肺炎球菌表面蛋白A(PSPA)的表达的制作方法

本发明涉及截短肺炎球菌表面蛋白a1(pspa1)在细菌中的高水平表达。

背景技术：

肺炎链球菌是中耳炎、脑膜炎、菌血症和肺炎的重要病因，也是老年人和基础性疾病患者致命感染的主要原因。链球菌疫苗接种的一个有吸引力的目标是减少在接种疫苗的人群中的携带，并随后减少肺炎球菌疾病的发生率。

以品牌名称pneumovax23销售的肺炎球菌多糖疫苗对2岁以下的儿童无效。多糖疫苗在这一人群中的无效性归因于婴儿免疫系统在b细胞受体表达方面的不成熟。多糖(ps)与载体蛋白的结合将其由t细胞非依赖性抗原转化为t细胞依赖性抗原。作为t细胞依赖性抗原，多糖可引起对同种型转换、记忆细胞生成的应答和可增强的免疫应答。

膜蛋白存在于膜中并跨膜，通过膜它们用于转运分子或促进细胞粘附。蛋白可以通过促进扩散(即，被动运输)或主动运输来协助物质的运动。肺炎球菌表面蛋白a(pspa)是一种膜蛋白，是附着在所有肺炎链球菌菌株细胞壁上的另一个重要毒力因子。

通过肺炎球菌蛋白，特别是pspa1或其片段代替通用载体蛋白，例如破伤风类毒素(tt)或crm197，除了扩大疫苗覆盖率外，还可以防止由于在结合疫苗中过度使用相同的载体蛋白引起的免疫应答受损。表达质粒经过工程改造，以包含充当增强子和启动子区域的调节序列，并导致表达载体上携带的基因的有效转录。设计良好的表达载体的目标是有效生产蛋白，这可以通过合成大量稳定的信使rna来实现。可以设计一种表达载体，该表达载体对表达施加严格控制，并且仅在必要时通过使用合适的表达条件才能大量生产蛋白。

在没有严格控制基因表达的情况下，蛋白也可以组成性表达。

谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)是革兰氏阳性发酵细菌，其被广泛用于大量生产谷氨酸单钠。由于其稳定的遗传特性和缺乏任何内毒素，谷氨酸棒杆菌被归类为gras生物体(通常被认为是安全的)。不清楚该细菌分泌任何细胞外蛋白酶，因此它成为在培养基中产生异源蛋白的有吸引力的平台。这可以使用表达质粒构建体来实现，该构建体可以大量合成重组蛋白。

ep2310502b1公开了ptac启动子在构建体中的用途，其中在lb培养基中生长含有iptg诱导的ftsz和mincde缺失突变的大肠杆菌菌株。

nokano等人，jbacteriol.1984jan；157(1):79-83公开了卡那霉素抗性基因在质粒构建体中的用途，以使转化的菌株获得对卡那霉素具有抗性的性质。

masai等人，procnatlacadsciusa.1987jul；84(l4):4781-5公开了用于启动r1质粒复制并与orir序列相互作用的repa蛋白。

nayak等人，infect.immun.-l998-nayak-3744-51公开了表达肺炎球菌表面蛋白a(pspa)的口服重组沙门氏菌活疫苗株。

nabors等人，vaccine18(2000)1743-54公开了重组截短pspa作为胞质蛋白在大肠杆菌中的表达。

figueredo等人，applmicrobiolbiotechnol(2017)101:2305-2317公开了未标记的重组肺炎球菌表面蛋白a(pspa4pro)的生产和纯化。

上述参考文献公开了表达载体的遗传成分或肺炎球菌表面蛋白a在大肠杆菌(escherichiacoli)和沙门氏菌(salmonella)中的表达。

发明人已经鉴定了肺炎球菌表面蛋白的免疫原性片段。此后，发明人付出了巨大的努力来开发能够在细菌中高水平地稳定和组成型或可诱导地表达截短肺炎球菌表面蛋白a1(pspa1)的表达构建体。

因此，本发明打算通过制备用于表达截短肺炎球菌表面蛋白的表达载体和重组宿主细胞来克服现有技术的挑战。此外，发明人已经制备了包含截短蛋白作为载体蛋白的疫苗组合物。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种表达构建体，用于在细菌中高水平表达截短肺炎球菌表面蛋白a1(pspa1)。

本发明的另一个目的是提供一种表达构建体，该表达构建体能够在细菌中稳定地且组成性地或诱导地表达高水平的截短肺炎球菌表面蛋白a1(pspa1)。

技术实现要素：

本发明提供了一种能够高水平表达如seqidno:3和4描述的截短肺炎球菌表面蛋白a1(pspa1)的表达构建体。

本发明提供了一种包含编码如seqidno:5和6描述的截短pspal的基因的表达构建体。

本发明提供了一种用于在细菌中高水平表达如seqidno:3或4描述的截短pspa1(肺炎球菌表面蛋白a1)的表达构建体，其包含：

a)编码如seqidno:5或6描述的截短pspa1的基因，

b)复制原点，

c)抗生素抗性基因，

d)启动子，和

e)核糖体结合位点。

本发明还涉及用于高水平表达截短pspa1(肺炎球菌表面蛋白a1)的方法，该方法包括培养用表达构建体转化的细菌，从而纯化表达的蛋白。

附图说明

图1：小图a示出了pbe31c的示意图。小图b示出了由rx1pspa1的推导氨基酸序列描绘的pspa结构域的示意图。小图c示出了pbe117的示意图。小图d示出了含有rbs、天然信号肽、截短pspa1、天然终止子和trrnb的pcr扩增子。

图2：肽指纹分析中截短pspa1的蛋白质序列覆盖率。

图3：谷氨酸棒杆菌中表达的截短pspa1的完整质量分析。

图4：由陶瓷羟基磷灰石(cht-ii)柱洗脱的截短pspal。

图5：由阴离子交换柱洗脱的截短pspal。

图6：渗滤后的截短pspa1。

图7：肺炎球菌多糖血清型3(a)、6a(b)和6b(c)的结合反应动力学的sec-hplc色谱图。

图8：免疫兔针对来自血清型3、6a、6b(2.2mcg)的肺炎链球菌多糖与截短pspa1载体蛋白的不同结合物的血清抗体滴度。

图9：免疫兔针对来自血清型3、6a、6b(4.4mcg)的肺炎链球菌多糖与截短pspa1载体蛋白的不同结合物的血清抗体滴度。

图10：小图a示出了pbe114k的示意图。小图b示出了通过限制性消化对pbe114k的确认。

图11：由chti色谱法洗脱的截短pspal。

图12：由captoqimpress色谱法洗脱的截短pspal。

图13：maldi对pspa1的蛋白质覆盖率。

图14：对在大肠杆菌(escherichiacoli)中表达的截短pspa1的完整质量分析。

具体实施方式

术语pspa1是指来自肺炎链球菌的肺炎球菌表面蛋白a1。

本发明涉及截短pspal(肺炎球菌表面蛋白a1)在细菌中的高水平表达。适于pspa1的高水平表达的细菌是谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。

在一个实施方式中，本发明涉及如seqidno:3描述的截短pspa1(肺炎球菌表面蛋白a1)在谷氨酸棒杆菌中的高水平表达。

在另一个实施方式中，本发明涉及如seqidno:4描述的截短pspa1(肺炎球菌表面蛋白a1)在大肠杆菌中的高水平表达。

本发明提供了一种能够高水平表达如seqidno:3描述的表面蛋白的表达构建体。

本发明还提供了一种能够高水平表达如seqidno:4描述的表面蛋白的表达构建体。

在另一个实施方式中，本发明涉及一种用于在谷氨酸棒杆菌中高水平表达如seqidno:3描述的截短pspa1(肺炎球菌表面蛋白a1)的表达构建体。

在又一个实施方式中，本发明涉及一种用于在大肠杆菌中高水平表达如seqidno:4描述的截短pspa1(肺炎球菌表面蛋白a1)的表达构建体。

本发明涉及一种用于在谷氨酸棒杆菌中高水平表达截短pspa1的表达构建体，其包括：

i.orir复制原点，

ii.卡那霉素抗性基因，

iii.ptac启动子，

iv.编码截短pspa1(seqidno:5)的目的基因。

本发明还涉及一种用于在大肠杆菌中高水平表达截短pspa1的表达构建体，其包括：

i.puc复制原点

ii.卡那霉素抗性基因

iii.pt7启动子

iv.编码截短pspa1(seqidno:6)的目的基因。

在一个实施方式中，用于高水平表达截短pspa1的表达构建体还包含核糖体结合位点(rbs)。rbs包含在正向引物中，且一小段含有天然终止子的dna包含在用于进一步扩增截短pspa1的反向引物中。rbs(核糖体结合位点)是表达构建体中的磷酸丙糖异构酶用于在谷氨酸棒杆菌中表达截短pspa1。

在本发明的一个实施方式中，表达构建体包含磷酸丙糖异构酶基因(triosephosphateisomerasegene)的pspa1信号肽编码区(天然)、截短pspa1、ptac启动子和核糖体结合位点(rbs)。

在一个优选的实施方式中，本发明提供了用于在谷氨酸棒杆菌中高水平表达截短pspa1(seqidno:3)的表达构建体，其包含：

a.编码截短pspa1(seqidno:5)的基因，

b.orir复制原点(seqidno:12)，

c.卡那霉素抗性基因(seqidno:1)，

d.ptac启动子(seqidno:2)和

e.磷酸丙糖异构酶核糖体结合位点。

在另一个优选的实施方式中，本发明提供了用于在大肠杆菌中高水平表达截短pspa1(seqidno:4)的表达构建体，其包含：

a)编码截短pspa1(seqidno:6)的基因，

b)puc复制原点，

c)卡那霉素抗性基因(seqidno:1)，

d)pt7启动子(seqidno:11)和

e)核糖体结合位点。

肺炎球菌表面蛋白a(pspa)是一种膜蛋白，是发现附着在所有肺炎链球菌菌株细胞壁上的重要毒力因子，并且正如已被证明具有高免疫原性一样是有前景的组分。

在本发明的一个特定实施方式中，截短pspa1用作载体蛋白。结合疫苗中使用的载体蛋白优选是无毒且无反应原性并且可以大量和纯净形式获得的蛋白。可以将载体蛋白与从病原菌分离的荚膜多糖结合以增强多糖的免疫原性。载体蛋白应符合标准的化学结合程序。

谷氨酸棒杆菌中的截短pspa1被分泌到细胞外培养基中。分泌到细胞外培养基中有助于有效纯化。

本发明涉及在谷氨酸棒杆菌中高水平表达截短pspa1，其中从肺炎链球菌的23f荚膜血清型连同上游区域扩增截短pspa1基因的n末端区域以及脯氨酸丰富区域。

在本发明的一个实施方式中，表达构建体包含磷酸丙糖异构酶基因的截短pspa1、ptac启动子和核糖体结合位点(rbs)。

在本发明的一个实施方式中，表达构建体包含截短pspa1、pt7启动子和核糖体结合位点(rbs)。

将表达构建体电穿孔到谷氨酸棒杆菌中，并在卡那霉素作为选择标记的lb平板上选择。

ptac是强大的杂合启动子，由trp启动子的-35区和lacuv5启动子/运算符的-10区组成。

pspa序列从genbank获得，并从蛋白质数据库比对。设计引物以特异性扩增天然信号肽编码区、n末端区域以及属于家族1和2的pspa基因的脯氨酸丰富区域。从可用的肺炎链球菌临床分离株扩增所需的pspa1和pspa2区域。mhc肽分析表明，pspa1具有比pspa2相对更多的免疫原性。

在谷氨酸棒杆菌中表达和产生的编码截短pspa1的氨基酸序列示于seqidno:3中，观察到完整质量为35452道尔顿。

在大肠杆菌中表达和产生的编码截短pspa1的氨基酸序列示于seqidno:4中，观察到完整质量为41966道尔顿。

在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中表达的编码截短pspa1的dna序列分别示于seqidno:5和seqidno6中。

用于表达截短pspa1的谷氨酸棒杆菌(先前称为产谷氨酸微球菌)是gras微生物革兰氏阳性棒状细菌。谷氨酸棒杆菌是gras微生物。可获得谷氨酸棒杆菌atcc13032的整个基因组序列，其可以生长至更高的细胞密度，并且由于缺乏重组修复系统而在遗传上也是稳定的。它具有有限的限制修饰系统。它没有自溶作用，并且可以在生长停滞的条件下维持代谢活性。它具有低的蛋白酶活性，有利于重组蛋白生产。它的新陈代谢的可塑性和强大的次生代谢特性、利用广谱碳源(戊糖、己糖和替代碳源)的能力、对碳源的耐受力使其成为用于异源蛋白生产的有前景的宿主。这些生理特性使谷氨酸棒杆菌可以在强大的工业条件下进行操作和培养，因此使其成为成功的工业主力。在谷氨酸棒杆菌中报道了诸如α-淀粉酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、gfp、木聚糖酶的蛋白质的异源表达。

在本发明的一个实施方式中，截短pspa1的产量为为约500mg/l、约400mg/l、约300mg/l、约250mg/l、约220mg/l、约200mg/l、约180mg/l、约160mg/l、约150mg/l、约120mg/l、约100mg/l。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种肺炎球菌结合疫苗，其包含来自肺炎链球菌血清型的至少一种多糖与本发明的截短pspa1或截短pspa1和其他载体蛋白的组合结合，肺炎链球菌血清型选自1、2、3、4、5、6a、6b、6c、6d、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15a、15b、15c、16f、17f、18c、19f、19a、20a、20b、22f、23a、23b、23f、24b、24f、31、33f、34、35b、35f、38、39和45，其他载体蛋白如crm197、破伤风类毒素、百日咳类毒素；psaa等。

在另一个实施方式中，本发明提供了选自10价、14价、15价、17价、18价、19价、20价、22价、23价、24价或25价的多价肺炎球菌疫苗组合物，其包含来自肺炎链球菌血清型的多糖与本发明的截短pspa1或与截短pspa1和其他载体蛋白的组合结合，肺炎链球菌血清型选自1、2、3、4、5、6a、6b、6c、6d、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15a、15b、15c、16f、17f、18c、19f、19a、20a、20b、22f、23a、23b、23f、24b、24f、31、33f、34、35b、35f、38、39和45，其他载体蛋白如crm197、破伤风类毒素、百日咳类毒素；psaa等。

在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种多价结合疫苗，其包含与本发明的截短pspa1结合的至少三种来自肺炎链球菌血清型3、6a和6b的多糖。

在本发明的一个实施方式中，提供了一种结合疫苗，其包含来自与本发明的截短pspa1结合的肺炎链球菌血清型3、6a和6b的多糖和与crm197结合的肺炎链球菌血清型1、4、5、7f、9v、14、18c、19a、19f、22f、23f和33f。

本发明提供了包含2.2μg或4.4μg的来自各自与本发明的截短pspa1结合的血清型3、6a和6b的每种肺炎球菌多糖和约2.2μg的来自各自与crm197结合的血清型1、4、5、7f、9v、14、18c、19a、19f、22f、23f和33f的每种肺炎球菌多糖的制剂。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种单次0.5ml剂量的肺炎球菌疫苗组合物，该单次剂量包含约2.2至4.4μg的一种或多种肺炎球菌多糖；约1μg至约50μg的与一种或多种肺炎球菌多糖的每一种结合的本发明的截短pspa1；约0.2mg至约1mg的磷酸铝佐剂；和赋形剂。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种单次0.5ml剂量的肺炎球菌疫苗组合物，该单次剂量包含约2.2至4.4μg的一种或多种肺炎球菌多糖；约1μg至约30μg的与一种或多种肺炎球菌多糖中的每一种结合的本发明的截短pspa1；约1μg至约30μg的与一种或多种肺炎球菌多糖中的每一种结合的crm197；约0.2mg至约1mg的磷酸铝佐剂；和赋形剂。

在另一个实施方式中，本发明还提供了通过施用将通过将本发明的截短pspa1与肺炎球菌多糖结合而制备的结合疫苗，来预防由肺炎链球菌引起的侵袭性疾病的疫苗。

实施例

提供以下实施例以例示本发明，仅用于说明目的，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：截短pspa1在谷氨酸棒杆菌中的重组表达。

pbe31c的构建

使用具有2.692kbpng2orir序列的合成质粒，产生小稳定复制的广宿主范围质粒pbe30。使用该质粒dna作为模板，使用引物pep-fl(5’-gcgcggactagtagatctatggtaaatctgcgcagacag-3’)和pep-rl(5’-gcgcggactagtgaattcggtgaggttatggcg-3’)扩增1.8kborir区域。

同时，使用puc4-kixx模板dna和kan-f2(5’-aaggtcccgggatggcgatagctagactgggcggt-3’)和kan-r2(5’-aaggtcccgggggttgggcgtcgcttggtcgg-3’)引物扩增1.033kbkanr序列。将kanr基因扩增子和orir扩增子二者平端连接以产生pbe30载体。此外，使用各自附有spei限制酶切位点的ptac-fl(5’-ggagcactagtctgaaatgagctgttgacaattaatc-3’)和ptac-rl(5’-ggagcactagttttaaacatgagcggatacatatttgaa-3’)引物扩增包含串联的taclacuv5启动子、多克隆位点、lacza组分和trrnb终止子序列的0.851kb表达盒。用于扩增表达盒的模板dna是pmmb206(atcc37808)。之后，将表达盒克隆到在pbe30质粒中设计的唯一spei位点。如此获得的质粒称为pbe31c(图1a；seqidno:14)。

pbe117的构建

从肺炎链球菌的23f荚膜血清型连同上游区域扩增截短pspal基因(n末端区域以及脯氨酸丰富区域，图1b)。使用引物pspaf1_fp(5’atgaataagaaaaaaatgattttaacaagtctagcc3’)和pspaf1_rp(5’cgagagagatctaaattaaaatgtcaaatgttcttaacatgctttaatttttattttggtgc3’)将其克隆到ta载体(来自fermentas的ptz57r/t)中并序列验证。这被指定为ptz-pspal。天然终止子序列包括在反向引物pspaf1_rp中。将进化枝限定区域映射到获得的截短pspa1序列中，以证实其属于pspa蛋白的家族1。

为了在谷氨酸棒杆菌中表达截短pspa1，选择ptac启动子(seqidno:2)和属于棒杆菌属的磷酸丙糖异构酶基因(seqidno:7)的核糖体结合位点(rbs)，使用引物-sdticgr0949_fp5(5’gagcgatggatcctagaaaggtgtgtttcacccatgaataagaaaaa3’)和pspa2_2rp(5’tcaaatgttcttaacatgctttaatttttatggtgcaggagctggttg3’)和ptz-pspa1作为模板扩增pspa1基因以及包括rbs的完整盒、天然信号肽(seqidno:8)、截短pspal基因、天然终止子(seqidno:10)。rbs包含在正向引物sdticgr0949_fp5中。rrnb终止子(seqidno:13)从内部可得到的pbe31c中扩增区域，并使用通过重叠延伸(soe)pcr剪接连接至编码截短pspa1的基因。使用terfp2(5’atgttaagaacatttgacattttaatttcggcactggccgtcgtt3’)和terrp3(5’gcgatatggatcccatgagcggataca3’)扩增rrnb基因。设计pspa22rp和terfp2使得有17个碱基的重叠。扩增子pspa1和rrnb以1:1的摩尔比添加，并用作带有引物sdticgr0949_fp5(5’gagcgatggatcctagaaaggtgtgtttcacccatgaataagaaaaa3’)和ter_rp3(5’gcgatatggatcccatgagcggataca3’)的soepcr的模板。随后，用附加在正向(sdticgr0949_fp5)和反向引物(ter_rp3)上的限制性内切酶消化包括rbs的整个扩增子、天然信号肽(seqidno:8)、截短pspal基因、天然终止子(seqidno:8)、rrnb终止子，并克隆到为棒杆菌属制备的表达载体pbe31c中。将所得克隆命名为表达构建体pbeh7(图1c；seqidno:15)。下文将表达载体以及截短pspa1一起称为表达构建体。通过pcr分析确认插入物的方向(图1d)。通过dna测序确认截短pspa1基因的序列及其表达盒。

截短pspa1的表达

将表达构建体电穿孔到谷氨酸棒杆菌atcc13032中，并在卡那霉素作为选择标记的lb平板上选择。挑选二十个重组谷氨酸棒杆菌菌落，并通过pcr进行分析。选择五个菌落用于截短pspa1的组成型表达。将重组菌落以及谷氨酸棒杆菌atcc13032(作为阴性对照)一起接种到具有25μg/ml终浓度的卡那霉素的10ml的非常丰富的培养基中，并在35℃下伴随在200rpm下摇动进行孵化。在16小时后，在10ml的上述相同培养基中进行二次接种，使得最终od为0.1。伴随在200rpm下振荡将培养物在35℃下孵化18-20h。在18小时后，检查培养物上清液中截短pspa1的表达。将30μl的上清液加载到12％的sds-page上并分析截短pspa1表达。在约45kda观察到一个突出的带。

使用n末端表位特异性pspa多克隆抗体(santacruz)进行的western分析确认截短pspa1的表达。将重组克隆5的表达分析放大至500ml，并确认截短pspa1的表达至少3次。最初使用1型cht从摇瓶实验中纯化截短pspa1，且captoqimpress达到接近99％的纯度。随后，在确认截短pspa1在谷氨酸棒杆菌中的一致表达后，该表达被放大至1.5l。

截短pspal的纯化和验证

将从上游获得的含有1.6l(0.66mg/ml)的截短pspa1的800ml培养上清液透析至10kda，并浓缩至260ml(1.92mg/ml)。使用1型cht和captoqimpress对70ml的这种透析浓缩物进行纯化。截短pspa1的最终回收率为162mg/l。

含有来自sds-page的纯化的截短pspa1的凝胶塞的maldims/ms分析给出肺炎球菌表面蛋白a的明确的命中得分为233。具有ncbi蛋白idaby67187.1的pspa蛋白显示31％(图2)的序列覆盖率。完整的分子量分析表明，表达的截短pspa1的分子量为35.4kda。该质量与截短的pspal的理论分子量匹配。17725.4处的峰是电荷为2的分子的峰，因此在m/z中，该峰出现在截短pspa1完整质量的一半处。(图3)

实施例2：截短pspa1的生产

从lb培养基中的来源库中再生具有包含截短pspa1(以下称为pspa1)基因的表达构建体的谷氨酸棒杆菌atcc13032。将其用于接种发酵罐(5l；cstr)。生产过程期间监控的参数为ph、do、温度(△t)、碳源、代谢物。采用基于过程自动化技术(pat)的补料策略来进行截短pspa1发酵的短补料分批。没有产物(截短pspa1)的基于诱导的控制，因为这是生长相关的产物。在半合成培养基中收获时，收获的od为约90(od6oonm)。收集细胞并用pbs洗涤，然后在弗氏压碎器中破坏细胞。

截短pspal的纯化

从20l的发酵批次中收集16.2l的废培养基、总蛋白质浓度为0.8mg/ml。通过使用10kda0.5m²盒将16.2l的废培养基浓缩至2.6l(3.6mg/ml)，然后对20mm的磷酸钾ph-6.8进行dia过滤，浓度为3.2ms/cm。将该2.6l分成两批次，即具有1.4l的批次1和具有1.2l的批次2，并进行进一步纯化。在hiscale50/40色谱柱中填充500ml的chti树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用8个柱体积(cv)的20mm磷酸钾ph-6.8(缓冲液a)平衡。将1400ml(3.6mg/ml)的废培养基浓缩液(批次1)上样至色谱柱，并收集流过液。用5倍柱体积的缓冲液a洗涤柱。使用250mm的磷酸钾ph-6.8(缓冲液b)以阶梯梯度洗脱pspa1。阶梯梯度涉及5cv的步骤-40％b，5cv的步骤-80％b和3cv的0.5m的磷酸钾缓冲液。在整个运行过程中，流速保持在80ml/min。在步骤-80％b的级分1中收集pspa1，级分体积为1250ml。(图4)

captoqimpress用作pspa1纯化的第二色谱步骤。在xk50/20色谱柱中填充250ml的captoqimpress树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用5个柱体积(cv)的20mm磷酸钾和100mm的nacl，ph-6.8(缓冲液a)平衡。用20mm的磷酸钾(ph-6.8)将1250ml的chti级分稀释至2300ml，上样到色谱柱上并收集流过液。用5倍柱体积的缓冲液a洗涤色谱柱。用12cv的缓冲液b(20mm的磷酸钾和1m的nacl，ph-6.2)以0-40％b的线性梯度洗脱pspa1，最后一步为3cv的100％b。收集250ml的每个级分。流速保持在40ml/min。以40％b的线性梯度收集pspal，合并级分体积为1250ml。(图5)

合并4、5、6、7和8的captoq级分，用20mm的ph-6.8的磷酸钾浓缩/渗滤。从批次1获得的最终回收物为100ml的pspal，浓度为15.5mg/ml的蛋白质(总pspal为1550mg)。批次2遵循类似的过程，获得的最终回收率为70ml的pspal，批次2的浓度为16mg/ml(总pspal为1120mg)。来自批次1和批次2的纯化的pspal为2670mg的来自16.2l批次(纯化的pspa1产量为164mg/l)。(图6)

实施例3：pbe114k的构建

表达载体prseta(来自invitrogen的商业载体)通过使用dral限制性消化去除氨苄青霉素抗性基因并与smal消化的卡那霉素编码基因(从puc4kixx获得)连接而被修饰。将该修饰的载体命名为prset-km。截短pspa1在prset-km的pt7启动子(seqidno:11)下在大肠杆菌中表达。含有天然终止子的短dna片段被包括在用于进一步扩增pspa1的反向引物中。随后，扩增完整的截短pspa基因及其天然终止子，用附加在正向和反向引物中的限制酶消化，并克隆到prset-km载体中。所得克隆命名为pbeh4k(图10a)。下文将表达载体以及截短pspa1一起称为表达构建体。通过限制性消化确认表达构建体pbeh4k(图10b)。通过dna测序确认截短pspa1基因的序列及其表达盒。

截短pspa1的表达

将pbeh4k转化到大肠杆菌dh5α-t1r化学感受态细胞(购自invitrogen)中，并在卡那霉素作为选择标记的lb平板上进行选择。挑选40个重组大肠杆菌菌落并通过pcr进行分析。选择所有40个菌落用于截短pspa1的诱导表达。将重组菌落与大肠杆菌(作为阴性对照)一起接种到具有25μg/ml终浓度的卡那霉素的10ml的非常丰富的培养基中，并在37℃下伴随在200rpm下摇动进行孵化。在对数中期，加入1mmiptg以诱导pspa1在大肠杆菌(pbel14k)中的表达。诱导后，将培养物在30℃下以200rpm振荡孵化16小时。在16小时后，检查培养物上清液中截短pspa1的表达。通过离心收集细胞，裂解并上样到12％sds-page上，并分析截短pspa1表达。在约65kda观察到一个突出的带。使用n末端表位特异性pspa多克隆抗体(santacruz)进行的western分析确认截短pspal的表达。确认重组克隆29的表达分析用于表达截短pspa1至少3次。最初使用1型cht和captoqimpress从摇瓶实验中纯化截短pspa1。

截短pspal的纯化和验证

取40克(湿重)的来自大肠杆菌(pbeh4k)的细胞团块，并将其重新悬浮于400ml的含1mg/ml溶菌酶和1mm的pmsf的20mm的磷酸钾缓冲液ph-6.8中。使用高压匀浆器在1000psi下裂解细胞悬液3次。用20mm的磷酸钾缓冲液ph-6.8将400ml的总蛋白浓度为4mg/ml的细胞裂解液稀释至750ml，并使用chti树脂纯化，然后captoqimpress作为第二色谱法纯化。

在hiscale50/20色谱柱中填充250ml的chti树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用5倍柱体积(cv)的缓冲液a平衡。将750ml的稀释的细胞裂解液上样至柱中并收集流过液。用5倍柱体积的缓冲液a洗涤柱。使用250mm的磷酸钾ph-6.8，cond-29.5ms/cm(缓冲液b)以阶梯梯度洗脱pspa1。阶梯梯度涉及5cv的步骤-50％缓冲液b，5cv的步骤-80％缓冲液b并将色谱柱用3cv的0.5m磷酸钾缓冲液ph-6.8，cond-48ms/cm(缓冲液c)洗脱。在整个运行过程中，流速保持在40ml/min。手动收集pspa1蛋白的峰级分，步骤-80％b的5、6和7的洗脱级分合并，最终体积为350ml(图11)。

captoqimpress用作pspa1纯化的第二色谱步骤。在xk26/20色谱柱中填充60ml的captoqimpress树脂。树脂用无菌蒸馏水洗涤，然后用5个柱体积(cv)的20mm磷酸钾和100mm的nacl，ph-6.8，con-13.6ms/cm(缓冲液a)平衡。用lmm的磷酸钾(ph-6.8)将350ml的chti级分稀释至700ml，上样到色谱柱上并收集流过液。用5个柱体积的缓冲液a洗涤色谱柱。使用线性梯度10cv的缓冲液b(20mm的磷酸钾和1mnacl，ph-6.2，cond-89ms/cm)以0至40％的线性梯度洗脱pspa1。手动收集b级分，级分4至8、10和11为60ml，且9和12为100ml级分(图12)。收集最终步骤的3cv的100％b，收集180ml作为级分13。流速维持在10ml/min。收集pspa1蛋白，其中线性梯度为40％的级分9为100ml。

收集9的captoq级分，用20mm的磷酸钾ph-6.8浓缩/渗滤。获得的最终回收率是来自浓度为4mg/ml的400ml的细胞裂解物的100ml的pspal，浓度为5mg/ml的蛋白质(总pspa1蛋白为500mg)。回收率％是31.25。

含有来自sds-page的纯化的截短pspa1的凝胶塞的maldims/ms分析给出肺炎球菌表面蛋白a的明确的命中得分为223。具有ncbi蛋白idwp050210652.1的pspa蛋白显示39％(图13)的序列覆盖率。

完整的分子量分析表明，表达的截短pspa1的分子量为41.96kda。在大肠杆菌中表达的截短pspa1的完整质量分析显示41966da(41.9kda)，与截短pspa1的理论分子量相符。20982.7da处的峰是电荷为2的分子的峰，因此在m/z中，该峰出现在截短pspa1完整质量的一半处。(图14)。

实施例4：单独的肺炎球菌多糖与载体蛋白的结合以形成多糖截短pspal结合物

血清型3的活化和与截短pspa1结合

在玻璃小瓶中混合约1:1比例的调整尺寸的血清型3(6.0mf的ps，浓度为10mg/mf)和cdap(乙腈中的100mg/mf(w/v))并搅拌1分钟。用0.2m三乙胺将肺炎球菌多糖血清型3的ph调节至9.25，并在室温(rt)下搅拌3分钟。将截短pspa1(4.0mf的浓度15.0mg/mf)以1:1的比例添加到活化的血清型3中(截短pspal：血清型3)。

用0.2m的三乙胺将反应的ph调节至约9.05，并在室温下在搅拌下继续反应5小时，最后通过加入过量浓度的甘氨酸使反应淬灭。

使用100kda的mwco膜对反应混合物进行渗滤，并通过尺寸排阻色谱法进行纯化，其中实线表示多糖，虚线表示截短pspal，且五小时反应用色谱图a中的虚线表示(图7)。通过sec-maffs蒽酮方法分析级分，合并包含结合物的级分，并用0.2μ过滤器无菌过滤。从现在开始，这种材料被称为单价结合物本体(血清型3-截短pspal结合物)。

血清型6a的活化和与截短pspa1结合

在玻璃小瓶中混合约1:1比例的调整尺寸的血清型6a(6.0mf的ps，浓度为10mg/mf)和cdap(乙腈中的100mg/mf(w/v))并搅拌1分钟。用0.2m的三乙胺将肺炎球菌多糖血清型6a的ph调节至9.25，并在室温(rt)下搅拌3分钟。将截短pspa1(4.0mf的浓度15.0mg/mf)以1:1的比例添加到活化的血清型6a中(截短pspal：血清型6a)。

用0.2m的三乙胺将反应的ph调节至约9.05，并在室温下在搅拌下继续反应5小时，最后通过加入过量浓度的甘氨酸使反应淬灭。

使用100kda的mwco膜对反应混合物进行渗滤，并通过尺寸排阻色谱法进行纯化，其中实线表示多糖，虚线表示截短pspal，且五小时反应用色谱图b中的虚线表示(图7)。通过sec-malls蒽酮方法分析级分，合并包含结合物的级分，并用0.2μ过滤器无菌过滤。从现在开始，这种材料被称为单价结合物本体(血清型6a-截短pspal结合物)。血清型6b的活化和与截短pspa1结合

血清型6b的活化和与截短pspa1结合

在玻璃小瓶中混合约1:1比例的调整尺寸的血清型6b(6.0mf的ps，浓度为10mg/ml)和cdap(乙腈中的100mg/ml(w/v))并搅拌1分钟。用0.2m的三乙胺将肺炎球菌多糖血清型6b的ph调节至9.25，并在室温(rt)下搅拌3分钟。将截短pspa1(4.0ml的浓度15.0mg/ml)以1:1的比例添加到活化的血清型6b中(截短pspal：血清型6b)。

用0.2m的三乙胺将反应的ph调节至约9.05，并在室温下在搅拌下继续反应5小时，最后通过加入过量浓度的甘氨酸使反应淬灭。

使用100kda的mwco膜对反应混合物进行渗滤，并通过尺寸排阻色谱法进行纯化，其中实线表示多糖，虚线表示截短pspal，且五小时反应用色谱图c中的虚线表示(图7)。通过sec-malls蒽酮方法分析级分，合并包含结合物的级分，并用0.2μ过滤器无菌过滤。从现在开始，这种材料被称为单价结合物本体(血清型6b-截短pspal结合物)。

实施例5：结合疫苗的免疫原性研究

制备包含2.2μg或4.4μg的各自与截短pspa1结合的血清型3、6a和6b的两种制剂，包含2.2μg的各自与crm197结合的血清型1、4、5、7f、9v、14、18c、19a、19f、22f、23f和33f。这些结合物被吸附到铝水凝胶上。

将体重为1.5至2kg的兔子分成每组7只动物，并用上述结合物制剂免疫。在免疫之前和之后分析血清样品。在间接elisa中分析获自免疫兔子的血清中多糖特异性抗体的存在。

通过间接elisa评估免疫兔的血清抗体滴度。使涂覆有特定多糖的微量滴定板与血清抗体反应。在免疫前，第1次和第2次给药后的兔血清用于分析，其中y轴表示抗体滴度，使用最大稀释度的倒数得出，从而使elisaod450高于截止点。免疫前兔子的血清抗体滴度低于检测极限。空心条表示第一剂疫苗施用后的滴度，而黑色实心条表示第二剂疫苗后的抗体滴度(图8和9)。截短pspa1结合的血清型和crm197结合的血清型滴度均存在剂量依赖性的增加。截短pspa1结合物的存在没有抑制crm197结合的多糖的滴度，反之亦然。这表明截短pspa1可用作多糖蛋白结合疫苗的替代载体蛋白。

sequencelisting

<110>生物e有限公司

<120>肺炎球菌表面蛋白a的表达

<130>pspa1

<160>15

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<212>dna

<213>人工的

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<213>人工的

<220>

<223>杂合启动子

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<211>310

<212>prt

<213>肺炎链球菌

<400>3

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151015

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lysalaglugluglulyslysalaserglngluglnglnlysalaasn

505560

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65707580

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lysvalthrglualalysglnlysleuaspalagluargalalysglu

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165170175

leugluthrlysleulysgluileaspgluseraspsergluasptyr

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<210>4

<211>369

<212>prt

<213>肺炎链球菌

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202530

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354045

lysalaglugluglulyslysalaserglngluglnglnlysalaasn

505560

leuasptyrglnglnlysleuarglystyrileasnglulysaspser

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859095

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100105110

proseralaglugluleuthrgluthrargarglysalaglugluala

115120125

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130135140

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145150155160

valalaleuglnalalysilealagluleugluasngluvalhisarg

165170175

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180185190

vallysgluglyleuargalaproleuglnsergluleuaspalalys

195200205

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210215220

leuaspalagluilealalysleuglulysaspvalgluaspphelys

225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

proalaproglualaproalagluglnprolysproalaproalapro

290295300

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305310315320

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340345350

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355360365

lys

<210>5

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<212>dna

<213>肺炎链球菌

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<210>6

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<212>dna

<213>肺炎链球菌

<400>6

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<213>肺炎链球菌

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<213>肺炎链球菌

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<213>人工的

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<213>白喉棒杆菌

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