免疫抑制性材料及相关方法与流程

免疫抑制性材料及相关方法
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本申请要求于2018年3月23日提交的第62/647,534号美国申请的权益，通过引用将其全部内容明确地并入本文。
[0003]
政府许可权声明
[0004]
本发明是在由美国国防威胁降低局(defense threat reduction agen cy)授予的授权号为hdtra1-13-1-0044的政府支持下和由美国国家科学基金会(national science foundation)授予的授权号为dmr-1708436的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
[0005]
发明背景
[0006]
当考虑将生物材料用于体内应用时，首要且最重要的要求是与人体具有生物相容性。除了惰性生物材料外，可以主动控制并调节免疫应答的功能性生物材料是另一种方法。发现凋亡细胞可以通过其表面上的外化磷脂酰丝氨酸(ps)将免疫细胞如巨噬细胞和树突细胞引导为免疫抑制表型，从而甚至在炎性激活区域中诱导免疫耐受。
[0007]
存在开发改进的不结垢聚合物以及包含这些具有有利的不结垢性能的聚合物的组合物和材料的需要。本发明试图满足这种需要并提供进一步的相关优点。
[0008]
发明概述
[0009]
本发明提供了两性离子磷脂酰丝氨酸(zps)单体、zps聚合物和zps共聚物，用于制备zps单体、zps聚合物和zps共聚物的方法，包含zps聚合物和zps共聚物的组合物和材料，和使用zps单体、zps聚合物和zps共聚物的方法。
[0010]
本发明还提供了非两性离子(中性)磷脂酰丝氨酸(nzps)单体、聚合物、共聚物，包含其的组合物和材料，和制备和使用其的方法。
[0011]
一方面，本发明提供了包含一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物的颗粒，其中所述聚合物偶联到所述颗粒。在一个实施方案中，所述颗粒具有微米或纳米级尺寸，并且包含偶联到所述颗粒的一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物。在某些实施方案中，所述聚合物共价地偶联到所述颗粒。在其他实施方案中，所述聚合物物理吸附到所述颗粒。如本文所使用，术语“微米级尺寸”是指直径为约1μm或更大的颗粒。如本文所使用，术语“纳米级尺寸”是指直径小于1μm的颗粒。
[0012]
在某些实施方案中，所述颗粒为生物分子，并且经修饰以包含所述聚合物的所述生物分子是生物缀合物。可用于本发明的代表性生物分子包括蛋白质、核酸、糖蛋白、脂质和蛋白多糖。代表性蛋白质包括酶、信号蛋白(例如，激素、细胞因子、调节蛋白、胰岛素、pd-1/pd-l1/2抑制剂)、止血或血栓形成蛋白、疫苗、补体系统蛋白和抗体或其功能片段或特征部分。在某些实施方案中，所述生物分子是先前经修饰的生物分子，如peg化的生物分子(例如，经修饰以包含一个或多个聚(乙二醇)的蛋白质。
[0013]
在其他实施方案中，所述生物分子是小分子治疗剂(分子量小于约1000g/mol，优选地小于约800g/mol的碳基治疗剂)。
[0014]
在另外的实施方案中，所述颗粒是药物递送载体。代表性药物递送载体包括胶束、
脂质体和聚合物囊泡(例如，包含一种或多种治疗剂和/或诊断剂)。
[0015]
在某些实施方案中，所述颗粒是细胞、病毒或细菌。
[0016]
在其他实施方案中，所述颗粒是水凝胶，如微凝胶或纳米凝胶。
[0017]
在另外的实施方案中，所述颗粒是金属、金属氧化物、陶瓷、合成聚合物、天然聚合物、晶体、半导体材料、石墨烯、氧化石墨烯、氧化铁或二氧化硅或量子点。
[0018]
在某些实施方案中，所述颗粒具有从所述颗粒接枝的一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物。在其他实施方案中，所述颗粒具有接枝到所述颗粒的一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物。
[0019]
在某些实施方案中，所述颗粒包含一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物，其具有下式的重复单元：
[0020][0021]
其中
[0022]
*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基；
[0023]
b为聚合物主链；
[0024]
l2为选自以下的连接基团：-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自1至20的整数；
[0025]
r2和r3独立地选自氢、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基；
[0026]
m为1至20的整数；
[0027]
p为1至20的整数；和
[0028]
n为约10至约500的整数。
[0029]
在其他实施方案中，所述颗粒包含一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物，其具有下式的重复单元：
[0030][0031]
其中
[0032]
*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基；
[0033]
r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基，
[0034]
r2和r3独立地选自氢、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0035]
r4和r5是可聚合官能团的聚合残基；
[0036]
l为c或si；
[0037]
l2为选自以下的连接基团：-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自1至20的整数；
[0038]
l3和l4独立地选自-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自0至20的整数；
[0039]
m为1至20的整数；
[0040]
p为1至20的整数；和
[0041]
n为约10至约500的整数。
[0042]
在另外的实施方案中，所述颗粒包含一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物，其具有下式的重复单元：
[0043][0044]
其中
[0045]
*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基；
[0046]
r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基；
[0047]
r2和r3独立地选自氢和c
1-c6烷基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0048]
x为o或nh，
[0049]
n为1至20的整数；
[0050]
m为1至20的整数；
[0051]
p为1至20的整数；和
[0052]
a为约10至约500的整数。
[0053]
另一方面，本发明提供了使颗粒具有免疫抑制性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物共价地偶联到所述颗粒。
[0054]
另一方面，本发明提供了基材表面，其具有共价地偶联到其的一种或多种两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物。
[0055]
在其他方面，本发明还提供了：具有微米或纳米级尺寸的颗粒，其包含共价地偶联到颗粒的一种或多种中性(非两性离子)磷脂酰丝氨酸聚合物；使颗粒具有免疫抑制性的方法，包括使一种或多种中性(非两性离子)磷脂酰丝氨酸聚合物共价地偶联到颗粒；和基材表面，其具有共价地偶联到其的一种或多种中性(非两性离子)磷脂酰丝氨酸聚合物。
[0056]
另一方面，本发明提供了zps单体。在这些实施方案中，所述单体包含共价偶联到两性离子磷脂酰丝氨酸部分的可聚合部分。
[0057]
在一个实施方案中，所述zps单体具有下式：
[0058][0059]
其中
[0060]
r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基；
[0061]
r2和r3独立地选自氢、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0062]
r4和r5独立地选自适合通过加成、缩合或自由基聚合而聚合的官能团；
[0063]
l为c或si；
[0064]
l2独立地选自-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-，其中x是1至20的整数；
[0065]
l3和l4独立地选自-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自0至20的整数；
[0066]
m为1至20的整数；和
[0067]
p为1至20的整数。
[0068]
在另一个实施方案中，所述zps单体具有下式：
[0069][0070]
其中，
[0071]
r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基，
[0072]
r2和r3独立地选自氢和c
1-c6烷基，或r2和r3与氮一起形成环，
[0073]
x为o或nh，
[0074]
n为1至20的整数，
[0075]
m为1至20的整数，和
[0076]
p为1至20的整数。
[0077]
另一方面，本发明提供了zps聚合物和共聚物。在这些实施方案中，所述zps聚合物或共聚物具有重复单元，其中一个或多个重复单元包含两性离子磷脂酰丝氨酸部分。在某些实施方案中，所述两性离子磷脂酰丝氨酸部分是来自聚合物主链的侧基。在其他实施方案中，所述两性离子磷脂酰丝氨酸部分是所述聚合物主链的组分(例如，两性离子磷脂酰丝氨酸部分的一部分在聚合物主链中)。
[0078]
在某些实施方案中，所述zps聚合物或共聚物包含具有下式的重复单元：
[0079][0080]
其中
[0081]
*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基；
[0082]
b为聚合物主链；
[0083]
l2为使zps部分连接到主链的连接基团，代表性基团包括-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自1至20的整数；
[0084]
r2和r3独立地选自氢、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0085]
m为1至20的整数；
[0086]
p为1至20的整数；和
[0087]
n为约10至约500的整数。
[0088]
在其他实施方案中，所述zps聚合物或共聚物包含具有下式的重复单元：
[0089]
[0090]
其中
[0091]
*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基；
[0092]
r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基；
[0093]
r2和r3独立地选自氢、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0094]
r4和r5独立地选自适合通过加成、缩合或自由基聚合而聚合的官能团的聚合残基；
[0095]
l为c或si；
[0096]
l2独立地选自-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-，其中x是1至20的整数；
[0097]
l3和l4独立地选自-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-，和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自0至20的整数；
[0098]
m为1至20的整数；
[0099]
p为1至20的整数；和
[0100]
n为约10至约500的整数。
[0101]
在另外的实施方案中，所述zps聚合物或共聚物包含具有下式的重复单元：
[0102][0103]
其中
[0104]
*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基；
[0105]
r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基；
[0106]
r2和r3独立地选自氢和c
1-c6烷基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0107]
x为o或nh；
[0108]
n为1至20的整数；
[0109]
m为1至20的整数；
[0110]
p为1至20的整数；和
[0111]
a为约10至约500的整数。
附图说明
[0112]
当结合附图时，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更加容易理解，因为通过参考以下详细描述，本发明的前述方面和许多伴随的优点变得更好理解。
[0113]
图1比较了通过elsia测量的mpc、nzps和zps水凝胶表面相对于对照tcps的相对纤维蛋白原吸附(％)。
[0114]
图2a比较了通过elisa测量的来自raw 264.7巨噬细胞(105个/孔)的上清液中的tnf-α分泌的水平，所述raw 264.7巨噬细胞经各种浓度(10、25、50、100、200、1000μg/ml)的mpc、nzps或zps纳米凝胶溶液处理18小时，然后经lps(100ng/ml)刺激48h。
[0115]
图2b比较了通过elisa测量的来自raw 264.7巨噬细胞(105个/孔)的上清液中的tnf-α分泌的水平，所述raw 264.7巨噬细胞经100μg/ml的mpc、nzps或zps纳米凝胶溶液处理18小时，然后经lps(100ng/ml)刺激48h，其中使用各种浓度(0、10、25、50、100、200μg/ml)的膜联蛋白v溶液，将所述纳米凝胶溶液预孵育6h。
[0116]
图2c比较了来自raw 264.7巨噬细胞(105个/孔)的恢复的荧光，所述raw 264.7巨噬细胞与包封fitc-bsa的mpc、nzps和zps纳米凝胶一起孵育30、60、120和180分钟，然后冲洗细胞并裂解，以检测恢复的荧光。
[0117]
图3a比较了相对于空白对照，dc 2.4树突细胞的cd40/cd80，所述dc 2.4树突细胞与天然尿酸酶、mpc-尿酸酶缀合物、nzps-尿酸酶缀合物和zps-尿酸酶缀合物一起孵育72小时，并染色用于流式细胞术。
[0118]
(b)保持未成熟状态的树突细胞(cd40-cd80-)的百分比汇总。(c)通过elisa试剂盒检测分泌到上清液中的tgf-β。
[0119]
图3b比较了对于图3a中描述的树突细胞，保持未成熟状态的树突细胞(cd40-cd80-)的百分比。
[0120]
图3c比较了对于图3a中描述的树突细胞，通过elisa测量的tgf-β分泌。
[0121]
图4a和4b比较了在小鼠中第一次(4a)和第三次(4b)注射后，天然尿酸酶、zps-尿酸酶、nzps-尿酸酶、mpc-尿酸酶缀合物的循环时间。
[0122]
图4c和4d比较了对尿酸酶或尿酸酶缀合物具有特异性的igm(4c)和igg(4d)的检测。在第21天处死小鼠，并收集其血清用于通过elisa测试检测对尿酸酶或尿酸酶缀合物具有特异性的igm和igg。
[0123]
图4e比较了相对于空白对照，小鼠cd4+cd25+脾细胞中的treg表型(foxp3+)细胞，所述小鼠cd4+cd25+脾细胞用天然尿酸酶、zps-尿酸酶缀合物、nzps-尿酸酶缀合物和mpc-尿酸酶缀合物处理72小时，然后染色用于流式细胞术。cd4+cd25+脾细胞中treg表型(foxp3+)细胞百分比汇总。
[0124]
图4f比较了如图4e中所述的处理的小鼠cd4+cd25+细胞中的treg％。
[0125]
发明详述
[0126]
一方面，本发明提供了两性离子磷脂酰丝氨酸(zps)单体、zps聚合物和zps共聚物，用于制备zps单体、zps聚合物和zps共聚物的方法，包含zps聚合物和zps共聚物的组合物和材料，和使用zps单体、zps聚合物和zps共聚物的方法。
[0127]
如本文所使用，术语“两性离子磷脂酰丝氨酸单体”或“zps单体”是指包含磷脂酰丝氨酸部分(nh
2-ch(-ch2o-p(＝o)(o-))-co2h及其离子形式)和另外的阳离子中心(例如，-n
+
(r
a
)(r
b
)-，其中r
a
和r
b
独立地为h或c
1-c3烷基)的均聚物或共聚物的可聚合的单体或侧基。均聚物或共聚物的单体或侧基由于阳离子n中心和阴离子磷酸中心而成为两性离子。
[0128]
代表性zps单体具有式(i)：
[0129][0130]
其中，在某些实施方案中，r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基(优选c
1-c6烷基)和c
6-c
12
芳基，r2和r3独立地选自氢和c
1-c6烷基，或r2和r3与氮一起形成环，x为o或nh，n为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)，m为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)，并且p为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)。
[0131]
如上所述，术语“两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物”或“zps聚合物”是指具有一个或多个包含磷脂酰丝氨酸部分的侧基和另外的阳离子中心的聚合物(即均聚物或共聚物)。该聚合物由于阳离子n中心和重复单元侧基中的阴离子磷酸中心而成为两性离子。
[0132]
通过使式(i)的单体聚合来制备zps均聚物聚合物，并且通过使式(i)的单体与共聚单体共聚来制备zps共聚物。这些zps聚合物(均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物)包含具有侧两性离子磷脂酰丝氨酸(zps)部分的重复单元，如下所示：
[0133][0134]
其中，在某些实施方案中，r1、r2、r3、x、n、m和p如以上针对式(i)的单体所述，a为约10至约500的整数，并且*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基。
[0135]
如本文所述，zps单体可以在标准聚合条件下容易地聚合以提供zps聚合物。
[0136]
zps单体、zps聚合物和zps共聚物
[0137]
在某些方面，本发明提供了zps单体以及由zps单体制备的zps聚合物和zps共聚物。
[0138]
本发明的单体包括：(a)zps单体，其主链选自硅氧烷、氟树脂(fluorinated)、肽、氨基甲酸酯、尿素、酰亚胺、碳酸酯、酸酐、磷腈、环氧树脂(epoxy)、砜和硫化物主链，以及除甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯主链以外的可降解主链，(b)线性zps交联剂，可降解和不可降解的zps基交联剂，或(c)提供聚合物主链中的zps基团或聚合物侧链中的zps基团的线性zps基单体。
[0139]
本发明的聚合物和共聚物包括包含含有zps基团的重复单元的聚合物和共聚物，例如均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、多嵌段共聚物和支链或星形聚合物，包括由本发明的一种或多种单体(例如，zps单体)的聚合(或共聚)制备的这样的聚合物。
[0140]
zps单体。一方面，本发明提供了zps单体。zps单体提供了包含含有zps的重复单元的zps聚合物和zps共聚物。重复单元和聚合物的zps基团可以是zps侧基(即，聚合物侧链)。
[0141]
在某些实施方案中，zps单体包含共价地偶联到两性离子磷脂酰丝氨酸部分的可聚合部分。
[0142]
在某些实施方案中，zps单体包括提供具有zps侧基(聚合物侧链)的聚合物或共聚物的单体。代表性zps单体具有以上示出的式(i)。其他代表性zps单体具有式(iii)：
[0143][0144]
其中
[0145]
r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基和c
6-c
12
芳基；
[0146]
r2和r3独立地选自氢、c
1-c
20
烷基(例如，c
1-c3烷基)和c
6-c
12
芳基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0147]
r4和r5独立地选自适合通过加成、缩合或自由基聚合而聚合的官能团；
[0148]
l为c或si；
[0149]
l2独立地选自-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-，其中x是1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)；
[0150]
l3和l4独立地选自-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自0至20，优选1至20的整数(在某些实施方案中，l3和/或l4不存在)；
[0151]
m为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)；和
[0152]
p为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)。
[0153]
实施例1中描述了可用于制备本发明的聚合物和共聚物的代表性zps单体的制备。
[0154]
应当理解的是，用于制备本发明的表面涂层、本体材料、独立材料、水凝胶和缀合物的本发明的zps聚合物和共聚物可以由本文所述的单体，包括式(i)的甲基丙烯酸酯/甲基丙烯酰胺zps单体和式(iii)的zps单体制备。
[0155]
zps聚合物和共聚物。在其他方面，本发明提供了如本文所述的由zps单体制备的zps聚合物，并且其包含zps重复单元。
[0156]
在某些实施方案中，zps聚合物或共聚物具有重复单元，其中一个或多个重复单元包含两性离子磷脂酰丝氨酸部分。在这些实施方案的某些方案中，两性离子磷脂酰丝氨酸部分是来自聚合物主链的侧基。在这些实施方案的其他方案中，两性离子磷脂酰丝氨酸部分是聚合物主链的组分(例如，两性离子磷脂酰丝氨酸部分的一部分在聚合物主链中)。
[0157]
在这些聚合物和共聚物的某些实施方案中，聚合物和共聚物主链可以是聚酯、多肽、聚酰亚胺、聚磷腈、聚硅氧烷、聚环氧树脂、乙烯基聚合物、酚醛聚合物、聚氨酯、聚脲、聚
碳酸酯、聚砜或聚硫化物中的任一种。
[0158]
本发明的zps聚合物和共聚物包括由式(i)和(iii)的单体制备的聚合物和共聚物。聚合物可以通过(a)式(i)的单体，(b)式(iii)的单体或(c)式(i)和(iii)的共聚单体的聚合而形成。可以通过以下的共聚来制备共聚物：(a)式(i)的单体和适合与式(i)的单体共聚的第二共聚单体，(b)式(iii)的单体和适合与式(ii)的单体共聚的第二共聚单体，和(c)式(i)的单体和适合与式(i)的单体共聚的式(iii)的单体。
[0159]
在某些实施方案中，zps单体提供了包含zps部分的聚合物重复单元，该zps部分是来自聚合物主链的侧基(即，形成聚合物侧链的一部分)。具有作为来自聚合物主链的侧基的zps部分的代表性聚合物具有如上所示的式(ii)。其他代表性zps聚合物具有式(iv)：
[0160][0161]
其中
[0162]
*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物或共聚物端基；
[0163]
b为如上所述的聚合物主链；
[0164]
l2是使zps部分连接到主链的连接基团，代表性基团包括-(ch2)
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自1至20的整数；
[0165]
r2和r3独立地选自氢、c
1-c
20
烷基(例如，c
1-c3烷基，包括环烷基，如c
3-c7环烷基)和c
6-c
12
芳基，或r2和r3与氮一起形成环；
[0166]
m为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)；
[0167]
p为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)；和
[0168]
n为约10至约500的整数。
[0169]
在其他实施方案中，具有作为来自聚合物主链的侧基的zps部分的代表性聚合物具有式(v)：
[0170][0171]
其中r1、r2、r3、r4、r5、l、l2、l3、l4、m、p和*如以上针对式(iii)的单体所述，其中应理解式(v)中的r4和r5分别为式(iii)中官能团r4和r5的聚合残基；n为约10至约500的整数。
[0172]
在某些实施方案中，zps聚合物的两性离子磷脂酰丝氨酸部分至少部分包含在聚合物主链中。
[0173]
在这些实施方案的某些方案中，zps聚合物具有包括下式的重复单元：
[0174][0175]
其中l2、p和*如以上针对式(iv)的聚合物所述，其中应理解l2偶联到b的点是n+(r1)的氮(即，与l2共价地偶联的b中的原子)；并且n为约10至约500的整数。
[0176]
在这些实施方案的其他方案中，zps聚合物具有包含下式的重复单元：
[0177][0178]
其中r1、r4、r5、l2、l3、l4、p和*如以上针对式(iii)的单体所述，其中应理解式(va)中的r4和r5分别是式(iii)中的官能团r4和r5的聚合残基；并且n为约10至约500的整数。
[0179]
在某些实施方案中，本发明提供了包含式(ii)、(iv)、(iva)、(v)或(va)的聚合物的改性表面。改性表面可以是人造神经系统、神经元再生平台、神经传感器、细胞培养平台、不结垢半导体、电池、有机太阳能电池、生物燃料电池、印刷电子电路、有机发光二极管、致动器、电致变色装置、超级电容器、化学传感器、柔性透明显示器、电磁屏(electromagnetic shield)、抗静电涂层、微波吸收装置或雷达吸收装置的表面。
[0180]
在某些实施方案中，本发明提供了包含式(ii)、(iv)、(iva)、(v)或(va)的聚合物的本体构建体(bulk construct)。代表性构建体可以是医疗、电子或海上装置。在这些实施方案的某些方案中，本体构建体是人造神经系统、神经元再生平台、神经传感器、细胞培养平台、不结垢半导体、电池、有机太阳能电池、生物燃料电池、印刷电子电路、有机发光二极管、致动器、电致变色装置、超级电容器、化学传感器、柔性透明显示器、电磁屏、抗静电涂层、微波吸收装置或雷达吸收装置。
[0181]
zps星形聚合物和共聚物。在其他方面，本发明提供了包含zps重复单元的zps星形聚合物和zps共聚物。
[0182]
这些聚合物包括核和共价地偶联到核的多个zps支链。这些聚合物的核可以是小分子、低聚物或具有星形形状的聚合物。在某些实施方案中，这些聚合物可包括三个、四个、五个或更多个zps支链。在这些实施方案的某些方案中，zps支链中的一个或多个本身可以进一步支化。在某些实施方案中，这些聚合物还可以包括结合到多个zps支链的末端的末端官能团。代表性末端官能团选自oh、nh、nh2、sh、n3、ch＝ch2、c≡ch、cooh、cho、亚氨酸酯、卤代乙酰基、酰肼、烷氧基胺、芳基叠氮化物、双吖丙啶、马来酰亚胺、碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、噻唑烷-2-硫酮、吡啶基二硫化物、二氟环辛炔、施陶丁格(staudinger)试剂对、异氰酸酯、异硫氰酸酯、硫醚、巯基、肼、羟甲基膦、磺基-nhs酯、五氟苯基酯、磺酰叠氮化物和5h-二苯并[b,f]氮杂环庚三烯及其衍生物。
[0183]
zps共聚物：疏水和亲水结构单元。在另外的方面，本发明提供了包含zps重复单元和疏水性和/或亲水性结构单元的zps共聚物。
[0184]
在某些实施方案中，共聚物是包含zps重复单元(例如，聚(zps))的无规、二嵌段或
超支化共聚物。
[0185]
代表性嵌段共聚物包括至少一种zps组分嵌段(a)；和至少一种疏水性嵌段(b)。在某些实施方案中，共聚物还包含亲水性嵌段(c)或第二疏水性嵌段(c)。本发明的嵌段共聚物包括ab二嵌段共聚物、abc三嵌段共聚物、aba三嵌段共聚物、bab三嵌段共聚物、线性或星形多嵌段(ab)
n
共聚物，杂臂(miktoarm)嵌段共聚物(ab
n
或a
n
b)及其混合物。在某些实施方案中，共聚物还包含中性亲水重复单元(例如，环氧烷重复单元，例如环氧乙烷重复单元)。
[0186]
在某些实施方案中，共聚物包含zps组分和疏水性组分，所述zps组分包含衍生自zps单体(例如，具有式(i)或(iii)的本发明的zps单体)的重复单元，所述疏水性组分包含衍生自疏水性单体的重复单元。
[0187]
代表性的疏水性重复单元可以衍生自丙烯酸和酯、烷基丙烯酸和酯、丙烯酰胺、烷基丙烯酰胺、聚硅氧烷重复单元、聚酯重复单元、聚氨酯重复单元、聚苯乙烯重复单元及其氟化衍生物。
[0188]
在某些实施方案中，共聚物包含zps组分、亲水性组分和任选的疏水性组分，所述zps组分包含衍生自zps单体(例如，具有式(i)或(iii)的本发明的zps单体)的重复单元，所述亲水性组分包含衍生自亲水性单体的重复单元，所述疏水性组分包含衍生自亲水性单体的重复单元。在这些实施方案的某些方案中，亲水性重复单元包含zps部分。在其他实施方案中，亲水性重复单元可以是聚甲基丙烯酸羟乙酯(phema)、聚乙二醇(peg)、聚羧基甜菜碱(pcb)、聚磺基甜菜碱(psb)、聚磷酸甜菜碱(ppb)、聚磷酰胆碱(ppc)、聚丙烯酰胺(paa)、聚(甲基丙烯酸2,3-二羟丙酯)(pdhpm)、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚丙烯酰胺(pam)、聚(2-噁唑啉)、聚(丙烯酸)、聚甲基丙烯酸酯(pma)、聚乙烯醇(pva)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚电解质、多糖、聚酰胺和其他亲水性聚合物、肽基材料以及两种或更多种亲水性单体的共聚物。
[0189]
zps聚合物表面涂层、本体材料和独立材料
[0190]
在其他方面，本发明提供了zps聚合物表面涂层、zps聚合物本体材料和zps聚合物独立材料。在某些实施方案中，zps聚合物表面涂料、本体材料和独立材料由zps单体和由zps单体制备的聚合物和共聚物制备。
[0191]
zps聚合物可以通过“接枝自”或“接枝到”方法连接到表面(例如，医疗装置、传感器、膜、船和海上结构)上，以使表面不结垢。zps聚合物也可以与本体材料(例如硅氧烷)共混或共混到本体材料(例如硅氧烷)中。表面涂层可以在平坦表面或纳米颗粒/微粒表面上。zps聚合物还可以通过(i)独特的主链，如硅氧烷、氟树脂、氨基甲酸酯、酰亚胺、酰胺，和(ii)强相互作用，如多个氢键，以及(iii)互穿网络制备成用于医疗和海上应用的独立的低结垢和高强度的材料和装置。
[0192]
zps聚合物表面涂层。本发明提供了zps聚合物表面涂料。在某些实施方案中，表面涂层包含如本文所述的本发明的zps聚合物(低聚物)或zps共聚物(例如，式(ii)、(iv)、(iva)、(v)或(va)的聚合物)。
[0193]
涂覆有zps聚合物和共聚物的表面具有不结垢性能。可以通过纤维蛋白原吸附和细胞粘附来评价表面的不结垢性能。在某些实施方案中，本发明的表面具有小于约200ng/cm2的纤维蛋白原吸附。在其他实施方案中，本发明的表面具有小于约100ng/cm2的纤维蛋白原吸附。在另外的实施方案中，本发明的表面具有小于约50ng/cm2的纤维蛋白原吸附。在其
他实施方案中，本发明的表面具有小于约30ng/cm2的纤维蛋白原吸附。在另外的实施方案中，本发明的表面具有小于约20ng/cm2的纤维蛋白原吸附。在其他实施方案中，本发明的表面具有小于约10ng/cm2的纤维蛋白原吸附。在某些实施方案中，本发明的表面具有小于约5ng/cm2的纤维蛋白原吸附。
[0194]
在某些实施方案中，表面涂覆有zps聚合物或共聚物，该zps聚合物或共聚物由一种或多种选自可聚合基团的zps单体制备，所述可聚合基团包括但不限于zps丙烯酸酯、zps丙烯酰胺、zps甲基丙烯酸酯、zps甲基丙烯酰胺、zps乙烯基化合物、zps环氧化物及其混合物。代表性zps单体包括本文所述的那些，包括式(i)和(iii)的zps单体。
[0195]
在某些实施方案中，zps聚合物或共聚物是包含聚(zps)的无规、多嵌段或超支化共聚物。在其他实施方案中，zps聚合物或共聚物是互穿的zps聚合物网络。
[0196]
在某些实施方案中，zps聚合物或共聚物具有表面粘附基团(例如，dopa、硫醇、硅烷、点击化学、疏水性、亲水性和带电基团)。
[0197]
可以通过将zps聚合物或共聚物通过共价相互作用、物理疏水-疏水、电荷-电荷和水凝胶键合相互作用或其化学和物理相互作用的组合连接到基材表面，来制备涂覆有zps聚合物和共聚物的表面。
[0198]
可以通过从基材表面接枝zps聚合物(“接枝自”)来制备涂覆有zps聚合物或共聚物的表面(例如，通过在基材的存在下聚合合适的单体形成聚合物或共聚物来制备聚合物表面)，或可以通过将zps聚合物接枝到基材表面(“接枝到”)来制备涂覆有zps聚合物或共聚物的表面(例如，通过将预形成的聚合物或共聚物偶联到基材来制备聚合物表面)。
[0199]
在某些实施方案中，zps聚合物和共聚物通过聚合方法，例如原子转移自由基聚合(atrp)、可逆加成-断裂链转移聚合(raft)或光引发转移终止聚合(photoinferter polymerization)从基材接枝。
[0200]
在某些实施方案中，通过缀合方法，例如点击化学、dopa缀合化学或自组装单层(sam)，通过硫醇或硅烷将zps聚合物和共聚物接枝到基材。
[0201]
zps聚合物表面涂层可以施加到多种基材(例如基材表面)。在某些实施方案中，表面是生物医学装置的全部或部分。代表性的生物医学装置包括导管、耳道引流管、饲管、青光眼引流管、脑积水分流器、角膜假体、神经引导管、组织粘合剂、x射线引导器、人造关节、人造心脏瓣膜、人造血管、起搏器、左心室辅助装置(lvad)、动脉移植物、血管移植物、支架、血管内支架、心脏瓣膜、关节置换物、血管假体、皮肤修复装置、耳蜗置换物、隐形眼镜、人造韧带和肌腱、牙科植入物以及用于再生组织工程的组织支架。在某些实施方案中，该装置是隐形眼镜。
[0202]
在某些实施方案中，表面是颗粒的全部或部分。代表性颗粒包括金属、金属氧化物、陶瓷、合成聚合物、天然聚合物、二氧化硅、晶体和半导体材料颗粒。在某些实施方案中，颗粒是生物分子，例如蛋白质(例如酶)或核酸(例如dna或rna)。在其他实施方案中，颗粒是细胞。
[0203]
在某些实施方案中，表面是膜或生物分离膜的全部或部分。代表性的膜包括用于蛋白质纯化、废水处理、生物反应器、海水淡化和水/油纯化的膜。
[0204]
在某些实施方案中，所述表面在药物递送载体上，或形成药物递送载体的全部，所述药物递送载体如基因递送载体、rna递送载体或蛋白质递送载体。
[0205]
在某些实施方案中，所述表面在可植入或皮下传感器上，或形成可植入或皮下传感器的全部或部分。
[0206]
在某些实施方案中，所述表面在组织支架上，或形成组织支架的全部或部分。
[0207]
zps聚合物本体材料。本发明提供了zps聚合物本体材料。在某些实施方案中，本体材料包含如本文所述的本发明的zps聚合物(低聚物)或zps共聚物(例如，式(ii)、(iv)、(iva)、(v)或(va)的聚合物)。在某些实施方案中，使用如本文所述的本发明的单体(例如，式(i)或(iii)的单体)通过聚合或共聚方法制备材料。
[0208]
在某些实施方案中，通过将一种或多种zps聚合物或共聚物与一种或多种其他聚合物共混而获得本体材料，所述其他聚合物例如聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚脲、聚硫化物、聚砜、聚酰亚胺、聚环氧树脂、芳族聚酯、纤维素、含氟聚合物、聚丙烯酸类聚合物、聚酰胺、聚酸酐、聚醚、乙烯基聚合物、酚醛树脂、弹性体和其他加成聚合物。
[0209]
在其他实施方案中，本体材料包含互穿的zps聚合物网络和一种或多种其他聚合物，如聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚脲、聚硫化物、聚砜、聚酰亚胺、聚环氧树脂、芳族聚酯、纤维素、含氟聚合物、聚丙烯酸类聚合物、聚酰胺、聚酸酐、聚醚、乙烯基聚合物、酚醛树脂、弹性体和其他加成聚合物。
[0210]
zps聚合物独立材料。本发明提供了zps聚合物独立材料。在某些实施方案中，材料包含本文所述的本发明的zps聚合物(低聚物)或zps共聚物(例如，式(ii)、(iv)、(iva)、(v)或(va)的聚合物)。在某些实施方案中，使用本文所述的本发明的单体(例如，式(i)或(iii)的单体)通过聚合或共聚方法制备材料。
[0211]
在某些实施方案中，zps聚合物独立材料是不结垢材料并且具有高机械强度。在这些实施方案的某些方案中，独立材料是蛋白吸附小于约30，小于约50或小于约100ng/cm2，拉伸/压缩强度大于约0.2，大于约0.5或大于约1.0mpa的不结垢材料。
[0212]
在某些实施方案中，zps聚合物独立材料是zps聚合物网络，其通过引入(a)偶极-偶极相互作用，如氰基基团(c≡n)和(b)氢供体/受体，如酰胺基团((nh)-(c＝o)-)、多酰胺基团(-(nh)-(c＝o)-)
n
(n＝1-5))、氨基甲酸酯基团((nh)-(c＝o)-o-)、多氨基甲酸酯基团((-(nh)-(c＝o)-o-)
n
(n＝1-5))、脲基团(-(nh)-(c＝o)-(nh)-)、多脲基团(-(nh)-(c＝o)-(nh)-)
n
(n＝1-5))及它们的组合来增强。这些基团可以衍生自zps单体和zps(无规或嵌段)共聚物。这些基团可以在聚合物主链或聚合物侧基中。
[0213]
zps聚合物网络可以用zps单体或zps聚合物中的主链来增强，所述主链例如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚酰胺、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚异丁烯、聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚脲、聚硫化物、聚砜、聚酰亚胺、聚环氧化物、聚酸酐、聚醚和其他缩合/加成聚合物。在某些实施方案中，通过以上的任意组合来增强zps聚合物网络。
[0214]
在某些实施方案中，zps聚合物可以与其他聚合物或复合材料形成共聚物，所述其他聚合物或复合材料例如聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚脲、聚硫化物、聚砜、聚酰亚胺、聚环氧化物、芳族聚酯、纤维素、含氟聚合物、聚丙烯酸、聚酰胺、聚酸酐、聚醚、乙烯基聚合物、酚醛树脂、弹性体和其他加成聚合物。可以添加纤维、粘土、纳米管和其他无机物体，以提高这些材料的机械性能。
[0215]
本发明的zps独立材料可以通过各种方法，例如注射成型、吹塑成型、挤出成型、压
延成型、流延成型、压塑成型、多义度成型(prevarication molding)和3d打印形成物体。
[0216]
本发明的zps独立材料可用于生物医学/生物技术、消费产品、工程/海上、治疗/诊断应用，如导管、耳道引流管、饲管、青光眼引流管、脑积水分流器、角膜假体、神经引导管、组织粘合剂、x射线引导器、人造关节、人造心脏瓣膜、人造血管、起搏器、左心室辅助装置(lvad)、动脉移植物、血管移植物、支架、血管内支架、心脏瓣膜、关节置换物、血管假体、皮肤修复装置、耳蜗置换物、隐形眼镜、人造韧带和肌腱、牙科植入物和用于再生组织工程的组织支架，药物递送、基因递送、rna递送、蛋白递送、海上和工程装置/物体(例如膜、管、管道、容器或板)。
[0217]
在某些实施方案中，独立材料可以用于海上产品中，例如海上船体、海上结构、桥梁、螺旋桨、热交换器、潜望镜、传感器、鱼网、电缆、管/管道、容器、膜和防油栅(oil boom)。
[0218]
在某些实施方案中，独立材料可以与生物材料结合。代表性的生物材料包括核酸(例如基因、dna、rna)、蛋白(例如酶、抗体或其功能片段)、肽、脂质、细胞或微生物、固体纳米颗粒(氧化铁、二氧化硅、量子点或金纳米颗粒)，或用于防止表面活性剂使皮肤脱水。
[0219]
zps聚合物水凝胶
[0220]
本发明提供了zps聚合物水凝胶。在某些实施方案中，水凝胶包含如本文所述的本发明的交联的zps聚合物(低聚物)或zps共聚物(例如，式(ii)、(iv)、(iva)、(v)或(va)的聚合物)。在某些实施方案中，使用本文所述的本发明的单体(例如，式(i)或(iii)的单体)通过聚合或共聚方法制备水凝胶。
[0221]
zps聚合物水凝胶可以由zps单体和各种交联剂产生，包括可降解或不可降解的zps交联剂。可以通过形成水凝胶(例如通过点击化学)来制备zps星形聚合物。这些水凝胶可以是本体水凝胶或粒状水凝胶的形式。这些水凝胶可以用作可植入的材料和装置，以减少包膜(capsule)形成，并用作以受控方式保护、扩增、保存和分化各种细胞(例如干细胞、免疫细胞、胰岛、血小板和心肌细胞)的介质。粒状和星形水凝胶可以与生物制品(例如用于肿瘤疫苗的各种细胞和肿瘤)一起注射。
[0222]
在某些实施方案中，zps水凝胶是使用一种或多种交联剂由一种或多种zps单体(例如，式(i)或(ii)的单体)制备的交联的水凝胶。
[0223]
在这些实施方案的其他方案中，交联剂是多官能两性离子交联剂，其包括羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或磷酸甜菜碱部分。
[0224]
在这些实施方案的另外的方案中，交联剂是多官能交联剂，例如n,n'-亚甲基双丙烯酰胺(mbaa)、聚乙二醇(peg)二丙烯酸酯或二丙烯酰胺，或peg二甲基丙烯酸酯或二甲基丙烯酰胺。
[0225]
在某些实施方案中，使用双官能zps交联剂制备水凝胶。在其他实施方案中，使用可降解或不可降解的交联剂制备水凝胶。在进一步的实施方案中，使用可降解的两性离子二硫化物交联剂制备水凝胶。在其他实施方案中，使用可被酶或合适的试剂降解的基于肽的交联剂制备水凝胶。
[0226]
可以通过自由基介导的聚合技术，例如热、光或氧化还原来制备本发明的zps水凝胶。
[0227]
实施例4中描述了本发明的代表性的zps水凝胶的制备。实施例4中描述了代表性的zps水凝胶的蛋白吸附和细胞粘附。
[0228]
本发明的zps水凝胶可用于生物传感器和生物医学装置、血管移植物、血管内支架、心脏瓣膜、关节置换物、细胞保存/扩增/分化、药物递送平台、船体、海上结构/装置以及与生理环境接触的其他材料和装置。
[0229]
在某些实施方案中，zps水凝胶是星形水凝胶。星形水凝胶可以由具有核和多个共价偶联到核上的zps基或两性离子支链的聚合物制备。代表性的核包括具有三个、四个、五个或更多个支链的星形的小分子、低聚物或聚合物中的一种。
[0230]
在某些实施方案中，水凝胶通过可选择性地(即在特定条件下)降解的可降解交联剂交联。所述可降解的交联剂可以选自肽交联剂、多糖交联剂、酸酐交联剂、二硫化物交联剂和聚酯交联剂。对于这些实施方案中的某些方案，水凝胶可以被酶水解或消化。
[0231]
在某些实施方案中，星形水凝胶支链聚合物包含结合到支链末端(例如，多个zps或两性离子支链的末端)的末端官能团。代表性的末端官能团包括oh、nh、nh2、sh、n3、ch＝ch2、c≡ch、cooh、cho、亚氨酸酯、卤代乙酰基、酰肼、烷氧基胺、芳基叠氮化物、双吖丙啶、马来酰亚胺、碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、噻唑烷-2-硫酮、吡啶基二硫化物、二氟环辛炔、施陶丁格(staudinger)试剂对、异氰酸酯、异硫氰酸酯、硫醚、巯基、肼、羟甲基膦、磺基-nhs酯、五氟苯基酯、磺酰叠氮和5h-二苯并[b,f]氮杂环庚三烯。
[0232]
在某些实施方案中，水凝胶包含结合到一种或多种第二聚合物/共聚物(第二星形水凝胶)的第一聚合物/共聚物(第一星形水凝胶)。水凝胶可以用作可注射水凝胶。在这些实施方案的某些方案中，第一聚合物通过末端官能团结合到一种或多种第二聚合物。
[0233]
星形水凝胶可以与两性离子水凝胶组合，并在特定模板中或通过机械减小(例如共混器)形成各种尺寸的粒料。这些粒状水凝胶可用作具有或不具有生物内容物的可注射水凝胶。
[0234]
本发明的zps星型水凝胶可以通过以下制备：(a)通过atrp、raft、rop、缩合、michael加成、支链产生/增长反应合成zps或两性离子支链，和(b)使zps或两性离子支链与核反应以提供星形聚合物。在某些实施方案中，该方法进一步包括通过“点击”反应、硫醇交换反应或还原反应使zps或两性离子支链的末端官能化。
[0235]
在某些实施方案中，zps水凝胶是微凝胶。本发明的微凝胶是微米级的、交联的水凝胶，其尺寸在约1微米(10-6
m)至1mm(10-2
m)之间，由zps基单体组成，并通过任意交联化学物质支撑。
[0236]
本发明的微凝胶可以使用官能化的zps单体、低聚物或聚合物，通过多种方法制备，其中：
[0237]
(a)选自叠氮化物和炔烃、叠氮化物和烯烃、硫醇和马来酰亚胺、硫醇和烯烃、硫醇和二硫化物、或任意其他“点击”、生物正交或其他反应对的反应对之一；
[0238]
(b)位于(多种)聚合物结构的末端或沿着主链；
[0239]
(c)整合肽、核酸、蛋白、抗体、纳米颗粒、微米颗粒、胶束、脂质体、聚合物囊泡(polymersome)、药物、药物前体或其他治疗物质或药物递送形式，用于外科应用、治疗应用、伤口愈合应用、药物递送制剂、细胞存储和保存或再生医学。
[0240]
在某些实施方案中，微凝胶包含zps单体或聚合物与其他类型的离子或非离子不结垢单体或聚合物的混合物，或zps基聚合物与其他类型的离子或非离子单体的共聚物。
[0241]
对于微凝胶，使用物理和/或化学机理的任意组合来实现交联，在某些实施方案
中，这些机理包括：
[0242]
(a)通过自由基介导的反应与单体共聚的任意结构的化学交联剂，包括市售的基于聚乙二醇(peg)、低聚乙二醇(oeg)或其他结构或基团的交联剂，其以两种或多种丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、马来酰亚胺或类似的反应性基团封端，或包含任意官能、反应性或可降解基团的定制合成的交联剂。任选的可降解基团可以选自二硫键、酯、酸酐、可酶裂解的肽(例如gpqgiwcg基序)或对外部刺激有反应的化学物质。
[0243]
(b)生物正交交联化学和“点击”化学，例如叠氮化物/炔烃(包括spaac)和硫醇-烯化学，其通过包含作为在(多条)主聚合物链或结构中的官能团或作为单独的交联分子；
[0244]
(c)任意类型的物理相互作用，包括离子相互作用、氢键、疏水相互作用、与天然或合成来源的生物分子或纳米颗粒的相互作用或任意其他可逆或不可逆的物理相互作用；和
[0245]
(d)上述交联机理的任意组合。
[0246]
在某些实施方案中，微凝胶是使用双官能zps交联分子、包含一种或多种zps部分的低聚物或聚合物或这些分子的混合物制备的。
[0247]
在某些实施方案中，微凝胶是使用两性离子(羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或磷酸甜菜碱)交联分子、包含一种或多种两性离子部分的低聚物或聚合物或这些分子的混合物来制备。这些交联剂可以包含可降解基团，例如二硫键、酯或刺激响应基团或可降解肽。
[0248]
在某些实施方案中，如上所述，本发明提供了由两种或更多种组装的微凝胶形成的材料，其中每种离散的微凝胶之间的相互作用产生具有独特性质的本体材料。这些材料可以包括其他成分，例如小分子药物、肽、生物分子、纳米颗粒、细胞或组织。
[0249]
在某些实施方案中，上述微凝胶和组装体是由微凝胶制备的，所述微凝胶由于聚合方法例如微乳液聚合而具有有限尺寸。
[0250]
在其他实施方案中，微凝胶衍生自上述(本体)水凝胶或上述星形水凝胶，在聚合后，使用将水凝胶研磨、挤出、切碎、切割或造粒成有限尺寸的离散单元的任何加工步骤，进一步将其尺寸设定至有限尺寸。
[0251]
可以将上述微凝胶和组装体干燥或冻干(冷冻干燥)为脱水粉末，用于储存、运输、使用或灭菌。微凝胶粉末可以用任何水性流体再水合，所述水性流体包括水、盐水或离子溶液，含有或不含有细胞的细胞生长或保存介质，或者可以含有治疗药物、治疗蛋白、治疗核酸、细胞、纳米颗粒或微米颗粒的任何其他生理相关溶液。
[0252]
zps星型水凝胶和微凝胶及它们的组装体和/或它们的部分或完全干燥或再水化的组合物具有以下用途：
[0253]
(a)具有非牛顿行为的材料(例如，表现出粘弹性、震凝性、触变性、剪切增稠(膨胀)、剪切稀化(假塑性)和/或宾汉姆塑性性质)；
[0254]
(b)自愈合材料和/或形状记忆材料，或类似类别的“智能”材料，可在损伤或外部刺激后修复损伤或恢复其性质；和
[0255]
(c)防止非特异性蛋白或其他生物分子吸附的防结垢材料或表面涂层，例如用于海上应用、药物递送平台、生物传感器和其他医疗装置、血管移植物、血管内支架、心脏瓣膜、关节置换物以及与生理环境接触的其他材料和装置。
[0256]
zps星型水凝胶和微凝胶及它们的组装体可以用作用于生物医学应用的可注射或可铺展材料，特别是在需要非牛顿流体性质和高生物相容性的应用中：
[0257]
(a)能够机械支撑的可注射或可铺展材料，例如用于美容或重建手术、血管假体、皮肤修复装置、耳蜗置换物、可注射玻璃体物质、人造软骨、人造脂肪、胶原模拟物和其他软组织模拟物或支撑物的材料的那些；
[0258]
(b)与表面或组织具有期望或特异性生物学相互作用的可注射或可铺展材料，特别是在应避免非特异性相互作用或必须实现非特异性/特异性相互作用的期望的平衡时；和
[0259]
(c)用于外科应用、治疗应用、伤口愈合和药物递送制剂的递送和/或保护或屏蔽药物、生物分子(例如核酸、肽、蛋白、多糖)、细胞(例如胰岛、心血管细胞、干细胞、t细胞、血细胞)、纳米颗粒或微米颗粒(例如，plga/药物制剂)、胶束、脂质体、聚合物囊泡或其他治疗物质或药物递送形式的可注射或可铺展的载体。
[0260]
zps星形水凝胶和微凝胶及它们的组装体可用作细胞和组织的生长、维持或扩增的支架、基质或基材，其中细胞和微凝胶构建体可使用任何培养方法或装置，包括任何类型的生物反应器生长，并且可以源自以下谱系，包括：
[0261]
(a)多能(pluripotent)和多潜能(multipotent)干细胞和祖细胞，包括：
[0262]
(i)胚胎干细胞(esc)、组织来源的干细胞(例如，来自皮肤、血液或眼睛)、源自或纯化自脐带血或骨髓的造血干细胞和祖细胞(hspc)、间充质干细胞或诱导性多能干细胞(ipsc)，
[0263]
(ii)基因修饰或转染的干细胞和祖细胞，以及
[0264]
(iii)癌症干细胞(csc)；
[0265]
(b)通常在人血液中循环的造血细胞，包括红细胞(红血球)，白细胞(白血球)和血小板(凝血细胞)；
[0266]
(c)免疫细胞和祖细胞或其分化的谱系，包括：
[0267]
(i)表达cd8表面糖蛋白的t细胞，特别包括初始细胞毒性t淋巴细胞(ctl)及其分化或激活的谱系，包括中枢记忆t细胞，
[0268]
(ii)表达cd4表面糖蛋白的t细胞，特别包括初始辅助t淋巴细胞，及其分化或激活的谱系，包括th1、th2、th9、th17、tfh、treg和中枢记忆(tcm)t细胞，
[0269]
(iii)来自任何来源的调节性t细胞(treg)，天然treg或诱导型treg，
[0270]
(iv)自然杀伤t细胞(nkt)，
[0271]
(v)嵌合抗原受体t细胞(car-t)，
[0272]
(vi)基因修饰t细胞；
[0273]
(d)上面未具体列出的b细胞、树突细胞和其他抗原呈递细胞(apc)或免疫细胞；
[0274]
(e)胰岛或可用于治疗和管理糖尿病的其他产生胰岛素的细胞和β细胞；
[0275]
(f)神经系统细胞和祖细胞；
[0276]
(g)心血管系统细胞和祖细胞；和
[0277]
(h)可用于免疫疗法、再生医学、血液疾病或恶性肿瘤或癌症疫苗或治疗领域的细胞。
[0278]
zps星形水凝胶和微凝胶及它们的组装体可用作生物相容性材料、支架、制剂组分或接触材料，用于保存细胞或组织或保留它们的生物学功能以用于临床或军事用途的任何方法，特别是用于在室温或低温下，在全血或保存溶液中，以及在有或没有dmso、甘油、甘氨
酸甜菜碱或其它渗透剂或冷冻保护剂存在的情况下，难以用常规方法长时间保存的细胞类型，如血细胞(例如血小板和红细胞)。
[0279]
zps星形水凝胶和微凝胶及它们的组装体可用于物体、装置和组件，例如可植入生物传感器；伤口护理装置、胶和密封剂、隐形眼镜；牙科植入物；矫形装置，如人造关节、人造骨、人造韧带和人造肌腱；心血管装置，如导管、人造瓣膜、人造血管、人造支架、lvad或心律管理装置；肠胃科装置，如进食管、消化道夹、肠胃套管或胃球囊；ob/gyn装置，如可植入的节育装置或阴道吊带；肾脏科装置，如吻合连接器或皮下端口；神经外科装置，如神经引导管、脑脊液引流管或分流器；皮肤科装置，如皮肤修复装置；眼科装置，如分流器；耳鼻喉科装置，如支架、耳蜗植入物、管、分流器或扩张器；眼内透镜；美学植入物，如乳房植入物、鼻植入物和脸颊植入物；神经科植入物，如神经刺激装置、耳蜗植入物和神经导管；激素控制植入物，如血糖传感器和胰岛素泵；植入式生物传感器；接入端口装置；和组织支架肺装置，如用于管理copd的瓣膜或人工肺；放射学装置，如不透射线或不透声的标记物；或泌尿科装置，如导管或人造尿道。
[0280]
在其他方面，本发明提供了涂覆有zps星形水凝胶或微凝胶或微凝胶组装体的基材。代表性的基材包括物体、装置和组件，如可植入生物传感器；伤口护理装置、胶和密封剂、隐形眼镜；牙科植入物；矫形装置，如人造关节、人造骨、人造韧带和人造肌腱；心血管装置，如导管、人造瓣膜、人造血管、人造支架、lvad或/和心律管理装置；肠胃科装置，如进食管、消化道夹、肠胃套管或胃球囊；ob/gyn装置，如可植入的节育装置或阴道吊带；肾脏科装置，如吻合连接器或皮下端口；神经外科装置，如神经引导管、脑脊液引流管或分流器；皮肤科装置，如皮肤修复装置；眼科装置，如分流器；耳鼻喉科装置，如支架、耳蜗植入物、管、分流器或扩张器；眼内透镜；美学植入物，如乳房植入物、鼻植入物和脸颊植入物；神经科植入物，如神经刺激装置、耳蜗植入物和神经导管；激素控制植入物，如血糖传感器和胰岛素泵；植入的生物传感器；接入端口装置；和组织支架肺装置，如用于管理copd的瓣膜或人工肺；放射学装置，如不透射线或不透声的标记物；或泌尿科装置，如导管或人造尿道。
[0281]
zps聚合物纳米颗粒和微米颗粒
[0282]
另一方面，本发明提供了包含本发明的zps聚合物和共聚物的纳米和微米颗粒。本发明的zps聚合物和共聚物可用于形成纳米和微凝胶、胶束、脂质体和聚合物囊泡的形式的纳米和微米颗粒。它们还可以用于涂覆固体颗粒，如量子点、氧化铁、二氧化硅和金，以用于治疗或诊断。本发明的zps聚合物和共聚物可以通过共价和非共价连接与纳米和微米颗粒关联。
[0283]
在某些实施方案中，提供了具有纳米级尺寸的颗粒。所述颗粒具有核，该核的表面具有接枝到该核或接枝自该核的多种zps聚合物或共聚物。代表性的颗粒核包括金属、金属氧化物、陶瓷、合成聚合物、天然聚合物、晶体、半导体材料、石墨烯、氧化石墨烯、氧化铁、二氧化硅、量子点、水凝胶、脂质体、胶束、碳基材料或生物分子。
[0284]
zps聚合物和共聚物缀合物
[0285]
另一方面，本发明提供了zps聚合物和共聚物缀合物。zps聚合物可以通过接枝到或接枝自的方法连接到生物分子(例如蛋白/肽、核酸和糖)、其他大分子和细胞，从而提供多种缀合物。
[0286]
在某些实施方案中，zps聚合物缀合物或共聚物缀合物是包含与生物分子偶联的
一种或多种zps聚合物的zps聚合物生物缀合物。合适的生物分子包括蛋白、核酸、糖蛋白、蛋白聚糖和脂质。合适的生物分子包括小分子治疗剂(即分子量小于约1000g/mol，优选小于约800g/mol的碳基治疗剂)。
[0287]
代表性蛋白质包括酶、信号传导蛋白、止血和血栓形成蛋白、疫苗、补体系统蛋白和抗体，它们的功能片段或特征部分。代表性的信号传导蛋白包括激素、细胞因子、调节蛋白、胰岛素和pd-1/pd-l1/2抑制剂。
[0288]
在这些实施方案的某些方案中，zps聚合物缀合物或共聚物缀合物是zps聚合物或共聚物的生物缀合物，其包含与已改性的生物分子例如聚合物改性的生物分子偶联的一种或多种zps聚合物或共聚物。示例性的聚合物改性的生物分子包括已经用聚乙二醇(peg)聚合物改性的生物分子(例如，这些peg改性的生物分子的peg部分可以在聚合物主链中或在来自聚合物主链的侧基中)。实施例5中描述了代表性的聚合物改性的生物分子，其通过将一种或多种zps聚合物或共聚物与其偶联而进一步改性。
[0289]
在其他实施方案中，zps聚合物缀合物或共聚物缀合物是zps聚合物或共聚物的生物缀合物，其包含与细胞、病毒或细菌偶联的一种或多种zps聚合物。
[0290]
zps聚合物缀合物或共聚物缀合物可以是递送载体。代表性的递送载体包括用于治疗或诊断应用的胶束、脂质体或聚合物囊泡。
[0291]
在某些实施方案中，本发明提供了由包含一种或多种zps聚合物或共聚物的本发明的共聚物或缀合的脂质自组装而成的胶束、脂质体、聚合物囊泡或颗粒。
[0292]
在另外的实施方案中，本发明提供了包含zps聚合物或共聚物缀合物和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。在某些实施方案中，本发明的zps聚合物和共聚物可以用作用于组合物的载体或稀释剂。
[0293]
实施例7中描述了代表性zps聚合物蛋白缀合物的制备和免疫原性。
[0294]
zps聚合物纳米凝胶和纳米笼
[0295]
另一方面，本发明提供了zps聚合物纳米凝胶和纳米笼。zps聚合物可用于提供化学捕获一种或多种其他物质的纳米凝胶，以及物理捕获一种或多种其他物质的纳米笼。
[0296]
在某些实施方案中，本发明提供了用于化学封装装载物的纳米凝胶，其包含一种或多种zps聚合物或一种或多种zps共聚物。
[0297]
在其他实施方案中，本发明提供了用于物理封装装载物的纳米笼，其包含一种或多种zps聚合物或一种或多种zps共聚物。
[0298]
被纳米凝胶化学捕获或被纳米笼物理捕获的合适的装载物(例如，物质)包括生物分子，如蛋白质、脂质、糖蛋白、细胞、病毒、细菌和小分子(例如，分子量小于约1000g/mol，优选800g/mol的治疗剂)或本文所述的其他生物分子。
[0299]
在某些实施方案中，纳米凝胶或纳米笼包含zps聚合物或共聚物和一种或多种治疗剂。
[0300]
在其他实施方案中，纳米凝胶或纳米笼包含zps聚合物或共聚物和一种或多种诊断剂。
[0301]
在另外的实施方案中，纳米凝胶或纳米笼包含zps聚合物或共聚物、一种或多种治疗剂和一种或多种诊断剂。
[0302]
非两性离子磷脂酰丝氨酸单体、聚合物、共聚物、组合物、表面及其制备和使用方
法
[0303]
应当理解，中性磷脂酰丝氨酸(nps)单体、聚合物和共聚物，在本文中也称为非两性离子磷脂酰丝氨酸(nzps)单体、聚合物和共聚物，也在本发明的范围内。因此，在另外的方面，本发明提供了非两性离子磷脂酰丝氨酸(nzps)单体、nzps聚合物和nzps共聚物，用于制备nzps单体、nzps聚合物和nzps共聚物的方法，包含nzps聚合物和nzps共聚物的组合物和材料，和使用nzps单体、nzps聚合物和nzps共聚物的方法。
[0304]
如本文所使用，术语“非两性离子磷脂酰丝氨酸单体”或“nzps单体”是指包含磷脂酰丝氨酸部分(nh
2-ch(-ch2o-p(＝o)(o-))-co2h及其离子形式)的可聚合单体或均聚物或共聚物的侧基。
[0305]
代表性nzps单体具有式(vi)：
[0306][0307]
其中，在某些实施方案中，r1选自氢、氟、三氟甲基、氰基、c
1-c
20
烷基(优选c
1-c6烷基)和c
6-c
12
芳基，x为o或nh，n为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)，并且p为1至20的整数(例如，1、2、3、4、5或6)。
[0308]
术语“非两性离子磷脂酰丝氨酸聚合物”或“nzps聚合物”是指具有如上所述的一个或多个包含磷脂酰丝氨酸部分的侧基的聚合物(即均聚物或共聚物)。
[0309]
通过使式(vi)的单体聚合来制备nzps聚合物，并且通过使式(vi)的单体与共聚单体共聚来制备nzps共聚物。这些nzps聚合物(均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物)包括如下所示的具有侧磷脂酰丝氨酸(ps)部分的重复单元：
[0310][0311]
其中，在某些实施方案中，r1、x、n和p如以上针对式(vi)的单体所述，a为约10至约500的整数，并且*表示聚合物或共聚物中的重复单元与其他重复单元的连接点，或聚合物端基。
[0312]
nzps单体可以在标准聚合条件下容易地聚合以提供nzps聚合物。
[0313]
因此，应当理解，本文对zps单体、zps聚合物、zps共聚物、包含zps聚合物的组合物、包含zps聚合物的表面，以及使用zps单体、聚合物和组合物的方法的整个描述同样适用于nzps单体、聚合物、组合物、表面和方法。
[0314]
实施例2描述了本发明的代表性nzps的制备和表征。
[0315]
实施例7中描述了代表性nzps聚合物蛋白缀合物的制备和免疫原性。
[0316]
本文描述了ps模拟可聚合(nzps)的单体，衍生自该单体的聚合物，以及连接到生物分子、大分子、小分子、颗粒、植入物、装置、表面、涂层和水凝胶的聚合物。生物相容性免疫抑制生物材料包括nzps聚合物及其衍生物和前体，用于与肽、蛋白质、脂质、糖蛋白、生物大分子(例如细胞、病毒、细菌)、纳米颗粒、微粒、小分子药物一起使用，其中任一种均可用于人体给药，包括与医疗装置、假肢、植入材料(包括牙科)、器官移植物共同使用。
[0317]
一方面，可聚合nzps单体和衍生物或前体具有以下显示的式(viii)：
[0318][0319]
其中
[0320]
a、g和i是在某些实施方案中使单体可聚合的官能团，并且独立地选自h、f、cl、br、
i、sh、被保护的硫醇、nh2、-nh-(仲胺)、n＝c＝o、被保护的nco、n＝c＝s、cooh、活化的酯、醛、cosh、c(＝s)sh、ocooh、ocosh、oc(＝s)oh、sc(＝o)sh、sc(＝s)sh、n(c＝o)nh2、n(c＝nh)nh2、n(c＝s)nh2、δ-戊内酯、ε-己内酯、ch2＝ch-c(＝o)-o-,ch2＝ch-c(＝o)-nh-,ch2＝ch-c(＝o)-s-、cn、ch2＝c(ch3)-c(＝o)-o-、ch2＝c(ch3)-c(＝o)-nh-、oh、叠氮化物、炔烃、c
6-c
10
芳基、环状基团(异冰片基、环己基、环戊基)、氟(全氟丁基、全氟乙基)衍生物或空白(不存在)；
[0321]
b、f和h独立地选自-(ch2)
x-，其中x是0至20的整数；
[0322]
c选自c、n、si或空白(不存在)；和
[0323]
d选自c(＝o)(ch2)
x
、-(ch2)
x-，其中x是1至20的整数；
[0324]
还提供了制备这些单体的方法，由这些单体制备的聚合物，以及使用这些聚合物将其连接到纳米颗粒、表面、涂层和水凝胶或从纳米颗粒、表面、涂层和水凝胶使其连接的方法，以及它们对这些纳米颗粒、表面、涂层和水凝胶赋予免疫抑制作用的用途。
[0325]
另一方面，提供了nzps聚合物和共聚物。这些聚合物和共聚物包含重复单元。在某些实施方案中，这些聚合物和共聚物的重复单元具有以下所示的式(ix)(较少的r2和r3)(重复单元将不包括r2和r3；但是，大分子单体也可能包括聚合物和共聚物)：
[0326][0327]
其具有n个重复单元-m
1-(k
1-z-k2)
j-m
2-m
1-(k
3-x-k4)
j-m
2-，其包含j个重复单元-k
1-z-k
2-和j个重复单元-k
3-x-k
4-。
[0328]
在上式中，
[0329]
k1、k2、k3和k4独立地选自-(ch2)
x-、
–
(ch(cn))
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自0至20的整数、其组合或空白(当取代基不存在时)；
[0330]
r2和r3独立地选自h、f、cl、br、i、oh、sh、被保护的硫醇、nh2、-nh-(仲胺)、n＝c＝o、n＝c＝s、cooh、cosh、c(＝s)sh、ocooh、ocosh、oc(＝s)oh、sc(＝o)sh、sc(＝s)sh、n(c＝o)nh2、n(c＝nh)nh2、n(c＝s)nh2、δ-戊内酯部分、ε-己内酯部分、ch2＝ch-c(＝o)-o-、ch2＝ch-c(＝o)-nh-、ch2＝ch-c(＝o)-s-、cn、ch2＝c(ch3)-c(＝o)-o-、ch2＝c(ch3)-c(＝o)-nh-或空白(当取代基不存在时)；
[0331]
n为5至约10,000的整数。
[0332]
j在每次出现时都是1至约1000的整数。
[0333]
m1和m2独立地选自-o-(ch2)
n-、-s-(ch2)
n-、-c(＝o)-(ch2)
n-、-c(＝s)-(ch2)
n-、-c(＝nh)-(ch2)
n-和-nh-(ch2)
n-，其中n是1至20的整数；-(ch2)
x-、
–
(ch(cn))
x-、-c(＝o)nh(ch2)
x-、-c(＝o)o(ch2)
x-、-c(＝o)oc(＝o)o(ch2)
x-、-(ch2)
x-o-(ch2)
x-和
–
(ch2)
x-s-s-(ch2)
x-，其中x在每次出现时为独立地选自0至20的整数，其组合，或空白(当取代基不存在时)；和
[0334]
z和x独立地选自下式：
[0335][0336]
其中l独立地选自f、cl、br、i、sh、被保护的硫醇、nh2、-nh-(仲胺)、n＝c＝o、被保护的nco、n＝c＝s、cooh、cosh、c(＝s)sh、ocooh、ocosh、oc(＝s)oh、sc(＝o)sh、sc(＝s)sh、n(c＝o)nh2、n(c＝nh)nh2、n(c＝s)nh2、δ-戊内酯、ε-己内酯、ch2＝ch-c(＝o)-o-,ch2＝ch-c(＝o)-nh-、ch2＝ch-c(＝o)-s-、cn、ch2＝c(ch3)-c(＝o)-o-、ch2＝c(ch3)-c(＝o)-nh-、oh、叠氮化物、炔烃、c
6-c
10
芳基、环状基团(异冰片基、环己基、环戊基)、氟(全氟丁基、全氟乙基)衍生物或空白；
[0337]
k独立地选自-(ch2)
x-，其中x为0至20的整数；
[0338]
j选自c(＝o)(ch2)
x
,-(ch2)
x-，其中x为1至20的整数；和
[0339]
*是如上式所示的与k1、k2、k3和k4的连接点。
[0340]
如本文所用，术语“约”是指规定值的
±
5％。
[0341]
提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。
实施例
[0342]
实施例1
[0343]
代表性zps单体的制备与表征
[0344]
在该实施例中，描述了代表性的可聚合两性离子(zps)单体的合成和纯化。
[0345]
合成本发明的可聚合zps单体的说明性方法如下所示。
[0346][0347]
(2-((2-(甲基丙烯酰氧基)乙基)二甲基铵基)乙基)磷酸3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-氧代丙酯(化合物3)的合成。将n-boc-ser-otbu(1.0g，3.82mmol)溶于30ml无水苯中，并将溶液冷却至0℃。接下来，加入三乙胺(0.62ml，4.6mmol)，然后在30分钟内滴加2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烷1(0.42ml，4.6mmol)的10ml无水苯溶液，然后将反应内容物在室温下再搅拌3小时。反应完成后，将乙醚倒入反应混合物中，并滤出沉
淀的三甲胺盐酸盐。然后将滤液减压浓缩，得到作为油状物的化合物2，其无需进一步纯化即可用于下一步。将化合物2重新溶解于30ml无水乙腈中，并加入甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(1.45ml，8.8mmol)。然后将反应混合物在55℃下搅拌24小时。然后将反应内容物在真空下浓缩并通过快速柱色谱法纯化，以42％的产率得到化合物3。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ6.18(s,1h),5.67(s,1h),4.63
–
4.54(m,2h),4.35
–
4.14(m,3h),4.10
–
3.99(m,2h),3.83
–
3.76(m,2h),3.40
–
3.27(m,2h),2.82(s,6h),1.97(s,3h),1.46(d,j＝11.7hz,18h)。
[0348]
代表性zps单体(化合物4)的合成。将化合物3(0.84g，1.6mmol)溶于5ml二氯甲烷中，并加入30ml三氟乙酸。将反应内容物搅拌5小时。反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩，得到粘稠的液体。然后将粗产物用meoh:二乙醚(1:15)结晶，得到作为白色粉末的期望的化合物4。1h nmr(300mhz,d2o)δ6.08(s,1h),5.69(s,1h),4.47
–
4.41(m,2h),4.26
–
4.23(m,2h),4.05
–
4.00(m,1h),3.87
–
3.84(m,2h),3.69
–
3.67(m,2h),3.50
–
3.45(m,2h),2.88(s,6h),1.84(s,3h)。
[0349]
实施例2
[0350]
代表性中性ps单体的制备与表征
[0351]
在该实施例中，描述了代表性的可聚合中性ps(nzps)单体的合成和纯化。合成nzps单体的说明性方法如下所示。
[0352][0353]
化合物5的合成。将n-boc-ser-otbu(1.0g，3.82mmol)溶于30ml无水苯中，并将溶液冷却至0℃。接下来，加入三乙胺(0.62ml，4.6mmol)，然后在30分钟内滴加2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烷1(0.42ml，4.6mmol)的10ml无水苯溶液，然后将反应内容物在室温下再搅拌3小时。反应完成后，将乙醚倒入反应混合物中，并滤出沉淀的三甲胺盐酸盐。然后将滤液减压浓缩，得到作为油状物的化合物2，其无需进一步纯化即可用于下一步。将化合物2重新溶解于30ml无水乙腈中，并向其中加入甲基丙烯酸钠(0.62gm，5.7mmol)以及18-冠-6醚(0.14g，0.53mmol)。然后将反应混合物在55℃下搅拌72小时。反应后，将反应内容物过滤，真空浓缩，并通过快速柱色谱纯化，以71％的收率得到化合物5。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ6.15(s,1h),5.57(s,1h),4.41
–
4.27(m,2h),4.24
–
4.04(m,4h),3.86
–
3.78(m,1h),1.95(s,3h),1.46(d,j＝5.4hz,18h)。
[0354]
代表性中性ps单体(化合物6)的合成。将化合物5(1.2g，2.65mmol)溶解在5ml二氯甲烷中，并向其中加入30ml三氟乙酸。将反应内容物搅拌5小时。反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩，得到粘稠的液体。然后将粗产物用meoh:二乙醚(1:20)结晶，得到作为白色粉末的期望的化合物6。1h nmr(300mhz,d2o)δ6.11(s,1h),5.66(s,1h),4.34
–
4.15(m,5h),4.10
–
3.97(m,2h),1.85(s,3h)。
[0355]
实施例3
[0356]
代表性nzps和zps水凝胶的不结垢性能
[0357]
在该实施例中，描述了代表性的nzps和zps水凝胶的不结垢性能。
[0358]
zps水凝胶的制备
[0359]
zps水凝胶是通过水凝胶水溶液的本体光聚合而制备的，该水凝胶水溶液含有zps单体(0.67g milli-q水，330mg)、交联剂n,n'亚甲基双(丙烯酰胺)(1wt％，3.3mg)和光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮(0.33mg)。将水凝胶水溶液放置在用0.5mm厚的聚四氟乙烯垫片隔开的两个载玻片之间，然后在室温下光聚合30分钟。聚合后，将水凝胶从铸模中取出，并浸泡在pbs中三天，以除去未反应的化学物质并实现完全水合的水凝胶网络。每12小时更换磷酸盐缓冲盐水。按照相同的方案，制备具有相同交联密度的mpc和nzps水凝胶。
[0360]
纤维蛋白原吸附试验
[0361]
使用活检取样器将水合的mpc、nzps和zps水凝胶穿孔以形成5毫米直径的盘。将水凝胶盘置于24孔板中，并与1ml的1mg/ml纤维蛋白原的pbs缓冲液溶液一起孵育1小时，然后用纯pbs缓冲液洗涤5次。然后将水凝胶盘转移到新孔中，并与1ml辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗纤维蛋白原(1μg/ml)的pbs缓冲液溶液孵育1小时。在用纯pbs缓冲液洗涤5次后，将所有水凝胶盘转移至新孔中。接着，加入1ml的1mg/ml邻苯二胺(opd)、含有0.03％过氧化氢的0.1m柠檬酸磷酸盐ph 5.0溶液。孵育15分钟后，通过加入等体积的1m hcl终止酶促反应。在具有相同表面积的组织培养聚苯乙烯(tcps)盘上进行相同的步骤作为对照。用酶标仪记录492nm处的吸光度值，并归一化为tcps样品的吸光度值。从三个样本获取平均数据。
[0362]
在高度浓缩的纤维蛋白原溶液(10mg/ml)中孵育1h后，通过相对于tcps盘降低84.4％的吸附的纤维蛋白原，zps水凝胶盘表现出优异的不结垢性能。相比之下，与tcps盘相比，nzps水凝胶盘仅降低41％的吸附的纤维蛋白原(图1)。
[0363]
实施例4
[0364]
代表性nzps和zps纳米凝胶的免疫抑制作用
[0365]
在该实施例中，描述了代表性的nzps和zps纳米凝胶的免疫抑制作用。
[0366]
mpc、nzps和zps纳米凝胶的制备
[0367]
将aot(双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠，237mg)和brij 30(聚(乙二醇)十二烷基醚，459mg)加入到20ml玻璃小瓶中，并向其中加入搅拌棒。用聚四氟乙烯内衬隔膜盖密封小瓶，并用干燥氮气吹扫10分钟。然后在剧烈搅拌下将氮气脱氧的己烷(10ml)加入到小瓶中。对于水相，将单体(mpc、nzps、zps)和交联剂(mba)以95％∶5％的摩尔比溶解在pbs缓冲液(ph 7.4，250μl)中。将干燥的氮气鼓泡通过单体溶液2分钟，然后将水相缓慢滴加到有机连续相中。将小瓶超声处理以形成稳定的纳米乳液。将干燥的氮气鼓泡通过单体溶液2分钟，然后将水相缓慢滴加到有机连续相中。将小瓶超声处理以形成稳定的纳米乳液。然后将20％(w/v)的过硫酸铵的去离子水(10μl)溶液加入到乳液中。5分钟后，通过加入四甲基乙二胺(temed，6μl)引发聚合，并在快速磁力搅拌下保持在4℃。反应2小时后，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，使纳米凝胶沉淀，并用thf洗涤3次。将纳米凝胶重悬于pbs缓冲液中，并用截留分子量为100kda的离心过滤器纯化，以除去未反应的单体和交联剂。
[0368]
包封fitc-bsa的mpc、nzps和zps纳米凝胶的制备
[0369]
将aot(双(2-乙基己基)磺基琥珀酸钠，237mg)和brij 30(聚(乙二醇)十二烷基醚，459mg)加入到20ml玻璃小瓶中，并向其中加入搅拌棒。用聚四氟乙烯内衬隔膜盖密封小
瓶，并用干燥氮气吹扫10分钟。然后在剧烈搅拌下将氮气脱氧的己烷(10ml)加入到小瓶中。对于水相，将fitc-bsa、单体(mpc、nzps、zps)和交联剂(mba)以95％∶5％的摩尔比溶解在pbs缓冲液(ph 7.4，250μl)中。将干燥的氮气鼓泡通过单体溶液2分钟，然后将水相缓慢滴加到有机连续相中。将小瓶超声处理以形成稳定的纳米乳液。然后将20％(w/v)的过硫酸铵的去离子水(10μl)溶液加入到乳液中。5分钟后，通过加入四甲基乙二胺(temed，6μl)引发聚合，并在快速磁力搅拌下保持在4℃。反应2小时后，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，使纳米凝胶沉淀，并用thf洗涤3次。将纳米凝胶重悬于pbs缓冲液中，并用截留分子量为100kda的离心过滤器纯化，以除去游离的fitc-bsa、未反应的单体和交联剂。
[0370]
免疫抑制作用
[0371]
将raw 264.7细胞(105个/孔)暴露于各种浓度(10、25、50、100、200、1000μg/ml)的mpc、nzps或zps纳米凝胶溶液中18小时。然后，通过lps溶液(100ng/ml)，将这些细胞再刺激48小时，然后以300g离心细胞10分钟，并收集上清液介质用于通过elisa进行细胞因子(tnf-α)分析。如图2a所示，虽然nzps和zps对tnf-α水平的影响均为剂量依赖性的，但nzps在相对较低的浓度下开始表现出其对tnf-α的抑制作用，表明其与zps相比具有强的免疫抑制作用。
[0372]
膜联蛋白v阻断
[0373]
为了确认nzps和zps的免疫抑制作用源于它们的ps头基介导的eat-me信号，将mpc、nzps或zps的纳米凝胶溶液(100μg/ml)与各种浓度(0、10、25、50、100、200μg/ml)的膜联蛋白v(一种对ps基团具有高亲和力，并且可以阻断eat-me信号的蛋白)预孵育6小时。然后用这些纳米凝胶溶液(100μg/ml)将raw 264.7巨噬细胞(105个/孔)处理18小时，然后通过lps(100ng/ml)刺激48小时。用elisa试剂盒测定上清液中tnf-α的分泌水平。如图2b所示，随着膜联蛋白v浓度的增加，nzps和zps纳米凝胶在减少tnf-α分泌方面的作用减弱，显示出对其免疫抑制作用的有效阻断。值得注意的是，zps纳米凝胶对膜联蛋白v的阻断作用不那么敏感，这可能是因为zps的不结垢性能可能在某种程度上降低zps中ps官能团对其受体的亲和力。这也解释了为什么zps的免疫抑制作用比nzps的免疫抑制作用弱。
[0374]
细胞摄取
[0375]
将raw 264.7巨噬细胞(105个/孔)与包封fitc-bsa的mpc、nzps和zps纳米凝胶一起孵育30、60、120和180分钟，然后冲洗细胞并裂解，以检测恢复的荧光。如图2c所示，mpc由于其优异的不结垢性能而显示出最小的细胞摄取，而nzps纳米凝胶由于其对eat-me信号的介导而被巨噬细胞迅速摄取。与nzps相比，zps的摄取由于其不结垢性能和与受体的亲和力降低而减慢了。这些结果表明，zps独特的两性离子结构可以同时实现有效的免疫抑制和良好的不结垢性能。
[0376]
实施例5
[0377]
代表性的含聚(zps)和聚(nzps)的生物缀合物
[0378]
在该实施例中，描述了本发明的代表性生物缀合物。在某些实施方案中，代表性的生物缀合物包含zps聚合物组分。在其他实施方案中，代表性生物缀合物包含nzps聚合物组分。
[0379]
在该实施例中，生物缀合物是酶缀合物。代表性酶是尿酸酶。聚合物直接地或通过适合将聚合物连接到酶的接头共价地偶联到酶。
[0380]
在以下所示的代表性生物缀合物中，生物缀合物还包含聚(乙二醇)(peg)部分。在某些实施方案中，这些生物缀合物包含在酶和ps聚合物之间的接头中的peg。在其他实施方案中，这些生物缀合物包含作为来自聚合物主链的侧基的peg(例如，源自pegma的聚合)。
[0381]
含代表性聚(zps)-嵌段-聚(pegma)嵌段共聚物的生物缀合物的制备与表征
[0382]
巯基封端的聚(zps)-嵌段-聚(pegma)嵌段共聚物的合成。使用可逆的加成-断裂链转移(raft)聚合以制备嵌段共聚物。通常，zps单体(6.7g)的聚合反应是在作为链转移剂(cta)的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(100mg)的存在下，由偶氮二异丁腈(aibn，18mg)引发的。反应12小时后，停止聚合，并通过透析纯化所得聚合物，聚(zps)-cta。然后，将聚(zps)-cta用作pegma单体聚合的大分子cta(摩尔比：cta/pegma＝1/50)。在过量的醚中沉淀后，通过透析和冻干进一步纯化聚(zps)-嵌段-聚(pegma)-cta嵌段共聚物。然后，通过使用己胺和三乙胺的混合溶液将嵌段共聚物上的cta部分转化为巯基。
[0383]
聚(zps)-嵌段-聚(pegma)-尿酸酶缀合物的制备
[0384]
首先通过双官能交联剂bmps(n-马来酰亚胺基丙基-氧基琥珀酰亚胺酯)将尿酸酶上的胺基转化为马来酰亚胺基。然后将活化的尿酸酶(10mg)与巯基封端的聚(zps)-嵌段-聚(pegma)共聚物(300mg)的4ml pbs溶液混合。通过渗滤纯化聚(zps)-嵌段-聚(pegma)-尿酸酶缀合物，以除去过量的聚合物和未反应的尿酸酶。
[0385]
含代表性聚(zps)和聚(pegma)聚合物的生物缀合物的制备和表征
[0386]
巯基封端的聚(zps)的合成。使用可逆的加成-断裂链转移(raft)聚合以制备嵌段共聚物。通常，zps单体(6.7g)的聚合反应是在作为cta的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(100mg)的存在下，由偶氮二异丁腈(aibn，18mg)引发的。反应12小时后，停止聚合，并通过透析纯化所得聚合物，聚(zps)-cta。然后，通过使用己胺和三乙胺的混合溶液将聚(zps)-cta上的cta部分转化为巯基。
[0387]
巯基封端的聚(pegma)的合成。pegma(5g)的聚合反应是在作为链转移剂(cta)的2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸(100mg)的存在下，由偶氮二异丁腈(aibn，18mg)引发的。反应12小时后，停止聚合，并通过透析纯化所得聚合物，聚(pegma)-cta。然后，通过使用己胺和三乙胺的混合溶液将聚(pegma)-cta上的cta部分转化为巯基。
[0388]
含聚(zps)和聚(pegma)的生物缀合物的制备.
[0389]
首先通过双官能交联剂bmps(n-马来酰亚胺基丙基-氧基琥珀酰亚胺酯)将尿酸酶上的胺基转化为马来酰亚胺基。然后将活化的尿酸酶(10mg)与巯基封端的聚(zps)(100mg)的4ml pbs溶液混合。通过渗滤纯化聚(zps)-尿酸酶缀合物，以除去过量的聚合物和未反应的尿酸酶。通过将巯基封端的聚(pegma)与聚(zps)-尿酸酶混合进行第二个缀合步骤。通过渗滤纯化聚(zps)和聚(pegma)改性的尿酸酶，以去除多余的聚合物。
[0390]
该实施例中描述的代表性生物缀合物具有以下结构：
[0391]
[0392]
[0393][0394]
实施例6
[0395]
代表性的中性ps
–
peg生物缀合物的免疫原性
[0396]
在该实施例中，将代表性的中性ps
–
peg生物缀合物的免疫原性与代表性peg-尿酸酶进行比较。
[0397]
通过尾静脉将25u/kg体重剂量的peg-尿酸酶和ps-模拟聚合物-peg-尿酸酶静脉内给予大鼠。将尿酸酶样品的给药重复五次，其中每次免疫之间的时间间隔为一周。在第五周结束时(第35天)，对所有大鼠实施安乐死。处死大鼠并处理通过心脏穿刺收集的大鼠血液以进行直接elisa测试。对于elisa测试，尽管抗尿酸酶抗体的检测使用包被的尿酸酶作为抗原，但抗peg抗体的检测需要bsa-peg缀合物。
[0398]
作为直接elisa测试的第一步，使用在包被缓冲液(0.1m碳酸钠缓冲液，ph 10.5)中制备的100μl抗原溶液(10μg/ml的蛋白浓度)以包被96孔板的每个孔。在4℃下过夜包被过夜后，将板用pbs缓冲液(ph 7.4)洗涤五次以去除抗原溶液，然后用封闭缓冲液(1％bsa的0.1m tris缓冲液溶液，ph 8.0)填充，在室温下孵育1小时，然后除去封闭缓冲液。然后将所有孔再用pbs缓冲液洗涤五次。随后，将在含有1％bsa的pbs缓冲液中的大鼠血清的系列稀释液加入板中(100μl/孔)，在37℃下孵育1小时，然后去除大鼠血清，并用pbs缓冲液洗涤所有孔5次。接下来，将山羊抗大鼠igm或igg(hrp缀合的，bethyl laboratories)作为二抗
添加到每个孔中，在37℃下再孵育1小时。随后，使用pbs缓冲液洗涤所有孔五次，然后加入100μl/孔hrp底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb；bethyl laboratories)。将板振荡15分钟，并将100μl终止溶液(0.2m h2so4)添加到每个孔。用酶标仪记录450nm(信号)和570nm(背景)的吸光度。将未给予尿酸酶样品的大鼠血清用作所有elisa检测的阴性对照。
[0399]
收获大鼠的脾脏，并通过100μm细胞过滤器(fisherbrand
tm
)分离脾细胞。将来自每组的大鼠脾细胞用针对mhcii和cd86的抗大鼠ab(ebioscience)染色，然后通过流式细胞术分析。为了测试t细胞活化，将来自每组的大鼠脾细胞培养在12孔板中(106个/孔)，并分别用peg-尿酸酶和ps-模拟聚合物-peg-尿酸酶(1mg/ml)再次刺激。将来自每只大鼠的脾细胞作为平行组在两个孔中培养。72小时后，使用il-4大鼠elisa试剂盒(life technologies)收集来自每个孔的细胞培养基，用于il-4的定量。
[0400]
实施例7
[0401]
代表性zps、中性ps和pc生物缀合物的免疫原性
[0402]
在该实施例中，描述了代表性生物缀合物的免疫原性。生物缀合物是尿酸酶缀合物。通过将(a)两性离子ps(zps)聚合物，(b)中性非两性离子(nzps)聚合物或(c)磷脂酰胆碱(pc)(mpc)聚合物共价地偶联到尿酸酶表面制备尿酸酶缀合物。
[0403]
简言之，将aot(120mg)和brij 30((230mg)加入到20ml玻璃小瓶中，并向其中加入搅拌棒。用聚四氟乙烯内衬隔膜盖密封小瓶，并用干燥氮气吹扫10分钟。然后在剧烈搅拌下将氮气脱氧的己烷(5ml)加入到小瓶中。对于水相，将尿酸酶(1mg)溶解在hepes缓冲液(ph 8.5,125μl)中，向其中加入zps单体(50mg)并溶解。将干燥的氮气鼓泡通过单体/蛋白质溶液2分钟，然后将水相缓慢滴加到有机连续相中。将小瓶超声处理以形成稳定的微乳液。然后将20％(w/v)的aps的milli-q水溶液(10μl)加入到乳液中。5分钟后，通过加入temed(6μl)引发聚合，并在快速磁力搅拌下保持在4℃。反应2小时后，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，使zps-尿酸酶缀合物沉淀，并用thf洗涤3次。将zps-尿酸酶缀合物重悬于pbs缓冲液中，并用高分辨尺寸排阻色谱法(sephacryl s-500hr)纯化，以除去游离的尿酸酶。最后，缀合物使用截留分子量为100kda的离心过滤器用pbs(ph 7.4)洗涤并浓缩3次。
[0404]
缀合物的结构在下面示意性说明。
[0405][0406]
对于体外免疫原性研究，将dc 2.4树突细胞(105个/孔)分别与pbs(空白对照)、天然尿酸酶、zps-尿酸酶、nzps-尿酸酶、mpc尿酸酶缀合物(2mu/ml)孵育72小时。孵育期结束时，将细胞以300g离心10分钟，并收集上清液介质用于通过elisa进行细胞因子(tgf-β)分析。收获细胞并用冰冷的无菌磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。用抗cd40-fitc或抗cd80-pe标记细胞，并使用流式细胞术进行分析。如图3a和3b所示，暴露于天然尿酸酶导致共刺激标志物cd40和cd80的表达增加(图3a)，从而使未成熟树突细胞减少(图3b)。相反，mpc-尿酸酶、nzps-尿酸酶和zps-尿酸酶在刺激树突细胞的活化方面显示出减弱的作用，其中nzps-尿酸酶作用最小，其次是zps-尿酸酶。tgf-β(一种典型的免疫抑制细胞因子标志物)的测量结果(图3c)表明，虽然mpc-尿酸酶不影响tgf-β的水平，但nzps-尿酸酶和zps-尿酸酶均具有上调tgf-β分泌的显著作用。
[0407]
对于体内免疫原性研究，通过尾静脉将25u/kg体重的剂量的zps-尿酸酶、nzps-尿酸酶、mpc-尿酸酶缀合物静脉内给予小鼠。尿酸酶样品的给药重复三次，其中每次免疫之间的时间间隔为一周。在不同时间点(0、6h、24h、48h、72h)收集小鼠血液，并通过使用amplex
tm
尿酸/尿酸酶试剂盒测量酶活性来估算血液中保留的尿酸酶。在第三周结束时(第21天)，对所有小鼠实施安乐死。处死小鼠，并通过心脏穿刺收集其血液以进行直接elisa测试。
[0408]
作为直接elisa测试的第一步，使用在包被缓冲液(0.1m碳酸钠缓冲液，ph 10.5)中制备的100μl抗原溶液(10μg/ml的蛋白浓度)以包被96孔板的每个孔。在4℃下过夜包被过夜后，将板用pbs缓冲液(ph 7.4)洗涤五次以去除抗原溶液，然后用封闭缓冲液(1％bsa的0.1m tris缓冲液溶液，ph 8.0)填充，在室温下孵育1小时，然后除去封闭缓冲液。然后将所有孔再用pbs缓冲液洗涤五次。随后，将在含有1％bsa的pbs缓冲液中的小鼠血清的系列稀释液加入板中(100μl/孔)，在37℃下孵育1小时，然后去除小鼠血清，并用pbs缓冲液洗涤所有孔5次。接下来，将山羊抗大鼠igm或igg(hrp缀合的，bethyl laboratories)作为二抗添加到每个孔中，在37℃下再孵育1小时。随后，在加入100μl/孔hrp底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb；bethyl laboratories)之前，使用pbs缓冲液洗涤所有孔五次。将板振荡15分钟，并将100μl终止溶液(0.2m h2so4)添加到每个孔。用酶标仪记录450nm(信号)和570nm(背景)的吸光度。将未给予尿酸酶样品的小鼠血清用作所有elisa检测的阴性对照。此外，在第21天收获小鼠脾脏，通过100μm细胞过滤器(fisherbrand
tm
)分离脾细胞。在天然尿酸酶、mpc-尿酸酶、nzps-尿酸酶或zps-尿酸酶的存在下培养来自每组的小鼠脾细胞72小时，然后用抗cd4-pe、抗cd25-fitc和抗foxp3-percep抗体染色，用于通过流式细胞术分析。
[0409]
如图4a和4b以及表1所示，与mpc(一种惰性两性离子聚合物)缀合的尿酸酶在三次给药后遭受加快的血液清除(abc)。
[0410]
表1.重复注射后的药代动力学参数。
[0411][0412]
抗尿酸酶或抗缀合物抗体的产生(图4c和4d)是天然尿酸酶和mpc-尿酸酶缀合物发生的abc现象的原因。相反，两性离子ps(zps)聚合物和非两性离子ps(nzps)聚合物二者均可以抑制免疫原性蛋白质载体(尿酸酶)引起的潜在免疫应答。这种免疫抑制作用导致不存在抗缀合物抗体(图4c和4d)，因此在重复给药后维持尿酸酶缀合物的循环时间(表1)。nzps-尿酸酶的循环时间比zps-尿酸酶的循环时间短得多，这表明nzps中ps头基的“eat-me”信号可能导致快速清除，这不利于增加蛋白质在体内的保留时间。相反，zps-尿酸酶的循环时间与mpc-尿酸酶的循环时间相当，这表明zps与其他两性离子物质一样，延长了蛋白质的循环时间，同时还保留了ps的免疫抑制作用，从而抑制了蛋白质的免疫原性。zps的该独特性能使其特别适用于纳米颗粒(例如蛋白缀合物、脂质体、胶束和固体纳米颗粒，例如
金、量子点、二氧化硅和氧化铁纳米颗粒)，因为它同时实现了长循环和低免疫原性。此外，小鼠脾细胞的表征证实了nzps-尿酸酶和zps-尿酸酶缀合物可以上调t-rege细胞的表达(图4e和4f)，这是由于它们避免了不期望的免疫应答。
[0413]
尽管已经示出和描述了说明性实施方案，但是应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在其中进行各种改变。