含有纳米分散体的静电纺丝纤维及其在治疗伤口中的用途的制作方法

本发明涉及基于纳米分散体的组合物，其优选进一步加工成包含这样的纳米分散体的静电纺丝纤维。所述纳米分散体可以任选地含有桦树皮提取物。所述静电纺丝纤维可以特别用于治疗伤口。为此目的，含有静电纺丝纤维的组合物优选原样或在喷雾或泡沫中施用。

us2010/0254961a1描述了水溶性静电纺丝片材和它们在药物中的用途。

m.laszczyk,freiburg于2007年在其博士论文中描述了来自桦树皮(betulaalbacortex)的三萜烯干提取物及其潜在的药物用途。桦树皮提取物具有抗菌活性，并且还具有抗疟原虫或病毒的活性。此外，它具有抗炎性，且有助于伤口愈合。甚至已经描述了抗肿瘤活性。尽管具有这些高度期望的性质，但是桦树皮提取物的使用已经受到制备合适的药物制剂的困难的阻碍。这些困难的原因可以从提取物在水中的低溶解度以及当将提取物溶解在油中时由于形成凝胶结构而出现的问题中看出。

在wo2018/017576中公开了含有桦木醇的油包水型泡沫，其包含分散在一种或多种非极性液体中的固体桦树皮提取物。该泡沫是乳化的油凝胶，其在油包水型乳液中包含固体桦树皮提取物。

本发明涉及改进的药物制剂，其含有静电纺丝纤维，任选地含有桦树皮提取物。人皮肤用作身体与环境之间的屏障。因此，其易于受到微生物、热、机械和化学威胁，这可能引起急性或慢性伤口。已知来自桦树外皮的三萜烯具有多种药理学效果，包括增强伤口愈合。由可生物降解的且生物相容的合成或天然的聚合物制成的聚合物纳米纤维已经用于开发治疗各种疾病的药物递送系统，并且使用它们的潜在领域之一是含药的伤口敷料。因此，本发明的一个目的是使用最近已经临床证明的桦树皮干提取物来加速伤口愈合，并提供生物活性纳米纤维伤口敷料。首先通过高压均化[hph]方法和作为乳化剂的卵磷脂基磷脂生产含有活性物质桦树皮干提取物的亚微米o/w乳液。在一个实施方案中，将乳液与可商购获得的可生物降解的且生物相容的聚合物共混以形成纳米纤维，旨在用于使用静电纺丝技术的伤口疗法。制备方法和乳液组合物(例如聚合物/桦树皮干提取物/磷脂/葵花油)影响支架的药物释放行为，以及它们的结构形态、表面和热性质。

桦树皮提取物可以使油增稠，这导致所谓的油凝胶。油凝胶是与水凝胶相当的柔性和可变形的系统。与水凝胶相反，油凝胶基于亲脂相。这样的油凝胶可以显示触变行为，这意味着通过快速搅拌，粘度降低，而在没有施加的剪切力的情况下粘度较高。尽管可能存在触变性质有帮助的一些应用，但它对于药物目的不总是方便的。因此，本发明的目的是提供适合于药物应用的桦树皮提取物的替代制剂。

本发明的一个目的是提供替代药物制剂，其具有关于生物活性、处理和患者接受性的有利性质。

桦树皮提取物具有高含量的三萜烯，三萜烯是生物活性的植物次生代谢物。在文献中充分研究和详细说明了它们的各种药理学性质，如抗炎、抗病毒、抗癌活性和伤口愈合效果。这些物质广泛分布于植物中，但只有白皮桦树的外皮含有高达34%(w/w)桦木醇，这是一种五环羽扇烷型三萜烯，其分子的相对侧具有两个极性羟基。一种经过充分表征的可商购获得的来自桦树外皮的三萜烯干提取物(te)含有约80%(w/w)桦木醇。该提取物通过用正庚烷加速溶剂提取获得。干提取物的其它公开的成分是羽扇豆醇(lu)、高根二醇(er)、桦木酸(ba)和齐墩果酸(oa)。然而，这些三萜烯在极性和非极性溶剂中的溶解性差可能由于生物利用度差而限制其治疗应用。目前，可用的局部施用形式是油凝胶和化妆品油包水型乳膏(例如imlancremepur,birkenag)。含有葵花油的油凝胶在2016年1月获得欧洲销售授权。

桦树皮是低价值废物，其在林业中大量产生。因此，用于桦树皮提取物的起始物料容易以低成本获得。

桦树皮由桦树内皮和桦树外皮组成。桦树内皮比桦树外皮更致密和更具颗粒性，而桦树外皮比桦树内皮更柔性和更具纤维性。与桦树内皮相比，桦树外皮颜色是白色、薄、坚韧并且具有较低的含水量。桦树内皮颜色较深，并且桦树外皮的碎片与桦树内皮的碎片分离导致所需的桦树皮提取物的产率增加。桦树外皮含有高浓度的感兴趣的化学组分，其可以例如用超临界流体(其中优选具有c5-c10的烷烃，优选庚烷)提取。

已知几种不同的提取方法。在一种方法中，三萜烯是在其中温度应高于约110℃的热正庚烷中从桦树皮中提取的。当将热正庚烷冷却时，三萜烯结晶并可以通过过滤和干燥晶体而获得。还可以使用其它提取流体或使用co2用于提取。由于桦树皮提取物是天然产物，单组分的组成强烈依赖于几个因素，如从中获得树皮的桦树的种类、桦树皮提取物的制备方式和随后的纯化步骤。

由于已经报道了抗病毒、抗菌和抗炎活性，桦树皮提取物含有可用于药物应用的化学成分。因此，桦树皮提取物可以用作抗菌剂或抗真菌剂和用于伤口愈合。

根据来源和生产方法，桦树皮提取物含有几种组分。主要组分是桦木醇，其通常以约75-85重量%的量存在于提取物中。羽扇豆醇以约1.5-2.8重量%的量存在，并且桦木酮酸(betulonicacid)以约3.0-4.5重量%的量存在。存在少量浓度的高根二醇、齐墩果酸和桦木酸甲酯。此外，在桦树皮提取物中还存在一些次要组分，如桦木醇醛、熊果酸、α-和β-乳香酸等。不言而喻，所有组分必须总计高达100%，然而，其中少量痕量的用于提取的溶剂可以存在于提取物中。

桦树皮提取物可能在制备药物制剂中引起问题，因为桦树皮提取物的组分可以通过氢键构建三维结构，其不能容易地被制成具有足够生物利用度的合适形式。可能出现可变大小和凝胶形成的颗粒，这使得制备合适的药物制剂困难，因为药物组分不能以受控的方式释放。例如，可能难以将薄且均匀分布的油凝胶层施用在伤口上。

根据本发明，提供显示优异生物利用度的桦树皮提取物的纳米分散体。根据本发明的纳米分散体优选通过均化预乳液来制备。该预乳液含有桦树皮提取物、药学上可接受的油、乳化剂和水相。油可以是任何合适的药学上可接受的油，如蓖麻油、玉米油、椰子油、亚麻子油、橄榄油或花生油，其中优选葵花油。通常将这样的油纯化以符合药物标准。

在优选的实施方案中，o/w乳液由四种重要成分组成，包括活性物质(桦树皮干提取物)、作为乳化剂的磷脂、油相和水相。预期组合物和加工条件对这些亚微米分散体的特性具有显著影响。而且，乳液-静电纺丝纳米纤维的性质将高度地受到三萜烯亚微米乳液的特性的控制。除此之外，通过改变分散性质可以获得受控的药物释放。含有磷脂的乳液的静电纺丝不是通常实践的。

根据本发明使用的乳化剂是磷脂。磷脂确保液-液和液-固界面的混溶性，并且可以衍生自商业卵磷脂。磷脂是动物和植物细胞原生质的基本成分。通常，可以使用不同类型的磷脂，如天然的和/或水合磷脂。根据本发明使用的优选的磷脂是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰丝氨酸及其混合物。根据本发明优选使用的磷脂可以例如以名称“phospholipon^®90h”商购获得。这主要是氢化磷脂酰胆碱，但也可以成功地使用其它可商购获得的用于制药目的的磷脂产品。

在纳米乳液中，相对于纳米乳液的重量，磷脂以0.01-8重量%，优选0.1-5.0重量%的量存在。在特别优选的实施方案中，纳米乳液含有约0.5%重量的桦树皮提取物。

在制备纳米乳液的第一步中，将由桦树皮提取物、油(优选药学上可接受的油，如葵花油或亚麻籽油)组成的预乳液与磷脂和水在均化器中混合。然后对该混合物进一步处理，以将单液滴颗粒的粒度从平均2-10μm液滴粒度降低至约<1μm，并优选低于400nm的亚微米尺寸。这可以通过高剪切或超声乳化来完成，其在减小液滴尺寸方面非常有效。或者，可以使用高压均化，其中使用高压均化器/活塞均化器来生产低至数纳米的极低粒度的纳米乳液。

纳米分散体的优点在于桦树皮提取物的药物活性组分分布到极细颗粒或液滴中，这导致改进的生物利用度。这样的纳米分散体可以直接施用于伤口或感染的皮肤，例如通过喷雾到身体的受影响的区域。关于处理性质，与油凝胶相比，根据本发明的纳米分散体是优越的。它是甚至可以喷雾或散布到感染的皮肤区域上的流体。

静电纺丝已经吸引了越来越多的注意，因为它允许药物通过简单地将活性化合物与聚合物溶液混合并随后使用适当的设备加工而结合到纳米纤维中。该方法在本领域中是公知的，并因此不必在这一点上进一步解释。生产的羊毛状物(fleece)具有独特的性质，例如高孔隙率、高包封效率和高表面积与体积比，因此高药物负载。此外，由静电纺丝纤维制成的伤口敷料模拟人体组织中的天然的细胞外基质，因此促进细胞增殖，改进气体交换，去除渗出物，在伤口愈合期间充当防止微生物进入和脱水的物理屏障。优选使用亲水性聚合物聚乙烯醇(pva)，并且已经被fda批准用于人类使用。pva聚合物具有独特的性质，例如良好的耐化学性、热稳定性、可生物降解性、生物相容性和无毒性，这使其适合作为用于伤口敷料的聚合物-药物载体而进行静电纺丝。

然而，将桦树皮干提取物包封到纳米纤维中可能引起困难。例如，早期研究表明，由于其独特的结构，干提取物的粒度不能被研磨以达到足够小的颗粒，即使当高能分散技术(例如超声或高压均化)与材料的水性和有机悬浮液一起使用时。这可以通过用桦树皮干提取物作为活性物质通过均化来加工亚微乳液和使用磷脂作为乳化剂来解决。假定该现象似乎与使用磷脂作为乳化剂直接相关。在这样的情境下，发现三萜烯提取物和磷脂的混合物的界面张力令人惊奇地揭示了协同效果。用高压均化器加工三萜烯提取物、磷脂和油的混合物，产生亚微米尺寸的分散体(纳米分散体)。这些亚微米液滴可以用作药物载体以包封难溶性药物。这可以增加亲脂性桦树皮干提取物的溶解度，导致改进的局部生物利用度。此外，磷脂也将有助于稳定o/w乳液中的亲脂性桦树皮干提取物，从而在静电纺丝之前增加其与亲水性pva聚合物溶液的相容性。此外，由于静电纺丝纳米纤维通常也在亚微米范围，亚微米乳液的生产将增强桦树皮干提取物在整个聚合物基质中更好的包封和均匀分布。

或者，纳米乳液的制备可以如下进行：在均化器中处理由一种或多种磷脂和水的混合物组成的预乳液。然后对该混合物进一步处理，以将单液滴颗粒的粒度从平均2-10μm液滴粒度降低至约<1μm，并优选低于400nm的亚微米尺寸。这可以通过高剪切或超声乳化来完成，其在减小液滴尺寸方面非常有效。或者，可以使用高压均化，其中使用高压均化器/活塞均化器来生产低至数纳米的极低粒度的纳米乳液。

如前所述，纳米分散体中的磷脂分布到极细颗粒或液滴中，这导致改进的生物利用度。这样的不含桦树皮提取物的纳米分散体可以直接施用于伤口或感染的皮肤，例如通过喷雾到身体的受影响的区域。它是甚至可以喷雾或散布到感染的皮肤区域上的流体。

此外，它可以转化成泡沫，该泡沫容易且几乎无接触地施加到皮肤，并且其是许多患者优选的。

对于这样的应用，将纳米分散体简单地填充到标准气溶胶罐中，加入推进气体如丙烷/丁烷、n2o、二甲醚等(2-20重量%)，并用标准泡沫头封闭该罐。

在本发明的优选的方面，将纳米分散体进一步加工成静电纺丝纤维，其中可以更长时间地保存纳米分散体的优点，即桦树皮提取物的精细分散和高生物利用度。该实施方案的另一个优点是容易处理这样的纤维。静电纺丝纤维可以容易地用于形成可以施用于伤口的羊毛状物或网状结构。存在许多其中这样的羊毛状物或网状物对于治疗伤口是非常有帮助的场合。例如，如果表皮的较大区域已经受伤或甚至被去除，例如在交通事故的情况下或在烧伤之后，这样的羊毛状物结构是非常有帮助的。或者，特别是对于老年人，经常存在例如由褥疮引起的严重伤口问题。这种类型的伤口难以治疗并且可能引起严重的不适。对于这样的伤口，具有抗菌和抗病毒活性的羊毛状物是非常有用的，特别是当由于纤维被身体溶解和吸收而不能去除织物结构时。

在本发明的优选的实施方案中，在第一步中将桦树皮提取物制成如上文所述的纳米分散体。然后将该纳米分散体转化为包含纤维形成剂的静电纺丝纤维。优选地，桦树皮提取物的纳米分散体与载体整合、掺合、共混或混合。具体地，静电纺丝纤维以均质方式共同含有药物活性剂(桦树皮提取物)和载体两者。

在以均质方式共同含有药物活性剂(桦树皮提取物)和载体两者的静电纺丝纤维的比较研究期间，已经令人惊讶地发现，由含有磷脂而没有任何桦树皮提取物的纳米分散体制成的静电纺丝纤维具有优异的性质并且可以用于生产用于伤口治疗的组合物。因此，本发明的其它目的是由含有磷脂且基本上不含桦树皮提取物的纳米分散体制成的静电纺丝纤维，及其在制造用于伤口治疗的组合物中的用途。

静电纺丝是一种生产纤维的方法，其中纤维的直径可以在约50nm至约2μm范围内，优选在200nm至800nm范围内。该方法包括向聚合物溶液施加高电压以生产聚合物射流。当射流穿过空气时，射流在静电排斥力下伸长，由此生产纳米纤维。

根据本发明，形成含有磷脂的纳米分散体并与聚合物混合。任选地，首先将桦树皮提取物溶解在纳米分散体中，然后将其与合适的聚合物混合。纳米分散体-聚合物溶液(含有或不含桦树皮提取物)例如用注射泵喷射，并且聚合物射流在高压场下移动到可以收集纤维的目标处。在这样的纤维中，纳米分散体的极小液滴分散在载体聚合物内。桦树皮提取物的纳米液滴精细地分布在聚合物基质中，其中超均化步骤也可能是有帮助的。由于液滴非常小并且均匀地分布在静电纺丝纤维内，纳米分散体已经转变为固态，这允许桦树皮提取物的活性成分的受控释放。静电纺丝纤维保持纳米分散体的生物利用度。

可用于优选实施方案的聚合物必须是药学上可接受的。这样的聚合物可以选自聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、藻酸盐、角叉菜胶、纤维素衍生物如羧甲基纤维素、甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、淀粉衍生物如羟乙基淀粉、淀粉羟乙酸钠、壳聚糖和衍生物、白蛋白、明胶、胶原、聚丙烯酸酯及其衍生物。特别优选易于溶解而在伤口上没有不期望的性质的这样的聚合物。特别优选聚乙烯醇或聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。

根据本发明的静电纺丝纤维的优点是与纳米分散体一起形成静电纺丝纤维的聚合物溶解在伤口中，并且不需要去除支架。根据静电纺丝纤维的具体需要，通过选择合适的聚合物或聚合物的共混物，可以调节溶解时间。例如，众所周知，通过改变聚丙交酯/聚乙交酯共聚物中单体的比率，可以调节在体内(或在伤口上)的溶解时间。通过选择两种或三种不同的聚合物并将它们一起混合成共聚物，可以精确地调节纤维的基质的性质。

用于制备医药目的的织物或羊毛状物的纳米纤维的静电纺丝方法是已知的。在静电纺丝方法中，可以容易地调节一些参数，由此可以影响静电纺丝纤维的性质。合适电压的选择对纤维的性质以及与聚合物混合的纳米分散体的粘度有影响。此外，与聚合物的浓度、聚合物的分子量、表面张力和溶液的均匀性和导电性相关的纳米分散体的浓度对静电纺丝纤维的性质具有重要影响。

必须优化参数，例如进料(流量)速率、施加的电压、注射器的尖端到收集器距离，并且必须控制环境参数，特别是温度、湿度和压力。根据用于静电纺丝纤维的装置，可以调节参数以获得纤维的期望的性质，其对于预期的应用领域是优化的。

由于用于形成静电纺丝纤维的材料是液体，在纤维被纺丝之后至少部分地去除液体可能是有利的。这可以通过加入高挥发性液体(如醇或醚)或通过在其中使纳米分散体(任选地含有桦树皮提取物)和聚合物纺丝的室中施加减压来获得。在减压下液体蒸发，并且纤维干燥并变硬。

包含任选地含有桦树皮提取物的纳米分散体的静电纺丝纤维可以有利地用于治疗伤口。这样的纤维可以容易地转变为所需厚度的羊毛状物中，并且可以容易地消毒。这样的无菌的羊毛状物或垫或网状物具有高的表面积与体积比，这导致高的药物负载能力。静电纺丝微纤维的另一个优点是织物的高孔隙率，其可以用作抵抗微生物的物理屏障。因此，受影响的皮肤区域可以非常好地愈合，由此防止来自环境的不期望的微生物的侵入。

市场上许多含有通常用于伤口愈合的活性剂(如水胶体或银敷料)的伤口敷料已显示出负面效果(如过敏性接触性皮炎)，并且使用负载抗生素的敷料承受在细菌中发展对抗生素的抗性的风险。

因此，一个目的是开发一种敷料(任选地负载有桦树皮提取物)，其具有约2天至约10天，优选约5天的持续药物释放，其适于人类用于伤口愈合，即使在长期使用后仍具有有效治疗。由于所有组分在人体中都是生物相容且可生物降解的，不需要侵入性和/或创伤性干预来去除如深伤口中的敷料。此外，持续药物释放可以导致较不频繁的敷料更换，敷料更换是疼痛的，尤其在治疗慢性伤口中，并从而导致更好的患者依从性。

根据本发明的纳米纤维还具有其它优点，如在细胞粘附、迁移、增殖和分化方面的优异性能以及细胞外基质的类似物理性质。根据本发明的静电纺丝纤维的另一个优点是桦树皮提取物随时间持续释放。由于衍生自桦树皮提取物的纳米分散体的液滴在静电纺丝纤维内分布，药物活性物质根据静电纺丝纤维的溶解而释放。

选择形成纤维的合适聚合物是确定溶解速度的另一种措施。一些聚合物迅速溶解，而其它聚合物在较长时间保持完整。当纤维溶解时，夹带在纤维内的液滴释放，并且精确地在需要的地方提供桦树皮提取物的化合物的最佳浓度。

根据预期用途，使用纳米分散体与聚合物的适当比率。通常纳米分散体与聚合物的比率在约1.0-60重量份的纳米分散体比99-40重量%的聚合物范围内，优选5-50%的纳米分散体比95-50%的聚合物，并特别优选25-45%的纳米分散体比55-75%的聚合物。

此外，已经发现，甚至任选地含有桦树皮提取物的静电纺丝纤维也可以转化成泡沫。如前所述，这样的泡沫容易且几乎无接触地施加到皮肤，并且被许多患者优选。

为了提供这样的泡沫制剂，静电纺丝纤维必须在搅拌下与水混合以形成分散体。然后将该分散体填充到标准气溶胶罐中，加入推进气体如丙烷/丁烷、n2o、二甲醚等(2-20重量%)，并用标准泡沫头封闭该罐。可以由这样的气溶胶罐提供的泡沫容易且几乎无接触地施加到所有种类的伤口，例如烧伤、擦伤或褥疮。

本发明的其它方面在以下实施例中显示。

实施例

在以下实施例中，使用具有可变量的桦树皮提取物的不同的纳米分散体。将纳米分散体与pva溶液混合，并将混合物静电纺丝。实施例1-4的不同的混合物如下所示。

用实施例1的混合物获得的垫的性质示于表1：

含有磷脂桦树皮提取物纳米分散体(60%/40%)的10%pva纳米纤维的电子显微镜照片如图1所示。

实施例5

为了显示本发明的实施方案的优越活性，已经进行猪离体伤口愈合测定。简言之，将从屠宰场(供人消费)获得的猪耳在屠宰后直接递送至实验室，清洁并消毒。此后，从耳朵的褶(plicae)取出6mm的穿孔活检组织，并且移除脂肪和皮下组织。因此，通过去除在7.1mm²的中心区域中的表皮和上层真皮产生伤口。然后，将如此形成的离体伤口愈合模型以真皮向下放置在培养皿中的纱布上，并与补充有氢化可的松、2%胎牛血清、青霉素和链霉素的dulbecco改良eagle培养基一起以空气-液体界面孵育。受伤后立即施加4cm²静电纺丝垫/5μl油凝胶，并将模型在37℃和5%co2下孵育48小时。其它步骤涉及振荡冷冻，使用显微镜中的标尺和通过在评价期间检查伤口的总长度来鉴定伤口愈合模型的中心部分的冷冻切片，用苏木精和曙红染色。通过用显微镜测量伤口边缘和再生表皮的尖端之间的距离来评估伤口愈合过程(上皮再形成)。

在作为对照的实例中，伤口根本没有被治疗。作为与现有技术的比较，使用油凝胶。可以观察到轻微的改进。此外，使用不含桦树皮提取物的聚乙烯醇垫(pva垫)。可以看出，愈合性质比对照组更好，甚至比油凝胶更好。

当聚乙烯醇垫含有桦树皮提取物时，可以观察到愈合活性的显著改进。这可以在5%桦树皮提取物(te)中看到，并且在0.5%桦树皮提取物(te)中更有效。

实施例6

a)在进一步的实验中(结果未在图2中显示)，将根据实施例5的制剂与基本上不含桦树皮提取物的制剂进行比较。令人惊讶的是，用不含桦树皮提取物的制剂实现的结果与具有桦树皮提取物的那些结果相当。

b)在另外的实验中(结果未在图2中显示)，将根据实施例1-4的含有静电纺丝纤维的制剂转化为泡沫制剂，其如实施例5中所述使用。同样，用不含桦树皮提取物的泡沫制剂实现的结果与具有桦树皮提取物的那些泡沫制剂相当。