膜蛋白抗原以增加分离可能在体内有效的抗体的机会，但这些系统通常是不稳定的(如，是氧化敏感的)、繁琐(tedious)且昂贵的。此外，此类膜蛋白抗原目前最先进的技术水平是将无活性的病毒样颗粒用于免疫接种。
另一方面，疫苗是预防疾病(主要是感染性疾病)最有效的方法[如，liu等人，2016]。截至目前，大多数获得许可的疫苗均是由活病毒或灭活的病毒制成的。尽管它们在产生体液应答(抗体介导的应答)以防止病毒增殖和进入细胞方面是有效的，但是此类疫苗的安全性仍然令人担忧。在过去的几十年中，科学进步已经通过使非复制型重组病毒的疫苗载体工程化从而帮助克服了这些问题。同时，将基于蛋白的抗原或亚单位抗原考察作为更安全的选择。然而，此类基于蛋白的疫苗通常会导致(illicit)较差的免疫(体液和细胞应答)。为了改善抗原的免疫原性，已经使用了若干种方法。例如，已经广泛研究了将抗原微包封到聚合物中，然而尽管这确实增强了免疫原性，但是抗原的聚集和变性问题仍然未得到解决[如，hilbert等，1999]。此外，将佐剂(如水包油乳剂或聚合物乳剂)[如us9636397b2、us2015/0044242a1]与抗原一起使用以引发更明显的体液和细胞应答。尽管取得了这些进步，但它们在摄取和交叉呈递方面的效率较低。为了促进交叉呈递，基于免疫系统在病毒感染期间的可用信息，已经开发了模拟此类特性的病毒样颗粒。合成结构(比如具有包封的抗原的脂质体)是特别有吸引力的。脂质体是由脂质制成的单层自组装结构，并且作为递送媒介，阳离子脂质体更具吸引力和前景，因为它们能被抗原呈递细胞(apc)有效摄取[如，maji等，2016]。此外，脂质体允许整合免疫调节剂比如单磷酰基脂质a(mpl)、cpg寡脱氧核苷酸，该免疫调节剂为可通过受体刺激免疫细胞的toll样受体(tlr)激动剂。尽管具有此类递送媒介的优势，但限制因素之一是在血清组分存在下的脂质体的稳定性。通过聚peg化，负载高熔点的脂质，脂质体的稳定性问题得到了一定程度的解决(reduced)，其中一个充分表征的实例是通过用连接脂质的短共价交联稳定多层囊泡而形成的内双层交联多层囊泡(icmv)[如，moon等人，2011]。采用纳米圆盘(nanodisc)[如kuai等人，2017]或ph敏感颗粒[如luo等人，2017]，其它纳米颗粒结构已实现了成功免疫接种。但是，此类策略要么仍需要佐剂，要么在原型卵清蛋白(ova)模型之外效果不佳。
此外，聚合物囊泡可作为脂质体的稳定替代物，并且已经将它们用于整合膜蛋白以引发免疫应答[如，quer等人，2011，wo2014/077781a1]。蛋白抗原也被包封在经过化学改变的聚合物囊泡的膜中(但是，是对氧化敏感的膜)，以将抗原和佐剂释放到树突状细胞中[如，stano等，2013]。
尽管通过使用聚合物已经取得了上述进步，但是仍然需要提供有效摄取和稳定的交叉呈递递送媒介和方法，从而克服或至少缓解上述问题并具有改进的功能性，特别是它们还能够引发cd8(+)t细胞介导的免疫应答，这在治疗和/或预防感染性疾病、癌症和自身免疫性疾病中特别重要。
技术实现要素：
本申请涉及聚合物囊泡(polymersome)，包括氧化稳定的聚合物囊泡(作为有效摄取和稳定交叉呈递递送媒介)，所述聚合物囊泡包含可溶性包封抗原，其中所述可溶性包封抗原选自：多肽、碳水化合物、多核苷酸以及它们的组合。本发明进一步涉及一种用于生产其中包封抗原的聚合物囊泡的方法以及由所述方法生产的聚合物囊泡。本发明再进一步涉及包含本发明的聚合物囊泡的组合物，暴露至本发明的聚合物囊泡或组合物的分离的抗原呈递细胞和杂交瘤细胞。本发明还涉及包含本发明的聚合物囊泡的疫苗，引发免疫应答的方法或用于治疗、改善、预防或诊断癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，此类方法包括向有此需要的受试者提供本发明的聚合物囊泡。
本发明还涉及一种直径为约120nm或140nm或更长的聚合物囊泡用于引发免疫应答的用途，所述聚合物囊泡包含可溶性包封抗原，其中所述可溶性包封抗原选自：
i)多肽；
ii)碳水化合物；
iii)多核苷酸，优选地，所述多核苷酸不是反义寡核苷酸，进一步优选地，所述多核苷酸是dna或mrna分子；或
iv)i)和/或ii)和/或iii)的组合。
一种平均直径为约120nm或140nm或更长的聚合物囊泡的集合用于引发免疫应答的用途，所述集合的聚合物囊泡包含可溶性包封抗原，其中所述可溶性包封抗原选自：
i)多肽；
ii)碳水化合物；
iii)多核苷酸，优选地，所述多核苷酸不是反义寡核苷酸，进一步优选地，所述多核苷酸是dna或mrna分子；或
iv)i)和/或ii)和/或iii)的组合。
此外，在本发明的过程中发现，提供本发明的聚合物囊泡允许可溶性(增溶的)包封(位于所述聚合物囊泡中)抗原产生(比具有或不具有佐剂的游离抗原)更强的体液免疫应答，以及引发cd8(+)t细胞介导的免疫应答。由此，实现了受试者中抗体产生效率的提高。无论是否使用佐剂均可实现这种效率的提高。此外，本发明的聚合物囊泡引发cd8(+)t细胞介导的免疫应答的能力使其作为免疫治疗性抗原递送和呈递系统的潜力显著增加。
由于由聚合物囊泡呈递可溶性(如增溶的)包封抗原，通过使用本发明的聚合物囊泡和方法产生的抗体不仅具有更高的产生成功率和对其相应的体外或体内靶标的更高的亲和力，并且当在各种基于溶液的抗体应用中使用时相应地提高了灵敏性，而且能够容易地针对通过使用游离抗原注射的常规方法不能触发抗体产生的困难抗原产生抗体和/或减少这种抗体产生过程所需的抗原量，从而降低此类生产的成本。此外，由本发明的聚合物囊泡呈递的可溶性(如增溶的)包封抗原还能够引发cd8(+)t细胞介导的免疫应答，这将相应的聚合物囊泡的用途扩展至细胞介导的免疫，并因此改善了所述聚合物囊泡的免疫治疗及抗原递送和呈递潜力。
因此，本申请通过提供改进了抗原免疫原性特性的氧化稳定的聚合物囊泡、其生产方法和包含此类聚合物囊泡的组合物来满足该种需求，所述聚合物囊泡、其生产方法和包含此类聚合物囊泡的组合物在下文描述，特征在权利要求书中表征并通过所附的实施例和附图加以说明。
序列表概述
如本文所述，参考uniprotkb登录号(http://www.uniprot.org/，如在uniprotkbrelease2017_12中获得)。
seqidno:1为源自结肠癌mc-38小鼠模型的肿瘤新抗原多肽reps1p45a的氨基酸序列。
seqidno:2为源自结肠癌mc-38小鼠模型的肿瘤新抗原肽adpgkr304m的氨基酸序列。
seqidno:3为源自结肠癌mc-38小鼠模型的肿瘤新抗原肽dpagt1v213l的氨基酸序列。
seqidno:4为鸡卵清蛋白(ova)的氨基酸序列，uniprotkb登录号：p01012。
seqidno:5为甲型流感病毒(influenzaavirus)(a/纽约/38/2016(h1n1))血凝素的氨基酸序列，uniprotkb登录号：a0a192zyk0。
seqidno:6为甲型流感病毒(a/猪/4/墨西哥/2009(h1n1))血凝素的氨基酸序列，uniprotkb登录号：d2ce65。
seqidno:7为甲型流感病毒(a/波多黎各/8/1934(h1n1))血凝素的氨基酸序列。
seqidno:8为甲型流感病毒(a/加利福尼亚/07/2009(h1n1))血凝素的氨基酸序列。
seqidno:9为源自黑色素瘤b16-f10小鼠模型的肿瘤新抗原多肽cd8trp2173–196的氨基酸序列。
seqidno:10为源自黑色素瘤b16-f10小鼠模型的肿瘤新抗原多肽cd4m30kif18bk739n的氨基酸序列。
seqidno:11为源自黑色素瘤b16-f10小鼠模型的肿瘤新抗原多肽cd4m44cpsf3ld314n的氨基酸序列。
seqidno:12为猪流行性腹泻病毒(pedv)纤突(spike)蛋白(s蛋白)(uniprotkb登录号：v5ta78)的可溶性部分(氨基酸残基19至1327)的氨基酸序列。
seqidno:13为pedv纤突蛋白(s蛋白)的s1区(氨基酸残基19至739)的氨基酸序列，和
seqidno:14为pedv纤突蛋白(s蛋白)的s2区(氨基酸残基739至1327)的氨基酸序列。
seqidno:15为增强型绿色荧光蛋白(egfp)的氨基序列。
附图说明
图1示出了采用包封抗原的本发明的聚合物囊泡进行免疫接种并测量体液和细胞应答的示意图。
图2示出了本发明的聚合物囊泡的动态光散射结果的结果。图2a示出了具有173.1nm(直径)的单分散群的包封ova的聚合物囊泡的动态光散射图。图2b示出了通过dls测量的包封不同抗原的不同聚合物囊泡的平均直径(z平均值)表。
图3示出了在尺寸排阻色谱中包封ova的聚合物囊泡的洗脱曲线。
图4示出了包封ova的聚合物囊泡的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)。
图5示出了在本发明的聚合物囊泡中核酸(此处是增强型绿色荧光蛋白(egfp)的编码基因)的包封以及具有包封的核酸的聚合物在细胞中的摄取的结果。图5a示出了细胞内部不同聚合物囊泡的荧光强度摄取和基于聚合物囊泡中包封的dna的egfp表达，而图5b和图5c示出了用包封dna的聚合物囊泡转染的细胞的荧光图像。
图6示出了用pbs、仅ova、具有sas佐剂的ova、无佐剂的包封ova的聚合物囊泡免疫的小鼠血清的抗体效价。仅acm包封的ova(以下“acm”是指本发明的聚合物囊泡)能够诱导igg效价。
图7示出了用pbs、仅ha和无佐剂的包封ha的聚合物囊泡免疫的小鼠血清的抗体效价。仅acm包封的ha(本发明的聚合物囊泡)能够诱导igg效价。
图8示出了mc-38小鼠肿瘤模型的结果。在用游离肽(空心圆)、acm包封的肽(实心正方形，本发明的聚合物囊泡)或用acm包封的肽与抗pd1抗体治疗一起(实心三角形)免疫的小鼠中监测肿瘤体积。与游离肽相比，acm包封的肽(本发明的聚合物囊泡)改变了肿瘤的发展，通过添加抗-pd1抗体进一步增强了这种改变。任何组中均未添加佐剂。
图9示出了用pbs和用如本文所用的已经被包封在聚合物囊泡中的pedvs蛋白的可溶性片段(“包封了spike蛋白的聚合物囊泡”)免疫的小鼠血清的igg抗体效价和病毒中和(针对毒株pedvusa/科罗拉多/2013(co/13))，并与用灭活的ped病毒(“灭活的pedv”)和仅acm聚合物囊泡(即不具有任何抗原，“仅聚合物囊泡”)免疫的小鼠血清的igg抗体效价和病毒中和进行比较。从图9的igg效价可以看出，acm包封的pedvs蛋白的片段以及灭活的病毒均诱导了igg效价。病毒中和数据表明，只有acm包封的pedvs蛋白导致了显著的中和效价，而阴性对照(不具有任何抗原的acm聚合物囊泡)和灭活的ped病毒的中和作用则可忽略不计。
图10示出了用pbs和不同的聚合物囊泡(如bd21(如下文所定义的)、pdms46-peo37(在图中标记为“pdms”)、具有dspe-peg(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺[dspe]聚乙二醇)作为添加的脂质的pdms46-peo37、添加了大豆磷脂(asolectinlipid)(商购可获得的来自大豆的磷脂)包封全长可溶性ped纤突蛋白(在“具有可溶性s蛋白的bd21”的情况下)或其s1或s2片段(在所有其它情况下)的聚乙二醇-聚乳酸(pla-peg))免疫后的小鼠产生的血清的病毒中和数据(针对毒株pedvusa/科罗拉多/2013(co/13))。从图10中可以看出，用pbs样品免疫的小鼠组未显示任何病毒中和，而无论是包封全长蛋白还是包封其片段，全部聚合物囊泡制剂均显示出不同程度的病毒中和。
图11示出了采用未使用佐剂的acm包封的pedvs蛋白口服免疫接种的猪的iga抗体效价。效价来自粪便拭子。如图11所示效价随时间升高，这表明口服施用本发明的其中包封了pedvs蛋白的聚合物囊泡能够在猪中引发免疫应答。
图12示出了猪流行性腹泻病毒(pedv)纤突蛋白(s蛋白)(uniprotkb登录号：v5ta78)和seqidno:12(氨基酸残基19至1327)、seqidno:13(氨基酸残基19至739)和seqidno:14(氨基酸残基739至1327)的可溶性片段的示意图，已经将它们用于在聚合物囊泡中包封可溶性s蛋白并随后如本文对小鼠和猪进行免疫接种/疫苗接种。
发明详述
以下详细的描述参照所附的实施例和附图，这些实施例和附图通过示例的方式示出了可以实施本发明的特定细节和实施方案。对这些实施方案进行了足够详细的描述，以使本领域技术人员能够实施本发明。可以使用其它实施方案，使得在不脱离本发明的范围的情况下进行结构、逻辑和折衷改变。本文描述的本发明的各个方面不一定相互排斥，因为本发明的各个方面可以与一个或多个其它方面组合以形成本发明的新的实施方案。
在本上下文中，聚合物囊泡为具有聚合物膜的囊泡，这些聚合物囊泡通常但非必需地由一种或多种两亲性嵌段共聚物的稀溶液的自组装形成，所述两亲性嵌段共聚物可以是不同类型的，比如二嵌段和三嵌段(a-b-a或a-b-c)。本发明的聚合物囊泡也可以由四嵌段或五嵌段共聚物形成。对于三嵌段共聚物，中央嵌段通常由其侧面嵌段与环境隔离，而二嵌段共聚物自组装成双层，将两个疏水性嵌段尾对尾放置，效果大致相同。在多数情况下，囊泡膜具有不溶性中间层和可溶性外层。将通过自组装形成聚合物囊泡的驱动力看作是不溶性嵌段的微相分离，其倾向于结合以便保护自身不与水接触。由于成分共聚物的分子量大，因此，本发明的聚合物囊泡具有显著的性能。嵌段共聚物的总分子量的增加有利于囊泡的形成。由此，与由脂质和表面活性剂形成的囊泡相比，(聚合的)两亲性物质在这些囊泡中的扩散非常低。由于聚集在囊泡结构中的聚合物链的迁移率(mobility)较低，因此可以获得稳定的聚合物囊泡形态。除非另有明确说明，否则将本文所用的术语“聚合物囊泡(polymersome)”和“囊泡(vesicle)”看作相似的并且可以互换使用。重要的是，本发明的聚合物囊泡可以由一种pf嵌段共聚物或由两种或更多种嵌段共聚物形成，这意味着聚合物囊泡也可以由聚合物囊泡的混合物形成，并由此可以包含两种或更多种嵌段共聚物。在一些方面，本发明的聚合物囊泡是氧化稳定的。
在一些方面，本发明涉及一种用于在受试者中引发对可溶性(如增溶的)包封抗原的免疫应答的方法。该方法适合于向受试者注射组合物，该种组合物包含具有两亲性聚合物的膜(如，周向膜(circumferentialmembrane))的聚合物囊泡(如，载体或媒介)。所述组合物包含可溶性(如增溶的)抗原，该抗原由本发明的聚合物囊泡的两亲性聚合物的膜(如周向膜)包封。所述抗原可以是以下的一种或多种：i)多肽；ii)碳水化合物；iii)多核苷酸(如所述多核苷酸不是反义寡核苷酸，优选地，所述多核苷酸是dna或信使rna(mrna)分子)或i)和/或ii)和/或iii)的组合。
在另一些方面，本发明涉及能够引发cd8(+)t细胞介导的免疫应答的聚合物囊泡。
在一些方面，本发明涉及能够靶向淋巴结驻留性巨噬细胞和/或b细胞的聚合物囊泡。本发明设想的示例性的非限制性靶向机制包括：i)将包封的抗原(如多肽等)递送至树突状细胞(dc)以使t细胞活化(cd4和/或cd8)。另一机制为：ii)完整折叠的抗原(例如蛋白质等)的递送，这些抗原将转移至dc并也会触发效价(b细胞)。
在一些方面，本发明涉及包封抗原的聚合物囊泡，所述抗原选自：i)自身抗原，ii)非自身抗原，iii)非自身免疫原和iv)自身免疫原。因此，本发明的产品和方法适合用在诱导耐受性的环境(setting)(如临床环境)中，如当靶向自身免疫性疾病时。
在一些方面，本发明涉及包含脂质聚合物的本发明的聚合物囊泡。
本发明的聚合物囊泡还可以具有共包封的(即除了抗原外，包封的)一种或多种佐剂。佐剂的实例包括含有未甲基化cpg基序的合成寡脱氧核苷酸(odn)，所述未甲基化cpg基序可触发表达toll样受体9的细胞(包括人浆细胞样树突状细胞和b细胞)以启动先天免疫应答，所述先天免疫应答的特征在于产生th1和促炎性细胞因子，比如白介素-1、白介素-2或白介素-12的细胞因子，匙孔血蓝蛋白(klh)，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，仅列举了几个示例性的实例。
只要所述聚合物囊泡能够引发免疫应答，本发明的聚合物囊泡可以是任何尺寸。例如，所述聚合物囊泡可具有大于70nm的直径。所述聚合物囊泡的直径的范围可为约100nm至约1μm，或约100nm至约750nm，或约100nm至约500nm。所述聚合物囊泡的直径的范围还可为约125nm至约175nm，或约125nm至约250nm，约140nm至约240nm，约150nm至约235nm，约170nm至约230nm，或约220nm至约180nm，或约190nm至约210nm。例如，所述聚合物囊泡的直径可以为约200nm；约205nm或约210nm。当用作集合来引发免疫应答时，所述聚合物囊泡的集合通常为单分散群。所采用的聚合物囊泡的集合/群的平均直径通常在70nm以上、或在120nm以上、或在125nm以上、或在130nm以上、或在140nm以上、或在150nm以上、或在160nm以上、或在170nm以上、或在180nm以上、或在190nm以上(对此还参见图2)。所述聚合物囊泡的集合的平均直径可以，例如在上述单个聚合物囊泡的范围内，即所述聚合物囊泡的集合的平均直径可以处于约100nm至约1μm、或约100nm至约750nm、或约100nm至约500nm、或约125nm至约250nm、约140nm至约240nm、约150nm至约235nm、约170nm至约230nm、或约220nm至约180nm、或约190nm至约210nm的范围内。所述聚合物囊泡的集合的平均直径也可以为，例如约200nm、约205nm或约210nm。可以例如通过动态光散射(dls)仪器，使用z平均值(d,nm)(一种优选的dls参数)来确定直径。z平均尺寸是强度加权调和平均颗粒直径(intensityweightedharmonicmeanparticlediameter)(参见实施例1和2)。在本上下文中，应注意，根据hubbel等人的美国专利8,323,696，聚合物囊泡的集合应当具有小于70nm的平均直径才能引发免疫应答。类似地，stano等人，同上，2013，尽管希望使用较小的聚合物囊泡，但由于技术限制，他们使用了直径为125nm+/-15nm的聚合物囊泡来引发免疫应答。因此，令人惊讶的是，具有例如大于150nm的平均直径的本发明的聚合物囊泡的群/集合能够诱导细胞和体液免疫应答(参见实施例部分)。此类聚合物囊泡的集合可以是适合例如通过注射或口服给药引发免疫应答的形式。
在一些方面，本发明涉及本发明的组合物，其适合于皮内、腹膜内、皮下、静脉内或肌内注射或无创施用本发明的抗原，所述无创施用例如口服施用或经鼻腔施用。所述组合物可包括本发明的聚合物囊泡(如载体)，其具有两亲性聚合物的膜(如周向膜)。所述组合物进一步包含由所述聚合物囊泡的两亲性聚合物的膜包封的可溶性(如增溶的)抗原。本发明的组合物可用于治疗目的(例如，通过例如疫苗接种的手段来治疗患有疾病的受试者或预防患有疾病)或用于抗体发现、疫苗发现或靶向递送。
在一些方面，本发明的聚合物囊泡在其表面具有羟基。在另一些方面，本发明的聚合物囊泡在其表面不具有羟基。
在本发明的上下文中，术语“包封的”意指被膜包裹(如，本发明的聚合物囊泡的膜，如内嵌在所述聚合物囊泡的腔内)。对于抗原，术语“包封的”进一步意指所述抗原既未整合到、也未共价结合至、也未缀合至(如，本发明的聚合物囊泡的)所述膜上。对于如本文所述的聚合物囊泡的囊泡结构的隔室化，术语“包封的”意指内部囊泡完全包含在外部囊泡内部，并被外部囊泡的囊泡膜包围。由外部囊泡的囊泡膜包围的密闭空间形成一个隔室。由内部囊泡的囊泡膜包围的密闭空间形成另一个隔室。
在本上下文中，术语“抗原”意指可以被免疫系统的组分特异性结合的任何物质。只有能够引发(或引起或诱导)免疫应答的抗原才被认为具有免疫原性，并被称为“免疫原”。示例的非限制性抗原是源自蛋白质的可溶部分的多肽、可变得可溶的用于包封的疏水性多肽以及可作为聚集体可溶的聚集多肽。所述抗原可以来自体内(“自身抗原”)或来自外部环境(“非自身”)。
膜蛋白形成一类通常产生低免疫应答水平的抗原。值得注意的是，可溶性(如增溶的)膜蛋白(mp)和膜相关肽(map)及其片段(即部分)(如本文提到的抗原)是由聚合物囊泡包封的，所述聚合物囊泡可允许它们以生理相关的方式折叠。这极大地增强了此类抗原的免疫原性，因此，与游离抗原相比，可以使用更少量的相应抗原来产生相同水平的免疫应答。此外，(与游离膜蛋白相比)更大尺寸的聚合物囊泡允许免疫系统更容易地检测到它们。
在本发明的上下文中，术语“b16肽”是指源自自发c57bl/6衍生的b16黑色素瘤模型(例如，黑色素瘤b16-f10小鼠模型)的任何新抗原多肽。其非限制性实例包括肽seqidno:9、10和11。
在本发明的上下文中，术语“mc38肽”是指源自结肠癌mc38小鼠模型的任何新抗原多肽。其非限制性实例包括肽seqidno:1、2和3。
在本发明的上下文中，术语“流感血凝素(ha)”是指一种在流感病毒表面发现的糖蛋白。ha具有至少18种不同的抗原，这些抗原均在本发明的范围内。将这些亚型型命名为h1至h18。“流感血凝素(ha)”亚型h1的非限制性实例包括多肽seqidno:5、6、7和8。
在本发明的上下文中，术语“猪流感血凝素(ha)是指一种在猪流感病毒表面发现的糖蛋白，其是一种在猪中流行的流感病毒家族。“猪流感血凝素(ha)”的非限制性实例包括亚型h1seqidno:6。
在本发明的上下文中，术语“pedvs蛋白”是指猪流行性腹泻病毒(pedv)表面上存在的spike糖蛋白，该病毒属于猪的冠状病毒家族。可用于本发明的可溶性“pedvs蛋白”的非限制性实例包括猪流行性腹泻病毒(pedv)纤突蛋白(s蛋白)(uniprotkb登录号：v5ta78)的由具有氨基酸序列seqidno:12的s1和s2区域组成的完整可溶性片段，s1区seqidno:13的可溶性片段，或s2区seqidno:14的可溶性片段。当然也可以使用s1和s2区的完整可溶性片段的较短片段，或者仅单独使用s1区或s2区(对此参见图12)。当然也可以在本发明的聚合物囊泡中使用包含部分s1和部分s2的片段，例如，纤突蛋白的沉积序列的氨基酸500至939。在此还应注意，本发明的聚合物囊泡可具有包封的所述纤突蛋白的一种或多种不同可溶性片段，例如s1区、s2区和/或完整的s1和s2区。在本发明的聚合物囊泡的示例性实施方案中，所述聚合物囊泡在其中包封了一种类型的可溶性片段(例如，仅s1区)、两种不同类型的可溶性片段(例如，s1和s2区)，三种不同类型的可溶性片段(s1区、s2区域和seqidno:12(氨基酸残基19至1327)的s1和s2的完整可溶性片段)或甚至四种不同类型的片段(例如，s1区、s2区、seqidno:12(氨基酸残基19至1327)的s1和s2的完整可溶性片段，以及作为第四种类型，包含部分s1和部分s2的上述片段，例如，纤突蛋白序列的氨基酸500至939)。在此还应注意，在一个优选的实施方案中，将其中包封了一种或多种不同的spike蛋白的可溶性片段的本发明的聚合物囊泡用作针对猪流行性腹泻病毒的口服疫苗。
在本发明的上下文中，术语“氧化稳定的”是指采用例如scott等人，2012描述的方法对聚合物囊泡(或相应的聚合物或膜)的抗氧化性的度量。在该种方法中，将具有包封的抗原的聚合物囊泡在0.5％的过氧化氢溶液中温育并且游离(释放)的抗原的量可通过uv/荧光hplc进行定量。将在这些氧化条件下释放大量或全部的包封抗原的聚合物囊泡看作是对氧化敏感的。在美国专利8,323,696的第16栏描述了另一种确定嵌段共聚物和由此得到的聚合物囊泡是氧化稳定的还是氧化敏感的方法。根据该方法，通过温和的氧化剂对具有氧化敏感的官能团的聚合物进行化学改变，其检验标准是在体外达20小时针对10％过氧化氢的溶解增强了。例如，聚(硫化丙烯)(pps)是一种氧化敏感的聚合物(参见例如scott等人2012，同上和us8,323,696)，pps可以用作确定目标聚合物以及相应的目标聚合物囊泡是氧化敏感的还是氧化稳定的参照物，例如，若与其中包封了相同抗原的pps聚合物囊泡中释放的抗原量相比，从目标聚合物囊泡中释放了相同或更高量的抗原，或所述量的约90％或更多，或所述量的约80％或更多，或所述量的约70％或更多，或所述量的约60％或更多，则将该聚合物囊泡看作是氧化敏感的。若与其中包封了相同抗原的pps聚合物囊泡中释放的抗原量相比，从目标聚合物囊泡中释放了仅约0.5％或更少，或仅约1.0％或更少，或约2％或更少，或约5％或更少，或约10％或更少，或约20％或更少，或约30％或更少，或约40％或更少或约50％或更少的抗原，则将该聚合物囊泡看作是氧化稳定的。因此，与此一致，如美国专利8,323,696描述的pps聚合物囊泡或如由stano等人描述的由聚(硫化丙烯)(pps)和聚(乙二醇)(peg)作为组分制成的pps-bl-peg聚合物囊泡不是本发明意义上的氧化稳定的聚合物囊泡。类似地，pps30-peg17聚合物囊泡不是本发明意义上的氧化稳定的聚合物囊泡。测量氧化稳定性的其他非限制性实例包括例如在血清组分(如哺乳动物血清，如人血清组分)存在下的稳定性或核内体内部的稳定性的测量。
在本发明的上下文中，术语“还原稳定的”是指在还原环境下聚合物囊泡的抗还原性的度量。
在本发明的上下文中，术语“血清”是指已经从中移除凝结蛋白的血浆。
在本发明的上下文中，术语“不依赖于氧化的释放”是指在形成聚合物囊泡的聚合物没有或基本上没有氧化的情况下聚合物囊泡内容物的释放。
在本文中术语“多肽”与术语“蛋白”等同使用。蛋白(包含其片段，优选生物活性片段，以及通常具有少于30个氨基酸的肽)包含通过共价肽键彼此相连的一个或多个氨基酸(从而产生一个氨基酸链)。本文所用术语“多肽”描述了一组由例如超过30个氨基酸组成的分子。多肽可更进一步形成多聚体比如二聚体、三聚体及更高的低聚体，即由大于一个多肽分子组成。形成此类二聚体或三聚体等的多肽分子可以相同或不同。这种多聚体对应的较高阶结构因此称为同二聚体或异二聚体，同三聚体或异三聚体等。一个异多聚体的实例是抗体分子，在其天然存在的形式中由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白”也指经天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰由如翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)实现。这些修饰是本领域熟知的。
在本上下文中，术语“碳水化合物”是指具有化学计量式cn(h2o)n的化合物(如，因此也称为“碳的水合物”)，如醛糖和酮糖。该上位术语“碳水化合物”包括但不限于单糖、寡糖和多糖以及由通过羰基还原(醛糖醇)，通过将一个或多个末端基团氧化为羧酸或通过用氢原子、氨基、硫醇基或类似基团取代一个或多个羟基衍生的物质。还包括这些化合物的衍生物。
在本上下文中，术语“多核苷酸”(也称为“核酸”，其可与术语“多核苷酸”互换使用)是指由核苷酸单元组成的大分子，这些核苷酸单元如可以水解为某些嘧啶或嘌呤碱基(通常为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、d-核糖或2-脱氧-d-核糖和磷酸。“多核苷酸”的非限制性实例包括dna分子(如cdna或基因组dna)、rna(mrna)、它们的组合或由dna和rna组成的杂合分子。核酸可以是双链或单链的，并且可以同时包含双链和单链的片段。最优选的多核苷酸的实例是双链dna分子和mrna分子。
在本上下文中，术语“反义寡核苷酸”是指核酸聚合物，其至少一部分与正常细胞或受累细胞(affectedcell)中存在的核酸互补。示例性“反义寡核苷酸”包括反义rna、sirna、rnai。
在本上下文中，术语“cd8(+)t细胞介导的免疫应答”是指由细胞毒性t细胞(也称为tc、细胞毒性t淋巴细胞、ctl、t杀伤细胞、溶细胞性t细胞、cd8(+)t细胞或杀伤性t细胞)介导的免疫应答。细胞毒性t细胞的实例包括但不限于抗原特异性效应cd8(+)t细胞。为了使t细胞受体(tcr)与i类mhc分子结合，前者必须伴有称为cd8的糖蛋白，该种糖蛋白与i类mhc分子的恒定部分结合。因此，将这些t细胞称为cd8(+)t细胞。一旦被激活，tc细胞将在细胞因子白介素2(il-2)的帮助下进行“克隆扩增”，所述il-2是t细胞的生长和分化因子。这使得对靶抗原具有特异性的细胞的数量增加，随后这些细胞可以在全身各处寻找抗原阳性的体细胞。
在本上下文中，术语“抗原特异性cd8(+)t细胞的克隆扩增”是指对靶抗原具有特异性的cd8(+)t细胞的数量增加。
在本上下文中，术语“细胞免疫应答”是指不涉及抗体而是涉及吞噬细胞、抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞的活化以及在针对抗原的应答中各种细胞因子的释放的免疫应答。
在本上下文中，术语“抗原特异性cd8(+)t细胞的细胞毒性表型”是指抗原特异性cd8(+)t细胞的一组可观察特征，这些特征与它们的细胞毒性功能相关。
在本上下文中，术语“淋巴结驻留性巨噬细胞”是指巨噬细胞，所述巨噬细胞是大的白血细胞，作为我们免疫系统不可分割的一部分，这些巨噬细胞利用吞噬作用过程吞噬并消化存在于淋巴结中的颗粒，所述淋巴结是遍布全身的小、豆状腺体。
在本上下文中，术语“体液免疫应答”是指由在细胞外液中发现的大分子介导的免疫应答，所述大分子比如分泌的抗体、补体蛋白和某些抗微生物肽。其涉及抗体的方面通常称为抗体介导的免疫。
在本上下文中，术语“b细胞”也称为b淋巴细胞，其是一种淋巴细胞亚型的白血细胞。它们通过分泌抗体在适应性免疫系统的体液免疫组分中发挥作用。
本文所用“抗体”是包含一个或多个基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽(其包含一个或多个结合结构域，优选抗原结合结构域)的蛋白质。本文所述术语“免疫球蛋白”(ig)与“抗体”可互换使用。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。特别地，本文所用的“抗体”是典型地由两个轻(l)链(每个约25kda)和两个重(h)链(每个约50kda)组成的四聚体糖基化蛋白。在抗体中可以发现两种类型的轻链，称作λ和κ。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分为五个主要类别：a、d、e、g和m，这些中若干类别可进一步划分成亚类(同种型)，如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2，其中igg在本发明的上下文中是优选的。还设想了与本发明有关的抗体，其具有由fcε受体i结合的ige恒定结构域或其部分。igm抗体由5个基本异四聚体单元连同一个另外的称为j链的多肽组成，并含有10个抗原结合位点，而iga抗体包含与j链组合的2-5个可聚合形成多价聚集体(assemblage)的基本4-链单元。在igg的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每个轻链包括n端可变(v)结构域(vl)和恒定(c)结构域(cl)。每个重链包括n端v结构域(vh)、三或四个c结构域(ch)和铰链区。所述恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是可表现出多种效应物作用，诸如参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)。如果抗体应施加adcc，则其优选为igg1亚类，而igg4亚类不会具有施加adcc的能力。
术语“抗体”还包括但不限于单克隆、单特异性、聚-或多-特异性抗体比如双特异性抗体、人源化的、骆驼化的、人的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的、移植的和在体外产生的抗体，其中优选嵌合的或人源化的抗体。术语“人源化的抗体”通常被定义为其中hc和lc的特异性编码cdr已经被转移到适当的人可变框架(“cdr移植”)的抗体。术语“抗体”还包括scfv、单链抗体、双体或四体、结构域抗体(dab)和纳米抗体。就本发明而言，术语“抗体”应还包含具有若干抗原结合位点的双、三或多聚体抗体或者双、三或多功能抗体。
此外，本文中所用术语“抗体”还涉及本文所述抗体(包括片段)的衍生物。抗体的“衍生物”包含通过引入氨基酸残基置换、缺失或添加而被改变的氨基酸序列。此外，衍生物涵盖由任意类型的分子共价连接到抗体或蛋白质而被修饰的抗体。这样的分子的实例包括糖、peg、羟基、乙氧基、羧基或氨基，但不限于这些。实际上，所述抗体的共价修饰导致糖基化、聚乙二醇化、乙酰化、磷酸化和酰胺化，而又不限于这些。
本发明涉及的抗体优选为“分离的”抗体。本文用于描述所公开抗体的“分离的”意指已经从其产生环境的组分中识别、分离和/或回收的抗体。优选地，所述分离的抗体不与来自其产生环境的全部其他组分关联。其产生环境的污染物组分，比如由重组转染细胞引起的，是典型地会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选的实施方案中，所述抗体将被纯化(1)至足以通过使用旋转杯测序仪获得n端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(2)至使用考马斯蓝或优选地使用银染在非还原或还原条件下通过sds-page同质。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
术语“基本上非免疫原性的”意指本发明的嵌段共聚物或两亲性聚合物不引发适应性免疫应答，即，与包封的免疫原相比，该嵌段共聚物或两亲性聚合物显示出小于30％、优选地20％、更优选地10％、特别优选地小于9、8、7、6或5％的免疫应答。
术语“基本上非抗原性的”意指本发明的嵌段共聚物或两亲性聚合物不与具有适应性免疫的某些产物组(如t细胞受体或抗体)特异性结合，即，与包封的抗原相比，该嵌段共聚物或两亲性聚合物显示出小于30％、优选地20％、更优选地10％、特别优选地小于9、8、7、6或5％的结合。
通常，当结合亲和力高于10-6m时，则认为结合是特异性的。优选地，当结合亲和力为约10-11至10-8m(kd)，优选地为约10-11至10-9m时，认为结合是特异性的。如有必要，可以通过改变结合条件来减少非特异性结合，而基本不会对特异性结合产生影响。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公知定义的氨基酸，比如选自以下的氨基酸：丙氨酸(ala或a)；精氨酸(arg或r)；天冬酰胺(asn或n)；天冬氨酸(asp或d)；半胱氨酸(cys或c)；谷氨酰胺(gln或q)；谷氨酸(glu或e)；甘氨酸(gly或g)；组氨酸(his或h)；异亮氨酸(he或i)；亮氨酸(leu或l)；赖氨酸(lys或k)；甲硫氨酸(met或m)；苯丙氨酸(phe或f)；脯氨酸(pro或p)；丝氨酸(ser或s)；苏氨酸(thr或t)；色氨酸(trp或w)；酪氨酸(tyr或y)；及缬氨酸(val或v)，尽管可以根据需要使用修饰、合成或罕见的氨基酸。通常，可以根据所具有的非极性侧链(如ala、cys、he、leu、met、phe、pro、val)；具有负电荷的侧链(如asp、glu)；具有正电荷的侧链(如arg、his、lys)或不带电荷的极性侧链(如asn、cys、gln、gly、his、met、phe、ser、thr、trp和tyr)将氨基酸分组。
“多克隆抗体”或“多克隆抗血清”是指含有对一种(单价或特异性抗血清)或多种(多价抗血清)抗原具有特异性的抗体混合物的免疫血清，其可以由采用一种或多种抗原免疫的动物的血液来制备。
另外，本发明所用术语“抗体”也涉及本文描述的与所述抗体具有相同特异性的所述抗体的衍生物或变体。“抗体变体”的实例包括非人抗体的人源化变体、“亲和性成熟的”抗体(参见如hawkins等人j.mol.biol.254,889-896(1992)和lowman等人,biochemistry30,10832-10837(1991))和效应功能改变的抗体突变体(参见如美国专利5,648,260)。
本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(如异构化、酰胺化)之外，构成所述群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(determinant)(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，不会被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，而不应被解释为需要通过任意方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过kohler等人，nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组dna方法(参见，如，美国专利no.4,816,567)产生。还可以采用例如clackson等人，nature,352:624-628(1991)和marks等人，j.mol.biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离“单克隆抗体”。
单克隆抗体在此具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类别的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类别的抗体中的对应序列相同或同源，以及包括这些抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性即可(美国专利no.4,816,567；morrison等人，proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括“原始化(primitized)”抗体，其包含源自非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是主要为人序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如，抗体的fv、fab、fab’、f(ab’)2或其它抗原结合亚序列)，其含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是其中来自受体的高变区(也称cdr)的残基被来自非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔的高变区(其具有所需的特异性、亲和力和能力)的残基取代的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基取代。而且，如本文所用，“人源化抗体”还可以包含在受体抗体和供体抗体中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步完善和优化抗体的性能。理想地，人源化抗体还将会包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，典型地，包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。进一步细节参见：jones等人，nature,321:522-525(1986)；reichmann等人，nature,332:323-329(1988)；和presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)。
术语“人抗体”包括具有与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列基本上对应的可变区和恒定区的抗体，包括，例如，kabat等人所述的抗体(参见kabat，等人(1991)，在上述引文中)。本发明的人抗体可以例如在cdr、特别是cdr3中包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如，通过体外的随机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)。人抗体可以具有至少1、2、3、4、5或更多个被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基取代的位置。
如本文所用，“体外产生的抗体”是指其中全部或部分的可变区(如，至少一个cdr)是在非免疫细胞选择(例如，体外噬菌体展示、蛋白质芯片或其中可以测试候选序列的抗原结合能力的任何其他方法)中产生的抗体。因此，该术语优选地排除通过免疫细胞中的基因组重排产生的序列。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过许多种方法产生，包括杂交瘤的融合或fab’片段的连接。参见，如，songsivilai&lachmann，clin.exp.immunol.79:315-321(1990)；kostelny等人，j.immunol.148，1547-1553(1992)。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一结合结构域多肽，比如fab’片段，其经由免疫球蛋白恒定区与第二结合结构域多肽连接。
本领域技术人员已知的许多种方法均可用于获得抗体或其抗原结合片段。例如，可以使用重组dna方法产生抗体(美国专利4,816,567)。也可以根据已知方法通过产生杂交瘤产生单克隆抗体(参见，如，kohler和milstein(1975)nature,256:495-499)。通过该方式形成的杂交瘤则使用标准方法进行筛选以识别出一种或多种产生特异性结合特定抗原的抗体的杂交瘤，所述标准方法比如酶联免疫吸附检验(elisa)和表面等离子体共振(biacoretm)分析。可以将任何形式的特定抗原用作免疫原，如，重组抗原、天然存在形式、其任意变体或片段以及其抗原性肽。
除展示文库的用途以外，还可以将特定的抗原用于对非人动物例如啮齿类动物如小鼠、仓鼠或大鼠进行免疫。在一个实施方案中，非人动物包括至少一部分人免疫球蛋白基因。例如，有可能将小鼠抗体产生不足的小鼠株系用人ig基因座的大的片段工程化。使用杂交瘤技术，可以产生并选择源自具有所需特异性的基因的抗原特异性单克隆抗体。参见，如，xenomousetm；green等人(1994)naturegenetics7:13-21、us2003-0070185、wo96/34096和wo96/33735。
在另一个实施方案中，自非人动物中获得单克隆抗体，然后对其进行修饰，如，人源化、去免疫化(deimmunized)、嵌合，可以使用本领域已知的重组dna技术产生。已经描述了许多种用于产生嵌合抗体的方法。参见，如，morrison等人，proc.natl.acad.sclu.s.a.81:6851,1985；takeda等人，nature314:452,1985，cabilly等人，美国专利no.4,816,567；boss等人，美国专利no.4,816,397；tanaguchi等人，ep171496；ep173494，gb2177096。人源化抗体也可以使用例如转基因小鼠产生，该转基因小鼠表达人重链和轻链基因，但不能表达内源性小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。winter描述了一种示例性的cdr-移植方法，其可以用于制备本文所述的人源化抗体(美国专利no.5,225,539)。特定人抗体的全部cdr均可以被至少一部分非人cdr取代，或者仅一些cdr可以被非人cdr取代。只需取代人源化抗体与预定抗原结合所需数量的cdr即可。
人源化抗体或其片段可以通过以下产生：将fv可变结构域的不直接参与抗原结合的序列用来自人fv可变结构域的等同序列取代。morrison(1985)science229:1202-1207；oi等人(1986)biotechniques4:214；和us5,585,089；us5,693,761；us5,693,762；us5,859,205；和us6,407,213中提供了用于产生人源化抗体或其片段的示例性方法。这些方法包括从重链或轻链中的至少一个分离、操纵和表达编码全部或部分免疫球蛋白fv可变结构域的核酸序列。这些核酸可以获自如上所述产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤，以及获自其它来源。然后可以将编码人源化抗体分子的重组dna克隆到适当的表达载体中。
在某些实施方案中，通过引入保守置换、共有序列置换、种系置换和/或回复突变，对人源化抗体进行优化。这些改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的若干技术中的任意者产生(如，teng等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.,80:7308-7312,1983；kozbor等人，immunologytoday,4:7279,1983；olsson等人，meth.enzymol.,92:3-16,1982)，并且可以根据wo92/06193或ep239400的教导产生。
还可以通过人t细胞表位的特异性缺失或者通过wo98/52976和wo00/34317中公开的方法进行“去免疫化”来修饰抗体或其片段。简言之，可以对抗体的重链和轻链可变结构域进行结合ii类mhc的肽的分析；这些肽代表着潜在的t-细胞表位(如wo98/52976和wo00/34317中所定义)。对于潜在的t-细胞表位的检测，可以应用称作“肽穿线(peptidethreading)”的计算机建模方法，此外，可以如wo98/52976和wo00/34317中所述在人ii类mhc结合肽的数据库中搜索vh和vl序列中存在的基序。这些基序与18种主要的ii类mhcdr同种异型中的任意者结合，从而构成潜在的t细胞表位。可以通过将可变结构域中的少量氨基酸置换，或者优选地通过单一氨基酸置换，来消除检测到的潜在的t-细胞表位。典型地，进行保守置换。经常地，但并非排他性地，可以使用人种系抗体序列中的位置所共有的氨基酸。在如tomlinson,等人(1992)j.moi.biol.227:776-798；cook,g.p.等人(1995)immunol.todayvol.16(5):237-242；chothia等人(1992)j.moi.biol.227:799-817；和tomlinson等人(1995)emboj.14:4628-4638中公开了人种系序列。vbase目录提供了人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(tomlinson，la.等人编纂，mrccentreforproteinengineering，cambridge，uk)。这些序列可以用作如框架区和cdr的人序列的来源。还可以使用共有的人框架区，例如，如美国专利no.6,300,064中所述。
“效应细胞”，优选地人效应细胞，是表达一种或多种fcr并发挥效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞表达至少fcyrm，并发挥adcc效应子功能。介导adcc的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(pbmc)、天然杀伤(nk)细胞、单核细胞、细胞毒性t细胞和嗜中性粒细胞。可以自天然来源如血液中分离效应细胞。
用于产生抗体(包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性和杂缀合物(heteroconjugate)抗体)的技术是本领域已知的，其中一些例示如下。
1)多克隆抗体。
多克隆抗体通常通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关的抗原(如包封在聚合物囊泡中的抗原)和佐剂在动物体内产生。可有用的是，使用双官能性或衍生剂，如马来酰亚胺苯磺酰琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、n-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐，将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质缀合，上述蛋白质如匙孔血蓝蛋白(klh)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和mpl-tdm佐剂(单磷酰脂质a，合成海藻糖二分支霉菌酸酯(trehalosedicorynomycolate))。本领域技术人员可以在不进行过度实验的情况下选择免疫方案。
例如，通过将蛋白质或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积弗氏完全佐剂合并，并将溶液在多个部位皮内注射，可以对动物进行针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物的免疫。1个月后，通过在多个部位皮下注射，用弗氏完全佐剂中1/5至1/10原始量的肽或缀合物对动物进行加强。7-14天后，对动物进行采血，并检验血清的抗体效价。对动物进行加强，直至达到效价平台。缀合物也可以在重组细胞培养中作为蛋白质融合物产生。另外，比如明矾的诱聚剂适合用于增强免疫应答。
术语“免疫”是指以下的一个或多个步骤：向非人动物施用一种或多种抗原从而在该动物中可产生抗体。
具体地，优选地用任选地与佐剂混合的所述多肽(抗原)免疫非人动物至少2次，更优选3次。“佐剂”是非特异性的免疫应答刺激剂。佐剂可以是包含以下组分中任一种或两种的组合物的形式：(a)设计成形成保护(多种)抗原不被迅速代谢的储剂的物质(例如，矿物油、明矾、氢氧化铝、脂质体或表面活性剂(如普朗尼克多元醇(pluronicpolyol)))；和(b)非特异性地刺激进行免疫的宿主动物的免疫应答(如，通过增加其中淋巴因子水平)的物质。
用于增加淋巴因子水平的分子的实例包括脂多糖(lps)或其脂质a部分；百日咳博代氏杆菌(bordetallapertussis)；百日咳毒素；结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)；和胞壁酰二肽(mdp)。佐剂的实例包括弗氏佐剂(任选地包含灭活的结核分枝杆菌；完全弗氏佐剂)；氢氧化铝佐剂；和单磷酰脂质a-合成海藻糖二分支霉菌酸酯(mpl-tdm)。
优选地，本文中的待免疫的“非人动物”是啮齿类动物。“啮齿类动物”是属于胎盘哺乳动物啮齿目的动物。啮齿类动物的实例包括小鼠、大鼠、豚鼠、松鼠、仓鼠、雪貂等，小鼠是优选的根据本文的方法进行免疫的啮齿类动物。本文可以进行免疫的其它非人动物包括非人灵长类动物，比如旧大陆猴(如狒狒或猕猴，包括恒河猴和食蟹猴；参见美国专利5,658,570)；鸟(如鸡)；大鼠；山羊；绵阳；牛；马；猪；驴；犬等。
“筛选”意指使一种或多种单克隆抗体(如，纯化的抗体和/或包含抗体的杂交瘤培养物上清液)进行一种或多种定性和/或定量地确定抗体结合目标抗原的能力的检验。
“免疫检验”意指确定抗体与抗原结合的检验，其中在检验的某个阶段，将抗体或抗原之一或二者任选地吸附在固相上(即“免疫吸附”检验)。此类检验的实例包括elisa、放射免疫检验(ria)、和facs检验。根据上文所述，本发明因此提供可通过前述用于产生抗体的方法，即如前文所述通过对非人动物进行免疫获得的单克隆或多克隆抗体。
2)单克隆抗体
单克隆抗体是从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(如异构化、酰胺化)之外，构成所述群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是其并非是分离的抗体的混合物。例如，单克隆抗体可以通过kohler等人，nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重组dna方法(美国专利no.4,816,567)产生。
在杂交瘤方法中，如本文上文所述对小鼠或其它合适的宿主动物(比如仓鼠)进行免疫，以引发产生或能够产生将会特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。
另外可选地，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。然后使用合适的融合剂比如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,pp.59-103(academicpress,1986))。
免疫剂典型地包括抗原性蛋白质或其融合变体。通常，如果需要人来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“pbl”)，如果需要非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂比如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞。goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress(1986),pp.59-103。
永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种并生长，所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt或hprt)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包括阻止hgprt-缺陷细胞生长的物质次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(hat培养基)。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持所选择的抗体生成细胞高水平地稳定产生抗体并且对比如hat培养基的培养基敏感的细胞。其中，优选鼠骨髓瘤细胞系，比如可获自salkinstitutecelldistributioncenter,sandiego,californiausa的源自mopc-21和mpc-11小鼠肿瘤的细胞系；和可获自americantypeculturecollection,manassus,virginiausa的sp-2细胞(及其衍生物，如，x63-ag8-653)。另外还有描述将人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系用来产生人单克隆抗体(kozbor,j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等人，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。
对其中生长杂交瘤细胞的培养基进行针对抗原产生单克隆抗体的检验。优选地，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或者通过体外结合检验例如放射性免疫检验(ria)或酶联免疫吸附检验(elisa)测定。
可以对其中培养杂交瘤细胞的培养基进行针对所需抗原的单克隆抗体的存在的检验。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可以通过免疫沉淀或者通过体外结合检验比如放射性免疫检验(ria)或酶联免疫吸附检验(elisa)测定。这些技术和检验是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过munson等人，anal.biochem.,107:220(1980)的scatchard分析测定。
在识别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，克隆可以通过限制稀释过程进行亚克隆，并通过标准方法使之生长(goding，同上)。用于该目的的合适培养基包括，例如，d-mem或rpmi-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物中在体内生长为腹水肿瘤。
通过常规的免疫球蛋白纯化方法(比如，例如蛋白质a-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析或亲和力色谱)从培养基、腹水或血清中适当地分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
还可以通过重组dna方法，比如，美国专利no.4,816,567中所述的方法，如上文所述生产单克隆抗体。使用常规方法(如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可以很容易分离和测序编码单克隆抗体的dna。杂交瘤细胞用作这些dna的优选来源。一经分离，dna可以置于表达载体中，然后将其转染到不然便不产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞)中，以便在这些重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的dna在细菌中的重组表达的综述文章包括：skerra等人,curr.opinioninimmunol.,5:256-262(1993)；和pluckthun,immunol.revs.130:151-188(1992)。
3)人源化抗体。
本发明的抗体还可以包括人源化或人抗体。人源化形式的非人(如，鼠)抗体是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如，抗体的fv、fab、fab'、f(ab')2或其它抗原结合亚序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补性决定区(cdr)的残基被来自非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔的cdr(其具有所需的特异性、亲和力和能力)的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架残基被相应的非人残基取代。
人源化抗体还可以包含在受体抗体和引入的cdr或框架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将会包含基本上全部的至少1个、典型地2个可变结构域，其中全部或基本上全部的cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区，全部或基本上全部的fr区是人免疫球蛋白共有序列的fr区。人源化抗体任选地还会包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，典型地，包含人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。jones等人，nature321:522-525(1986)；riechmann等人，nature332:323-329(1988)和presta,curr.opin.struct.biol.2:593-596(1992)。
本领域熟知用于使非人抗体人源化的方法。通常，人源化抗体具有引入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常叫做“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化基本上可以遵照winter及同事；jones等人，nature321:522-525(1986)；riechmann等人，nature332:323-327(1988)；verhoeyen等人，science239:1534-1536(1988)的方法进行，或者通过将啮齿类动物的cdr或cdr序列置换成对应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利no.4,816,567)，其中基本上小于完整的人可变结构域已经被相应的来自非人物种的序列置换。实际上，人源化抗体典型地是其中一些cdr残基并可能有一些fr残基被来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基置换的人抗体。
用在产生人源化抗体中的重链和轻链的人可变结构域的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库进行啮齿类动物抗体可变结构域序列的筛选。然后取与啮齿类动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(fr)。sims等人，j.immunol.)151:2296(1993)；chothia等人，j.mol.biol.,196:901(1987)。
另一方法采用了源自轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可以用于若干种不同的人源化抗体。carter等人，proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等人，j.immunol.,151:2623(1993)。
进一步重要的是，抗体在保留对抗原的高亲和力和其他有利生物学特性的情况下加以人源化。为实现这一目的，根据优选的方法，使用亲本和人源化序列的三维模型，通过对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的方法，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是常见可获得的，并且是本领域技术人员熟知的。描绘和展示所选择候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。通过该方式，可以从受体和输入序列选择并组合fr残基，使得所需的抗体特性，比如对靶标抗原的亲和力增加得以实现。通常，cdr残基直接并且最显著地参与影响抗原结合。
预期有许多种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是比如fab的抗体片段，其任选地与一种或多种细胞毒性剂缀合，以便产生免疫缀合物。
可选地，人源化抗体可以是完整抗体，比如完整的igg1抗体。
4)人抗体
作为人源化的替代选择，可以产生人抗体。例如，现在可以产生转基因动物(如小鼠)，其能够在经免疫时，在不存在内源性免疫球蛋白生成的情况下产生人抗体的完整组集。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链接合区(jh)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列(genearray)将会导致在经抗原激发时产生人抗体。参见，如，jakobovits等人，proc.natl.acad.sci.usa,90:2551(1993)；jakobovits等人，nature,362:255-258(1993)；bruggermann等人，yearinimmun.,7:33(1993)；美国专利no.5,591,669和wo97/17852。
可选地，可以使用噬菌体展示技术，从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(v)结构域基因组集，在体外产生人抗体和抗体片段。mccafferty等人，nature348:552-553(1990)；hoogenboom和winter,j.mol.biol.227:381(1991)。根据该技术，将抗体v结构域基因框内克隆到丝状噬菌体例如m13的主要或次要外壳蛋白质基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链dna拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致选择出编码表现这些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟了b-细胞的一些特性。噬菌体展示可以通过许多种形式进行，其综述于如johnson,kevins.和chiswell,davidj.,curr.opinstruct.biol.3:564-571(1993)中。可以将若干来源的v-基因链段用于噬菌体展示。clackson等人，nature352:624-628(1991)从源自经免疫小鼠的脾脏的v基因随机组合小型文库中分离出大量多样的抗噁唑酮抗体。可以构建来自未经免疫的人供体的v基因的组集，并可以基本上遵循以下文献所述的技术分离出针对大量多样的抗原(包括自身抗原)的抗体：marks等人，j.mol.biol.222:581-597(1991)；或griffith等人，emboj.12:725-734(1993)。另外参见美国专利no.5,565,332和5,573,905。
也可将cole等人和boerner等人的技术用于制备人单克隆抗体(cole等人，monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,p.77(1985)；和boerner等人，j.immunol.147(1):86-95(1991))。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中产生人抗体，所述转基因动物比如其中内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全失活的小鼠。一经激发，观察到人抗体的产生，该抗体在所有方面密切地类似于人体内发现的抗体，包括基因重排、组装和抗体组集。该方法描述于，例如，美国专利no.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及如下科学出版物：marks等人，bio/technology10:779-783(1992)；lonberg等人，nature368:856-859(1994)；morrison,nature368:812-13(1994)；fishwild等人，naturebiotechnology14:845-51(1996)；neuberger,naturebiotechnology14:826(1996)；和lonberg和huszar,intern.rev.immunol.13:65-93(1995)。最后，还可以通过活化的b细胞在体外产生人抗体(参见美国专利no.5,567,610和5,229,275)。
5)双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体(bsab)是对于至少两种不同表位具有结合特异性的抗体，上述表位包括相同或另一蛋白质上的表位。可选地，一臂(arm)可以装备成结合靶标抗原，另一臂可以与结合白细胞上的触发分子(比如t-细胞受体分子(如cd3)或igg的fc受体(fcyr)(比如fcyrl(cd64)、fcyrii(cd32)和fcyrin(cd16))的臂组合，以便将细胞防御机制集中并定位于靶标抗原表达细胞。这些抗体可以源自全长抗体或抗体片段(如f(ab')2双特异性抗体)。
双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于表达靶标抗原的细胞。这些抗体具有结合所需抗原的一臂和结合细胞毒性剂(如氨甲蝶呤)的另一臂。
用于产生双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的全长双特异性抗体的产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性。millstein等人，nature,305:537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配(assortment)，这些杂交瘤(四元杂交瘤(quadroma))产生潜在的10种不同抗体分子的混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。纯化正确的分子通常通过亲和力色谱步骤进行，这是相当繁重的，并且产物收率很低。wo93/08829和traunecker等人，emboj.,10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
根据不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选是与包含铰链、ch2和ch3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选地，在至少一个融合物中存在含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(ch1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及免疫球蛋白轻链(如果需要的话)的dna插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。当构建中使用的三个多肽链的比率不等提供最优的产率时，这为在这样的实施方式中调节三个多肽片段的相互比率提供了极大的灵活性。但是，当至少两个多肽链以等比率表达导致高的产率时，或者当比率不是特别重要时，可以将两种或全部三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。
在该方法的优选实施方案中，双特异性抗体由以下组成：一臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链；和另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。经发现，这种不对称结构有利于将所需的双特异性化合物自不需要的免疫球蛋白链组合中分离，因为免疫球蛋白轻链仅存在于双特异性分子的一半中，这提供了容易的分离方式。该方法公开于wo94/04690中。产生双特异性抗体的进一步的细节参见，例如，suresh等人，methodsinenzymology121:210(1986)。
根据wo96/27011或us5,731,168中描述的另一方法，一对抗体分子之间的界面可以工程化为使从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大。优选的界面包含抗体恒定结构域的ch3区的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链用较大的侧链(如，酪氨酸或色氨酸)取代。通过将大的氨基酸侧链用较小者(如，丙氨酸或苏氨酸)取代，在第二抗体分子的界面上产生大小与大的侧链相同或类似的补偿性“腔”。这提供了用于增加异二聚体相对于其他不需要的最终产物(比如同二聚体)的收率的机制。
文献中已经描述了由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可以使用化学连接来制备。brennan等人，science229:81(1985)描述了其中将完整的抗体蛋白水解切割以产生f(ab')2片段的方法。将这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原，以使邻近的二硫醇稳定化，并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的fab'片段转化成硫代硝基苯甲酸酯(tnb)衍生物。然后将fab'-tnb衍生物中的一种恢复成fab'-tnb衍生物，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可以用作用于酶的选择性固定化的试剂。
fab'片段可以直接从大肠杆菌回收并经化学偶联形成双特异性抗体。shalaby等人，j.exp.med.175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体f(ab')2分子的产生。每个fab'片段分别从大肠杆菌分泌，并在体外进行定向化学偶联，以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合过表达erbb2受体的细胞和正常的人t细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺癌靶标的裂解活性。
另外已经描述了许多种用于直接从重组细胞培养物中产生并分离二价抗体片段的技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了二价异二聚体。kostelny等人，j.immunol.,148(5):1547-1553(1992)。
通过基因融合将来自fos和jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)描述的“双体抗体(diabody)”技术为产生双特异性/二价抗体片段提供了另外可选的机制。该片段包含通过连接子与轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)，所述连接子短到不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段上的vh和vl结构域与另一片段上的互补性vl和vh结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。另外已报道了另一种用于通过使用单链fv(sfv)二聚体来产生双特异性/二价抗体片段的策略。参见gruber等人，j.imnzunol.,152:5368(1994)。
预期具有多于两个价态的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。tutt等人，j.immunol.147:60(1991)。
示例性双特异性抗体可以结合给定分子上的两个不同表位。可选地，抗蛋白质的臂可以与结合白细胞上的触发分子如t-细胞受体分子(例如cd2、cd3、cd28或b7)或者igg的fc受体(fcyr)(如fcyri(cd64)、fcyrii(cd32)和fcyriii(cd16))的臂组合，以便将细胞防御机制集中于表达特定蛋白质的细胞。
另一种目标双特异性抗体结合目标蛋白质，并进一步结合人血清白蛋白。
hollinger等人，proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)描述的“双体抗体”技术为产生双特异性抗体片段提供了另外可选的机制。该片段包含通过连接子与vl连接的vh，所述连接子短到不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段上的vh和vl结构域与另一片段上的互补性vl和vh结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。另外已报道了另一种用于通过使用单链fv(sfv)二聚体来产生双特异性抗体片段的策略。参见gruber等人，j.imnzunol.,152:5368(1994)。
预期具有多于两个价态的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。tutt等人，j.immunol.147:60(1991)。
相比于二价抗体，多价抗体可以被表达抗体所结合的抗原的细胞更快地内化(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是具有3个或更多个抗原结合位点的(igm类别以外的)多价抗体(例如，四价抗体)，其可以容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而产生。多价抗体可以包含二聚结构域和3个或更多个抗原结合位点。优选的二聚结构域包含fc区或铰链区(或者由其组成)。在该情况下，抗体将会包含fc区以及fc区氨基端的3个或更多个抗原结合位点。本文优选的多价抗体包括3至约8个、但优选4个抗原结合位点(或者由其组成)。多价抗体包含至少一个多肽链(优选2个多肽链)，其中多肽链包含2个或更多个可变结构域。例如，多肽链可以包含vdl(x1n-vd2-(x2)n-fc，其中vd1是第一可变结构域，vd2是第二可变结构域，fc是fc区的一个多肽链，x1和x2代表氨基酸或多肽，和n是0或1。例如，多肽链可以包含：vh-chi-柔性连接子-vh-chi-fc区链；或vh-chi-vh-chi-fc区链。优选地，本文的多价抗体进一步包含至少2个(优选4个)轻链可变结构域多肽。在此多价抗体可以包含，例如，约2至约8个轻链可变结构域多肽。在此预期的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并任选地进一步包含cl结构域。
杂缀合物(heteroconjugate)抗体也在本发明的范围内。
杂缀合物抗体由2个共价连接的抗体组成。例如，杂缀合物中的抗体之一可以与亲和素偶联，另一个与生物素偶联。预期可以使用合成蛋白质化学中已知的方法体外制备抗体，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫化物交换反应或者通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适用于该目的的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯以及例如美国专利no.4,676,980中公开的试剂。杂缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法产生。合适的交联剂连同大量交联技术是本领域熟知的，并公开在美国专利no.4,676,980中。
对于其它的抗体产生技术，参见antibodies:alaboratorymanual,eds.harlow等，coldspringharborlaboratory,1988。本发明并无需限定于任何具体来源、产生方法或其它特定性质的抗体。
本发明的抗体优选是“分离”的抗体。当用于描述本文所述的抗体时，“分离”意指已经从其产生环境的组分中识别、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的抗体不与来自其产生环境的所有其它组分缔合。其产生环境的污染组分，比如由重组转染细胞造成的污染组分，是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，其可以包括酶、激素和其他的蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中，所述抗体将被纯化(1)至足以通过使用旋转杯测序仪获得n端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(2)至使用考马斯蓝或优选地使用银染在非还原或还原条件下通过sds-page同质。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
如本文所用，“癌症”是指以体内异常细胞不可控生长为特征的一大类疾病。不受调节的细胞分裂会导致形成恶性肿瘤或细胞，其侵入相邻组织，并可以通过淋巴系统或血流转移至身体的远部。
癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(nsclc)、非nsclc、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(如肾细胞癌(rcc))、前列腺癌(如激素难治性前列腺腺癌)、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)、子宫颈癌、胃癌(stomachcancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(或肿瘤)、胃癌(gastriccancer)、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤，如皮肤或眼内恶性黑色素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛门区癌症、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症，包括石棉诱导的癌症、病毒相关癌症(例如人乳头瘤病毒(hpv)相关肿瘤)和源自两种主要血细胞谱系中任一种的血液恶性肿瘤(两种主要血细胞谱系即髓细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴样细胞系(其产生b、t、nk和浆细胞))，比如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，如急性、慢性、淋巴细胞性和/或骨髓性白血病，比如急性白血病(all)、急性骨髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性骨髓性白血病(cml)、未分化aml(mo)、成骨髓细胞性白血病(ml)、成骨髓细胞性白血病(m2；细胞成熟)、早幼粒细胞性白血病(m3或m3变体[m3v])、骨髓单核细胞性白血病(m4或嗜酸性粒细胞增多的m4变体[m4e])、单核细胞性白血病(m5)、红白血病(m6)、成巨核细胞性白血病(m7)、分离的粒细胞肉瘤和绿色癌；淋巴瘤，比如霍奇金淋巴瘤(hl)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样b细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(malt)淋巴瘤、间变性(例如ki1+)大细胞淋巴瘤、成人t细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、肠t细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤、前体t淋巴母细胞性淋巴瘤、t淋巴母细胞性淋巴瘤；和淋巴瘤/白血病(t-lbly/t-all)、外周t细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后、淋巴增生性疾病、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、成淋巴细胞性淋巴瘤(lbl)、淋巴样谱系血液系统肿瘤、急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、伯基特(burkitt's)淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(dhl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b-成淋巴细胞性淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤(ctlc)(也称为蕈样真菌病或塞扎里(sezary)综合征)和具有waldenstrom巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(lpl)；骨髓瘤，比如igg骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、郁积性骨髓瘤(也称为无痛性骨髓瘤)、单发性、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、毛发细胞淋巴瘤；骨髓系血液细胞肿瘤、间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎瘤、中枢和外周神经肿瘤，包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤、淋巴样谱系血液细胞肿瘤，例如t细胞和b细胞肿瘤，包括但不限于t细胞疾病，比如t前淋巴细胞性白血病(t-pll)，包括小细胞和脑形细胞类型；大颗粒淋巴细胞性白血病(lgl)，优选t细胞类型；a/dt-nhl肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后t细胞淋巴瘤(多形和免疫母细胞性亚型)；血管中心(鼻)t细胞淋巴瘤；头或颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓性淋巴瘤，以及上述癌症的任何组合。本文所述方法还可用于治疗转移性癌症、难治性癌症(如，用先前的免疫疗法例如用阻断ctla-4或pd-1或pd-l1的抗体难治的癌症)和复发性癌症。
术语“受试者”旨在包括活的生物体。受试者的实例包括哺乳动物，如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。然而，受试者(动物)可以是比如鸟类或鱼类的非哺乳动物。在本发明的一些优选实施方案中，所述受试者是人，而在另一些其它优选实施方案中，所述受试者可以是农场动物，其中所述农场动物可以是哺乳动物或非哺乳动物。此类非哺乳动物的实例是鸟类(比如鸡、鸭、鹅或火鸡的禽类)、鱼类(例如在鲑鱼、鳟鱼或罗非鱼等水产养殖中养殖的鱼类)或甲壳类动物(比如虾或对虾)。哺乳动物(牲畜)的实例包括山羊；绵羊；牛；马；猪；或驴。其它哺乳动物包括例如猫、狗、小鼠和兔子。在说明性实施方案中，将本发明的聚合物囊泡用于上述农场动物(哺乳动物类农场动物和非哺乳动物类农场动物(鸟类、鱼类、甲壳类动物))的疫苗接种或免疫接种，以抵抗病毒感染(对此参见实施例部分)。因此，在这种情况下，本发明的聚合物囊泡中可以包封有可溶性病毒全长蛋白或病毒全长蛋白的可溶性片段。
当用于人或非人动物的疫苗接种时，本发明的聚合物囊泡或包含聚合物囊泡的组合物可仅溶解在合适的(药学上可接受的)缓冲液(比如磷酸盐缓冲盐水(pbs)或0.9％生理盐水溶液(0.90％w/vnacl的等渗溶液，摩尔渗透压浓度为308mosm/l))中口服施用于相应的受试者(也参见实施例部分)。可选地，可以通过比如采用天然聚合物的包衣来修饰聚合物囊泡，或也可以将聚合物囊泡配制在天然聚合物的颗粒或合成聚合物的颗粒中，所述天然聚合物比如海藻酸或壳聚糖，所述合成聚合物比如聚(d,l-丙交酯-co-乙交酯)(plg)、聚(d,l-乳酸-co-羟基乙酸)(plga)、聚(g-谷氨酸)(g-pga)[31,32]或聚(乙二醇)(peg)。这些颗粒可以是微米范围内的颗粒(“宏珠”)或纳米颗粒，或掺入到宏珠中的纳米颗粒，所有这些都是本领域熟知的。参见例如，hari等人，“chitosan/calcium–alginatebeadsfororaldeliveryofinsulin”,appliedpolymerscience,volume59,issue11,14march1996,1795-1801；sosnik“alginateparticlesasplatformfordrugdeliverybytheoralroute:state-of-the-art”isrnpharmaceuticsvolume2014,articleid926157的综述；machado等人，encapsulationofdnainmacroscopicandnanosizedcalciumalginategelparticles”,langmuir2013,29,15926-15935；国际专利申请wo2015/110656；liangzhao等人的综述“nanoparticlevaccines”vaccine32(2014)327-337)或li等人，“chitosan-alginatenanoparticlesasanoveldrugdeliverysystemfornifedipine”intjbiomedscivol.4no.3september2008,221-228。在这些聚合物囊泡和口服制剂的示例性实施方案中，用于疫苗接种的聚合物囊泡具有包封于其中的病毒抗原，所述病毒抗原包括流感血凝素、猪流感血凝素、口蹄疫(fmd)病毒蛋白(比如vp1，vp2或vp3外壳蛋白(vp1外壳蛋白包含fmd病毒体的主要抗原决定簇，因此其序列的改变应是该病毒的高抗原变异性的原因))、卵清蛋白(ova)和猪流行性腹泻(ped)病毒spike蛋白的可溶性部分。从包含流感血凝素或口蹄疫(fmd)病毒蛋白(比如vp1、vp2或vp3外壳蛋白)的可溶性部分的聚合物囊泡的使用可以明显地看出，病毒性疾病可以影响包括鸟类和哺乳动物在内的任何动物，其中哺乳动物还可以是人。
术语“有效剂量”或“有效量”定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为在已经患有疾病的患者中足以治愈或至少部分阻止疾病及其并发症的量。有效用于该用途的量将取决于感染的严重程度和受试者自身免疫系统的一般状态。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。
抗体或其抗原结合部分的合适剂量或治疗有效量将取决于待治疗的病状、病状的严重程度、先前疗法和患者的临床病史和对治疗剂的反应。可以根据主治医师的判断来调整适当的剂量，使得可以一次或经一系列给药将其给予患者。药物组合物可以作为唯一的治疗剂施用或根据需要与另外的疗法联合施用。
如果药物组合物已经被冻干，则在施用之前首先将冻干的材料重构于合适的液体中。冻干的材料可以在如抑菌注射用水(bwfi)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)或与蛋白质在冻干前所处的制剂相同的制剂中重构。
注射用药物组合物可以以单位剂型存在，如在安瓿或多剂量容器中，其中加入防腐剂。此外，已经开发了多种最近的药物递送方法，本发明的药物组合物适于使用这些新方法施用，如inject-ease、genject、比如genen的注射器笔和比如medijector和biojector的无针装置。本发明的药物组合物也可以适用于有待发现的施用方法。还参见langer,1990,science,249:1527-1533。
药物组合物也可以配制成贮库(depot)制剂。这样的长效制剂可以通过植入(例如皮下、植入韧带或肌腱、滑膜下或肌内)、滑膜下注射或肌内注射来施用。因此，例如，制剂可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂改性，或者改性成难溶衍生物，例如，改性成难溶盐。
药物组合物也可以是许多种用于给药的常规贮库形式，以提供反应性组合物。这些包括，例如，固体、半固体和液体剂型，比如液体溶液或悬浮液、浆液、凝胶、乳膏、香脂(balm)、乳液剂、洗剂、粉剂、喷雾剂、泡沫、糊剂、油膏、药膏(salve)、香脂和滴剂。
如果需要，药物组合物可以存在于小瓶、包装或分配器装置中，其可以含有一个或多个包含活性成分的单位剂型。在一个实施方案中，分配器装置可以包括注射器，该注射器具有单一剂量的注射备用的液体制剂。注射器可以随附施用说明书。
药物组合物可以进一步包括其它的药学上可接受的组分。其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，比如remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.ed.(1980)中描述的那些也可以包括在本文所述的蛋白质制剂中，只要它们不会对制剂的所需特性产生不利影响即可。如本文所用，“药学上可接受的载体”意指与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂。将这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，其包括：另外的缓冲剂；防腐剂；助溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；螯合剂，如edta；金属络合物(如锌-蛋白质络合物)；可生物降解的聚合物，比如聚酯；成盐的抗衡离子，比如钠、多元糖醇；氨基酸，比如丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、2-苯基丙氨酸和苏氨酸；糖或糖醇，比如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(如肌醇)、聚乙二醇；含硫的还原剂，比如谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、[α]-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，比如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；和亲水性聚合物，比如聚乙烯吡咯烷酮。
本文所述的制剂在对有此需要的患者中用作药物组合物，用于治疗和/或预防本文所述的病理性医学状况。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施。治疗包括将制剂应用于或施用于来自具有疾病/病症、疾病/病症的症状或者易患疾病/病症的倾向的患者的身体、分离的组织或细胞，目的在于治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、好转或影响疾病、疾病症状或易患疾病的倾向。
如本文所用，术语“治疗”和“处理”是指向受试者施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物。“治疗有效量”是指足以治疗或减轻疾病或病症、延迟疾病发作或在疾病的治疗或管理中提供任何治疗益处的药物组合物或抗体的量。
如本文所用，术语“预防”是指药剂用于预防疾病或病症的发作的用途。“预防有效量”定义了足以预防疾病发作或复发的活性成分或药剂的量。
如本文所用，术语“病症”和“疾病”可互换使用，指受试者的病状。特别地，术语“癌症”与术语“肿瘤”可互换地使用。
本发明的试剂盒通常将包括上述容器和一个或多个包含从商业和用户角度而言所需的材料的其他容器，上述材料包括缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。
在本上下文中，术语“脂质体”是指具有至少一个脂质双层的球形囊泡。
在本上下文中，术语“核内体”是指真核细胞内部的膜结合隔室(即液泡)，通过内吞作用摄入的物质被递送至该处。
在本上下文中，术语“晚期核内体”是指由早期核内体通过较低的管腔ph和不同的蛋白质组成而分化的前溶酶体内吞细胞器。晚期核内体比早期核内体更呈球形，并且大多为近核的，集中在微管组织中心附近。
在本上下文中，术语“t辅助细胞”(也称为th细胞或“效应cd4(+)t细胞”)是指在免疫学过程中协助其它白细胞的t淋巴细胞，包括进入浆细胞的b细胞和记忆b细胞的成熟，和细胞毒性t细胞和巨噬细胞的活化。这些细胞也被称为“cd4(+)t细胞”，因为它们在其表面表达cd4糖蛋白。当在抗原呈递细胞(apc)表面表达的mhcii类分子将例如肽抗原呈递给辅助t细胞时，辅助t细胞被激活。
如本文所用，术语“自身抗原”是指一个生物体的任何分子或化学基团，其作为抗原在另一生物体中诱导抗体形成，但是亲本生物体的健康免疫系统对其耐受。
如本文所用，术语“％同一性”是指当使用任选的序列比对(如可获自www.clustal.org的clustalw或x技术或者等同的技术所示例)时序列内对应位置处相同氨基酸残基的百分比。因此，比对两个序列(参考序列和目标序列)，识别两个序列之间相同的氨基酸残基，将相同氨基酸的总数量除以氨基酸的总数量(氨基酸长度)。该除法的结果是百分比数值，即，同一性值/程度百分比。
本发明的免疫方法可以在允许其适当折叠的合成环境中采用全长可溶性包封抗原(如蛋白)或该蛋白的片段来实施，并由此在体内分离出能够检测到相应抗原(如膜蛋白)的抗体的概率会更高。此外，可以在不了解膜蛋白结构的情况下进行免疫和抗体的产生，而当采用基于肽的免疫方法时则可能需要了解膜蛋白的结构。
此外，相比于其它技术，本发明的方法可以快速且经济地生产包封在氧化稳定的膜环境中的膜蛋白。
在一些方面，本发明涉及一种用于在受试者中引发针对抗原(如免疫原)的免疫应答的方法。所述方法可包括向受试者施用一种组合物，该组合物包含具有两亲性聚合物的膜(如周向膜)的本发明的聚合物囊泡。该组合物进一步包括由本发明的聚合物囊泡的两亲性聚合物的膜包封的可溶性抗原。该免疫原可以是膜相关蛋白。在一些其他方面，本发明的聚合物囊泡包含脂质聚合物。施用可以任何合适的方式进行，例如口服施用、局部施用或注射。
根据所需的应答水平，本领域技术人员可以确定并调整施用(如口服施用或注射)的频率。例如，可将本发明的聚合物囊泡每周一次或每两周一次(如口服地或通过注射)施用于受试者，该受试者可包括哺乳动物。通过针对本发明的聚合物囊泡包封的抗原的初始量定量哺乳动物中抗体的血浓度水平(效价)来测量免疫应答(参见实施例部分)。
聚合物囊泡的结构可包括自组装成囊泡形式并包封各种抗原(如，可溶性蛋白等)的两亲性嵌段共聚物，所述各种抗原通过溶剂再水化、直接分散或自发的自组装方法而被包封(如，如本文所述的实施例1)。
在本发明的上下文中，本文所用术语“可溶性抗原”意指能够溶解或液化的抗原。术语“可溶性抗原”包括通过去污剂或其他试剂的作用而被“增溶”的抗原(尤其是在水中)，所述增溶即使抗原变得可溶或更可溶。本发明的示例性非限制性可溶性抗原包括：源自蛋白质的非可溶性部分的多肽、变得可溶的用于包封的疏水性多肽以及可作为聚集体可溶的聚集多肽。
在一些方面，借助于去污剂、表面活性剂、温度改变或ph改变来使本发明的抗原(如，膜蛋白)增溶。由两亲性嵌段共聚物提供的囊泡结构允许抗原(如膜蛋白)以生理学上正确和功能性的方式折叠，从而允许目标哺乳动物的免疫系统检测到所述抗原，由此产生强的免疫应答。
在一些方面，本发明的组合物的注射可包括腹膜内、皮下或静脉、肌内或无创给药。在一些其它方面，本发明的组合物的注射可以包括皮内注射。
在一些其它方面，可以通过在包含本发明的聚合物囊泡的组合物中包含佐剂来进一步提高或增强免疫应答水平。在这方面，可以将聚合物囊泡和佐剂同时施用于受试者。
在一些方面，本发明的聚合物囊泡的嵌段共聚物或两亲性聚合物既非免疫刺激剂也非佐剂。
在一些其它方面，本发明的聚合物囊泡的嵌段共聚物或两亲性聚合物为免疫刺激剂和/或佐剂。
在另一些方面，本发明的聚合物囊泡是免疫原性的。
在又一些方面，本发明的聚合物囊泡是非免疫原性的。
在一些方面，佐剂可以与包含本发明的聚合物囊泡的本发明的组合物的施用分开施用。可以在施用包含包封了本发明的抗原的聚合物囊泡的组合物之前、同时或之后施用佐剂。例如，可以在注射包含包封了本发明的抗原的聚合物囊泡的组合物之后向受试者注射佐剂。在一些方面，可以将佐剂与抗原一起包封在聚合物囊泡中。
本领域技术人员将容易认识并了解，待注射的佐剂的类型取决于待注射的抗原的类型。抗原可以是细菌、病毒或真菌来源的抗原。例如，若抗原为ova，则佐剂可以是sigmaadjuvantsystem(sas)。其它抗原-佐剂对也适合用在本发明的方法中。在一些方面，无需使用佐剂。在另一些方面，本发明的方法更有效，即在不使用佐剂的情况下引发了更强的免疫应答。
在一些方面，膜蛋白可以是跨膜蛋白、g蛋白偶联受体、神经递质受体、激酶、孔蛋白、abc转运蛋白、离子转运蛋白、乙酰胆碱受体和细胞粘附受体。膜蛋白也可以与标签融合或偶联，或者也可以是无标签的。如果膜蛋白带有标签，则该标签可以例如选自众所周知的亲和标签，比如vsv、his-标签、
在一些方面，膜蛋白或其片段(或部分)可在包封之前呈现，或在通过无细胞表达系统产生蛋白的同时被包封。无细胞表达系统可以是体外转录和翻译系统。
无细胞表达系统也可以是真核的无细胞表达系统，比如基于兔网织红细胞、小麦胚芽提取物或昆虫提取物的tnt系统，可以是原核的无细胞表达系统或古老的无细胞表达系统。
如上所述，聚合物囊泡可以由两亲性的二嵌段或三嵌段共聚物形成。在各个方面，两亲性聚合物可包括羧酸、酰胺、胺、烯属烃(alkylene)、二烷基硅氧烷、醚或亚烷基硫化物(alkylenesulfide)的至少一个单体单元。
在一些方面，两亲性聚合物可以是选自如下的聚醚嵌段：低聚(氧乙烯)嵌段、聚(氧乙烯)嵌段、低聚(氧丙烯)嵌段、聚(氧丙烯)嵌段、低聚(氧丁烯)嵌段和聚(氧丁烯)嵌段。可包含在聚合物中的嵌段的其它实例包括但不限于：聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚(丁二烯)、聚(2-甲基噁唑啉)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(ε-己内酯)、聚(丙烯硫醚)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚(2-乙烯基吡啶)、聚(甲基丙烯酸2-(二乙氨基)乙酯)、聚(甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯)、聚(2-甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱、聚(异戊二烯)、聚(异丁烯)、聚(乙烯-共-丁烯)和聚(乳酸)。合适的两亲性聚合物的实例包括但不限于：聚(乙基乙烯)-b-聚(氧化乙烯)(pee-b-peo)、聚(丁二烯)-b-聚(氧化乙烯)(pbd-b-peo)、聚(苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)(ps-paa)、聚(二甲基硅氧烷)-聚(氧化乙烯)(本文称为pdms-peo)也称为聚(二甲基硅氧烷-b-氧化乙烯)、聚(2-甲基噁唑啉)-b-聚(二甲基硅氧烷)-b-聚(2-甲基噁唑啉)(pmoxa-bpdms-bpmoxa)(包括例如三嵌段共聚物，比如may等人2013年使用的pmoxa20-pdms54-pmoxa20(aba))、聚(2-甲基噁唑啉)-b-聚(二甲基硅氧烷)-b-聚(氧化乙烯)(pmoxa-b-pdms-b-peo)、聚(氧化乙烯)-b-聚(硫化丙烯)-b-聚(氧化乙烯)(peo-b-pps-b-peo)和聚(氧化乙烯)-聚(氧化丁烯)嵌段共聚物。可以进一步通过共聚物中包含的各嵌段的平均嵌段长度来确定嵌段共聚物。因此，pbmpeon表示存在长度为m的聚丁二烯嵌段(pb)和长度为n的聚氧化乙烯(peo)嵌段。m和n独立地选自整数，例如可选自约6至约60范围内的整数。因此，pb35peo18表示存在平均长度为35的聚丁二烯嵌段和平均长度为18的聚氧化乙烯嵌段。在一些方面，pb-peo二嵌段共聚物包含5-50个嵌段pb和5-50个嵌段peo。类似地，pb10peo24表示存在平均长度为10的聚丁二烯嵌段和平均长度为24的聚氧化乙烯嵌段。可以用在本发明中的合适的pb-peo二嵌段共聚物的示例性实例包括二嵌段共聚物pbd21-peo14(其也可商购获得)和[pbd]21-[peo]12(参见wo2014/077781a1和nallani等人，2011)。作为进一步的实例，eobp表示存在长度为o的氧化乙烯嵌段(e)和长度为p的丁二烯嵌段(b)。因此，o和p独立地选自整数，如选自约10至约120范围内的整数。因此，e16e22表示存在平均长度为16的氧化乙烯嵌段和平均长度为22的丁二烯嵌段。
对于用于形成本发明的聚合物囊泡的另一优选的嵌段共聚物，聚(二甲基硅氧烷-b-氧化乙烯)(pdms-peo)，应注意，线性和梳型pdms-peo均可用在本文中(参见，gaspard等人，“mechanicalcharacterizationofhybridvesiclesbasedonlinearpoly(dimethylsiloxane-b-ethyleneoxide)andpoly(butadiene-b-ethyleneoxide)blockcopolymers”sensors2016,16(3),390，其描述了由pdms-peo形成的聚合物囊泡)。
线性pdms-peo的结构如以下式(i)所示：
而梳型pdms-peo的结构如以下式(ii)所示：
按照结构式(i)，用语“pdmsn-peom”表示存在长度为n的聚二甲基硅氧烷(pdms)嵌段和长度为m的聚氧化乙烯(peo)嵌段。m和n独立地选自整数，它们中的每一个均可例如选自约5或约6至约100、约5至约60、或约6至约60、或约5至50范围内的整数。例如，可以从polymersourceinc.,dorval(montreal)quebec,canada商购获得比如pdms12-peo46或pdms47peo36的线性pdms-peo。因此，pdms-peo嵌段共聚物可包含5-100个嵌段pdms和5-100个嵌段peo、6-100个嵌段pdms和6-100个嵌段peo、5-100个嵌段pdms和5-60个嵌段peo或5-60个嵌段pdms和5-60个嵌段peo。
根据以上所述，本发明一方面涉及一种在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用携带抗原的由pdms-peo形成的聚合物囊泡。该抗原可以以任何合适的方式与pdms-peo聚合物囊泡缔合/物理连接。例如，pdms-peo聚合物囊泡可具有如本发明所述的包封于其中的可溶性抗原。可选地或另外地，聚合物囊泡可具有如wo2014/077781a1中所述的整合至/引入至该聚合物囊泡的周向膜中的抗原。在该种情况下，抗原是一种以其(一个或多个)跨膜结构域整合到pdms-peo聚合物囊泡的周向膜中的膜蛋白。遵循如wo2014/077781a1或nallani等人，"proteopolymersomes:invitroproductionofamembraneproteininpolymersomemembranes",biointerphases,1december2011,153页中所述可以实现上述整合。若抗原是包封在pdms-peo聚合物囊泡中的，则其可以是选自如下的可溶性抗原：多肽、碳水化合物、多核苷酸以及它们的组合。本发明进一步涉及一种用于生产由pdms-peo形成的其中包封抗原的聚合物囊泡的方法以及涉及由所述方法生产的聚合物囊泡。
本发明进一步涉及组合物，所述组合物包含携带抗原的pdms-peo聚合物囊泡。此外，在这些组合物中，抗原可以以任何合适的方式与pdms-peo聚合物囊泡缔合/物理连接。例如，pdms-peo聚合物囊泡可具有如本发明所述的包封于其中的可溶性抗原。可选地或另外地，聚合物囊泡可具有如wo2014/077781a1中所述的整合至/引入至该聚合物囊泡的周向膜中的抗原。本发明还涉及包含此类携带抗原的pdms-peo聚合物囊泡的疫苗、引发免疫应答的方法、用于治疗、改善、预防或诊断癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病的方法，此类方法包括向有此需要的受试者提供携带抗原的pdms-peo聚合物囊泡。
根据以上所述，本发明还涉及以适于引发免疫应答的方式在体外或体内应用携带(或转运)抗原的pdms-peo聚合物囊泡。抗原可以包封在pdms-peo聚合物囊泡内，或例如如wo2014/077781a1中所述引入至该聚合物囊泡的周向膜中。
在一些方面，本发明的聚合物囊泡可包含一个或多个隔室(或称为“多隔室”)。聚合物囊泡的囊泡结构的隔室化允许活细胞中的复杂的反应途径共存在并且有助于提供细胞内的许多活动在空间和时间上的分离。因此，本发明的聚合物囊泡可以包封多于一种类型的抗原。不同的抗原可具有相同或不同的同种型。每个隔室也可以由相同或者不同的两亲性聚合物形成。在各方面中，将两种或更多种不同的抗原整合到两亲性聚合物的周向膜内。每个隔室可包封肽、蛋白质和核酸中的至少一种。所述肽、蛋白质、多核苷酸或碳水化合物可以是免疫原性的。
在wo20121018306中可以找到合适的多隔室化的聚合物囊泡的进一步细节，该申请的全部内容以引用的方式并入本文以用于全部目的。
聚合物囊泡也可以是独立的或固定在表面上，比如wo2010/1123462中描述的那些，该申请的全部内容以引用的方式并入本文以用于全部目的。
若聚合物囊泡载体包含多于一个的隔室，则该隔室可包含外部嵌段共聚物囊泡和至少一个内部嵌段共聚物囊泡，其中所述至少一个内部嵌段共聚物囊泡被包封在外部嵌段共聚物囊泡的内部。在一些方面，所述外部囊泡和所述内部囊泡的嵌段共聚物中的每一个包括聚醚嵌段，比如聚(氧乙烯)嵌段、聚(氧丙烯)嵌段和聚(氧丁烯)嵌段。可包含在共聚物中的嵌段的其他实例包括但不限于：聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、聚(丁二烯)、聚(2-甲基噁唑啉)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)酰胺)、聚(ε-己内酯)、聚(丙烯硫醚)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚(2-乙烯基吡啶)、聚(甲基丙烯酸2-(二乙氨基)乙酯)、聚(甲基丙烯酸2-(二异丙基氨基)乙酯)、聚(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酰胆碱)和聚(乳酸)。合适的外部囊泡和内部囊泡的实例包括但不限于：聚(乙基乙烯)-b-聚(氧化乙烯)(pee-b-peo)、聚(丁二烯)-b-聚(氧化乙烯)(pbd-b-peo)、聚(苯乙烯)-b-聚(丙烯酸)(ps-b-paa)、聚(氧化乙烯)-聚(己内酯)(peo-b-pcl)、聚(氧化乙烯)-聚(乳酸)(peo-b-pla)、聚(异戊二烯)-聚(氧化乙烯)(pi-b-peo)、聚(2-乙烯基吡啶)-聚(氧化乙烯)(p2vp-b-peo)、聚(氧化乙烯)-聚(n-异丙基丙烯酰胺)(peo-b-pnipam)、聚(乙二醇)-聚(硫化丙烯)(peg-b-pps)、聚(甲基苯基硅烷)-聚(氧化乙烯)(pmps-b-peo-b-pmps-b-peo-b-pmps)、聚(2-甲基噁唑啉)-b-聚-(二甲基硅氧烷)-b-聚(2-甲基噁唑啉)(pmoxa-b-pdms-b-pmoxa)、聚(2-甲基噁唑啉)-b-聚(二甲基硅氧烷)-b-聚(氧化乙烯)(pmoxa-b-pdms-b-peo)、聚[苯乙烯-b-聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)酰胺)](ps-b-piat)、聚(氧化乙烯)-b-聚(硫化丙烯)-b-聚(氧化乙烯)(peo-b-pps-b-peo)和聚(氧化乙烯)-聚(氧化丁烯)(peo-b-pbo)嵌段共聚物。可以进一步通过共聚物中包含的各嵌段的平均长度来确定嵌段共聚物。因此，psmpiatn表示存在具有m个重复单元的聚苯乙烯(ps)嵌段和具有n个重复单元的聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)酰胺)(piat)嵌段。因此，m和n独立地选自整数，例如可选自约5至约95范围内的整数。因此，ps40piat50表示存在具有平均40个重复单元的ps和具有平均50个重复单元的piat嵌段。
在一些方面，本发明涉及一种用于生产其中包封抗原的聚合物囊泡的方法，所述方法包括：i)将本发明的两亲性聚合物溶解在氯仿中，优选地，所述两亲性聚合物为聚丁二烯-聚氧化乙烯(bd)；ii)使所述溶解的两亲性聚合物干燥以形成聚合物膜；iii)向步骤ii)的所述干燥的两亲性聚合物膜添加增溶的抗原，其中所述抗原选自：(a)多肽；优选地所述多肽为根据本发明所述的抗原；(b)碳水化合物；(c)a)和/或b)和/或c)的组合；iv)使步骤iii)的所述聚合物膜再水化以形成聚合物囊泡；v)任选地，过滤步骤iv)的聚合物囊泡以纯化聚合物囊泡单分散囊泡；和/或vi)任选地，使步骤iv)或v)的所述聚合物囊泡与未包封的抗原相分离。
在一些其它方面，本发明涉及用于生产其中包封抗原的聚合物囊泡的其它方法，包括基于将聚合物的非水性溶液在抗原的水性溶液中混合、将相应的聚合物和抗原的混合溶液进行声波处理或挤压相应的聚合物和抗原的混合溶液的方法。示例性方法包括在rameez等人，langmuir2009和neil等人，langmuir2009,25(16),9025–9029中描述的那些方法。
与现有的摄取和交叉呈递媒介以及基于其的方法相比，本发明的聚合物囊泡特别提供了以下优点，这些优点也是本发明的一些方面：
-聚合物囊泡在摄取及交叉呈递至免疫系统方面非常有效；
-免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答；
-聚合物囊泡是氧化稳定的；
-与在具有或不具有佐剂的情况下通过基于游离抗原的技术产生的体液应答相比，体液应答更强；
-使用佐剂甚至仍可以进一步增强由本发明的聚合物囊泡诱导的免疫应答；
-本发明的聚合物囊泡的聚合物本质上是坚固(robust)的，并且可经过定制或功能化以增加其在体内循环的时间；
-在血清组分存在下本发明的聚合物囊泡是稳定的；
-聚合物囊泡的聚合物价格低廉且合成迅速；
-与在具有或不具有佐剂的情况下基于游离抗原的技术相比，采用本发明的聚合物囊泡通过本发明的方法引发免疫应答所需的抗原量更少。
本发明的特征还在于以下项目：
1、一种聚合物囊泡(如氧化稳定的聚合物囊泡)，所述聚合物囊泡包含可溶性包封抗原，其中所述可溶性包封抗原选自：
i)多肽；
ii)碳水化合物；
iii)多核苷酸，优选地，所述多核苷酸不是反义寡核苷酸，进一步优选地，所述多核苷酸是dna或mrna分子；
iv)i)和/或ii)和/或iii)的组合。
2、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够引发cd8(+)t细胞介导的免疫应答，优选地，所述引发为体内、离体或体外引发。
3、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原包含膜蛋白(mp)或膜相关肽(map)的可溶性部分，优选地，所述抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述抗原包含多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性。
4、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中在血清组分存在下所述聚合物囊泡是稳定的，优选地，所述稳定为体内、离体或体外稳定。
5、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡在核内体内部是稳定的，优选地，所述稳定为体内、离体或体外稳定。
6、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中与脂质体的相应的氧化稳定性相比，所述聚合物囊泡具有改进的氧化稳定性，优选地，所述改进的稳定性为体内、离体或体外改进的稳定性。
7、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够以不依赖于氧化的方式释放其包含所述可溶性包封抗原的内容物并触发cd8(+)t细胞介导的免疫应答，优选地，所述释放为体内、离体或体外释放。
8、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够引发细胞免疫应答，其中所述细胞免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答，优选地，所述免疫应答为体内、离体或体外免疫应答。
9、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够引发细胞和/或体液免疫应答，其中所述细胞免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答，优选地，免疫应答为体内、离体或体外免疫应答。
10、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述体液免疫应答包含特异性抗体的产生，进一步优选地，所述免疫应答为体内、离体或体外免疫应答。
11、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够增强效应cd4(+)t细胞的频率，优选地，所述增强为体内、离体或体外增强。
12、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述细胞免疫应答包含t细胞介导的免疫应答，优选地，所述免疫应答为体内、离体或体外免疫应答。
13、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中与游离抗原相比，所述聚合物囊泡能够增强抗原特异性cd8(+)t细胞的克隆扩增，优选地，所述扩增为体内、离体或体外扩增。
14、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够诱导抗原特异性效应cd8(+)t细胞，优选地，所述诱导为体内、离体或体外诱导。
15、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够增强抗原特异性cd8(+)t细胞的细胞毒性表型，优选地，所述增强为体内、离体或体外增强。
16、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够靶向淋巴结驻留性巨噬细胞和/或b细胞，优选地，所述靶向为体内、离体或体外靶向。
17、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡为还原稳定的，优选地，在血清组分存在下所述聚合物囊泡是还原稳定的，进一步优选地，所述还原稳定为体内、离体或体外还原稳定。
18、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡具有降低的渗透性，优选地，所述降低的渗透性是与脂质体的相应的渗透性相比较的，进一步优选地，所述渗透性为体内、离体或体外渗透性。
19、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够在核内体内部释放其内容物，优选地，所述核内体为晚期核内体，进一步优选地，所述释放为体内、离体或体外释放。
20、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡能够进行如下的一种或多种：
i)引发细胞免疫应答；优选地，所述细胞免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答；进一步优选地，所述细胞免疫应答为cd8(+)t细胞介导的免疫应答；最优选地，所述细胞免疫应答针对流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步最优选地，所述细胞免疫应答针对多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
ii)在核内体内部释放聚合物囊泡内容物，优选地，所述核内体为晚期核内体；进一步优选地，所述内容物包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，最优选地，所述内容物包含多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
iii)以不依赖于氧化的方式释放聚合物囊泡内容物并触发cd8(+)t细胞介导的免疫应答；优选地，所述内容物包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述内容物包含多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
iv)刺激对所述抗原的免疫应答；优选地，所述抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述抗原包含多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
v)触发由cd8(+)t细胞介导的免疫应答诱导的交叉保护；优选地，所述应答针对流感血凝素、猪流感血凝素、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、卵清蛋白(ova)、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述应答针对多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
vi)将肽或蛋白递送至抗原呈递细胞(apc)；优选地，所述肽或蛋白包含或衍生自流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述肽或蛋白包含或衍生自多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
vii)触发免疫应答，所述免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答和/或cd4(+)t细胞介导的免疫应答；优选地，所述应答针对流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述应答针对多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
viii)在受试者中刺激免疫应答；优选地，所述应答针对流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述应答针对多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
ix)免疫非人动物；优选地，所述免疫针对流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述免疫针对多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
x)与在不具有所述聚合物囊泡的情况下所述抗原的相应的抗原性相比，所述聚合物囊泡具有改变的抗原性；优选地，所述抗原为流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述抗原为多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
xi)与在不具有所述聚合物囊泡的情况下所述抗原的相应的免疫原性相比，所述聚合物囊泡具有改变的免疫原性；优选地，所述免疫原为流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步优选地，所述免疫原为多肽，所述多肽与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性。
21、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡具有以下性质的一种或多种：
i)所述聚合物囊泡包含氧化稳定的膜；和/或
ii)所述聚合物囊泡是合成的；和/或
iii)所述聚合物囊泡不含未包封的抗原或与游离的未包封的抗原混合；和/或
iv)所述聚合物囊泡包含两亲性聚合物的膜；和/或
v)所述聚合物囊泡包含形成囊泡膜的两亲性合成嵌段共聚物；和/或
vi)所述聚合物囊泡的直径大于70nm，其中优选地，所述直径在约100nm至约1μm的范围内、或约120nm至约250nm的范围内、或约125nm至约250nm、约140nm至约240nm、约150nm至约235nm、约170nm至约230nm、或约220nm至约180nm、或约190nm至约210nm的范围内；和/或
vii)所述聚合物囊泡具有囊泡形态；
viii)所述聚合物囊泡是自组装的。
22、根据项目21所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡为聚合物囊泡的集合的形式，其中所述聚合物囊泡的集合的平均直径在约100nm至约1μm的范围内、或约100nm至约750nm的范围内、或约100nm至约500nm、或约120nm至约250nm、或约125nm至约250nm、约140nm至约240nm、约150nm至约235nm、约170nm至约230nm、或约220nm至约180nm、或约190nm至约210nm的范围内。
23、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原为免疫原。
24、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原选自：i)自身抗原，ii)非自身抗原，iii)非自身免疫原和iv)自身免疫原。
25、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原选自：
i)多肽，所述多肽与病毒多肽序列具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；优选地，所述病毒多肽序列为流感血凝素或猪流感血凝素，进一步优选地，所述病毒多肽序列选自：seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8；
ii)多肽，所述多肽与细菌多肽序列具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
iii)多肽，所述多肽与哺乳动物或禽类多肽序列具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；优选地，所述哺乳动物或禽类多肽序列为卵清蛋白(ova)，与spike蛋白、b16肽或mc38肽具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性的多肽，进一步优选地，所述哺乳动物或禽类多肽序列选自：seqidno:4、seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14。
26、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述哺乳动物多肽序列选自人、啮齿类动物、兔和马多肽序列。
27、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原为抗体或其片段。
28、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述抗原选自：
i)流感血凝素(ha)，优选地，选自：seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8；
ii)猪流感血凝素(ha)，优选地，为seqidno:6；
iii)卵清蛋白(ova)，优选地，为seqidno:4；
iv)猪流行性腹泻病毒(ped)，纤突蛋白，优选地，为seqidno:12-14；
v)b16肽，优选地，选自：seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11；
vi)mc38肽，优选地，选自：seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3；
vii)b16和mc38肽，优选地，所述肽独立地选自：i)seqidno:1-3和ii)seqidno:9-11。
29、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡选自阳离子聚合物囊泡、阴离子聚合物囊泡、非离子聚合物囊泡及它们的混合物。
30、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述嵌段共聚物或两亲性聚合物为基本上非免疫原性的或基本上非抗原性的；优选地，所述嵌段共聚物或两亲性聚合物为非免疫原性的或非抗原性的。
31、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述嵌段共聚物或两亲性聚合物是氧化稳定的。
32、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述嵌段共聚物或所述两亲性聚合物既非免疫刺激剂也非佐剂。
33、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物包含二嵌段或三嵌段(a-b-a或a-b-c)共聚物。
34、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物包含共聚物聚(n-乙烯吡咯烷酮)-b-pla。
35、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物包含羧酸、酰胺、胺、烯属烃、二烷基硅氧烷、醚或亚烷基硫化物的至少一个单体单元。
36、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为选自如下的聚醚嵌段：低聚(氧乙烯)嵌段、聚(氧乙烯)嵌段、低聚(氧丙烯)嵌段、聚(氧丙烯)嵌段、低聚(氧丁烯)嵌段和聚(氧丁烯)嵌段。
37、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚(丁二烯)-聚(氧化乙烯)(pb-peo)二嵌段共聚物。
38、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述pb-peo二嵌段共聚物包含5-50个嵌段pb和5-50个嵌段peo。
39、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚(二甲基硅氧烷)-聚(氧化乙烯)(pdms-peo)二嵌段共聚物，其中优选地，所述pb-peo二嵌段共聚物优选包含5-100个嵌段pdms和5-100个嵌段peo。
40、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡可仅包含嵌段共聚物或两亲性聚合物或包含嵌段共聚物或两亲性聚合物与脂质的混合物。
41、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述脂质包含合成脂质或天然脂质或合成脂质和天然脂质的脂质混合物或组合。
42、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚(丙交酯)-聚(氧化乙烯)/1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(pla-peo/popc)共聚物，优选地，所述pla-peo/popc具有50:50及以上(如50/50或75/25或90/10)的pla-peo与popc(如pla-peo/popc)的比率。
43、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚(己内酯)-聚(氧化乙烯)/1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(pcl-peo/popc)共聚物，优选地，所述pcl-peo/popc具有50:50及以上(如50/50或75/25或90/10)的pcl-peo与popc(如pcl-peo/popc)的比率。
44、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述两亲性聚合物为聚丁二烯-聚氧化乙烯(bd)或聚(二甲基硅氧烷)-聚(氧化乙烯)(pdms-peo)二嵌段共聚物。
45、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡包含二嵌段共聚物pbd21-peo14(下文称为“bd21”)、pdms47-peo36(pdms-peo)或三嵌段共聚物pmoxa12-pdms55-pmoxa12。
46、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡包含一个或多个隔室。
47、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡包含一个或多个隔室，其中所述一个或多个隔室中的每一个均包封至少一种肽、蛋白和核酸，优选地，所述肽、蛋白和核酸中的至少一种为免疫原性或抗原性的，进一步优选地，所述一个或多个隔室中的每一个均由相同或不同的两亲性聚合物组成。
48、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡包含多于一个隔室，其中所述隔室包含外部嵌段共聚物囊泡和至少一个内部嵌段共聚物囊泡，其中所述至少一个内部嵌段共聚物囊泡被包封在所述外部嵌段共聚物囊泡的内部，优选地，所述外部嵌段共聚物囊泡为由独立地选自以下的共聚物形成的聚合物囊泡：
i)聚[苯乙烯-b-聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)酰胺)](ps-piat)，
ii)聚(丁二烯)-聚(氧化乙烯)(pbd-peo)，
iii)聚(氧化乙烯)-聚(己内酯)(peo-pcl)，
iv)聚(乙基乙烯)-聚(氧化乙烯)(pee-peo)，
v)聚(氧化乙烯)-聚(乳酸)(peo-pla)，
vi)聚(异戊二烯)-聚(氧化乙烯)(pi-peo)，
vii)聚(2-乙烯基吡啶)-聚(氧化乙烯)(p2vp-peo)，
viii)聚(氧化乙烯)-聚(n-异丙基丙烯酰胺)(peo-pnipam)，
ix)聚(苯乙烯)-聚(丙烯酸)(ps-paa)，
x)聚(乙二醇)-聚(硫化丙烯)(peg-pps)，
xi)聚(2-甲基噁唑啉)-聚(二甲基硅氧烷)-聚(2-甲基噁唑啉)(pmoxa-pdms-pmoxa)，
xii)聚(氧化乙烯)-聚(二甲基硅氧烷)-聚(2-甲基噁唑啉)(peo-pdms-pmoxa)，和
xiii)聚(甲基苯基硅烷)-聚(氧化乙烯)(pmps-peo-pmps-peo-pmps)；
进一步优选地，所述至少一个内部嵌段共聚物囊泡为由独立地选自以下的共聚物形成的聚合物囊泡：
xiv)聚[苯乙烯-b-聚(l-异氰基丙氨酸(2-噻吩-3-基-乙基)酰胺)](ps-piat)，
xv)聚(丁二烯)-聚(氧化乙烯)(pbd-peo)，
xvi)聚(氧化乙烯)-聚(己内酯)(peo-pcl)，
xvii)聚(乙基乙烯)-聚(氧化乙烯)(pee-peo)，
xviii)聚(氧化乙烯)-聚(乳酸)(peo-pla)，
xix)聚(异戊二烯)-聚(氧化乙烯)(pi-peo)，
xx)聚(2-乙烯基吡啶)-聚(氧化乙烯)(p2vp-peo)，
xxi)聚(氧化乙烯)-聚(n-异丙基丙烯酰胺)(peo-pnipam)，
xxii)聚(苯乙烯)-聚(丙烯酸)(ps-paa)，
xxiii)聚(乙二醇)-聚(硫化丙烯)(peg-pps)，
xxiv)聚(2-甲基噁唑啉)-聚(二甲基硅氧烷)-聚(2-甲基噁唑啉)(pmoxa-pdms-pmoxa)，
xxv)聚(氧化乙烯)-聚(二甲基硅氧烷)-聚(2-甲基噁唑啉)(peo-pdms-pmoxa)，和
xxvi)聚(甲基苯基硅烷)-聚(氧化乙烯)(pmps-peo-pmps-peo-pmps)。
49、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡包含脂质聚合物。
50、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述聚合物囊泡进一步包含包封的佐剂。
51、一种用于生产其中包封抗原的聚合物囊泡的方法，所述方法包括：
i)将两亲性聚合物溶解在氯仿中，优选地，所述两亲性聚合物为聚丁二烯-聚氧化乙烯(bd)；
ii)使所述溶解的两亲性聚合物干燥以形成聚合物膜；
iii)向步骤ii)的所述干燥的两亲性聚合物膜添加增溶的抗原，其中所述抗原选自：
a)多肽；优选地，所述多肽抗原为前述项目中的任一项所述，进一步优选地，所述多肽抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，最优选地，所述多肽抗原与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
b)碳水化合物；
c)多核苷酸，其中所述多核苷酸不是反义寡核苷酸，优选地，所述多核苷酸是dna或mrna分子；
d)(a)和/或(b)和/或(c)的组合；
iv)使步骤iii)的所述聚合物膜再水化以形成聚合物囊泡；
v)任选地，过滤步骤iv)的聚合物囊泡以纯化聚合物囊泡单分散囊泡；和/或
vi)任选地，使步骤iv)或v)的所述聚合物囊泡与未包封的抗原相分离。
52、根据前述项目中任一项所述的用于生产其中包封抗原的聚合物囊泡的方法，其中所述聚合物囊泡为前述项目中任一项所述的聚合物囊泡。
53、通过根据前述项目中任一项所述的生产其中包封抗原的聚合物囊泡的方法生产的聚合物囊泡。
54、一种组合物，其包含根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡。
55、根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述组合物为药物或诊断组合物。
56、根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述组合物为免疫原性、抗原性或免疫治疗性组合物。
57、根据前述项目中任一项所述的组合物，其进一步包含一种或多种免疫刺激剂和/或一种或多种佐剂。
58、根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述组合物为疫苗。
59、根据前述项目中任一项所述的组合物，其被配制为用于皮内、腹膜内、肌内、皮下、静脉注射或粘膜表面的无创给药。
60、分离的抗原呈递细胞或杂交瘤细胞，其被暴露于前述项目中任一项所述的聚合物囊泡或组合物。
61、根据前述项目中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞包含树突状细胞。
62、根据前述项目中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞包含巨噬细胞。
63、根据前述项目中任一项所述的抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞包含b-细胞。
64、一种疫苗，其包含前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞或杂交瘤，和进一步包含药学上可接受的赋形剂或载体。
65、根据前述项目中任一项所述的疫苗，其中：
i)所述抗原包含流感血凝素(ha)，其中所述疫苗为流感疫苗，优选地，所述流感血凝素(ha)与选自seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8的多肽具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
ii)所述抗原包含猪流感血凝素(ha)，其中所述疫苗为猪流感疫苗，优选地，所述猪流感血凝素(ha)与seqidno:6具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
iii)所述抗原包含卵清蛋白(ova)，其中所述疫苗为癌症疫苗，优选地，所述卵清蛋白(ova)与seqidno:4具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
iv)所述抗原包含spike蛋白(pedvs)，其中所述疫苗为ped疫苗，优选地，所述猪流行性腹泻病毒spike蛋白(s蛋白)与seqidno:12-14具有至少80％或更高(如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
v)所述抗原包含b16肽，其中所述疫苗为癌症疫苗，优选地，所述肽选自：seqidno:9-11；
vi)所述抗原包含mc38肽，其中所述疫苗为癌症疫苗，优选地，所述肽选自：seqidno:1-3；
vii)所述抗原包含b16和mc38肽，其中所述疫苗为癌症疫苗，优选地，所述肽独立地选自：i)seqidno:1-3和ii)seqidno:9-11；
viii)所述抗原与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；其中所述疫苗为癌症疫苗。
66、一种试剂盒，其包含前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗。
67、一种在受试者(如人)中引发免疫应答的方法，所述方法包括：
i)向所述受试者提供根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗，
ii)向所述受试者施用所述聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗，优选地，所述施用为皮内、腹膜内、肌内、皮下、静脉注射或粘膜表面的无创给药。
68、根据前述项目中任一项所述的引发免疫应答的方法，其中所述免疫应答为广泛的免疫应答。
69、根据前述项目中任一项所述的引发免疫应答的方法，其中所述免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答和/或cd4(+)t细胞介导的免疫应答。
70、一种用于在有此需要的受试者(如人)中治疗或预防感染性疾病、癌症或自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗，优选地，所述感染性疾病为病毒或细菌感染性疾病。
71、一种用于免疫非人动物的方法，所述方法包括如下步骤：
i)提供前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗；
ii)用所述聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗免疫所述非人动物。
72、一种用于制备抗体的方法，所述方法包括：
i)用前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗免疫非人动物；
ii)分离步骤(i)得到的抗体。
73、根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体(mab)。
74、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗，其用作药物。
75、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗，其用在如下方法的一种或多种中：
i)用在抗体发现和/或筛选和/或制备的方法中；
ii)用在疫苗发现和/或筛选和/或制备的方法中；
iii)用在生产或制备免疫原性或免疫刺激剂组合物的方法中；
iv)用在靶向递送蛋白质和/或肽的方法中，优选地，所述靶向递送为靶向递送根据前述项目中任一项所述的抗原性蛋白和/或肽；进一步优选地，所述抗原性蛋白和/或肽包含膜蛋白(mp)或膜相关肽(map)的可溶性部分，最优选地，所述抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分，进一步最优选地，所述抗原与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；再进一步最优选地，所述靶向递送在受试者中实施；
v)用在刺激对抗原的免疫应答的方法中，优选地，所述抗原为前述项目中任一项所述，进一步优选地，所述抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分；进一步最优选地，所述抗原与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；进一步最优选地，其用于在受试者中刺激对所述抗原的免疫应答；
vi)用在触发由cd8(+)t细胞介导的免疫应答诱导的交叉保护的方法中，优选地，用在触发由cd8(+)t细胞介导的免疫应答诱导的交叉保护的方法中，所述免疫应答针对前述项目中任一项所述的抗原；进一步优选地，所述抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分；最优选地，所述抗原与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
vii)用在将肽和/或蛋白递送至前述项目中任一项所述的抗原呈递细胞(apc)的方法中；优选地，所述肽和/或蛋白为前述项目中任一项所述的抗原；进一步优选地，所述抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分；最优选地，所述抗原与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
viii)用在触发免疫应答的方法中，所述免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答和/或cd4(+)t细胞介导的免疫应答；优选地，所述应答针对前述项目中任一项所述的抗原；进一步优选地，所述抗原包含流感血凝素、猪流感血凝素、卵清蛋白(ova)、猪流行性腹泻病毒spike蛋白、b16肽或mc38肽的可溶性部分；更进一步优选地，所述应答针对抗原，所述抗原与选自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11和seqidno:12-14的多肽序列具有至少60％或更高(如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的同一性；
ix)用在用于治疗、改善、预防或诊断感染性疾病的方法中，优选地，所述感染性疾病为病毒或细菌感染性疾病；进一步优选地，所述病毒感染性疾病选自：流感病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、疱疹病毒感染；
x)用在用于治疗、改善、预防或诊断癌症或自身免疫性疾病的方法中；
xi)用在用于使癌细胞对化学疗法敏感的方法中；
xii)用在用于在癌细胞中诱导凋亡的方法中；
xiii)用在用于在受试者中刺激免疫应答的方法中；
xiv)用在用于免疫非人动物的方法中；
xv)用在用于制备杂交瘤的方法中；
xvi)用在根据前述项目中任一项所述的方法中；
xvii)用在根据前述i)-xvi)中任一项所述的方法中，其中所述方法为体内和/或离体和/或体外方法；
xviii)用在根据前述i)-xvii)中任一项所述的方法中，其中所述抗原对所述抗原使用的环境而言是异源的。
76、根据前述项目中任一项所述的聚合物囊泡、组合物、抗原呈递细胞、杂交瘤或疫苗用于以下的一种或多种的用途：
i)用于抗体发现和/或筛选和/或制备；
ii)用于疫苗发现和/或筛选和/或制备；
iii)用于免疫原性或免疫刺激剂组合物的生产或制备；
iv)用于蛋白质和/或肽的靶向递送，优选地，所述靶向递送为抗原性蛋白和/或肽的靶向递送；进一步优选地，所述靶向递送在受试者中实施；
v)用于刺激对抗原的免疫应答，优选地，用于在受试者中刺激对抗原的免疫应答；
vi)用于触发由cd8(+)t细胞介导的免疫应答诱导的交叉保护；
vii)用于将肽或蛋白递送至抗原呈递细胞(apc)；优选地，所述肽或蛋白为抗原，进一步优选地，所述肽或蛋白为免疫原性的或免疫治疗性的；
viii)用于触发免疫应答，所述免疫应答包含cd8(+)t细胞介导的免疫应答和/或cd4(+)t细胞介导的免疫应答；
ix)在用于治疗、改善、预防或诊断感染性疾病的方法中，优选地，所述感染性疾病为病毒或细菌感染性疾病；进一步优选地，所述病毒感染性疾病选自：流感病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、疱疹病毒感染；
x)用于治疗、改善、预防或诊断癌症或自身免疫性疾病；
xi)用于使癌细胞对化学疗法敏感；
xii)用于在癌细胞中诱导凋亡；
xiii)用于在受试者中刺激免疫应答；
xiv)用于免疫非人动物；
xv)用于制备杂交瘤；
xvi)在根据前述项目中任一项所述的方法中；
xvii)用于根据前述i)-xvi)中任一项所述的用途，其中所述用途为体内和/或离体和/或体外用途；
xviii)用于根据前述i)-xvii)中任一项所述的用途，其中所述抗原对所述抗原使用的环境而言是异源的。
77、一种在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用携带抗原的由pdms-peo形成的聚合物囊泡。
78、根据项目77所述的方法，其中所述抗原被包封在所述pdms-peo聚合物囊泡中。
79、根据项目78所述的方法，其中包封在所述pdms-peo聚合物囊泡中的抗原为可溶性抗原。
80、根据项目79所述的方法，其中所述抗原选自多肽、碳水化合物、多核苷酸以及它们的组合。
81、根据项目77所述的方法，其中将所述抗原整合至所述pdms-peo聚合物囊泡的周向膜中。
82、一种携带抗原的pdms-peo聚合物囊泡。
83、根据项目82所述的聚合物囊泡，其中所述抗原被包封在所述pdms-peo聚合物囊泡中。
84、根据项目83所述的聚合物囊泡，其中包封在所述pdms-peo聚合物囊泡中的抗原为可溶性抗原。
85、根据项目84所述的聚合物囊泡，其中所述抗原选自多肽、碳水化合物、多核苷酸以及它们的组合。
86、根据项目85所述的聚合物囊泡，其中将所述抗原整合至所述pdms-peo聚合物囊泡的周向膜中。
87、根据项目86所述的聚合物囊泡，其中所述抗原为膜相关蛋白或脂质抗原。
88、根据项目87所述的聚合物囊泡，其中所述膜相关蛋白选自跨膜蛋白、g蛋白偶联受体、神经递质受体、激酶、孔蛋白、abc转运蛋白、离子转运蛋白、乙酰胆碱受体和细胞粘附受体。
89、一种药物组合物，其包含项目82至88中任一项所述的聚合物囊泡。
90、根据项目82至88中任一项所定义的pdms-peo或项目89所述的药物组合物用于引发免疫应答的体外和体内用途。
发明实施例
为了本发明可以被容易地理解并付诸实际效果，现将通过以下非限制性实施例来描述本发明的一些方面。
材料和方法
实施例1：聚合物囊泡中卵清蛋白、肽、可溶性ha、pedvspike蛋白和egfpdna的包封
将100mg/ml的聚丁二烯-聚氧化乙烯(本文称为“bd21”)储备液溶解在氯仿中。然后将100μl100mg/ml的bd21储备液沉积到硼硅酸盐(12x75mm)培养管中，并在氮气流中缓慢干燥以形成聚合物薄膜。在干燥器中将该膜于真空下进一步干燥6小时。然后将1ml的1-5mg/ml在1xpbs缓冲液中溶解的卵清蛋白(ova)蛋白溶液添加到培养管中。将混合物在4℃下以600rpm搅拌至少18小时以使膜再水化并形成聚合物囊泡。然后用挤压机(avanti1ml脂质体挤压机，21冲程)通过200nm孔径的whatmannucleopore膜将混浊悬液挤出以得到单分散囊泡[如，fu等人，2011，lim.s.k等人，2017]。通过使用透析膜(300kdamwco，纤维素酯膜)针对1l的1xpbs对混合物进行透析，从未包封的蛋白中纯化含有蛋白质的bd21聚合物囊泡。
使用尺寸排阻色谱法分析最终的囊泡混合物中未包封的蛋白。将来自sec的囊泡峰的级分用于通过sds-page定量蛋白质包封的量。采用动态光散射仪(malvern,unitedkingdom)(用1xpbs的100x稀释液)表征囊泡的尺寸和单分散性。为了定量包封在聚合物囊泡中的ova，先用20％dmso然后用样品缓冲液预处理样品，之后将样品上样进行sds-page分析。
对于肽包封(以seqidno:1、2和3的mc38新抗原肽为示例)，遵循相似的方案。将溶解在pbs中的浓度为0.5-0.3mg/ml的肽用于包封。透析后，采用caryeclipse分光光度计(agilent)通过苯丙氨酸荧光(ex270nm/em310nm)确定包封的肽的量。分别进行3种肽的包封并且所有肽的浓度经测定为20-30ug/ml。在注射到小鼠中之前，将等体积的3种包封肽中的每一种混合在一起。
对于ha包封，遵循相似的方案。将重组ha(h1n1/a/波多黎各/8/1934株)以10ug/ml的浓度溶解在pbs中以用于包封。透析后，通过蛋白质印记来确定包封肽的量。包封后ha浓度经测定为约1ug/ml。将100ul注射到小鼠体内。
对于在bd21聚合物囊泡中pedvspike蛋白的包封，遵循与如上所述相似的方案。使用杆状病毒表达系统表达pedvspike蛋白(不同的构建体，seqidno:12-14)。添加从昆虫细胞分离的蛋白质用于包封。而对于在由聚(二甲基硅氧烷)-聚(氧化乙烯)(自polymersource,quebec,canada获得的pdms46-peo37)或由嵌段共聚物和脂质的混合物(比如pdms46-peo37(/dspe-peg、pla-peg/popc、pla-peg/大豆磷脂)制备的聚合物囊泡中pedvspike蛋白的包封，采用了不同的方法以表明这些方法的通用性。将聚合物和/或聚合物脂质混合物溶于乙醇或任何与水混溶的溶剂中，然后滴加到蛋白质溶液中进行自组装，并在自组装过程中将蛋白质包封到聚合物囊泡中。通过用pbs透析除去未包封的蛋白质。透析后，通过密度计确定每种聚合物囊泡样品包封的蛋白的量。对于这些聚合物囊泡制剂中的每一种，包封后蛋白的浓度经测定为约1μg/ml。聚合物囊泡包封有可溶性spike蛋白(seq12)或spike蛋白的s1区(seq13)和spike蛋白的s2区(seq14)。将100-200μl的聚合物囊泡(仅具有可溶性spike蛋白或具有spike蛋白的s1和s2区的聚合物囊泡的混合物)注射到小鼠中，并且将1ml的该种聚合物囊泡口服施用至猪。
对于egfrdna包封，遵循与ova包封相似的方案。简言之，将比如聚(丁二烯)-聚(氧化乙烯)(bd21)、在聚(氧化乙烯)链末端用官能团(如nh2、cooh)修饰的聚(丁二烯)-聚(氧化乙烯)(bd21-nh2)的嵌段共聚物，比如pla-peg/popc、pla-peg/大豆磷脂、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基(dc)-胆固醇、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)的嵌段共聚物和脂质的混合物溶解在氯仿中并转移至玻璃管中，在氮气流下缓慢干燥以形成薄膜。在干燥器中将该膜于真空下进一步干燥6小时。然后将1μg的egfpdna添加到薄膜中并再水化过夜。之后，将样品用0.2um聚碳酸酯过滤器挤出并用hepes缓冲液透析。
实施例2：用包封egfpdna的聚合物囊泡转染hek293t细胞
将hek293t细胞以50,000个细胞/孔的密度接种到48孔板中。对于转染(lipofectamine2000转染)，将1,000μlopti-memi(invitrogen)、2μllipofectamine2000(invitrogen)和1μgsf-gfppcdna(或含1μgsf-gfppcdna的聚合物囊泡制剂)混合。在室温下温育20分钟形成转染复合物。为了转染，将脂质体(lipofectamine)复合物加入细胞中，并在37℃和5％co2下温育24小时至72小时。通过gfp荧光(ex485nm，em520nm)测量转染效率。对于细胞摄取，在ex530nm和em560nm处测量荧光。为了成像，抽出细胞培养基，然后用dpbs(含ca2+/mg2+)洗涤细胞，并用4％对甲醛固定。然后，取下玻璃盖玻片并放到载玻片上，该载玻片包含一滴20ul的具有dapi的封片剂(mountingmedium)。最后，用指甲油密封盖玻片，并保存在4℃下以用于进一步成像。将荧光显微镜用于成像。
实施例3：免疫接种包封ova的聚合物囊泡以测定抗体效价
采用具有或不具有sigma佐剂系统(sas)的游离ova和包封ova的acm(聚合物囊泡)，通过进行初免和21天后的加强来免疫c57bl/6小鼠。所有免疫接种均以最终量的ova进行：5-10ugova/注射/小鼠。初免后42天采集最终血样。然后进行elisa以评估效价：将ova包被在maxisorp平板(1ug/ml)上过夜。在室温下使用pbs中的3％bsa封闭板达1小时。将所有血清以1:100稀释，并在室温下在平板上温育1小时。用pbs+0.05％tween20洗涤3次后，将偶联的二抗抗-小鼠igghrp以1:10,000的稀释度在室温下温育1h。用pbs/tween20缓冲液洗涤3次后，加入tmb底物，并使用1mhcl终止反应。在450nm处定量光密度。
实施例4：免疫接种包封ha的聚合物囊泡以测定抗体效价
类似地，采用pbs中游离ha蛋白(seqidno:7)、acm包封的ha(聚合物囊泡)或pbs对照免疫balb/c小鼠。所有免疫接种均以相同的最终量的ha进行：100ngha/注射/小鼠。初免后42天采集最终血样并按照如上所述采用1ug/mlha用于包被平板以进行elisa。
实施例5：免疫接种包封mc38新抗原肽的聚合物囊泡以测定细胞应答
为了观察免疫后的特定cd8t细胞应答，我们采用了mc-38同源肿瘤模型。在c57bl/6小鼠的右侧皮下接种0.1mlpbs中的mc-38肿瘤细胞(3×105个)，来发展肿瘤。将接种日定义为第0天。基于体重将动物随机化，并在接种后第4天开始免疫接种。免疫接种包括：游离肽、在有或没有可商购获得的抗-pd-1抗体共处理情况下的acm包封的肽(聚合物囊泡)。肽为：reps1p45a(seqidno:1)、adpgkr304m(seqidno:2)和dpagt1v213l(seqidno:3)，获自genscript。在第4、12和18天皮下免疫200ul肽和acm中的肽。acm中的肽的浓度经测定为20-30μg/ml，而对于单独的肽，采用每只小鼠每次注射10μg。在第5、8、12、15、19和22天以5mg/kg的剂量腹膜内注射抗pd1抗体。检查动物的肿瘤生长和治疗对其正常行为的任何影响，所述正常行为比如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/减少(体重每周测量3次)。使用卡尺每周3次测量肿瘤的二维尺寸，并使用以下公式以mm3表示体积：v＝0.5axb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。
实施例6：用包封pedv纤突蛋白的聚合物囊泡免疫接种小鼠和猪
用acm包封的pedv纤突蛋白免疫小鼠并在21天后采用第二剂量加强，免疫150ul-200μl的包封了pedv纤突蛋白的聚合物囊泡。从最终血样中收集血清并将其用于elisa。此外，通过常规病毒中和测试了这些血清中和pedv毒株usa/科罗拉多/2013(co/13)的能力。另外，给断奶仔猪口服接种1ml包封了pedvspike蛋白的聚合物囊泡(在第1天初免和第14天加强免疫后)。将简单的生理溶液用于口服疫苗接种。
结果
实施例1的蛋白和dna的包封：
将包封ova的聚合物囊泡通过透析和尺寸排阻柱(sec)纯化以移除未包封的蛋白并通过动态光散射进行分析。如图2a、图3和图4所示，观察到来自sec和单分散群的包封ova的聚合物囊泡的洗脱曲线。
图2b呈现了其中包封了ova、pedvspik蛋白或egfpdna的各种不同的聚合物囊泡的动态光散射(dls)数据。使用z平均值(d,nm)，优选的dls参数，所有聚合物囊泡的平均直径为120nm-180nm。z平均尺寸是强度加权调和平均颗粒直径(intensityweightedharmonicmeanparticlediameter)，其值与聚合物囊泡的较早数据[fu等人，2011，lim.s.k,等人，2017]良好吻合。
实施例2的包封的egfpdna及转染数据：
使包封egfpdna的聚合物囊泡转染hek293t细胞，转染后，通过荧光读板器在ex530nm和em560nm下测量acm聚合物囊泡的摄取并通过gfp荧光(ex485nm，em520nm)测量转染的效率。如图5所示，很明显，具有dna的聚合物囊泡能够渗透到细胞中并释放dna以将dna表达成蛋白质，所有的聚合物囊泡制剂均被细胞摄取并能够释放dna，而聚合物囊泡的释放与蛋白质表达的比率与其稳定性和可生物降解性良好关联(图5a)。与可生物降解的聚合物囊泡相比，诸如bd21之类的不可生物降解的聚合物囊泡的摄取量较小，并且表达水平较低。从细胞的荧光图像也观察到了相似的结果(图5b和图5c)。
实施例3的包封的ova和效价：
通过进行初免和21天后的加强在c57bl/6小鼠中进行包封ova的聚合物囊泡的免疫。将最终血样用于实施elisa。如图6所示，很明显，与游离的ova、具有佐剂的ova或对照样品(单独的pbs)相比，包封ova的聚合物囊泡是唯一能够触发效价的制剂。具有sas的ova未产生效价的原因可能是由于试验中使用的ova量很少(每次注射约5ug)。因此，acm包封的ova能够以卵清蛋白特异性igg血清效价形式触发针对ova的b细胞应答。
实施例4的包封的ha和效价：
通过进行初免和21天后的加强在balb/c小鼠中进行包封ha(h1n1/a/波多黎各/8/1934株，seqidno:7)的聚合物囊泡的免疫。将最终血样用于实施elisa。如图7所示，很明显，与游离的ha或对照样品(单独的pbs)相比，包封ha的聚合物囊泡是唯一能够触发效价的制剂。游离ha未产生效价的原因可能是由于试验中使用的ha量很少(每次注射约100ng)。因此，acm包封的ha能够以ha特异性igg血清效价形式触发针对ha的b细胞应答。
实施例5的包封的mc-38新抗原肽和cd8t细胞应答：
为了表明acm包封的抗原能够触发cd8t细胞应答，我们使用了定义明确的mc-38同源小鼠肿瘤模型，该模型依赖于已知cd8抗原肽的递送。已显示高量的与佐剂组合的这些肽在治疗性小鼠模型中触发肿瘤控制(例如kuai等人，2017；luo等人，2017)。此外，这些作用显然与小鼠血液中肽特异性cd8t细胞的存在有关。因此，各组之间的任何肿瘤发展差异可直接归因于cd8t细胞的肽特异性库(pool)的存在。mc-38细胞系接种后4天，按照本文“材料和方法”部分所述，用游离肽、具有或不具有抗pd1抗体治疗的acm包封的肽(聚合物囊泡)免疫小鼠。如图8所示，与游离肽相比，采用包封的肽的免疫接种能够触发对肿瘤发展的抑制作用。当添加抗pd1抗体注射时，这种效果就会显著增强。该数据表明，acm包封的肽(聚合物囊泡)最有可能是通过将这些肽递送至树突状细胞而得以触发肽特异性cd8t细胞应答，从而控制了肿瘤。通过添加比如抗pd1抗体的检查点抑制剂增强了这一效果。事实上，已经表明mc-38在其细胞表面表达pd-l1分子，已知该分子可抑制肿瘤内t细胞的杀伤活性。因此，已知通过阻断pd1/pd-l1相互作用的抗体来抑制这种相互作用甚至进一步揭示了肿瘤特异性t细胞的存在。总而言之，这些数据清楚地表明，acm包封的抗原(聚合物囊泡)无需添加佐剂即可触发抗原特异性cd8t细胞应答。
实施例6的包封的pedv纤突蛋白和igg、iga及病毒中和应答：
用acm包封的pedv纤突蛋白免疫接种小鼠并在21天后采用第二剂量加强。从最终血样中收集血清并将其用于elisa。从图8可以看出，与用acm疫苗接种的小鼠相比，与包被在elisa平板上的spike蛋白结合的抗体及效价与接种了灭活病毒的动物的水平相似。此外，通过常规病毒中和实验测试了这些血清中和pedv毒株usa/科罗拉多/2013(co/13)的能力(图9)。在此观察到，仅在用acm疫苗(即acm包封的pedspike蛋白)免疫的小鼠的血清中发生了病毒中和，而在用灭活病毒疫苗接种的小鼠的血清中未观察到中和。此外，免疫接种了不同的包封了全长可溶性蛋白的聚合物囊泡(如bd21、pdms46-peo37(在图10中仅标记为“pdms”)，pdms46-peo37/dspe-peg，pla-peg/大豆磷脂)和含有s1和s2区的聚合物囊泡混合物，并对血清进行免疫中和测试(图10)。从图10可以明显看出，用pbs样品免疫的小鼠组未显示任何病毒中和，而所有其它聚合物囊泡制剂均显示不同程度的病毒中和。此外，当给断奶仔猪进行acm包封的pedspike蛋白的口服疫苗接种时(在第1天初免和第14天加强免疫后)，从收集和经elisa测量的粪便拭子中观察到针对该病毒的特异性iga抗体增加(参见图11)。
本领域技术人员将易于认识到，本发明非常适于实现所述的目的和获得其结果和优点以及其内固有的那些。此外，对于本领域技术人员显而易见的是，可以进行本文描述的本发明的不同取代和修饰，而不脱离本发明的范围和精神。本文所述的组合物、方法、操作程序、治疗、分子和具体化合物目前是某些实施方案的代表，是示例性的，而不意在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到的其中的变化和其它用途将被包括在本发明的精神内，由权利要求书的范围限定。本说明书中之前公开的文献的列出或讨论不应一定理解为承认该文献为本领域现有技术的一部分或者为公知常识。
本文示例性地描述的发明可以适于在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元件、一种或多种限制的情况下实施。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地理解且无限制。此外，本文采用的术语和表述用作描述性的术语而非限制，并且无意使用排除所示和所述特征的任何等同物或其部分的此类术语和表述，而是应该认识到，各种修改形式都在要求保护的发明的范围内。因而，应该理解，尽管本发明通过示例性实施方案和任选的特征进行了具体公开，本领域技术人员可能进行本文其中实施的发明的修改和变化，并且此类修改和变化认为是在本发明的范围内。
本发明在本文中已经作了广泛且概括性的描述。落入上位公开内容中的每一个较窄类别和亚类分组也构成本发明的部分。这包括本发明的概括性描述，条件是或者否定性限制是从类属中去除了任何主题内容，无论排除的材料是否在本文中具体描述。
其它实施方案在权利要求之内。此外，在所述发明的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员应认识到本发明也因此按照马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。
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