包含合成嵌合痘苗病毒的干细胞及其使用方法与流程

包含合成嵌合痘苗病毒的干细胞及其使用方法
发明背景
[0001]
与本申请相关联的序列表通过efs-web以文本格式电子提交，并且通过引用将其全部内容并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为 104545-0032-wo1-sequencelisting.txt。文本文件创建于2019年5月2日，大小为882,663字节。
[0002]
痘病毒(痘病毒科(poxviridae)的成员)是可以感染人和动物两者的双链dna病毒。痘病毒基于宿主范围分为两个亚科。感染脊椎动物宿主的脊椎动物痘病毒(chordopoxviridae)亚科由8个属组成，已知其中有4个属 (正痘病毒属(orthopoxvirus)、副痘病毒属(parapoxvirus)、软疣痘病毒属 (molluscipoxvirus)和亚塔痘病毒属(yatapoxvirus))感染人。天花是由正痘病毒属(opv)的成员天花病毒(varv)感染引起的。opv属包括许多遗传上相关且形态上相同的病毒，包括骆驼痘病毒(cmlv)、牛痘病毒(cpxv)、鼠痘病毒(ectv，“鼠痘剂(mousepox agent)”)、马痘病毒(hpxv)、猴痘病毒(mpxv)、兔痘病毒(rpxv)、浣熊痘病毒(raccoonpox virus)、臭鼬痘病毒(skunkpox virus)、沙鼠痘病毒(taterapox virus)、瓦辛吉舒病病毒(uasingishu disease virus)、痘苗病毒(vacv)、天花病毒(varv)和田鼠痘病毒 (vpv)。除varv外，已知至少有三种其他opv(包括vacv、mpxv和 cpxv)感染人。
[0003]
在寻找能够消除或减少肿瘤细胞的治疗剂的过程中，溶瘤病毒在临床前研究中显示出巨大的潜力。这些病毒通常是经过基因工程改造或对肿瘤细胞具有天然嗜性，以便仅在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞。在治疗性病毒中，溶瘤痘苗病毒是癌症疗法最有前途的候选药物之一。例如，jx-594是带有tk 基因缺失和gm-csf(一种能够刺激免疫系统杀死肿瘤细胞的细胞因子)基因插入的痘苗病毒，目前正在进行iii期试验(park sh等，phase 1b trial ofbiweekly intravenous pexa-vec(jx-594),an oncolytic and immunotherapeutic vaccinia virus in colorectal cancer.mol ther(2015)；23(9)：1532
–
40)。
[0004]
为了改善病毒治疗剂的递送和规避抗病毒免疫性，许多研究已经探索了使用受感染的细胞作为溶瘤病毒的递送媒介物的可能性(garcia-castro， j.等，treatment of metastatic neuroblastoma with systemic oncolytic virotherapydelivered by autologous mesenchymal stem cells:an exploratory study.cancergene ther，2010.17(7)：476-83；coukos，g.等，use of carrier cells to delivera replication-selective herpes simplex virus-1mutant for the intraperitoneal therapy of epithelial ovarian cancer.clin cancer res,1999.5(6)：1523-37；komarova， s.等，mesenchymal progenitor cells as cellular vehicles for delivery of oncolyticadenoviruses.mol cancer ther,2006.5(3)：755-66)。间充质干细胞在这方面已显示出巨大的希望。
[0005]
尽管有希望，但是这些研究由于它们无法探索负载溶瘤病毒的间充质干细胞的治疗功效而受到限制。另外，在接受干细胞疗法的受试者中，细胞疗法如干细胞的施用已与恶性癌症的形成相关。尽管细胞疗法在疾病、病症和损伤的治疗中的潜力是巨大的，但是由于
这种治疗而形成的肿瘤，例如畸胎瘤，是不可接受的结果。
[0006]
因此，需要递送溶瘤病毒和安全地施用细胞组合物的方法，所述方法降低接受细胞疗法的受试者中肿瘤形成的风险。发明概述
[0007]
一方面，本发明提供了包含合成的嵌合痘病毒(scpv)的干细胞，其可以用于癌症或其他传染病的治疗。因为化学基因组合成不依赖于天然模板，所以病毒基因组的过多结构和功能修饰都是可能的。当天然模板无法通过常规分子生物学方法进行基因复制或修饰时，化学基因组合成特别有用。
[0008]
因此，在一方面，本发明涉及分离的干细胞或其群体，其包含合成的嵌合痘病毒(scpv)，其中病毒从合成dna衍生的dna复制并再激活，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组的特征在于一个或多个修饰。
[0009]
在另一方面，本发明涉及药物组合物，包含本发明的分离的干细胞和药学上可接受的载体。
[0010]
在另一方面，本发明涉及用于将本发明的scpv递送至受试者的方法，包括感染本发明的干细胞并将scpv感染的干细胞施用至受试者。
[0011]
在另一方面，本发明涉及治疗或预防受试者的癌症的方法，包括向受试者施用本发明的干细胞或本发明的药物组合物，从而使受试者的癌细胞与 scpv接触。
[0012]
在另一方面，本发明涉及治疗天花病毒感染的方法，包括向有此需要的受试者施用本发明的干细胞或本发明的药物组合物。附图简述
[0013]
本专利申请包含至少一个彩色绘制的附图。专利局将根据要求并支付必要的费用后，提供带有彩色附图的本专利申请的副本。
[0014]
当结合附图阅读时，将更好地理解前述概述以及本公开的以下详细描述。出于示例说明本发明多个方面的目的，在附图中示出了目前优选的一个或多个实施方案。然而，应该理解，本发明不限于所示的精确排列和手段。
[0015]
图1a和1b.线性dsdna hpxv基因组(株mnr；genbank登录号dq792504)的示意图。a.图1a示例说明hpxv基因组的未修饰基因组序列，指示了分别的hpxv基因(紫色)和天然存在的aari和bsai位点。b. 图1b描绘使用重叠的基因组dna片段(以红色显示的)化学合成的经修饰的合成嵌合hpxv(schpxv)基因组。还显示了用于将vacv末端发夹环连接至itr上的工程化的sapi限制性位点以及左侧和右侧itr片段中的未修饰的bsai位点。sapi位点在质粒载体位点中分别位于紧接左侧反向末端重复 (litr)和右侧反向末端重复(ritr)的左端和右端。
[0016]
图2a-2c.经修饰的schpxv yfp-gpt::095基因组和vacv(wr株) 末端发夹环的详细示意图。a.图2a描绘了经修饰的schpxv yfp-gpt::095基因组。未修饰的bsai位点在基因组上显示为蓝线。在hpxv044(vacv f4l 同源物)中生成的新型avai和stui限制性位点也被标记(绿线)。还显示了可选择标志物黄色荧光蛋白/鸟苷磷酸核糖基转移酶(yfp/gpt)在frag_3的 hpxv095基因座(vacv j2r同源物)中的位置(黄色)。b.图2b描绘了末端发夹环的s(seqid no:11)和f(seq id no:12)形式的核苷酸序列，并且在(c)中解释了颜色编码。c.图2c描绘了末端发夹环的f和s形式(分别是seq id no:12和11)的二级结构预测，所述末端
发夹环共价附着至vacv 的线性dsdna基因组的末端。末端环序列以绿色突出显示。串联体解离序列用红色框表示。
[0017]
图3.～70bp vacv末端发夹连接到左侧和右侧hpxv itr片段。图3描绘了将～70bp末端发夹连接到用sapi切割的1472bp itr片段后左侧和右侧itr片段的琼脂糖凝胶电泳。随后用pvuii切割连接的dna，以便于检测由于添加发夹而引起的小的尺寸变化。
[0018]
图4a-4b .schpxv yfp-gpt::095基因组的pcr分析和限制性消化证实schpxv yfp-gpt::095的成功再激活。a.图4a描绘了vacv-wr和 schpxv yfp-gpt::095基因组dna的脉冲场凝胶电泳(pfge)。病毒dna用 bsai、hindiii消化或不处理，然后在1％seakem金琼脂糖凝胶上于14℃以 5.7v/cm分离14小时，切换时间为1至10秒。观察到完整vacv与schpxvyfp-gpt::095基因组之间的大小的略微差异。标有星号(*)的微弱条带或者为不完整的dna消化产物，或者可以是经常污染vacv病毒体制备物的切割的线粒体dna片段。b.图4b描绘了用bsai或hindiii消化的vacv-wr和 schpxvyfp-gpt::095基因组dna的常规琼脂糖凝胶电泳。通过用sybrgolddna染料对凝胶进行染色来使dna片段可视化。
[0019]
图5a-5c.schpxv yfp-gpt::095区域96,050至96,500中的bsai位点被正确突变。图5a描绘了被定位至hpxv(dq792504)基因组的一个区域的illumina序列读段。仅显示了一小部分读段。位置96,239和位置96437 处的测序读段的不一致分别以蓝色和黄色突出显示。图5b描绘了来自被定位至hpxv(dq792504)的位置96239附近的schpxv yfp-gpt::095的illumina 测序读段的放大图。检测到核苷酸取代(t96239c)(参见表2)。附图按出现顺序分别公开了seq id no 68-70、69、71、72、69、73-76、69、77-79、69、 69、80、81、69、82、69、83、69、84、69、84、85、69、69、86、69、69、 87、69、69、69、69、88、69、69、69、89和90。图5c描绘了来自被定位至hpxv(dq792504)的位置96437的schpxv yfp-gpt::095的illumina测序读段的放大图。检测到核苷酸取代(a96437c)(参见表2)。将这些突变引入用于组装schpxvyfp-gpt::095的克隆中，以便删除不需要的bsai识别位点 (ggtctc)。附图按出现顺序分别公开了seq id no 91-94、92、95、92、 92、92、96、92、97、98、92、92、92、92、92、99-101、92、102、103、92、 104-109、92、110、92、92、111、103、112、92、113、114、92、92、115和 116。
[0020]
图6a-6c.schpxv yfp-gpt::095像其他正痘病毒一样生长，但在 bsc-40细胞中表现出小的噬斑表型。a.图6a示例说明bsc-40细胞系(左上图)、hela细胞系(顶部中间图)、原代hel细胞系(右上图)和vero细胞系(左下图)中vacv-wr、dpp15、cpxv和schpxv yfp-gpt::095的多步骤生长。b.图6b示例说明vacv-wr、dpp15、cpxv与schpxvyfp-gpt::095之间的噬斑大小比较。用指定的病毒感染bsc-40细胞并在感染后48小时固定细胞并染色。在3个独立实验中对每种病毒测量24个噬斑的面积(以任意单位[a.u.]表示)。数据表示为平均噬斑直径。**，p<0.01；****， p<0.0001。c.图6c描绘了用指定病毒感染72小时的bsc-40细胞的噬斑形态。将细胞固定、染色并扫描以可视化。
[0021]
图7.向小鼠施用各种组合物和剂量后随时间的重量损失％的图示。所描绘的数据从5只雌性balb/c小鼠的组生成，所述小鼠用于10μl pbs中指定剂量的schpxv yfp-gpt::095(也称为schpxv(δhpxv_095/j2r)或 schpxv(yfp/gpt))、schpxv(wt)、dryvax dpp15或vacv wr接种。每天称重小鼠，持续28天，对任何失去>25％的它们的初始重量的小鼠进行安乐死。数据点代表平均得分，误差条代表标准偏差。
[0022]
图8a和8b.向小鼠施用各种组合物和剂量后随时间的重量损失％的图示。从先前
antibodies:a laboratory manual，cold spring harbor laboratorypress，cold spring harbor，ny(1998)；coligan等，short protocols in proteinscience，john wiley&sons，ny(2003)；short protocols in molecular biology (wiley and sons,1999)。
[0034]
根据制造商的说明书执行酶促反应和纯化技术，如本领域通常实现的或如本文所述的。与本文所述的分析化学、生物化学、免疫学、分子生物学、合成有机化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及其实验室程序和技术是本领域公知的和常用的那些命名法以及实验室程序和技术。标准技术用于化学合成和化学分析。
[0035]
在整个说明书和实施方案中，词语“包含”或诸如“含有”或“包括”的变化形式将被理解为暗示包括所述整数或整数组但不排除任何其他整数或整数组。
[0036]
应当理解，在本文中使用语言“包含”描述实施方案的任何地方，还提供了以“由...组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似实施方案。
[0037]
术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
[0038]
术语“例如”或“诸如”之后的任何实例并不意味着穷举或限制。
[0039]
除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
[0040]
本文中使用冠词“一个”、“一种”和“该”是指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。本文中对“约”值或参数的引用包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约x”的描述包括“x”的描述。数字范围包括定义该范围的数字。
[0041]
尽管阐明本申请广泛范围的数字范围和参量是近似值，但具体实例中阐述的数值应尽可能予以精确报道。然而，任何数值固有地包含必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差带来的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为包括其中包含的任何和所有子范围。例如，“1-10”的所述范围应被视为包括最小值1与最大值10之间的任何和所有子范围(并且包括1和10)；也就是说，所有子范围以最小值1或更大开始，例如1到6.1，并以最大值10 或更小结束，例如5.5到10。
[0042]
本文描述了示例性方法和材料，尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试。材料、方法和实施例仅是说明性的而非限制性的。定义除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
[0043]
如本文中所用，术语“野生型病毒”、“野生型基因组”、“野生型蛋白质”或“野生型核酸”是指在某群体(例如，特定的病毒种等)中天然存在的氨基酸或核酸的序列。
[0044]
术语“嵌合的”或“工程化的”或“经修饰的”(例如，嵌合痘病毒、工程化多肽、经修饰的多肽、工程化核酸、经修饰的核酸)或其语法变化形式在本文中可互换使用，以指已被操作而相对于天然序列具有一个或多个变化的非天然序列。
[0045]
如本文中所用，“合成病毒”是指最初衍生自合成dna(例如化学合成的dna、pcr扩增的dna、工程化dna、包含核苷类似物的多核苷酸等，或其组合)的病毒并且包括其后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，后代可能不一定与原始的亲本合成病毒完全相同(在形态学上或在基因组 dna互补物中)。在一些实施方案中，合成病毒是指其中基本上全部的病毒基因组最初衍生自化学合成的dna(例如化学合成的dna、pcr扩增的dna、工程化的dna、
包含核苷类似物的多核苷酸等，或其组合)的病毒。在优选的实施方案中，合成病毒衍生自化学合成的dna。
[0046]
如本文其他地方所概述的，可以改变病毒基因组的某些位置。本文中使用的“位置”是指基因组序列中的位置。通常通过与其他亲本序列比对来确定相应的位置。
[0047]
如本文所用，在多肽的上下文中，术语“残基”是指线性多肽链中的氨基酸单元。它是在从α-氨基酸(即nh2-chr-cooh)形成多肽时除去水之后，每个氨基酸所剩下的，即-nh-chr-c-。
[0048]
如本领域中已知的，本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸链，且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或可以通过dna或 rna聚合酶掺入链中的任何底物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，可以在链组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记组分缀合。其他类型的修饰包括例如“帽”，类似物对一个或多个天然存在的核苷酸的取代；核苷酸间修饰如例如具有不带电荷的键联(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨甲酸酯等)和带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些；含有侧挂部分如例如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-l-赖氨酸等)的那些；具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些；含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些；含有烷基化剂的那些；具有经修饰的键联(例如，α异头核酸等)的那些；以及一个或多个多核苷酸的未修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基可以被例如膦酸根基团、磷酸根基团替代，被标准保护基团保护，或被激活以制备对另外的核苷酸的另外的键联，或者可以与固体支持物缀合。5'和3'末端oh可以被磷酸化或者被胺或1-20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其他羟基也可被衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2'-o-甲基-、2'-o-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-或β-异头糖、差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环状类似物和无碱基核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键联可以被备选的连接基团替代。这些备选的连接基团包括但不限于，其中磷酸酯被p(o)s(“硫代物”)、p(s)s(“二硫代物”)、(o)nr
2
(“酰胺酯”)、p(o)r、p(o)or'、co或ch
2
(“甲缩醛”)替代的实施方案，其中每个r或r'独立地是h或者取代的或未取代的烷基(1-20c)，任选地包含醚(-o-)键联、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有键联都必须相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。
[0049]
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指具有任何长度的氨基酸链。链可以是直链或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸中断。该术语还包括已被天然修饰或通过干预而修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分的缀合。定义中还包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应理解，多肽可以作为单链或缔合链存在。
[0050]“同源”以其所有语法形式和拼写变化形式指具有“共同进化起源”的两种蛋白质(包括来自生物体的相同物种的超家族的蛋白质以及来自生物体的不同物种的同源蛋白质)之间的关系。此类蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，如其序列相似性(无论是根
据同一性百分比还是通过特定残基或基序和保守位置的存在)所反映的。“同源”也是指对病毒是天然的核酸。
[0051]
然而，在通常的用法和本申请中，术语“同源的”当用诸如“高度”的副词修饰时，可以指序列相似性并且可以与或可以不与共同的进化起源相关。
[0052]“异源的”以其所有的语法形式和拼写变化可以指对病毒是非天然的dna。它是指衍生自与描述为相对异源的dna的生物体的dna不同的物种或不同的株。在非限制性实例中，scpv的病毒基因组包含异源末端发夹环。所述异源末端发夹环可以衍生自不同的病毒种类或不同的病毒株。
[0053]
术语“序列相似性”以其所有语法形式指核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度，其可以共享或可以不共享共同的进化起源。
[0054]
相对于参照多肽(或核苷酸)序列的“百分比(％)序列同一性”或“与
…
相同的序列％”被定义为在比对序列并引入缺口(如有必要)以实现最大的序列同一性百分比后，并且在不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分的情况下，候选序列中与参照多肽(核苷酸)序列中的氨基酸残基(或核酸) 相同的氨基酸残基(或核酸)的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件(诸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件)来实现。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
[0055]
如本文中所用，“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的一个或多个载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组dna互补物方面)。宿主细胞包括用本公开内容的核酸体内转染和/或转化的细胞。
[0056]
如本文中所用，“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送，并且优选表达一个或多个目标基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体，裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体，包封在脂质体中的dna或rna表达载体，以及某些真核细胞，诸如生产者细胞。
[0057]
如本文中所用，“分离的分子”(其中该分子是例如多肽、多核苷酸或其片段)是就其起源或衍生源而言(1)不与在其天然状态中伴随其的一种或多种天然存在的组分相关联，(2)基本上不含来自相同物种的一种或多种其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界的分子。因此，化学合成的或在与其所天然源自的细胞不同的细胞系统中表达的分子将与其天然关联的一种或许多组分是“分离”的。还可使用本领域熟知的纯化技术通过分离使分子基本上没有一种或许多天然关联的组分。可通过本领域熟知的许多手段测定分子纯度或同质性。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用本领域熟知的技术对凝胶进行染色以使多肽可视化来测定多肽样品的纯度。出于某些目的，可通过使用hplc或本领域熟知的用于纯化的其他手段来提供更高的分辨率。
[0058]
如本文中所用，术语“分离的”在病毒的上下文中是指源自单一亲本病毒的病毒。可使用本领域技术人员已知的常规方法(包括但不限于基于噬斑纯化和有限稀释的那些方法)分离病毒。
[0059]
如本文中所用，短语“感染复数”或“moi”是每个受感染细胞的平均病毒数。通过将
加入的病毒数(加入的ml
×
噬斑形成单位(pfu))除以加入的细胞数(加入的ml
×
细胞/ml)来确定moi。
[0060]
如本文中所用，“纯化”及其语法变化形式是指从含有多肽和一种或多种杂质的混合物中去除(无论是完全地还是部分地)至少一种杂质，从而提高组合物中的多肽的纯度水平(即，通过减少组合物中一种或多种杂质的量(ppm))。如本文中所用，在病毒的上下文中“纯化的”是指基本上没有来自病毒所衍生自的细胞或组织来源的细胞物质和培养基的病毒。术语“基本上没有细胞物质”包括病毒的制备物，其中所述病毒与从中分离或从其重组产生的细胞的细胞组分分离。因此，基本上没有细胞物质的病毒包括具有少于约30％、 20％、10％或5％(按干重计)的细胞蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”) 的蛋白质制备物。病毒也基本上没有培养基，即培养基占病毒制备物体积的小于约20％、10％或5％。可使用本领域技术人员已知的常规方法(包括但不限于色谱法和离心)纯化病毒。
[0061]
如本文中所用，“基本上纯的”是指至少50％纯的(即，不含污染物)，更优选地至少90％纯的，更优选地至少95％纯的，还更优选地至少98％纯的，和最优选地至少99％纯的材料。
[0062]
术语“患者”、“受试者”或“个体”在本文中可互换使用并且指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，诸如人、灵长类动物、家畜动物(包括牛、猪、骆驼等)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
[0063]
如本文中所用，术语“预防”、“阻止”和“防止”是指作为疗法(预防剂或治疗剂)施用的结果而延缓受试者的疾病的复发或发作，或者减少受试者的疾病(例如，痘病毒感染)的一个或多个症状。例如，在针对感染向受试者施用疗法的情况下，“预防”、“阻止”和“防止”是指作为疗法(例如，预防剂或治疗剂)施用或疗法组合(例如，预防剂或治疗剂的组合)的施用的结果而抑制或减少受试者的感染(例如，痘病毒感染或与其相关的病况)的发展或发作，或者防止受试者的感染(例如，痘病毒感染或与之相关的病况)的一个或多个症状的复发、发作或发展。
[0064]
如本文中所用，术语“治疗”、“处理”或“医治”是指治疗病况或患者并是指采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果。关于感染(例如，痘病毒感染或天花病毒感染)，治疗是指由于施用一种或多种疗法(包括但不限于，施用一种或多种预防剂或治疗剂)而导致的传染因子(例如，痘病毒或天花病毒)的复制的根除或控制、传染因子数量的减少(例如，病毒滴度的降低)、感染(例如，痘病毒/天花病毒感染或者与其相关的病况或症状)的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善，或者一个或多个症状的缓解。关于癌症，治疗是指由于施用一种或多种本公开的治疗剂导致的原发性、局部或转移性癌组织的根除、去除、改变或控制。在某些实施方案中，此类术语是指由于向具有此种疾病的受试者施用一种或多种本发明的治疗剂而导致的癌症扩散的最小化或延迟。在其他实施方案中，此类术语是指消除引起疾病的细胞。
[0065]
可使用本领域技术人员已知的多种方法之一向受试者“施用”或“给予”物质、化合物或试剂。例如，可通过舌下或鼻内、通过吸入至肺中或经直肠施用化合物或试剂。还可以执行施用例如一次、多次和/或持续一个或多个延长的时段。在一些方面，施用包括直接施用(包括自我施用)和间接施用，包括开药物处方的行为。例如，如本文中所用，指导患者自我施用药物或使药物由另一个人施用和/或为患者提供药物处方的医生向患者施用药物。
[0066]
本文描述的每个实施方案可以单独使用或与本文描述的任何其他实施方案组合使用。概述
[0067]
痘病毒是在感染的细胞的细胞质中复制的大(～200kbp)dna病毒。正痘病毒(opv)属包括许多痘病毒，所述痘病毒感染不同宿主的能力差异很大。例如，痘苗病毒(vacv)可以感染广泛的宿主组，而天花病毒(varv) 是天花的致病因素，仅感染人。许多(如果不是全部的话)痘病毒的共同特征是它们在宿主中非遗传地“再激活”的能力。非遗传再激活是指这样的过程，其中被一种痘病毒感染的细胞可以促进本身是非感染性的第二“死亡”病毒(例如通过加热灭活的病毒)的恢复。
[0068]
纯化的痘病毒dna不具有感染性，因为病毒生命周期需要通过包装在病毒体中的病毒编码的rna聚合酶转录早期基因。然而，如果将病毒 dna转染到先前用辅助痘病毒感染的细胞中，从而反式地提供转录、复制和包装转染的基因组所需的必需因子(sam ck,dumbell kr.expression ofpoxvirus dna in coinfected cells and marker rescueof thermosensitive mutants bysubgenomic fragments of dna.ann virol(instpast).1981；132:135-50)，则可以克服这种缺陷。虽然这会产生混合的病毒后代，但通过在支持两种病毒繁殖的细胞系中执行再激活反应，然后通过将病毒混合物铺在不支持辅助病毒生长的细胞上来消除辅助病毒(scheiflinger f,dorner f,falkner fg.construction ofchimeric vaccinia viruses by molecular cloning and packaging.proceedingsof thenational academy of sciences of the united states of america.1992； 89(21):9977-81)，可以克服该问题。
[0069]
先前，yao和evans描述了其中由兔痘病毒、休普氏纤维瘤病毒 (sfv)催化的高频重组和复制反应可以与sfv催化的再激活反应偶联，以使用病毒dna的多个重叠片段来快速组装重组痘苗株的方法(yaoxd,evansdh.high-frequency genetic recombination and reactivation oforthopoxvirusesfrom dna fragments transfected into leporipoxvirus-infectedcells.journal ofvirology.2003；77(13):7281-90)。本公开的干细胞
[0070]
本发明的一个方面提供了包含合成嵌合痘病毒(scpv)的干细胞，其可以用于治疗癌症和传染病。首先，从化学合成的dna复制并组装干细胞中包含的功能性合成嵌合痘病毒(scpv)。scpv可以是基因组已测序的，或大部分被测序的，或其天然分离株可得的任何痘病毒。可以根据本发明的方法的各种实施方式产生的病毒可以是其基因组已被大部分测序或其天然分离株可获得的任何痘病毒。在一些方面，本发明的scpv可以基于天然存在的株、变体或突变体、诱变的病毒或基因工程化病毒的基因组序列。在一些方面，本发明的scpv的病毒基因组包含相对于所述病毒的野生型基因组或基础基因组序列的一个或多个修饰。修饰可以包括例如一个或多个删除、插入、取代或其组合。应当理解，可以以本领域中公知的许多方式中的任何方式来引入修饰。
[0071]
如本文所用，“干细胞”是能够分化为多种不同类型的细胞(例如，终末分化的细胞)的任何全能、多能或专能细胞。如本文所用，术语“干细胞”是指祖细胞的子集，其在特定情况下具有分化为更专门化或分化的表型的能力或潜力，并且在某些情况下保留了增殖而不实质性分化的能力。在一个实施方案中，术语干细胞通常是指天然存在的母细胞，其子代
(后代)通常通过分化而朝着不同方向专门化，例如通过获得完全个别化的特征，如在胚胎细胞和组织的逐步多样化中发生的那样。细胞分化是通常通过许多细胞分裂发生的复杂过程。分化的细胞可以衍生自多能细胞，其本身也衍生自多能细胞，如此类推。尽管这些多能细胞中的每一个都可以被认为是干细胞，但是每个细胞所能产生的细胞类型范围却可能相差很大。一些分化的细胞还具有产生更大发育潜力的细胞的能力。这样的能力可以是自然的，也可以在用各种因素处理后被人工诱导。在许多生物学实例中，干细胞也是“多能的”，因为它们可以产生不止一种独特细胞类型的后代，但这不是“干性”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，在本发明中使用它是必不可少的。从理论上讲，自我更新可以通过两种主要机制中的任一种发生。干细胞可能不对称分裂，一个子代保持干的状态，另一个子代表现出一些独特的其他特定功能和表型。备选地，群体中的某些干细胞可以对称地分为两个干，从而整体上维持群体中的某些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的后代。从形式上说，开始于干细胞的细胞可能会走向分化的表型，然后“逆转”并重新表达干细胞的表型，该术语通常称为“去分化”或“重编程”或“逆分化”。
[0072]
任何干细胞类型均可用于本发明的各个方面。干细胞包括任何类型的干细胞，包括胚胎干细胞(es)细胞、产后干细胞(例如来自脐带和胎盘)、胎儿干细胞和成体干细胞(即体细胞干细胞)。在实验室中，通过重新编程成年细胞以表达es特性，可以产生其他类型的细胞，例如诱导多能干细胞(ipsc)。在一实施方案中，成体干细胞是间充质干细胞。在一实施方案中，成体干细胞是组织或器官特定的干细胞，例如神经元干细胞、血管干细胞或表皮干细胞。在一个优选的实施方案中，成体干细胞是间充质干细胞(msc)。
[0073]
间充质干细胞可获自多种来源，例如骨髓、脐带血和脂肪组织(脂肪组织衍生的干细胞)。干细胞的常见来源是人脐静脉内皮细胞(huvec)和原代人皮肤微血管内皮细胞(hcmec)。类似的非人类干细胞也可以从相似的非人类来源获得。在本发明的一个方面中使用的干细胞可以是原代细胞或已经在细胞培养物中长期维持的细胞。干细胞可得自任何动物类型，包括人。在优选的实施方案中，干细胞是人细胞。
[0074]
如本文所用，“胚胎干细胞”是从通常六周或更短的年龄的胚胎获得的干细胞。全能人类胚胎干细胞(hesc)通常可以从5到7天大的胚胎中获得。多能人原始生殖细胞(heg)通常可以从六周或更短的年龄的胚胎中获得。如本文所用，“胎儿干细胞”是指从通常大于6周龄的胎儿出生前获得的任何干细胞。如本文所用，“成体干细胞”是指获自出生后受试者的任何干细胞。通常，受试者是发育完全的成年人。示例性的成体干细胞包括但不限于从诸如脂肪、肌肉或骨髓的器官收获的细胞。
[0075]
在一个实施方案中，干细胞是自体的，即，细胞是从受试者自身的干细胞获得或衍生的。在一个实施方案中，本发明的干细胞获自或衍生自需要针对细胞增殖性病症(肿瘤或癌症)进行治疗性处理的受试者。受试者可能已经患有细胞增殖性病症或处于该病症的风险中。
[0076]
在另一个实施方案中，干细胞是同种异体的，即，细胞是从供体获得或衍生的，所述供体的人白细胞抗原(hla)与受试者是可接受的匹配。
[0077]
在一个方面，本发明涉及包含合成嵌合痘病毒(scpv)的分离的干细胞或其群体，其中病毒从衍生自合成dna的dna复制并再激活，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组之处的特征在于一个或多个修饰。
[0078]
在另一方面，本发明涉及包含合成嵌合正痘病毒的分离的干细胞或其群体，其中病毒从衍生自合成dna的dna复制并再激活，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组之处的特征在于一个或多个修饰。
[0079]
在另一方面，本发明涉及包含合成嵌合痘苗病毒的分离的干细胞或其群体，其中病毒从衍生自合成dna的dna复制并再激活，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组之处的特征在于一个或多个修饰。
[0080]
在一方面，本发明涉及包含合成嵌合马痘病毒的分离的干细胞或其群体，其中病毒从衍生自合成dna的dna复制并再激活，所述病毒的病毒基因组不同于所述病毒的野生型基因组之处的特征在于一个或多个修饰。
[0081]
在一个实施方案中，本发明的干细胞是非癌症干细胞。本公开的合成嵌合痘病毒
[0082]
当天然模板不可用于通过常规分子生物学方法进行遗传修饰、扩增或复制时，化学基因组合成是特别有用的。例如，马痘病毒(hpxv)的天然分离株不易得到来获得模板dna，但已描述了hpxv(株mnr-76)的基因组序列。然而，hpxv基因组序列是不完整的。未确定末端发夹环的序列。因此，通过使用基于vacv端粒的末端发夹环代替hpxv末端发夹环序列可以生成功能性合成嵌合hpxv(schpxv)。相似地，已经描述和公布了wtvacv 的基因组序列(株nycbh，克隆acam2000)，尽管还不完整。未确定末端发夹环的序列，仅鉴定出四个54bp重复序列。因此，可以通过使用基于不同 vacv株(例如wr株)的末端发夹环代替vacv acam2000末端发夹环序列来生成功能性合成嵌合vacv acam2000。在其他实施方案中，末端发夹环基于vacv acam2000末端发夹环序列。
[0083]
在一些实施方案中，痘病毒属于脊椎动物痘病毒(chordopoxvirinae) 亚科。在一些实施方案中，痘病毒属于脊椎动物痘病毒亚科的属，选自禽痘病毒属(avipoxvirus)、羊痘病毒属(capripoxvirus)、鹿痘病毒属(cervidpoxvirus)、 crocodylipoxvirus、兔痘病毒属(leporipoxvirus)、软疣痘病毒属 (molluscipoxvirus)、正痘病毒属(orthopoxvirus)、副痘病毒属(parapoxvirus)、猪痘病毒属(suipoxvirus)或亚塔痘病毒属(yatapoxvirus)。在一些实施方案中，痘病毒是正痘病毒。在一些实施方案中，正痘病毒选自骆驼痘病毒 (cmlv)、牛痘病毒(cpxv)、鼠痘病毒(ectv，“鼠痘剂”)、hpxv、猴痘病毒(mpxv)、兔痘病毒(rpxv)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒、痘苗病毒(vacv)、天花病毒(varv)和田鼠痘病毒 (vpv)。在一个优选的实施方案中，痘病毒是hpxv。在另一个优选实施方案中，痘病毒是vacv。在一些实施方案中，痘病毒是副痘病毒。在一些实施方案中，副痘病毒选自orf病毒(orfv)、伪牛痘病毒(pcpv)、牛流行性口炎病毒(bovine popular stomatitits virus，bpsv)、松鼠副痘病毒(sppv)、马鹿副痘病毒、ausdyk病毒、羚羊传染性脓疱病毒(chamois contagious ecythemavirus)、驯鹿副痘病毒或海豹痘病毒。在一些实施方案中，痘病毒是软疣痘病毒。在一些实施方案中，软疣痘病毒是传染性软疣病毒(mcv)。在一些实施方案中，痘病毒是亚塔痘病毒。在一些实施方案中，亚塔痘病毒选自塔纳痘病毒(tanapox virus)或雅巴猴肿瘤病毒(ymtv)。在一些实施方案中，痘病毒是羊痘病毒。在一些实施方案中，羊痘病毒选自绵羊痘病毒、山羊痘病毒或粗糙皮肤病病毒。在一些实施方案中，痘病毒是猪痘病毒。在一些实施方案中，猪痘病毒是猪类痘病毒(swinepox virus)。在一些实施方案中，痘病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，兔痘病
毒选自粘液瘤病毒、休普氏纤维瘤病毒(sfv)、松鼠纤维瘤病毒或野兔纤维瘤病毒。新的痘病毒(例如正痘病毒) 仍在不断被发现。应理解，本发明许多方面的scpv可以基于这种新发现的痘病毒。
[0084]
在一些方面，scpv是cmlv，其基因组基于公开的基因组序列(例如，株cms(genbank登录号ay009089.1))。在一些方面，scpv是cpxv，其基因组基于公开的基因组序列(例如，株brighton red(genbank登录号 af482758)，株gri-90(genbank登录号x94355))。在一些方面，scpv是 ectv，其基因组基于公开的基因组序列(例如莫斯科株(genbank登录号 nc_004105))。在一些方面，scpv是mpxv，其基因组基于公开的基因组序列(例如，株zaire-96-1-16(genbank登录号af380138))。在一些方面，scpv 是rpxv，其基因组基于公开的基因组序列(例如株utrecht(genbank登录号 ay484669))。在一些方面，scpv是沙鼠痘病毒，其基因组基于公开的基因组序列(例如，株dahomey 1968(genbank登录号nc_008291))。
[0085]
化学病毒基因组合成还为将大量有用的修饰引入所得基因组或其特定部分提供了可能性。修饰可以改善克隆以生成病毒的容易性，提供用于引入重组基因产物的位点，改善鉴定再激活的病毒克隆的容易性和/或赋予许多其他有用的特征(例如，引入所需抗原，产生溶瘤病毒等)。在一些实施方案中，修饰可以包括一种或多种毒力因子的减弱或缺失。在一些实施方案中，修饰可以包括一种或多种毒力调节基因或基因编码调节因子的添加或插入。
[0086]
在一方面，本发明提供了用于产生合成嵌合马痘病毒(schpxv) 的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，schpxv基因组可以基于针对hpxv 株mnr-76描述的基因组序列(seq id no：49)(tulman er，delhon g， afonso cl，lu z，zsak l，sandybaev nt等，genome of horsepox virus.journalof virology.2006；80(18):9244-58)。该基因组序列不完整并似乎不包括末端发夹环的序列。在此显示，可以使用本发明的方法将痘苗病毒(vacv)的末端发夹环连接到hpxv基因组的末端，以产生功能性的schpxv颗粒。如本公开的工作实例中所述并且如表1所示，hpxv基因组可以被分成10个重叠的片段。在一些实施方案中，基因组可以被分成2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14或15个重叠片段。在一些实施方案中，整个基因组可以作为一个片段提供。表1中显示了示例性重叠片段的基因组位置和片段大小。表2 显示了可以在这些片段中相对于碱基序列进行的一些修饰。本发明一方面的多核苷酸包含与seq id no：1-10至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含这些序列的变体，其中这样的变体可以包括错义突变、无义突变、重复、缺失和/或添加。seq idno：11和seq id no：12描述了vacv(wr株)末端发夹环的核苷酸序列。在一些实施方案中，末端发夹环包含与seq id no：11或seq id no：12至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％相同的核酸序列。
[0087]
在另一方面，本发明提供了用于产生合成嵌合痘苗病毒(scvacv) 的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，scvacv基因组可以基于针对vacv 株nycbh克隆acam2000描述的公开的基因组序列(genbank登录号 ay313847；osborne jd等人vaccine.2007；25(52)：8807-32)。该基因组序列不完整，并似乎不包括末端发夹环的序列，仅鉴定出四个54bp重复序列。在本申请中显示，可以使用本公开的方法将来自痘苗病毒(vacv)株wr的末端发夹环连接到vacv基因组株nycbh克隆acam2000的末端上以产生功能性scvacv颗粒。在一些实施方案中，
可以使用本公开的方法将来自痘苗病毒(vacv)株acam2000的末端发夹环连接至vacv基因组株nycbh 克隆acam2000的末端上以产生功能性scvacv颗粒。如本公开的工作实例中所述并且如表4所示，scvacv基因组可以被分成9个重叠片段。在一些实施方案中，vacv基因组可以被分为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14或15个重叠片段。在一些实施方案中，整个基因组可以作为一个片段提供。片段大小显示在表4中。本发明一方面的多核苷酸包含与seq id no： 54-62至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含这些序列的变体，其中这样的变体可以包括错义突变、无义突变、重复、缺失和/或添加。seq id no：11和seq id no：12 描述了vacv(wr株)末端发夹环的核苷酸序列。seq id no：117和seq id no：118描述了vacv(acam2000株)末端发夹环的核苷酸序列。在一些实施方案中，末端发夹环包含与seq id no：11或seq id no：12至少70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％相同的核酸序列。在一些实施方案中，末端发夹环包含与seq idno：117或seq id no：118至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
[0088]
传统上，痘病毒的末端发夹难以克隆和测序，因此，某些公开的基因组序列(例如vacv、acam 2000和hpxv mnr-76)不完整也就不足为奇了。hpxv基因组的公开序列同样是不完整的，可能从末端缺失～60bp。因此，hpxv发夹不能精确地复制。在一个示例性实施方案中，使用vacv 末端发夹的公布的序列作为指导，化学合成了129nt ssdna片段，并连接到包含hpxv基因组的左端和右端的dsdna片段上。同样，已经描述并发表了 wtvacv、株nycbh、克隆acam2000的基因组序列，尽管它并不完整。未确定末端发夹环的序列，仅鉴定出四个54bp重复序列。由于wtvacv株 nycbh、克隆acam2000基因组的已公开序列不完整，因此发夹无法精确地复制。在一个示例性实施方案中，使用wtvacv wr株末端发夹环的公开序列作为指导来化学合成ssdna片段，并将其连接到包含vacv株nycbh的左端和右端的dsdna片段上。
[0089]
在另一个实施方案中，本公开的scpv的病毒基因组包含同源或异源末端发夹环和位于发夹环下游的串联重复区(70bp、125bp和54bp串联重复)，其中串联重复区包含与wtvacv(即自然界中存在的该病毒)不同数量的重复。在vacv病毒wr株中发现的70bp、125bp和54bp串联重复的重复数量分别是22、2和8。在另一个实施方案中，串联重复区的数量在不同痘病毒、不同痘苗病毒或不同痘苗病毒株中是可变的。术语“同源末端发夹环”表示所述末端发夹环来自相同的病毒物种/相同株，而术语“异源末端发夹环”表示所述末端发夹环来自不同的病毒物种/不同株。
[0090]
在一些实施方案中，本发明的scpv的末端发夹衍生自vacv。在一些实施方案中，末端发夹衍生自cmlv、cpxv、ectv、hpxv、mpxv、 rpxv、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒或vpv。在一些实施方案中，末端发夹环基于选自以下的株：western reserve、克隆3、 tian tian、tian tian克隆tp5、tian tian克隆tp3、nycbh、nycbh克隆 acambis 2000、wyeth、copenhagen、lister、lister 107、lister-lo、listergl-onc1、lister gl-onc2、lister gl-onc3、lister gl-onc4、lister ctc1、 lister img2(turbo fp635)、ihd-w、lc16m18、lederle、tashkent克隆tkt3、 tashkent克隆tkt4、ussr、evans、praha、l-ivp、v-vet1或livp 6.1.1、 ikeda、em-63、malbran、duke、3737、cv-1、connaught laboratories、serro 2、 cm-01、nycbh dryvax克隆dpp13、nycbh dryvax克隆dpp15、nycbh
dryvax克隆dpp20、nycbh dryvax克隆dpp17、nycbh dryvax克隆dpp21、 vacv-ioc、绒毛膜尿囊痘苗病毒ankara(cva)、修饰的痘苗ankara(mva) 和mvab-bn。在一个实施方案中，末端发夹环基于vacv的western reserve 株(wr株)。在另一个实施方案中，末端发夹环基于acam2000株。新的 vacv株仍在不断发现。应当理解，本发明各个方面的scpv可以基于这种新发现的痘病毒或新发现的株。
[0091]
在一些实施方案中，修饰可以包括一个或多个限制性位点的缺失。在一些实施方案中，修饰可以包括引入一个或多个限制性位点。在一些实施方案中，待从基因组缺失或添加到基因组的限制性位点可以选自一个或多个限制性位点，例如但不限于aani、aari、aasi、aati、aatii、abasi、absi、acc65i、 acci、accii、acciii、acii、acli、acui、afei、aflii、afliii、agei、ahdi、alei、 alui、alwi、alwni、apai、apali、apeki、apoi、asci、asei、asisi、avai、 avaii、avrii、baegi、baei、bamhi bani、banii、bbsi、bbvci、bbvi、bcci、 bceai、bcgi、bcivi、bcli、bcodi、bfai、bfuai、bfuci、bgli、bglii、blpi、 bmgbi、bmri、bmti、bpmi、bpu10i、bpuei、bsaai、bsabi、bsahi、bsai、 bsaji、bsawi、bsaxi、bseri、bseyi、bsgi、bsiei、bsihkai、bsiwi、bsli、 bsmai、bsmbi、bsmfi、bsmi、bsobi、bsp1286i、bspcni、bspdi、bspei、 bsphi、bspmi、bspqi、bsrbi、bsrdi、bsrfαi、bsrgi、bsri、bsshii、bsssαi、 bstapi、bstbi、bsteii、bstni、bstui、bstxi、bstyi、bstz17i、bsu36i、btgi、 btgzi、btsαi、btsci、btsimuti、cac8i、clai、cspci、cviaii、cviki-1、cviqi、 ddei、dpni、dpnii、drai、drdi、eaei、eagi、eari、ecii、eco53ki、econi、ecoo109i、ecop15i、ecori、ecorv、fati、faui、fnu4hi、foki、fsei、fspei、 fspi、haeii、haeiii、hgai、hhai、hincii、hindiii、hinfi、hinp1i、hpai、 hpaii、hphi、hpy166ii、hpy188i、hpy188iii、hpy99i、hpyav、hpych4iii、 hpych4iv、hpych4v、i-ceui、i-scei、kasi、kpni、lpnpi、mboi、mboii、 mfei、mluci、mlui、mlyi、mmei、mnli、msci、msei、msli、mspa1i、mspi、 mspji、mwoi、naei、nari、ncii、ncoi、ndei、ngomiv、nhei、nlaiii、nlaiv、 nmeaiii、noti、nrui、nsii、nspi、paci、paer7i、pcii、pflfi、pflmi、plei、 pluti、pmei、pmli、ppumi、pshai、psii、pspgi、pspomi、pspxi、psti、 pvui、pvuii、rsai、rsrii、saci、sacii、sali、sapi、sau3ai、sau96i、sbfi、 scrfi、sexai、sfani、sfci、sfii、sfoi、sgrai、smai、smli、snabi、spei、sphi、 srfi、sspi、stui、styd4i、styi、swai、taqαi、tfii、tsei、tsp45i、tspmi、tspri、 tth111i、xbai、xcmi、xhoi、xmai、xmni或zrai。应当理解，任何所需的一个或多个限制性位点或限制性位点的组合可以插入基因组中或者从基因组中突变和/或消除。在一些实施方案中，从病毒基因组中删除一个或多个aari位点。在一些实施方案中，从病毒基因组中删除一个或多个bsai位点。在一些实施方案中，一个或多个限制性位点从基因组中被完全消除(例如，病毒基因组中的所有aari位点可以被消除)。在一些实施方案中，将一个或多个avai 限制性位点引入病毒基因组。在一些实施方案中，将一个或多个stui位点引入病毒基因组。在一些实施方案中，一个或多个修饰可以包括重组工程靶的掺入，所述重组工程靶包括但不限于loxp或frt位点。
[0092]
在一些实施方案中，修饰可包括引入以下：荧光标志物，例如但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、增强的gfp、黄色荧光蛋白(yfp)、蓝绿色/蓝色荧光蛋白(bfp)、红色荧光蛋白(rfp)或其变体等；可选择标志物，例如但不限于耐药标志物(例如，大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因 (gpt)，白黑链霉菌(streptomyces alboniger)嘌呤霉素乙酰转
移酶基因(pac)，新霉素磷酸转移酶i基因(npti)，新霉素磷酸转移酶基因ii(nptii)，潮霉素磷酸转移酶(hpt)，sh ble基因等；蛋白质或肽标签，例如但不限于mbp(麦芽糖结合蛋白)，cbd(纤维素结合域)，gst(谷胱甘肽s转移酶)，聚(his)， flag，v5，c-myc，ha(血凝素)，ne标签，cat(氯霉素乙酰转移酶)，dhfr(二氢叶酸还原酶)，hsv(单纯疱疹病毒)，vsv-g(水泡性口腔炎病毒糖蛋白)，萤光素酶，蛋白a，蛋白g，链霉亲合素，t7，硫氧还蛋白，酵母2杂交标签(例如b42、gal4、lexa或vp16)；定位标签(例如nls标签、snap标签、myr标签)等。应当理解，可以使用本领域已知的其他可选标志物和/或标签。在一些实施方案中，修饰包括一种或多种可选择标志物以帮助选择再激活的克隆(例如，荧光标志物例如yfp，药物选择标志物例如 gpt等)以帮助选择再激活的病毒克隆。在一些实施方案中，在选择步骤之后，从再激活的克隆中删除一种或多种选择标志物。产生合成嵌合痘病毒的方法
[0141]
本发明在一些方面提供了用于从病毒基因组的化学合成的重叠双链dna片段合成、再激活和分离功能性合成嵌合痘病毒(scpv)的系统和方法。病毒基因组的重叠dna片段的重组和功能性scpv的再激活在先前用辅助病毒感染的细胞中进行。简言之，化学合成包含scpv的全部或基本上全部病毒基因组的重叠dna片段并将其转染到辅助病毒感染的细胞中。培养转染的细胞以产生包含辅助病毒和再激活的scpv的混合病毒后代。接下来，将混合的病毒后代铺在不支持辅助病毒生长，但允许合成嵌合痘病毒生长的宿主细胞上，以消除辅助病毒并回收合成的嵌合痘病毒。在一些实施方案中，辅助病毒不感染宿主细胞。在一些实施方案中，辅助病毒可以感染宿主细胞但在宿主细胞中生长不良。在一些实施方案中，与scpv相比，辅助病毒在宿主细胞中生长更慢。
[0093]
在一些实施方案中，基本上所有的合成嵌合痘病毒基因组均衍生自化学合成的dna。在一些实施方案中，约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约 99％、超过99％或100％的合成嵌合痘苗病毒基因组衍生自化学合成的dna。在一些实施方案中，痘病毒基因组衍生自化学合成的dna与天然存在的dna 的组合。在一些实施方案中，包含痘苗病毒基因组的所有片段都是化学合成的。在一些实施方案中，一个或多个片段是化学合成的，并且一个或多个片段衍生自天然存在的dna(例如，通过pcr扩增或通过确立的重组dna技术)。
[0094]
用于本发明方法的各个实施方案的重叠dna片段的数量将取决于痘病毒基因组，例如马痘病毒或痘苗病毒的大小。实际考虑因素诸如一方面随着片段数量的增加而重组效率下降以及另一方面随着片段数量减少而合成非常大的dna片段变得困难也将为在本发明的方法中使用的重叠片段的数量提供信息。在一些实施方案中，可以将合成嵌合痘苗病毒基因组合成为单个片段。在一些实施方案中，从2-14个重叠dna片段组装合成嵌合痘苗病毒基因组。在一些实施方案中，从4-12个重叠dna片段组装合成嵌合痘苗病毒基因组。在一些实施方案中，从6-12个重叠dna片段组装合成嵌合痘苗病毒基因组。在一些实施方案中，从8-11个重叠dna片段组装合成嵌合痘苗病毒基因组。在一些实施方案中，从8-10个、10-12个或10-14个重叠dna片段组装合成嵌合痘苗病毒基因组。在一些实施方案中，从2个、3个、4个、5个、6个、 7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个重叠dna片段组装合成嵌合痘苗病毒基因组。在一个示例性实施方案中，从9个重叠dna 片段组装合成嵌合痘苗病毒基因组。在一些实施方案中，从2-14个重叠dna 片段组装合成嵌合马痘病毒基因组。在一些实
施方案中，从4-12个重叠dna 片段组装合成嵌合马痘病毒基因组。在一些实施方案中，从6-12个重叠dna 片段组装合成嵌合马痘病毒基因组。在一些实施方案中，从8-11个重叠dna 片段组装合成嵌合马痘病毒基因组。在一些实施方案中，从8-10个、10-12 个或10-14个重叠dna片段组装合成嵌合马痘病毒基因组。在一些实施方案中，从2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、 13个、14个或15个重叠dna片段组装合成嵌合马痘病毒基因组。在本公开的一个示例性实施方案中，从9个化学合成的重叠双链dna片段再激活合成痘苗病毒(scvacv)。在本公开的另一个示例性实施方案中，从10个化学合成的重叠双链dna片段再激活合成嵌合马痘病毒(schpxv)。在一些实施方案中，单独合成末端发夹环并将其连接至包含痘苗病毒基因组的左端和右端的片段上。在一些实施方案中，末端发夹环可以衍生自天然存在的模板。在一些实施方案中，本公开的scpv的末端发夹衍生自vacv。在一些实施方案中，末端发夹衍生自cmlv、cpxv、ectv、hpxv、mpxv、rpxv、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒或vpv。在其他实施方案中，本发明的scvacv的末端发夹衍生自wtvacv。在一些实施方案中，末端发夹衍生自不同株的wtvacv末端发夹以代替vacv自身末端发夹环序列。在一些实施方案中，末端发夹基于其基因组已被完全测序的任何wtvacv或者可用于基因组测序的其天然分离株的末端发夹。在一个优选的实施方案中，末端发夹衍生自vacv。
[0095]
用于本发明方法的各个实施方案的重叠片段的大小将取决于痘病毒基因组的大小。应当理解，片段大小可以有很大的变化，并且各种实际考虑因素，诸如化学合成非常大的dna片段的能力，将为片段大小的选择提供信息。在一些实施方案中，片段的大小范围为约2,000bp至约50,000bp。在一些实施方案中，片段的大小范围为约3,000bp至约45,000bp。在一些实施方案中，片段的大小范围为约4,000bp至40,000bp。在一些实施方案中，片段的大小范围为约5,000bp至35,000bp。在一些实施方案中，最大片段为约18,000bp、20,000bp、21,000bp、22,000bp、23,000bp、24,000bp、25,000bp、 26,000bp、27,000bp、28,000bp、29,000bp、30,000bp、31,000bp、32,000bp、 33,000bp、34,000bp、35,000bp、36,000bp、37,000bp、38,000bp、39,000bp、 40,000bp、41,000bp、42,000bp、43,000bp、44,000bp、45,000bp、46,000bp、47,000bp、48,000bp、49,000bp或50,000bp。在本公开的一个示例性实施方案中，从大小范围为约10,000bp至约32,000bp的9个化学合成的重叠双链 dna片段(表4)再激活scvacv。在本公开的一个示例性实施方案中，从大小范围为约10,000bp至约32,000bp的9个化学合成的重叠双链dna片段(表 1)再激活schpxv。
[0096]
辅助病毒可以是能够提供从转染的dna再激活痘病毒所需的反式作用酶促机制的任何痘病毒。辅助病毒可以具有与待产生的scpv不同或更窄的宿主细胞范围(例如，与正痘病毒诸如痘苗病毒(vacv)或hpxv相比，休普氏纤维瘤病毒(sfv)具有非常窄的宿主范围)。与待产生的scpv相比，辅助病毒可具有不同的噬斑表型。在一些实施方案中，辅助病毒是兔痘病毒。在一些实施方案中，兔痘病毒是sfv、野兔纤维瘤病毒、兔纤维瘤病毒、松鼠纤维瘤病毒或粘液瘤病毒。在优选的实施方案中，辅助病毒是sfv。在一些实施方案中，辅助病毒是正痘病毒。在一些实施方案中，正痘病毒是骆驼痘病毒 (cmlv)、牛痘病毒(cpxv)、鼠痘病毒(ectv，“鼠痘剂”)、hpxv、猴痘病毒(mpxv)、兔痘病毒(rpxv)、浣熊痘病毒、臭鼬痘病毒、沙鼠痘病毒、瓦辛吉舒病病毒、vaca和田鼠痘病毒(vpv)。在一些实施方案中，辅助病毒是禽痘病毒、羊痘病毒、鹿痘病毒、crocodylipoxvirus、软疣痘病毒、副痘病毒、猪痘病毒或亚塔痘病
毒。在一些实施方案中，辅助病毒是禽痘 (fowlpox)病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是α昆虫痘病毒、β昆虫痘病毒或γ昆虫痘病毒。在一些实施方案中，辅助病毒是补骨脂素灭活的辅助病毒。在本公开的一个示例性实施方案中，从转染到经sfv感染的bgmk细胞中的重叠dna片段再激活scpv。然后通过将混合的病毒后代铺在bsc-40细胞上来消除sfv。
[0097]
技术人员将理解，用于scpv的再激活和scpv的选择和/或分离的合适宿主细胞将取决于辅助病毒与通过本发明的方法产生的嵌合痘病毒的特定组合。任何支持辅助病毒和scpv二者生长的宿主细胞都可用于再激活步骤，任何不支持辅助病毒生长的宿主细胞都可用于消除辅助病毒以及选择和/或分离scpv。在一些实施方案中，辅助病毒是兔痘病毒，并且用于再激活步骤的宿主细胞可选自兔肾细胞(例如，llc-rk1、rk13等)、兔肺细胞(例如r9ab)、兔皮肤细胞(例如，sf1ep、drs、rab-9)、兔角膜细胞(例如，sirc)、兔癌细胞(例如，oc4t/cc)、兔皮肤/癌细胞(例如，ctps)、猴细胞(例如， vero、bgmk等)或仓鼠细胞(例如，bhk-21等)。在一些实施方案中，辅助病毒是sfv。
[0098]
在各个方面，可在允许病毒生长至允许使用本文所述scpv的滴度的任何基质中繁殖本发明的scpv。在一个实施方案中，基质允许scpv生长至与针对对应的野生型病毒所确定的滴度相当的滴度。在一些实施方案中，scpv 可以在易受痘病毒感染的细胞(例如鸟类细胞、蝙蝠细胞、牛细胞、骆驼细胞、金丝雀细胞、猫细胞、鹿细胞、马细胞、禽细胞、沙鼠细胞、山羊细胞、人细胞、猴细胞、猪细胞、兔细胞、浣熊细胞、海豹细胞、绵羊细胞、臭鼬细胞、田鼠细胞等)中生长。此类方法是本领域技术人员公知的。代表性哺乳动物细胞包括但不限于bhk、bgmk、brl3a、bsc-40、cef、cek、cho、cos、 cvi、hacat、hel、hela细胞、hek293、人骨骨肉瘤细胞系143b、mdck、 nih/3t3、vero细胞等)。对于病毒分离，通常通过众所周知的澄清规程(例如，诸如梯度离心和柱色谱法)从细胞培养物中取出scpv并与细胞组分分离，并且可以使用本领域技术人员熟知的规程(例如，噬斑测定)根据需要进一步纯化。本公开的药物组合物
[0099]
一方面，本发明涉及药物组合物，包含本发明的分离的干细胞或其群体和药学上可接受的载体。
[0100]
术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于动物，尤其是人类。术语“载体”是指药物组合物(例如，免疫原性或疫苗制剂)与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的例子在e.w.martin的“remington's pharmaceutical sciences”中有所描述。制剂应适合于施用方式。
[0101]
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以通过标准施用途径来施用。可以使用许多方法将制剂引入受试者，这些方法包括但不限于鼻内、气管内、口服、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、经结膜和皮下途径。示例性用途通过本公开的干细胞递送scpv的方法
[0102]
在一方面，本发明涉及用于将合成嵌合痘病毒(scpv)递送至受试者中的方法，该方法包括用合成嵌合痘病毒感染本发明的干细胞并向受试者施用经scpv感染的干细胞。
[0103]
用合成嵌合痘病毒感染本发明的干细胞的方法是本领域已知的。本领域技术人员可以确定合适的参数，例如干细胞的数量和感染复数。
[0104]
在一个实施方案中，干细胞是自体的并且本发明涉及用于向受试者递送scpv的方法，该方法包括：(a)从所述受试者获得干细胞；(b)用溶瘤性scpv感染干细胞，和(c)将经scpv感染的干细胞施用回受试者中。在另一个实施方案中，干细胞是间充质干细胞(msc)。在另一个实施方案中，msc 衍生自受试者的脂肪组织。
[0105]
在另一个实施方案中，干细胞是同种异体的并且本发明涉及用于向受试者中递送scpv的方法，该方法包括(a)从受试者获得干细胞；(b)用溶瘤性scpv感染干细胞，和(c)将经scpv感染的干细胞施用回受试者。
[0106]
在一些实施方案中，本发明的干细胞以单次施用或多次施用来施用。
[0107]
干细胞可以在细胞损伤或功能障碍的部位局部地或全身地植入。干细胞组合物的示例性施用途径包括但不限于静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、冠状动脉内、心肌内、经心内膜、经心外膜、脊髓内、动脉内、纹状体内、肿瘤内、局部、经真皮、直肠或表皮下途径。最合适的施用途径将根据待治疗的病症或病况，例如细胞损伤或功能障碍的位置而变化。例如，干细胞可以在损伤部位动脉内或脊髓内施用以治疗脊髓损伤。在其他实例中，干细胞组合物可以通过冠状动脉内、心肌内、经心内膜或经心外膜途径施用以治疗心血管疾病。在一个优选的实施方案中，施用是静脉内的。
[0108]
在一个实施方案中，用于干细胞感染的scpv的量是1
×
10
5
或约1
ꢀ×
10
5
噬斑形成单位(pfu)，5
×
10
5
或约5
×
10
5
pfu，至少1
×
10
6
或约x10
6 pfu，5x10
6
或约5x10
6
pfu，1x10
7
或约1x10
7
pfu，5x10
7
或约5x10
7 pfu，1x10
8
或约1x10
8
pfu，5x10
8
或约5x10
8
pfu，1x10
9
或约1x10
9 pfu，5x10
9
或约5x10
9
pfu，1x10
10
或约1x10
10
pfu或者5x10
10
或约5x 10
10
pfu。
[0109]
在一个实施方案中，用于干细胞感染的scpv的感染复数为约0.5 pfu/细胞，或约1pfu/细胞，或约2pfu/细胞，或约3pfu/细胞，或约4pfu /细胞，或约5pfu/细胞，或约6pfu/细胞，或约7pfu/细胞，或约8pfu/细胞，或约9pfu/细胞或约10pfu/细胞。易于被本公开的示例性干细胞治疗的病况
[0110]
适用于干细胞疗法的病况包括其中一个或多个细胞群有缺陷或已被耗尽或破坏的任何病况。此类病况包括退行性病症或病况以及急性或慢性损伤。一旦将干细胞植入或嫁接入患者体内，例如在细胞或组织受损或功能障碍的位置，那么干细胞可以基于在局部细胞外微环境中的物理和化学信号而分化为所需的细胞或组织类型，从而用功能正常的细胞代替被破坏或有缺陷的细胞。示例性病况包括但不限于癌症、心血管疾病、糖尿病、脊髓损伤、神经退行性疾病、外伤性脑损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化(ms)、肌萎缩性侧索硬化(als)、杜兴氏肌营养不良、肌肉损伤或营养不良、中风、烧伤、肺部疾病、视网膜疾病、肾脏疾病、骨关节炎和类风湿关节炎。治疗癌症的方法
[0111]
如本文所使用的，用于治疗或预防癌症的方法是指作为疾病特征的任何症状，例如肿瘤，其转移，肿瘤的血管形成或其他参数的减轻、缓解、预防，处于减轻的状态，或保持在减轻的状态。这也意味着可以通过治疗消除、减轻或预防癌症和转移的迹象。迹象的非限制性实例包括基底膜和近端细胞外基质的不受控制的降解，内皮细胞向新的功能性毛细管中的迁移、分裂和组织，以及此类功能性毛细管的持久性。
[0112]
本发明的各个方面的合成嵌合痘病毒(scpv)可用作在癌细胞中选择性复制并杀死癌细胞的溶瘤剂。快速分裂的细胞，诸如癌细胞，通常比非分裂细胞更容许痘病毒感染。痘病毒的许多特征，诸如在人中的安全性、高滴度原液生产的容易性、病毒制备物的稳定性以及在肿瘤细胞中复制后诱导抗肿瘤免疫的能力使得痘病毒成为理想的溶瘤剂。根据本发明的方法产生的scpv可以包含一个或多个使其适合于治疗癌症的修饰。因此，在一个方面，本公开提供了诱导癌细胞的死亡的方法，该方法包括使癌细胞与分离的scpv或者包含本发明的scpv的药物组合物或本发明的干细胞接触。在一个方面，本公开提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的干细胞或本发明的药物组合物。另一方面包括使用本发明的干细胞或本文所述的药物组合物以诱导赘生性病症细胞(诸如癌细胞)的死亡或治疗赘生性病症(诸如癌症)。在一些实施方案中，将痘病毒溶瘤疗法与一种或多种常规癌症疗法(例如，手术、化学疗法、放射疗法、热疗法和生物学/免疫学疗法) 组合施用。在具体实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合vacv (scvacv)。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合粘液瘤病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合hpxv(schpxv)。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合浣熊痘病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒是本发明的合成嵌合亚巴样疾病(yaba-like disease)病毒。
[0113]
在各个方面，使用本发明的癌症治疗方法，可以容易地引入一个或多个所需基因，并且可以从合成嵌合痘病毒基因组中容易地删除一个或多个不需要的基因。在一些实施方案中，用作溶瘤剂的本发明的scpv被设计为表达转基因以增强其免疫反应性、抗肿瘤靶向性和/或效力、细胞到细胞扩散和/或癌特异性。在一些实施方案中，设计或工程化本发明的scpv以表达免疫调节基因(例如，gm-csf，或阻断tnf功能的病毒基因)。在一些实施方案中，设计本公开的scpv以包括表达减弱毒力的因子的基因。在一些实施方案中，设计或工程化本发明的scpv以表达治疗剂(例如hepo、bmp-4、针对特定肿瘤抗原或其部分的抗体等)。在一些实施方案中，已经修饰本发明的scpv 用于减毒。在一些实施方案中，设计或工程化本发明的scpv以缺乏病毒tk 基因。在一些实施方案中，设计或工程化本发明的scvacv以缺乏痘苗生长因子基因。在一些实施方案中，设计或工程化本发明的scvacv以缺乏血凝素基因。
[0114]
本发明的各个实施方案的干细胞可以用于治疗多种赘生性病症和/ 或癌症。在一些实施方案中，癌症类型包括但不限于骨癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、神经胶质瘤、胃癌、胃肠癌、头颈癌、肝癌诸如肝细胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌诸如黑素瘤、睾丸癌等，或可以治疗的任何其他肿瘤或瘤前病变。
[0115]
在另一个实施方案中，方法还包括检测施用的scpv在赘生性病症或癌细胞中和/或在来自施用了本文所述的分离的或重组的病毒或组合物的受试者的样品中的存在。例如，可在施用本文所述的scpv或组合物之前和/或之后测试受试者以评估例如感染的进展。在一些实施方案中，本公开的scpv包含检测盒并且检测施用的嵌合痘病毒的存在包括检测检测盒编码的蛋白质。例如，其中检测盒编码荧光蛋白，使用荧光可视化方法对受试者或样品成像。
[0116]
在一些实施方案中，本发明的各种实施方案的干细胞以单次施用或多次施用来施用。
[0117]
在其他实施方案中，本发明的干细胞可以局部地植入细胞损伤或功能障碍的部位，或全身地植入，以便用于治疗癌症的方法。干细胞组合物的示例性施用途径包括但不限于静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、冠状动脉内、心肌内、经心内膜、经心外膜、脊髓内、动脉内、纹状体内、肿瘤内、局部、经真皮、直肠或表皮下途径。最合适的施用途径将根据待治疗的病症或病况，例如细胞损伤或功能障碍的位置而变化。例如，干细胞可以在损伤部位动脉内或脊髓内施用以治疗脊髓损伤。在其他实例中，干细胞组合物可以通过冠状动脉内、心肌内、经心内膜或经心外膜途径施用以治疗心血管疾病。在一个优选的实施方案中，施用是静脉内的。
[0118]
用于癌症治疗方法的scpv可以编码治疗性基因产物。在一些实例中，治疗性基因产物是抗癌剂或抗血管生成剂。在一个实施方案中，治疗性基因产物可以选自细胞因子、趋化因子、免疫调节分子、抗原、抗体或其片段、反义rna、前药转化酶、sirna、血管生成抑制剂、毒素、抗肿瘤寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌多肽抗生素、转运蛋白和组织因子。
[0119]
包括本发明的干细胞的用于癌症治疗的方法还可以包括施用抗癌剂。示例性抗癌剂包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、光敏剂、毒素、抗癌抗生素、化疗化合物、放射性核素、血管生成抑制剂、信号传导调节剂、抗代谢物、抗癌疫苗、抗癌寡肽、有丝分裂抑制剂蛋白、抗有丝分裂寡肽、抗癌抗体、抗癌抗生素、免疫治疗剂、高温或高温疗法、细菌、放射疗法和这类试剂的组合。在一些实例中，该抗癌剂是顺铂、卡铂、吉西他滨、伊立替康、抗egfr抗体或抗vegf抗体。在一些实例中，抗癌剂与病毒同时、顺序或间歇地施用。
[0120]
在本文提供的用于向受试者施用溶瘤病毒的方法中，该方法还可以包括在疗法期间或之后施用抗病毒剂以减弱受试者的病毒复制或从受试者消除病毒。示例性抗病毒剂包括但不限于西多福韦(cidofovir)、西多福韦的烷氧基烷基酯、格列卫、更昔洛韦、阿昔洛韦和st-26。
[0121]
在用于癌症治疗的方法的一方面，scpv包含基因缺失。基因缺失理解为基因的dna序列的丢失或不存在，或者该基因中的缺陷或缺失突变，其中在dna复制期间染色体或dna序列的部分丢失。在一个实施方案中，缺失的基因选自编码蛋白质或其片段的基因，调节转录的基因区段，调节病毒复制的基因区段，影响细胞有丝分裂的基因区段，影响细胞代谢的基因区段，编码反义rna的基因区段，编码sirna的基因区段，调节血管生成的基因区段，调节一种或多种转运蛋白的基因区段，或调节一种或多种组织因子的基因区段。在另一个实施方案中，基因缺失增强了病毒的抗癌或抗血管生成作用。如本文所用，术语“增强作用”是指在基因缺失后，抗癌或抗血管生成化合物更有效或更有活性，这意味着在scpv上执行基因缺失后，化合物的活性增强。治疗天花病毒感染的方法
[0122]
本发明各个方面的干细胞可以用于治疗天花病毒感染。关于感染 (例如痘病毒感染或天花病毒感染)，治疗是指根除或控制传染因子(例如痘病毒或天花病毒)的复制，减少传染因子的数量(例如，病毒滴度的降低)，减少或缓解感染(例如，痘病毒/天花感染或与其相关的病症或症状)的进展、严重性和/或持续时间，或者缓解因施用一种或多种疗法(包括但不限于施用一种或多种预防剂或治疗剂)而引起的一种或多种症状。
[0123]
在一些实施方案中，本发明的干细胞以单次施用或多次施用的形式施用以治疗天
花感染。
[0124]
干细胞组合物的示例性施用途径包括但不限于静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、冠状动脉内、心肌内、经心内膜、经心外膜、脊髓内、动脉内、纹状体内、肿瘤内、局部、经真皮、直肠或表皮下途径。
实施例
实施例1.合成的嵌合hpxv(schpxv)病毒基因组的重叠片段的选择和设计
[0125]
schpxv基因组的设计基于先前描述的hpxv(株mnr-76；图1a) 的基因组序列[genbank登录号dq792504](tulman er,delhon g,afonso cl, lu z,zsak l,sandybaev nt等，genome of horsepox virus.journal of virology. 2006；80(18):9244-58)。将212,633bp基因组分成10个重叠片段(图1b)。这些片段被设计为使得它们与每个相邻片段共享至少1.0kbp的重叠序列(即同源性)，以提供同源重组将驱动全长基因组装配的位点(表1)。这些重叠序列将提供足够的同源性以准确地进行共转染片段之间的重组(yao xd,evansdh.high-frequency genetic recombination and reactivation of orthopoxviruses from dna fragments transfected into leporipoxvirus-infected cells.journal ofvirology.2003；77(13):7281-90)。来自hpxv基因组序列的末端40bp(5
’-ꢀ
tttattaaattttactatttatttagtgtctagaaaaaaa-3
’
)(seq id no: 50)不包括在合成的反向末端重复序列(itr)片段中。相反，sapi限制性位点被添加在itr片段的5'-末端(ga_litr)和3'-末端(ga_ritr)，接着是 tgt序列。这些sapi限制性位点用于将vacv末端发夹连接到itr片段上(如下所述)。
[0126]
化学合成每个片段并使用每个片段上的末端sfii限制性位点将其亚克隆到质粒中。为了帮助亚克隆这些片段，除两个itr编码片段外，aari和 bsai限制性位点在所有片段中被沉默突变(表2)。两个itr编码片段中的bsai 限制性位点未被突变，以防这些区域含有对高效dna复制和串联体解离重要的核苷酸序列特异性识别位点。
[0127]
将在痘病毒早晚期启动子控制下的yfp/gpt盒引入ga_fragment_3) 内的hpxv095/j2r基因座中，使得hpxv(schpxv yfp-gpt::095)的再激活在荧光显微镜下易于可视化。gpt基因座还提供了使用药物选择来选择再激活的病毒的潜在工具。hpxv095编码非必需vacv j2r基因的hpxv同源物，并通过将fragment_3和其他hpxv克隆与vacv dna一起共转染到sfv感染的bgmk细胞中，恢复了多种杂合病毒，验证选择策略(图10a和10b)。还将沉默突变引入hpxv044(vacv
wr
f4l)序列(ga_fragment_2)，以在 ga_fragment_2中产生两个独特的限制性位点(表3)。在一些实施方案中，这些独特的限制性位点可以用于在再激活hpxv之前将重组基因产物(例如但不限于选择标志物、荧光蛋白、抗原等)快速引入ga_fragment_2。表1：本研究中使用的hpxv基因组片段。指示了hpxv基因组内每个片段的大小和位置
表2：在schpxv yfp-gpt::095片段中创建的沉默突变，以从hpxv基因组中去除aari和bsai限制性位点。表3：将沉默核苷酸突变引入hpxv044(vacv f4l)基因中以在 ga_fragment_2中创建独特的限制性内切核酸酶位点。
来自vacv(株wr)的末端发夹环的慢速(s)和快速(f)形式的合成
[0128]
将来自vacv(株wr)的末端发夹环的慢速(s)和快速(f)形式合成为157nt的ssdna片段(integrated dna technologies；图2b)。通过dna合成，在每个发夹的末端留下由三个核苷酸组成的5'悬突(5'-aca；图 2c)。也在末端发夹环中合成来自hpxv序列[dq792504]的串联体解离位点(resolution site)(图2b)。schpxv yfp-gpt::095片段的消化和纯化
[0129]
将合成的hpxv片段在50℃用sfii消化过夜。将schpxv itr片段分别用sapi(thermofisher scientific)消化1小时，在65℃灭活10分钟，然后在50℃用sfii消化过夜。将约1u的fastap碱性磷酸酶添加到schpxvyfp-gpt::095itr消化物中，并在37℃再孵育1小时。随后使用qiaexii dnacleanup试剂盒(qiagen)纯化所有schpxv yfp-gpt::095片段。将所有schpxvyfp-gpt::095片段从qiaexii悬浮液中洗脱到10mm tris-hcl中。使用nanodrop (thermofisher scientific)估计dna浓度。
[0130]
痘病毒催化非常高频的同源重组反应，所述同源重组反应与病毒复制过程密不可分。在本文中，证明了可以使用病毒催化的重组和复制反应连接化学合成的hpxv双链体dna的大片段以形成功能性schpxv基因组。
[0131]
使用hpxv基因组(株wnr-76)的公开序列，将212,633bp基因组分成10个重叠片段(图2)。每个片段中的所有bsai和aari位点都被突变，但itr除外以防该区域内的序列特异性位点在未知情况下被需要来进行高效基因组复制和串联体解离。如上所述，为了便于将来自vaca的末端发夹环结构添加到itr的末端，分别在litr和ritr片段两者的左侧末端和右侧末端旁边包含sapi识别位点(图2a)。将这些sapi位点嵌入侧翼载体序列中，并且sapi酶在位点下游、识别序列的外部和hpxv dna中切割。因此，当用sapi切割dna时，其在从hpxv序列复制的dna中留下粘性末端，从而允许组装精确的序列拷贝(通过随后的连接)，不含有外来限制性位点。litr 和ritr片段的另一端(相对于基因组图谱的内部末端)各自由sfii识别位点限定，其余hpxv片段的两端也是如此。所有这些dna都以质粒形式提供，以便于扩增。为了制备用于转染到sfv感染的细胞中的内部片段，用sfii消化这些质粒以从每个schpxv yfp-gpt::095片段释放质粒(关于如何处理litr 和ritr片段，参见下文)。消化后，纯化每个反应物以除去任何污染酶，但不从消化物中除去质粒，并将质粒与每种schpxv yfp-gpt::095片段一起共转染。这不会干扰反应，并且进行以最大限度地减少dna操作的量和这些大 dna片段的可能的片段化。
[0132]
虽然反应效率可能受转染片段数量影响，但在本公开的方法中可使用多于或少于10个重叠片段。不受理论束缚，～15个片段可能代表实际上限而无需进一步优化再激活反应。理想的下限将是单个基因组片段，但实际上端粒最容易以更适度大小的片段(例如～10kb)操作。vacv f-和s-末端发卡环连接到schpxv yfp-gpt::095左侧和右侧itr片段上
[0133]
将约1微克的每种末端vacv发夹环在95℃孵育5分钟，然后在冰上“快速”冷却以形
成发夹结构。随后在连接之前将发夹环在其5'末端磷酸化。简言之，将分开的含有1μg的vacvf-发夹或vacv s-发夹、2μl的10xt4 多核苷酸激酶缓冲液(thermofisher scientific)、1mm atp和10个单位的t4 多核苷酸激酶的20μl反应物(thermofisher scientific)在37℃孵育1小时。通过在75℃加热灭活终止反应。
[0134]
在5％peg-4000和5个单位的t4dna连接酶存在的情况下，在 16℃将约1微克的左侧itr或右侧itr分别与20倍摩尔浓度过量的每种末端发夹一起孵育。将每个连接反应在65℃热灭活10分钟，然后在冰上孵育直至准备转染到细胞中。
[0135]
正痘病毒编码在基因组的每个末端携带可变长度的反向末端重复序列(itr)的线性dsdna基因组。双链体基因组的两条链通过发夹环连接以形成共价连续的多核苷酸链。环富含a+t，不能形成完全碱基配对的结构，并且以两种形式存在，所述两种形式在序列上是反向和互补的(baroudy bm, venkatesan s,moss b.incompletely base-paired flip-flop terminal loops link thetwo dna strands of the vaccinia virus genome into one uninterruptedpolynucleotide chain.cell.1982；28(2):315-24)(图2b)。它们基于它们的电泳特性被称为慢速[s]和快速[f]形式，并且可能折叠成部分双链发夹结构，所述结构给线性dsdna基因组的末端加帽(图2c)。hpxv基因组的已公开序列不完整，可能从末端缺失～60bp，因此使得不可能精确复制hpxv发夹。取而代之的是，使用vacv端粒的公开序列作为指导并在每个发夹末端留下由3 个核苷酸组成的5'悬突(5'-aca；图2c)来化学合成157nt ssdna片段(baroudy bm,venkatesan s,moss b.incompletely base-paired flip-flop terminal loopslink the two dna strands of the vaccinia virusgenome into one uninterruptedpolynucleotide chain.cell.1982；28(2):315-24)。该悬突与通过用sapi切割克隆的litr和ritr片段产生的末端互补。
[0136]
基于表明hpxv与vacv之间的紧密共同祖先的数据，使用衍生自vacv的序列。使用来自其他痘病毒的其他末端发夹可能是可以的，因为在不同的脊椎动物痘病毒的发夹末端之间存在通常保守的序列特征。例如，发夹末端中的解离位点在序列和功能性上都是高度保守的(它们类似于晚期启动子)。
[0137]
将这些单链寡核苷酸加热至95℃，然后在冰上快速冷却，以形成不完全碱基配对的末端发夹(图2c)。然后，将每种寡核苷酸磷酸化并分别以 20倍摩尔过量与预先用sapi和sfii消化的左侧或右侧itr片段连接。用这些酶消化itr在每个itr的5'末端产生5'-tgt悬突，其与末端发夹环结构中的 5'-aca悬突互补。这产生了每个itr的以发夹终止的拷贝。
[0138]
为了证实以发夹终止的结构被添加到两种itr片段上，用pvuii执行itr片段的限制性消化。由于不可能通过凝胶电泳显现～70bp末端发夹在～ 10kb itr末端的添加，因此用pvuii消化少量的每种连接。如果末端发夹未与 itr连接，则用pvuii消化产生1472bp的产物(图3，泳道2和5)。然而，如果末端发夹环被成功地添加到hpxv itr中，则在琼脂糖凝胶上观察到itr 片段大小的增加(图3，比较泳道2与3和4；比较泳道5与6和7)。这些数据表明，在这些条件下，几乎所有hpxv itr都在片段的一个末端含有末端发夹环。从化学合成的dsdna片段再激活schpxv yfp-gpt::095
[0139]
sfv株kasza和bsc-40最初获自美国典型培养物保藏中心。buffalo 绿猴肾(bgmk)细胞获自g.mcfadden(university of florida)。将bsc-40 和bgmk细胞在37℃，5％co
2
中在最少必需培养基(mem)中增殖，所述培养基补充有l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、
抗生素和抗真菌剂，以及5％胎牛血清(fcs；thermofisher scientific)。
[0140]
将buffalo绿猴肾(bgmk)细胞在含有mem的60mm组织培养皿中培养，直至它们达到约80％的汇合。在无血清mem中以0.5的moi用休普氏纤维瘤病毒(sfv)在37℃感染细胞1小时。用3ml含有5％fcs的温热mem替换接种物，并将其返回培养箱中再进行1小时。同时，如下设置转染反应。通过将1ml opti-mem中的约5μg总合成hpxv dna片段与在1mlopti-mem中稀释的lipofectamine2000以3:1(lipofectamine2000对总dna) 的比率混合来制备lipofectamine复合物。将复合物在室温孵育10分钟，然后逐滴加到先前用sfv感染的bgmk细胞中。感染后约16小时，用含有5％fcs 的新鲜mem替换培养基。将细胞在37℃再培养4天(总共5天)。通过将感染的细胞刮到细胞培养基中并进行三个冷冻和解冻循环来回收病毒颗粒。将粗提取物在无血清mem中稀释10-2
，并将4ml接种物涂布在bsc-40细胞的9-16 个150mm组织培养板上，以回收再激活的schpxv yfp-gpt::095。感染后1 小时，用含有5％fcs和0.9％noble琼脂的mem替换接种物。在倒置显微镜下看到黄色荧光噬斑，挑选各个噬斑用于进一步分析。将schpxv yfp-gpt::095 噬斑用黄色荧光选择进行噬斑纯化三次。
[0141]
先前已描述了正痘病毒dna的sfv催化的重组和再激活以组装重组痘苗病毒(yao xd,evans dh.high-frequency genetic recombination and reactivation of orthopoxviruses from dna fragments transfected into leporipoxvirus-infectedcells.journal of virology.2003； 77(13):7281-90).construction of recombinant vaccinia viruses using leporipoxvirus-catalyzed recombination and reactivation of orthopoxvirus dna. methods mol biol.2004；269:51-64)。几个生物特征使其成为有吸引力的模型系统。首先，sfv具有狭窄的宿主范围，有效地感染兔细胞和某些猴细胞系，如bgmk。它可以感染像bsc-40的细胞，但在其上生长非常差。其次，与正痘病毒相比，它生长得更慢，花费约4-5天在单层细胞中形成转化的“病灶”，这一特征与正痘病毒非常不同，后者在培养的1-2天内产生噬斑。兔痘病毒与正痘病毒之间的这种生长差异允许通过在bgmk细胞中执行再激活测定法并将后代涂布在bsc-40细胞上来区分这些病毒。在一些实施方案中，可以使用其他辅助病毒(例如但不限于禽痘病毒)。在一些实施方案中，可使用不同的细胞组合。
[0142]
用sfv以0.5的moi感染bgmk细胞，然后在2小时后用5μg消化的ga_hpxv片段转染。转染后5天，通过细胞裂解回收所有感染性颗粒并将其重新涂布在bsc-40细胞上，所述bsc-40细胞仅高效地支持hpxv(或其他正痘病毒)的生长。在荧光显微镜下使所得的再激活的schpxvyfp-gpt::095噬斑可视化。frag_3内的hpxv095/j2r基因座中的yfp/gpt可选择标志物使得能够进行可视化(图2a)。在转染48小时内在bsc-40单层中检测到病毒噬斑。回收schpxv yfp-gpt::095的效率取决于许多因素，包括 dna转染效率，但范围达到数个pfu/μg转染的dna)。通过pcr和限制性片段分析确认schpxvyfp-gpt::095基因组序列schpxv的pcr和限制性消化分析
[0143]
为了快速确认在再激活的噬斑挑选中存在schpxv yfp-gpt::095， pcr引物被设计为侧接在schpxv中被突变的各个bsai位点(表5)。从用 schpxv yfp-gpt::095感染的bsc-40细胞中分离基因组schpxv yfp-gpt::095 dna并用作模板。将来自vacv感染的bsc-40细胞的基因组dna用作对照以确认bsai位点存在于每种pcr产物中。pcr扩增后，随后用
bsai在37℃消化反应物1小时。在含有安全染料的1％琼脂糖凝胶上分离pcr反应物，以使dna条带可视化。
[0144]
通过限制性消化，然后通过脉冲场凝胶电泳(pfge)对使用蔗糖梯度纯化分离的基因组dna进行schpxv yfp-gpt::095基因组的进一步分析 (yao xd,evans dh.construction of recombinant vaccinia viruses usingleporipoxvirus-catalyzed recombination and reactivation of orthopoxvirus dna. methods mol biol.2004；269:51-64)。简言之，将100ng纯化的病毒基因组 dna用5u bsai或hindiii在37℃消化2小时。将消化的dna在1％seakemgold琼脂糖凝胶铸件上运行，并在0.5x tris-硼酸盐-edta电泳(tbe)缓冲液[110mm tris；90mm硼酸盐；2.5mm edta]中运行。使用1至10秒的切换时间梯度、线性斜坡因子和120
°
的角，在14℃以5.7v/cm在chef dr-iii设备(biorad)上解析dna，持续9.5小时。该程序允许解析1kbp至>200kbp 的dna种类。为了解析75bp至5kbp的片段，在1.5％琼脂糖凝胶铸件上进行电泳，并在室温在115v于1.0xtbe中运行2小时。用金染料使dna可视化。将消化的schpxv yfp-gpt::095dna片段的大小与对照vacv 基因组dna进行比较。表5：在该研究中用于扩增vacv和hpxv内在ga_fragment_1a、 ga_fragment_1b、ga_fragment_2、ga_fragment_3、ga_fragment_4、 ga_fragment_5、ga_fragment_6和ga_fragment_7内发现的bsai限制位点周围的区域的引物。
[0145]
通过pcr、限制性消化和全基因组测序确认来自再激活测定法中生长的噬斑中分离的病毒的基因组序列。pcr分析基于除itr hpxv片段外的所有片段内的突变的bsai位点。引物组被设计为侧接schpxv yfp-gpt::095中的每个bsai位点(表5)。确认了这些引物组也将扩增vacv wr内的类似区域。在pcr扩增围绕schpxv yfp-gpt::095内的这些突变的bsai位点的约1kb 区域后，用bsai消化每个反应，并通过凝胶电泳分析所得的dna片段。由于在vacv(wt)中没有bsai位点突变，因此酶促消化成功地消化了每种pcr 产物，产生更小的dna片段。从schpxv yfp-gpt::095基因组dna生成的 pcr产物对bsai消化具有抗性，表明bsai识别位点在这些基因组中被成功突变。引物组7c的引物产物不导致schpxv yfp-gpt::
annotation transferutility(gatu):rapid annotation of viral genomes using aclosely related referencegenome.bmc genomics.2006；7:150.epub 2006/06/15)用于将参考注释转移到schpxv基因组序列。
[0150]
使用多重方法和illumina miseq测序仪对纯化的schpxvyfp-gpt::095基因组进行测序。将序列读段映射至野生型hpxv(dq792504) 和schpxv yfp-gpt::095参照序列上，以证实schpxv yfp-gpt::095基因组中存在特定修饰。为了确认vacv末端重复序列被正确连接到左侧itr的末端，分析了基因组该区域中的测序读段。将一串c添加到schpxv yfp-gpt::095基因组参照序列的起始处，以捕获映射在该区域中的所有序列读段。这样做是因为用于组装序列读段的程序否则将在schpxv yfp-gpt::095基因组参照序列结束的位点处截断序列的展示。
[0151]
从映射的读段清楚地看出，尽管sapi识别位点存在于schpxvyfp-gpt::095参考基因组中，但所有测序读段都缺少该序列。这证实了本文所述的方法在将合成发夹连接到itr末端的位点处产生真正的hpxv序列。还成功地获得了vacv wr末端发夹环的完整序列，证明了所述序列与连接到 tir末端上的合成ssdna的序列相同。总体而言，这些数据表明vacv-wr 末端发夹环被成功地连接到hpxv itr序列上并在传染性病毒中得以回收。此外，五种病毒中的每种病毒的f-读段和s-读段的1:1分布表明两个末端都需要用来产生病毒。
[0152]
接下来，证实沉默突变bsai位点的每个核苷酸取代已被正确地掺入 schpxv yfp-gpt::095基因组中。将测序读段映射到hpxv(dq792504)参照序列。schpxv yfp-gpt::095中来自区域96,050至96,500的整体illumina测序读段覆盖示于图5a中。从此处可以清楚地看出，该区域存在两个与参照 hpxv无法正确对齐的冲突之处(图5a，蓝色和黄色垂直线)。放大这些区域后，很明显的是在schpxv yfp-gpt::095基因组中，在位置96,239处存在t 至c的取代(图5b)，和在位置96,437处存在a至g的取代(图5c)。证实了在schpxvyfp-gpt::095基因组中产生了为了突变选择的bsai和aari识别位点而引入的所有核苷酸取代(表2)。
[0153]
最后，确定hpxv044中被设计为在ga_frag_2中产生独特限制性位点的核苷酸取代也掺入到schpxv yfp-gpt::095基因组中。映射到hpxv044 (区域44,400至45,100)的测序读段显示在该区域内，存在两个区域，其中测序读段与hpxv yfp-gpt::095参照序列中的序列的读段矛盾。放大这些区域后，很明显的是两个t至g的取代在位置44,512和45,061处被引入hpxv044 的非编码链，从而在frag_2中产生avai和stui限制性位点。总体而言，测序数据证实了体外基因组分析数据并证实schpxvyfp-gpt::095在经sfv感染的细胞中被成功地再激活。与其他痘病毒相比，schpxv yfp-gpt::095在hela细胞中复制更慢
[0154]
bsc-40、hela和hel成纤维细胞最初获自美国典型培养物保藏中心。将bsc-40细胞在37℃，5％co
2
中于最少必需培养基(mem)中增殖，所述培养基补充有l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、抗生素和抗真菌剂，以及5％胎牛血清(fcs；thermofisher scientific)。将hela和hel细胞在补充有l-谷氨酰胺、抗生素和抗真菌剂以及10％fcs的dulbecco改良eagle 培养基中于37℃，5％co
2
中增殖。
[0155]
使用多步生长曲线和噬斑大小测量来评估schpxv yfp-gpt::095是否类似于其他正痘病毒在体外复制和传播。由于无法获得天然hpxv分离株，因此将schpxv yfp-gpt::095的生长与原型痘病毒vacv(株wr)、牛痘病毒 (cpx)(与hpxv密切相关的痘病毒)和dryvax病
毒的克隆dpp15进行比较。以低moi用vacv wr、cpx、dpp15或schpxv yfp-gpt::095感染猴肾上皮细胞(bsc-40)、vero细胞、人癌细胞系(hela)和原代人成纤维细胞 (hel)，并在72小时的时间过程中收获感染的细胞。在bsc-40细胞中，病毒复制和传播的速率在所有测试的病毒中是相当的(图8a)。重要的是， schpxv yfp-gpt::095与任何另外的测试的痘病毒复制得一样好。病毒在hel 细胞和vero细胞上生长至略低的滴度，在hela细胞上生长最不好。在hela 细胞中，与其他正痘病毒相比，该病毒产量降低高达1.5-log。
[0156]
接下来，测量在bsc-40细胞中生长的schpxv yfp-gpt::095的噬斑大小。与vacvwr和甚至牛痘病毒(图6b)相比，观察到schpxvyfp-gpt::095的噬斑大小的统计学显著降低。有趣的是，在bsc-40细胞中，当与所有其他测试的正痘病毒相比时，schpxv yfp-gpt::095产生最小的噬斑 (图6c)。而且，虽然不同的vacv株产生形成较小的二级噬斑的细胞外病毒，但schpxv yfp-gpt::095没有产生这些(图6c)。总体而言，这些数据表明，当与其他正痘病毒相比时，使用本文所述系统再激活schpxv yfp-gpt::095 没有在病毒体外复制和传播中引入任何明显缺陷。此外，schpxv yfp-gpt::095 的噬斑大小与牛痘病毒(cpxv)的噬斑大小相似，表明合成病毒再激活对先前对于其他hpxv样克隆观察到的小噬斑表型没有任何有害影响(medaglia ml,moussatche n,nitsche a,dabrowski pw,li y,damon ik等，genomicanalysis,phenotype,and virulence of the historical braziliansmallpox vaccinestrain ioc:implications for the origins and evolutionary relationships ofvaccinia virus.journal of virology.2015；89(23):11909-25)。除去yfp/gpt选择标志物
[0157]
在再激活schpxv yfp-gpt::095后，除去hpxv095基因座中的 yfp/gpt选择标志物。为此，合成对应于hpxv(dq792504)中的核苷酸位置 91573至92921的1349bp区域的序列(thermofisher scientific)(seq idno:51)。该片段包含侧接wt hpxv095/j2r基因两侧之一的约400bp的同源性。将该dna序列克隆到geneart提供的商业载体中。为了用hpxv095基因序列替换yfp/gpt盒，以0.5的moi用schpxv yfp-gpt::095感染bsc-40细胞，并在2小时后使用lipofectamine 2000(thermofisher scientific)，用2μg含有 wthpxv095序列的线性化质粒进行转染。感染后48小时收获病毒重组体，并在琼脂下使用三轮非荧光噬斑纯化分离重组病毒(schpxv(wt))。使用侧接 hpxv095基因座的引物用pcr来确认schpxv(wt)的身份。用于确认 hpxv095基因的正确替换的引物是hpxv095_check-fwd 5
’-ꢀ
cctattagatacatagatcctcgtcg-3
’
(seq id no:52)和 hpxv095_check-rev 5
’-
cggtttatctaacgacacaacatc-3
’
(seq idno:53)。schpxv(wt)对比schpxvyfp-gpt::095的生长特性
[0158]
在如上文所述执行的实验中，schpxv(wt)在体外显示出与schpxvyfp-gpt::095无显著差异的生长特性(图11a-c)。与vacv wr相比，观察到schpxv(wt)的噬斑大小的统计学显著减小(图11a)。与schpxvyfp-gpt::095一样，schpxv(wt)不产生细胞外病毒(图11b)，并且schpxv (wt)和schpxv yfp-gpt::095在bsc-40细胞、hel细胞、hela细胞和vero 细胞上的生长没有显著差异(图11c)。鉴于该性质影响毒力，schpxv(wt) 不产生细胞外病毒的发现具有相关性。在鼠鼻内模型中确定schpxv(wt)的毒力
[0159]
在该研究中测定schpxv(wt)的毒性作用。对于该实验，向6组balb/c小鼠施用3个
不同剂量的实施例中描述的schpxv(δhpxv_095/j2r) 或schpxv(wt)，并与pbs对照组以及vacv(wr)对照组和vacv(dryvax 株dpp15)对照组(总共9个处理组)进行比较。在该实验中包括另外3只小鼠，其在研究期间未接受任何治疗。在整个实验中，在预定点对所有小鼠进行血液取样，并将另外的小鼠作为血清分析的基线。
[0160]
在接种balb/c小鼠之前，将所有病毒株在bsc-40细胞(非洲绿猴肾)中生长，将其通过胰蛋白酶消化收获，在pbs中洗涤，通过杜恩斯匀浆从细胞中提取，通过超速离心经过36％蔗糖垫纯化，重悬于pbs中，并进行滴定，使得最终浓度为：1)vacv(wr)
–
5x10
5
pfu/ml；2)vacv(dpp15)
ꢀ–
10
9
pfu/ml；3)schpxv(δhpxv_095/j2r)
–
10
7
pfu/ml、10
8
pfu/ml和10
9 pfu/ml以及4)schpxv(wt)-10
7
pfu/ml、10
8
pfu/ml和10
9
pfu/ml。
[0161]
选定用于该研究的schpxv剂量(10
5
pfu/剂量、10
6
pfu/剂量和 10
7
pfu/剂量)是基于使用vacv的已知疫苗株(包括dryvax和ioc)的先前研究(medaglia ml,moussatche n,nitsche a,dabrowski pw,li y,damon ik 等，genomic analysis,phenotype,and virulence of the historical braziliansmallpox vaccine strain ioc:implications for the origins and evolutionaryrelationships of vaccinia virus.journal of virology.2015；89(23):11909-25；qinl,favis n,famulski j,evans dh.evolution of and evolutionary relationshipsbetween extant vaccinia virus strains.journal of virology.2015；89(3):1809-24)。
[0162]
由于将体重减轻用作小鼠中的毒力量度，因此以5x10
3
pfu的剂量鼻内施用vacv(株wr)，这导致约20-30％的体重减轻。vacv dryvax克隆dpp15也以10
7
pfu/剂量鼻内施用，使得这种公知的天花疫苗的毒力可以直接与schpxv(wt)进行比较。小鼠购自charles river实验室并且一旦接收，在病毒施用之前使其适应环境至少一周。
[0163]
每只小鼠在麻醉下接受通过鼻内注射施用的单剂量的病毒(～ 10ul)。每天监测小鼠的感染迹象，诸如肿胀、排出(discharge)或其他异常，持续30天的时期。在病毒施用后每天特别监测每只小鼠的体重损失。根据我们在university of alberta的动物卫生保健机构协议，将除了其他发病因素以外还体重损失超过25％的小鼠经历安乐死。
[0164]
即使在测试的最高剂量的schpxv下，在balb/c小鼠中也可能没有明显的疾病迹象。与schpxv最密切相关的vacv株，旧南美病毒在一些情况下在10
7
pfu没有产生疾病(medaglia ml,moussatche n,nitsche a, dabrowski pw,li y,damon ik等，genomic analysis,phenotype,and virulenceof the historical brazilian smallpox vaccine strain ioc:implications for theorigins and evolutionary relationships of vaccinia virus.journal of virology. 2015；89(23):11909-25)。由于难以制备滴度超过10
9
pfu/ml的纯化的原液，因此测试比此高得多的剂量是不切实际的。确定schpxv是否赋予针对致死性vacv-wr攻击的免疫保护
[0165]
在整个实验过程中，看起来不受实施例中所述的初始病毒施用影响的小鼠正常地继续增重。病毒接种后30天，随后通过鼻内接种用致死剂量的vacv-wr(10
6
pfu/剂量)攻击小鼠。如上所述密切监测小鼠的感染迹象。每天对小鼠称重，并且将除了其他发病因素以外还体重损失超过25％的小鼠实施安乐死。我们预期在施用致死剂量的vacv-wr之前用pbs接种的小鼠在接种后7-10天内显示出显著的体重损失和其他发病因素的迹象。在用 vacv-wr致死攻击后大约14天，对所有小鼠实施安乐死并收集血液以通过标准噬斑减少测定法确认
血清中存在vacv特异性中和抗体。实施例2.合成的嵌合vacv(scvacv)包含vacv wr株发夹和双链体序列的合成嵌合vacv acam2000(scvacv acam2000-wr dup/hp)
[0166]
scvacv基因组的设计基于先前描述的vacv acam2000的基因组序列[genbank登录号ay313847](osborne jd等，vaccine.2007；25(52)： 8807-32)。基因组被分成9个重叠的片段(图12)。这些片段被设计为使得它们与每个相邻片段共享至少1.0kbp的重叠序列(即同源性)，以提供同源重组将驱动全长基因组组装的位点(表4)。这些重叠的序列提供了足够的同源性，以准确地在共转染的片段之间进行重组(yao xd,evans dh.virology.2003； 77(13)：7281-90)。表4：本研究中使用的vacv acam2000基因组片段。描述了vacvacam2000基因组[genbank登录号ay313847]内的大小和序列。[genbank登录号ay313847]内的大小和序列。
[0167]
为了辅助这些片段的亚克隆，在除了两个itr编码片段之外的所有片段中，aari和bsai限制性位点被沉默突变。两个itr编码片段中的bsai限制性位点没有突变，以防这些区域包含对于有效的dna复制和串联体解离来说重要的核苷酸序列特异性识别位点。
[0168]
将在痘病毒早晚期启动子控制下的yfp/gpt盒引入胸苷激酶基因座中，使得易于在荧光显微镜下观察到vacv acam2000(vacv acam2000 yfp-gpt::105)的再激活。gpt基因座还提供了使用药物选择来选择再激活的病毒的潜在工具。
[0169]
传统上，末端发夹难以克隆和测序，因此vacv acam2000基因组的公开序列不完整也就不足为奇了。在检查公开的vacv acam2000株的末端区域后，acam2000与特征明确的vacv wr株(genbank登录号 ay243312)之间似乎存在一些差异(图12)。在wr株中，位于vacv基因组的末端5'和3'末端的共价闭合发夹环的紧邻下游有70bp的串联重复序列。这些之后是两个125bp重复序列和八个54bp重复序列(图13a)。但是，在公开的vacv acam2000序列中，仅鉴定到四个54bp重复序列。测序后(使用 illumina)在vacv acam2000的野生型分离株中确认了70bp、125bp和54bp 重复序列的存在，表明当前公开的acam2000序列不完整。由于illumina读段的短读段长度(＜300个核苷酸)，发明人无法准确确定在该～3kbp中实际的acam2000基因组序列是什么。相反，发明人决定重新创建vacvacam2000病毒，其与vacv wr从末端发夹到刚好在c23l基因终止密码子之前有相似的序列(图12)。这包括125bp和54bp串联重复序列，尽管未包括在公开的acam2000序列中，但在执行的wtvacv acam2000的
下一代 illumina测序时被检测到。在修饰的vacv acam2000的左侧和右侧itr片段的5'末端，还包含nhei限制性位点，该位点将允许70bp串联重复序列直接附着到itr末端(如上所述)。wtvacv wr株的f和s末端发夹环序列分别显示在seq id no：11和12中。包含vacv acam2000株发夹和双链体序列的合成嵌合vacv acam2000 (scvacv acam2000-acam2000 dup/hp)
[0170]
scvacv基因组的设计基于先前描述的vacv acam2000的基因组序列[genbank登录号ay313847](osborne jd等，vaccine.2007；25(52)： 8807-32)。基因组被分成9个重叠的片段(图12)。这些片段被设计为使得它们与每个相邻片段共享至少1.0kbp的重叠序列(即同源性)，以提供同源重组将驱动全长基因组组装的位点(表4)。这些重叠的序列提供了足够的同源性，以准确地在共转染的片段之间进行重组(yao xd,evans dh.virology.2003； 77(13)：7281-90)。
[0171]
为了辅助这些片段的亚克隆，在除了两个itr编码片段之外的所有片段中，aari和bsai限制性位点被沉默突变。两个itr编码片段中的bsai限制性位点没有突变，以防这些区域包含对于有效的dna复制和串联体解离来说重要的核苷酸序列特异性识别位点。
[0172]
将在痘病毒早晚期启动子控制下的yfp/gpt盒引入胸苷激酶基因座中，使得易于在荧光显微镜下观察到vacv acam2000(vacv acam2000 yfp-gpt::105)的再激活。gpt基因座还提供了使用药物选择来选择再激活的病毒的潜在工具。
[0173]
wtvacv acam2000的f和s末端发夹环序列分别显示在seq idno：118和117中。将vacv wr f和s末端发夹环连接到vacv acam2000右侧和左侧itr片段上
[0174]
合成了与vacv wr株相同的70bp重复片段(图13a；seq id no： 63)。sapi和nhei限制性位点包含在70bp串联重复片段的5'和3'末端，以方便分别连接到vacv wr发夹序列和vacv acam2000右侧和左侧itr片段。在可以将vacv wr末端发夹环连接到70bp串联重复片段之前，必须使用idt 合成的双链体序列将环再延伸另外的58bp。这是由于在vacv株wr中发现第一个70bp重复序列之前，紧接在串联体解离位点下游的额外序列。双链体序列是通过合成两个单链dna分子产生的，当退火在一起时，它们将产生双链体dna分子，其在5'末端具有5'-tgt悬突和在3'端具有5'-ggt悬突(seqid no：64和seq id no：65)。由于vacv wr f和s末端发夹环在它们的末端环上生成3'-aca悬突，因此将58bp双链体连接到发夹以生成～130bp末端发夹环，看起来与vacv wr菌株中发现的序列相同直到70bp重复序列的开始。将该发夹/双链体片段进行凝胶纯化，然后将其连接到70bp重复片段的 sapi消化的末端。用sapi消化70bp串联重复片段产生三碱基悬突(5'-cca)，与末端发夹/双链体结构中的5'ggt悬突互补。在dna连接酶存在下，将70bp 串联重复与f末端发夹/双链体结构或s末端发夹/双链体结构以相对于70bp 串联重复片段约5倍摩尔过量混合。与仅70bp的反应相比，这在dna电泳凝胶中产生了向上移位，指示末端发夹/双链体成功地连接到70bp串联重复片段上。
[0175]
该末端发夹/双链体/70bp串联重复片段随后被连接到70bpacam2000左侧或右侧itr片段上，所述片段先前已在其末端修饰以包括nhei 限制性位点。当消化该片段时，在其5'末端保留了5'-ctag悬突。在70bp串联重复片段的3'末端，nhei位点用于将该片段直接连接至vacv acam2000 dna片段的litr和ritr区。消化vacv acam2000左侧和右侧itr片段后，使用dna连接酶以1：1的摩尔比分别将s末端发夹/双链体/70bp串联重复片段或f末端发夹/
双链体/70bp串联重复片段连接到左侧或右侧itr片段，在16℃过夜。随后将dna连接酶在65℃热灭活，然后再转染到经休普氏纤维瘤病毒(sfv)感染的bgmk细胞中。将vacv acam2000 f和s末端发夹环连接到vacv acam2000左侧和右侧 itr片段上
[0176]
合成了与vacv acam2000株相同的70bp重复片段。sapi和nhei 限制性位点包含在70bp串联重复片段的5'和3'末端，以促进分别连接到vacvacam2000发夹序列和vacv acam2000左侧和右侧itr片段上。在可以将 vacv acam2000末端发夹环连接到70bp串联重复片段之前，必须使用idttechnologies合成的双链体序列将环延伸另外的58bp。这是由于在vacv株acam2000中可见的第一个70bp重复序列之前，紧接在串联体解离位点下游的额外序列。双链体序列是通过合成两个单链dna分子产生的，当退火在一起时，它们将产生双链体dna分子，在5'端具有5'-tgt悬突和在3'端具有 5'-ggt悬突(seq id no：119和seq id no：120)。由于vacv acam2000 f和s末端发夹环在其末端环上生成3'-aca悬突，因此将58bp双链体连接到发夹以生成～130bp末端发夹环。将该发夹/双链体片段进行凝胶纯化，然后将其连接到70bp重复片段的sapi消化的末端上。用sapi消化70bp的串联重复片段，产生了三碱基悬突(5'-cca)，与末端发夹/双链体结构中的5'ggt悬突互补。在dna连接酶存在下，将70bp串联重复与f末端发夹/双链体结构或 s末端的发夹/双链体结构以相对于70bp串联重复片段～5倍摩尔过量混合。与仅70bp的反应相比，这在dna电泳凝胶中产生了向上移位，指示末端发夹/ 双链体成功地连接到70bp串联重复片段上。
[0177]
该末端发夹/双链体/70bp串联重复片段随后连接到先前已经在其末端修饰以包括nhei限制性位点的acam2000左侧或右侧itr片段上。当消化该左侧和右侧itr片段时，在其5'末端留下了5'-ctag悬突。在70bp串联重复片段的3'末端，nhei位点用于将该片段直接连接至vacv acam2000 dna 片段的litr和ritr区。消化vacv acam2000左侧和右侧itr片段后，使用dna连接酶以1：1的摩尔比分别将s末端发夹/双链体/70bp串联重复片段或f末端发夹/双链体/70bp串联重复片段连接到左侧或右侧itr片段，在16℃过夜。随后将dna连接酶在65℃热灭活，然后再转染到休普氏纤维瘤病毒 (sfv)感染的bgmk细胞中。vacv acam2000重叠dna片段的制备
[0178]
使用限制酶i-scei将表4中的每个vacv acam2000重叠dna片段克隆到由geneart提供的质粒中。在将这些合成dna片段转染到bgmk 细胞中之前，将质粒用i-scei消化并将产物在凝胶上电泳以确认dna片段成功地进行线性化。在37℃消化2小时后，随后将反应在65℃热灭活。将样品存储在冰上或4℃，直到产生末端发夹/双链体/70bp串联重复/itr片段(如上所述)。在休普氏纤维瘤病毒感染的细胞中再激活scvacv acam2000-wr dup/hp 或scvacv acam2000-acam2000 dup/hp
[0179]
sfv株kasza和bsc-40最初获自美国典型培养物保藏中心。buffalo 绿猴肾(bgmk)细胞获自g.mcfadden(university of florida)。将bsc-40和 bgmk细胞在37℃，5％co
2
中在最少必需培养基(mem)中增殖，所述培养基补充有l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、抗生素和抗真菌剂，以及5％胎牛血清(fcs；thermofisher scientific)。
[0180]
将buffalo绿猴肾(bgmk)细胞在含有mem的60mm组织培养皿中培养，直至它们达到约80％的汇合。在无血清mem中以0.5的moi用休普氏纤维瘤病毒(sfv)在37℃感染细胞1小时。用3ml含有5％fcs的温热mem替换接种物，并将其返回培养箱中再进行1小时。同时，如下
设置转染反应。在37℃约2h后，以基于组成vacv acam2000基因组的每个片段的长度的摩尔当量将线性化的vacv acam2000片段转染(使用lipofectamine 2000)到sfv感染的bgmk细胞中。尝试了不同数量的总dna，并且5、6 和7.5μg的dna能够成功地从这些重叠dna片段中再激活acam2000。将复合物在室温孵育10分钟，并然后逐滴加到先前感染了sfv的bgmk细胞中。感染后约24小时，将培养基替换成含有5％fcs的新鲜mem。将细胞在 37℃再培养4天(总共5天)。通过将感染的细胞刮到细胞培养基中并进行三个冷冻和解冻循环来回收病毒颗粒。将粗提取物在无血清mem中稀释10-2
，并将4ml接种物涂布在 bsc-40细胞的9-16个150mm组织培养板上，以回收再激活的scvacvacam2000 yfp-gpt::105。感染后1小时，用含有5％fcs和0.9％noble琼脂的mem替换接种物。在倒置显微镜下观察黄色荧光噬斑，并挑选各个噬斑用于进一步分析。将scvacv acam2000 yfp-gpt::105噬斑用黄色荧光选择进行噬斑纯化三次。4天后，收集包含sfv和vacv acam2000克隆两者的感染的平板，然后进行三个冻融循环以释放病毒，并然后连续稀释并铺在bsc-40细胞上，与 sfv病毒相比，其优先地促进vacv acam2000病毒的生长。执行三轮噬斑纯化，然后在10
–
150mm组织培养板中大量堆积病毒。随后从这些细胞中裂解病毒并在36％蔗糖垫上分离，然后在24％-40％蔗糖密度梯度上进一步纯化。从这些纯化的基因组中分离出基因组dna并执行下一代illumina测序，以确认合成病毒基因组的序列。与野生型acam2000病毒相比的生长特性
[0181]
在猴肾上皮(bsc-40)细胞中执行分离的合成嵌合vacvacam2000-wr dup/hp、scvacv acam2000-acam2000 dup/hp和野生型 vacv acam2000病毒的体外多步骤生长曲线。以感染复数为0.03来感染细胞，在指定的时间(3h、6h、12h、21h、48h和72h)收获病毒，并在bsc-40 细胞上滴定病毒。图16所示的数据代表三个独立的实验。如图16所示，scvacvacam2000和wtvacv acam2000-wr dup/hp病毒在72小时时段内以不可区分的生长动力学生长。
[0182]
scvacv acam2000-wr dup/hp(yfp-gpt标志物)、scvacvacam2000-acam2000 dup/hp(yfp-gpt标志物)、scvacv acam2000-wrdup/hp(无标志物)(yfp-gpt标志物已替换为j2r基因序列)、scvacvacam2000-acam2000 dup/hp(无标志物)(yfp-gpt标志物已替换为j2r 基因序列)和wtvacv acam2000的生长曲线之间的比较，显示了与 wtacam2000 vacv相比在这些病毒的生长特性中没有统计学上的差异(图 16)。通过pcr和限制性片段分析确定scvacv acam2000-wr dup/hp yfp-gpt::105基因组序列
[0183]
对使用蔗糖梯度纯化分离的基因组dna进行通过限制性消化然后通过脉冲场凝胶电泳(pfge)的scvacv acam2000 yfp-gpt::105基因组的进一步分析(yao xd，evans dh.methods mol biol.2004；269:51-64)。纯化两个独立的scvacv acam2000-wr dup/hp克隆以及vacv_wrδj2r对照 (其中已将j2r基因序列替换为yfp-gpt标志物)，以及wtvacv acam2000 对照(vac_acam2000)，并然后不进行消化，用bsai、hindiii，或noti和 pvui消化。用bsai和hindiii消化来自scvacv acam2000-wr dup/hp和 wtvacv acam2000两者的分离的基因组dna。由于scvacv acam2000基因组中的大多数bsai位点均已被沉默突变，因此
在bsai消化后观察到几乎完整的～200kbp片段(图17，泳道8和9)。这与wtvacv acam2000和wtvacv wr对照(vac_wrδj2r)基因组不同，其在用bsai处理后已被严重消化(图 17，泳道6和7)。为了确认仍然可以用另一种酶消化scvacv acam2000-wrdup/hp基因组，用hindiii消化这些基因组，这从scvacv acam2000-wrdup/hp克隆中产生了许多条带(图17，泳道12和13)。为了确认itr区域内70bp串联重复元件的存在，用noti和pvui消化了基因组dna(图17，泳道14至17)。在wtvacv wr对照(vac_wrδj2r)样品中，检测到约3.6kbp处的条带(标有星号)，该条带涵盖了vac的wr株中的所有70bp串联重复。鉴于以vacv wr株为模板来设计itr重复元件的合成，预期在经过noti/pvui 处理的scvacv acam2000-wr dup/hp克隆中检测到一些条带，其大小接近在株wr中所见。当比较两个scvacv acam2000-wr dup/hp克隆时，观察到该区域大小的差异，表明并非所有的70bp重复都掺入了每个重建的基因组中(图17，泳道16和17)。这并不出乎意料，因为其他人已经证明这些重复元件可以在细胞培养中的选择性压力下扩展和收缩(paez和esteban 1988)。
[0184]
总体上，对scvacv-wr dup/hp acam2000 yfp-gpt::105基因组的体外分析表明从化学合成的dna片段中成功地再激活了vacv-wrdup/hp acam2000，并且scvacv-wr dup/hp acam2000病毒在体外的表现类似于wtvacv acam2000病毒。通过全基因组序列分析确认scvacv acam2000yfp-gpt::105基因组序列
[0185]
对scvacv acam2000-wr dup/hp的两个克隆和scvacvacam2000-acam2000 dup/hp的两个克隆进行测序。使用clc genomicsworkstation(版本11)从头开始组装illumina读段，字段大小为35或61。然后将组装的重叠群导入snapgene软件中并将其与基于由geneart提供的合成片段预期的scacam2000序列的参考序列进行比对。
[0186]
对于scvacv acam2000-wr dup/hp的克隆1，重叠群1为 16,317bp，并且对应于大部分itr区域(串联重复序列除外。重叠群2为 167,020bp，并且与基因组的中央保守区(核苷酸位置19,467至186,486)比对。对于scvacv acam2000-wr dup/hp的克隆2，重叠群3为16,322bp，并对应于大部分itr区(串联重复序列除外。重叠群1为167,020bp，并与基因组的中央保守区(核苷酸位置19,467至186,486)比对。在克隆2的该重叠群的核苷酸位置136791处有一个单核苷酸取代(c到a)。这对应于scacam2000 基因组序列中的核苷酸位置156,256并导致vac_acam2000_177(a41l)中的氨基酸从asp变为tyr。
[0187]
对于scvacv acam2000-acam2000 dup/hp的克隆1，重叠群1 为167,020bp，并且与基因组的中央保守区(核苷酸位置19,469至186,488) 比对。重叠群2为16,150bp并对应于大部分itr区域(串联重复序列除外)。当该重叠群映射到snapgene中的参考基因组时，在位置2633至3417和核苷酸位置15,175至15220处观察到序列中的缺口。第一个缺口区域对应于54bp 的重复区域并最可能是由于无法使用从头组装工具准确组装这些区域。将原始illumina读段直接映射到参考基因组未产生任一区域内的任何缺口。对于 scvacv acam2000-acam2000dup/hp的克隆2，重叠群1为16,075bp，并对应于大部分itr区(串联重复序列除外)。重叠群2为167,078bp并与基因组的中央保守区(核苷酸位置19,469至186,546)比对。在重叠群2中观察到了从核苷酸位置15,176到15,220的缺口。但是，将原始illumina读段直接映射到参考基因组未产生该区域内的任何缺口。scvacv acam2000-acam2000 dup/hp的测序克隆均未在基因组内的任何位置显示任何其他核苷酸突变。
[0188]
illumina读段也被映射到clc genomics中的参考图。illumina读段覆盖了参考序列的全长，对于scvacv acam2000-wr dup/hp的克隆1和2 的平均覆盖分别为1925和2533，并且对于scvacv acam2000-acam2000 dup/hp的克隆1和2的平均覆盖分别为2195和1602。
[0189]
总体而言，测序数据证实了体外基因组分析数据，并确认scvacvacam20000-wr dup/hp和scvacv acam2000-acam2000 dup/hp在感染 sfv的细胞中成功地再激活。去除yfp/gpt选择标志物
[0190]
在scvacv acam2000 yfp-gpt::105再激活后，可以去除胸苷激酶基因座中的yfp/gpt选择标志物。实施例3.载有合成嵌合痘病毒的人间充质干细胞(msc)
[0191]
如apel a等exp cell res 2009；315：498-507所述，从健康供体的骨髓中分离原代人msc，进行培养和表征。
[0192]
人msc用合成的嵌合痘病毒，例如schpxv、scvacvacam2000-wr dup/hp或scvacv acam2000-acam2000 dup/hp进行感染。在37℃在无血清培养基中感染细胞2小时，同时不断旋转以防止细胞沉降。以2或4的感染复数(moi)感染细胞。孵育后，轻轻沉淀msc并去除上清液。将细胞铺板并使其在37℃孵育48小时。通过流式细胞术确定受感染细胞的百分比。
[0193]
载有合成嵌合痘病毒的msc的溶瘤活性是通过使用特定的高度增殖或中等增殖的细胞系或体内来确定的。实施例4.载有合成嵌合痘病毒的脂肪来源的干细胞(adsc)
[0194]
脂肪组织是间充质干细胞的理想来源。人脂肪组织从健康供体以在门诊就诊的脂肪活检样本获得。在切开筋膜之前，先切除2立方厘米的皮下脂肪。脂肪组织用手术刀切碎并于37℃在0.075％i型胶原酶(worthingtonbiochemical，lakewood，nj)中孵育90分钟。将消化的组织以400g离心5 分钟，用pbs洗涤沉淀，通过70μm细胞过滤器(bd biosciences，san jose, ca)，并在红细胞裂解缓冲液(154mm nh4cl，10mm khco3，0.1mm edta) 中孵育。在含5％pltmax(mill creek life sciences，rochester，mn)、100u/ml 青霉素、100g/ml链霉素和2mm l-谷氨酰胺(invitrogen，carlsbad,ca,usa) 的advanced mem中，以1.0-2.5
×
103个细胞/cm2的浓度在t-175cm2烧瓶中培养细胞，在37℃5％co2培养箱中3-4天。当细胞到达60-80％的汇合时，使用tryple(胰蛋白酶样酶，invitrogen)传代细胞。
[0195]
将细胞以等分试样在液氮中冷冻并储存直至使用。
[0196]
adsc用合成嵌合痘病毒例如schpxv、scvacv acam2000-wrdup/hp或scvacv acam2000-acam2000 dup/hp进行感染。在37℃在无血清培养基中感染细胞2小时，同时不断旋转以防止细胞沉降。以2或4的感染复数(moi)感染细胞。孵育后，轻轻沉淀adsc并去除上清液。将细胞铺板并使其在37℃孵育48小时。通过流式细胞术确定受感染细胞的百分比。
[0197]
载有合成嵌合痘病毒的adsc的溶瘤活性是通过使用特定的高度增殖或中等增殖的细胞系或体内来确定的。