可重构的替维瑞克-TFA组合物的制作方法

可重构的替维瑞克-tfa组合物
技术领域
[0001]
本发明涉及一种可重构的替维瑞克-tfa组合物、制备所述组合物的方法、和重构所述组合物的方法。


背景技术：

[0002]
替维瑞克(teverelix)是一种合成的促性腺激素释放激素拮抗剂(gnrh拮抗剂)，其与内源性神经激素gnrh(或称为黄体生成素释放激素，lhrh)竞争结合其在垂体前叶中的受体。通过降低或阻断gnrh的作用，该gnrh拮抗剂抑制促卵泡激素(fsh)和黄体生成素(lh)从垂体前叶释放。
[0003]
fsh和lh均参与正常的生殖功能。在女性中，fsh刺激未成熟的格拉夫卵泡(graafian follicle)生长至成熟，而lh水平的变化控制排卵。另一方面，在男性中，fsh在精子发生中起重要作用，而lh刺激睾丸中睾酮的产生。
[0004]
因此，替维瑞克适合于治疗激素依赖性病症，例如良性前列腺肥大、激素依赖性前列腺癌、子宫内膜异位症和子宫肌瘤。
[0005]
由于替维瑞克(ac-d-nal-d-pclphe-d-pal-ser-tyr-d-hci-leu-lys(ipr)-pro-d-ala-nh2)是疏水性肽，它在许多抗衡离子的存在下具有形成凝胶的倾向。wo2003/022243中解决了该问题，它公开了可以通过使替维瑞克肽与抗衡离子(例如，三氟乙酸根(tfa))以肽与抗衡离子至少1:1.6的摩尔比接触来防止凝胶的形成，从而提供了替维瑞克-盐(例如替维瑞克-tfa)的流体乳状微晶水性悬浮液。
[0006]
根据wo2003/022243，为了确保得到期望的微晶悬浮液，替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根(tfa)的比率至少为1:1.6是至关重要的，否则将形成凝胶。然而，本发明的发明人发现，wo2003/022243中公开的摩尔比将导致不希望的凝胶形成并导致悬浮液不均匀。这是一个问题，不仅因为这样的悬浮液将难以注射，而且因为由于凝胶干扰了替维瑞克肽的期望的持续作用从而损害了所述肽的生物利用度。
[0007]
由于替维瑞克在与水和酸接触时会去酰胺化，因此wo2003/022243的替维瑞克-tfa组合物在例如冷藏和室温下储存期间不稳定，因此所述替维瑞克组合物在这样的条件下保存期限相对较短。
[0008]
去酰胺化是由替维瑞克肽的水解引起的。然而，因为例如由于组合物中的ph值较低，水含量的减少可促进去酰胺化的速率增加，所以降低组合物中的水含量以求增加保存期限将不会很明显。
[0009]
关于wo2003/022243中公开的替维瑞克-tfa组合物的另一个问题是，本发明的发明人发现，尽管所应用的制造条件和工艺相同，但制造商提供的替维瑞克与抗衡离子tfa的摩尔比存在批次差异。
[0010]
由于摩尔比对于获得期望的微晶悬浮液是至关重要的，因此所述比率的差异可影响药物制剂中替维瑞克的生物利用度。因此，医疗人员和其他用户能够信赖制造商提供的替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比是至关重要的。
[0011]
因此，既需要开发具有长保存期限的稳定的组合物，又需要提供新方法来制造获得预定的肽与抗衡离子摩尔比并且符合预期的替维瑞克-tfa。


技术实现要素：

[0012]
因此，本发明的第一方面是提供在冷藏和室温下具有延长的保存期限的替维瑞克-tfa组合物。
[0013]
本发明的第二方面是提供一种确保获得期望的肽与抗衡离子摩尔比的方法。
[0014]
本发明的第三方面是提供一种调节溶液中肽与抗衡离子摩尔比的方法。
[0015]
本发明的第四方面是提供表现出长作用持续时间、且注射量较低并还允许较低施用频率的替维瑞克-tfa组合物。
[0016]
根据本发明，这些方面和其他方面通过提供一种可重构的替维瑞克-tfa组合物来实现，所述组合物所具有的替维瑞克与三氟乙酸根摩尔比低于形成微晶所需的摩尔比。
[0017]
由于本发明的可重构组合物具有低含量的抗衡离子三氟乙酸根，因此所述可重构组合物中的ph值维持在确保替维瑞克的去酰胺化降低到可接受水平的值，即，将会发生的可能的去酰胺化降低到不会影响替维瑞克的稳定性的水平，从而使替维瑞克在例如大约2-8℃下储存期间保持稳定。
[0018]
在这方面，优选的是，所述可重构组合物中替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比在1:1至1:1.85之间，优选约为或低于1:1.6，因为这将提供稳定的可重构替维瑞克-tfa组合物。
[0019]
在本发明的内容之内，术语“替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比”是指替维瑞克和三氟乙酸根之间的摩尔关系，其中所述摩尔比的第一个数字是组合物中替维瑞克的摩尔含量，第二个数字是指组合物中tfa的摩尔含量。例如，摩尔比为1:1.85意味着对于组合物中的每摩尔替维瑞克而言，所述组合物包含1.85mol tfa。以类似的方式，摩尔比为至少1:2.2将意味着对于组合物中的每摩尔替维瑞克而言，所述组合物包含至少2.2摩尔三氟乙酸根(tfa)。
[0020]
在一个优选的实施方式中，替维瑞克与三氟乙酸根(tfa)的摩尔比高于1:1.3且低于1:1.6，即，当所述组合物包含1mol的替维瑞克时，tfa的含量在1.3和1.6mol之间，因为本发明的发明人发现，在该范围内的摩尔比为所述可重构的替维瑞克-tfa组合物提供了最佳的稳定性。
[0021]
术语“可重构的替维瑞克-tfa组合物”是指基本上干燥的替维瑞克-tfa组合物，优选粉末、冻干物、饼块或这些的组合，并且其中所述组合物在添加重构液体后溶解和/或悬浮在所述液体中。
[0022]
可重构的组合物在制药工业中是众所周知的，其中在即将施用之前将水或其它稀释剂添加到干组合物中。这样的常规可重构组合物以基本上干燥的状态储存，以保持组合物的稳定性。然而，本发明的发明人发现，如果在可重构的组合物中存在少量的水(即，基于所述可重构的替维瑞克-tfa组合物的总重量，其量在0.3至5重量％之间，优选约1至2重量％)，则提供了一种改善的替维瑞克-tfa组合物，其易于处理、重构、和相应地使用。
[0023]
不受理论的束缚，水含量可以在替维瑞克粒子之间提供高静电力，这在处理所述可重构组合物时，例如当将所述组合物填充到小瓶或注射器腔中时，具有重要性。
[0024]
在一个优选的实施方式中，基于可重构的替维瑞克-tfa组合物的总重量，水在所
述可重构的替维瑞克-tfa组合物中的存在量为1重量％和2重量％之间，优选1.5重量％，因为这将提供保留化学完整性并提供稳定组成的可重构的替维瑞克-tfa组合物。
[0025]
本发明提供的稳定性使得在室温下的保存期限能够更长，使得所述可重构的替维瑞克-tfa组合物可以在例如灭菌后储存。可以将所述可重构的组合物包装和储存(例如在注射器或小瓶中)供以后使用。
[0026]
本发明的可重构组合物可以用任何合适的方式制备/制造，但在一个实施方式中，将替维瑞克和三氟乙酸根在水溶液中接触以提供替维瑞克-tfa水溶液，然后例如通过冷冻干燥(冻干)或喷雾干燥将其干燥，例如干燥成粉末，以提供本发明的可重构组合物。因此，在一个优选的实施方式中，所述可重构的组合物是通过冻干(冷冻干燥)或喷雾干燥获得的粉末，和/或通过冻干获得的饼块。在一个实施方式中，将替维瑞克和三氟乙酸根以预定的摩尔比接触，所述摩尔比低于微晶形成所需的摩尔比，优选高于1:1.3且低于1:1.6。
[0027]
在一个优选的实施方式中，当基于可重构的替维瑞克-tfa组合物的总重量，所述可重构的组合物(例如粉末)含有的水量在0.3至5重量％之间时，停止所述干燥步骤。优选干燥溶液，使得所述可重构的替维瑞克-tfa组合物中水的存在量在1重量％和2重量％之间，例如1.5重量％。所述组合物中水的量可以例如在干燥期结束时使用常规的测量方法和设备进行评估。
[0028]
如前所述，由于未知的原因，在制造期间可能会出现替维瑞克与三氟乙酸根摩尔比的批次差异，然而，优选知道在特定的可重构替维瑞克-tfa组合物中替维瑞克与三氟乙酸根的确切摩尔比。因此，制造所述可重构的替维瑞克-tfa组合物的方法可以进一步包括在干燥之前分析溶液中的摩尔比的步骤，以便知道具体摩尔比。这也将提供通过在干燥溶液之前添加三氟乙酸根将所述摩尔比调节至特定的预定摩尔比的可能性，从而有效地抵消了摩尔比中可能存在的任何差异。因此，如果发现溶液中摩尔比为例如1:1.2，可通过添加三氟乙酸根将所述摩尔比调节至1:1.4。唯一的要求是，由此产生的摩尔比在干燥前必须低于微晶形成所需的摩尔比。
[0029]
可以通过首先使用常规hplc方法测量样品中三氟乙酸根和替维瑞克的含量，然后使用以下公式计算摩尔比来确定溶液的摩尔比：
[0030][0031]
三氟乙酸根和替维瑞克的摩尔质量已经计算出：m
tfa
＝114g/mol以及m
tev
＝1459g/mol。
[0032]
干燥后，由此获得的可重构的替维瑞克-tfa组合物可以被储存，并在要制备可注射的药物制剂时，用水或其它合适的溶液进行重构。
[0033]
提供具有特定和预定摩尔比的本发明的可重构替维瑞克-tfa组合物将确保在重构时可以将固定量的三氟乙酸根添加到所述组合物中，从而有效且简单地获得精确和期望的摩尔比以便得到所述替维瑞克盐(替维瑞克-tfa)的流体乳状微晶水性悬浮液，而不形成凝胶。在这方面，优选的是，将重构后的替维瑞克与tfa的摩尔比调节到至少1:2.1，因为发明人已表明由此获得了替维瑞克-tfa微晶悬浮液，而不由此形成凝胶。当比率高于1:2.2时，该悬浮液也是均匀的。
[0034]
因此，本发明的可重构组合物中替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根的低摩尔比，除
了优化替维瑞克肽的稳定性之外，也将确保简单地通过在重构期间或之后添加足够量的三氟乙酸根，可以在重构过程期间调节肽与三氟乙酸根的摩尔比，从而确保获得最佳的肽与抗衡离子摩尔比(取决于重构组合物的预期用途)。
[0035]
例如，如果在制造过程期间已经确定所述可重构的替维瑞克-tfa组合物的摩尔比为1:1.4，并且如果期望在最终的替维瑞克-tfa水性制剂中摩尔比为1:2.2，则在重构过程期间必须添加0.8mol tfa/摩尔所述组合物中存在的替维瑞克。所述量可以由本领域技术人员容易地计算。
[0036]
本领域技术人员将进一步理解，只要替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比低于微晶形成所需的摩尔比，则所述摩尔比是例如1:1.4还是1:1.36都是无关紧要的，只要所述比率是已知的或可以计算的，以确保本领域技术人员可以计算出重构过程期间要使用的正确的tfa量即可。
[0037]
三氟乙酸根含量可以在所述组合物重构之后添加/调节，但在优选的实施方式中，三氟乙酸根是水性重构溶液的一部分，因为这将提供重构本发明组合物的快速而有效的方式。如果需要，所述水性重构溶液可含有等渗剂，例如甘露醇和/或可药用的赋形剂。
[0038]
本领域技术人员基于本申请将理解，代替干燥所述替维瑞克-tfa溶液以获得可重构的替维瑞克-tfa组合物，可以在评估精确的摩尔比之后通过添加足够量的三氟乙酸根直接在溶液中将所述摩尔比调节到替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比高于微晶形成所需的摩尔比，即，高于1:2.1的比率，优选至少1:2.2，更加优选至少1:2.4。这将提供可直接使用的水性药物制剂，即该制剂是即用的。
[0039]
本发明的发明人此外发现，当最终的水性药物制剂中替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比为至少1:2.1、优选至少1:2.2时，所述制剂将包含可溶性和不溶性替维瑞克二者，从而提供独特的替维瑞克生物利用度。
[0040]
不受理论的束缚，所述可溶性替维瑞克为水溶液形式，在一些情况下为凝胶形式。凝胶的存在将抑制任何自由的水性替维瑞克，因此防止或至少减少了立即释放。所述不溶性替维瑞克为微晶形式。所述微晶将防止凝胶形成，因此“解锁”所述水性替维瑞克。随着时间流逝，本发明的组合物中的tfa将被身体吸收，使比率降低，使得微晶随后转变成凝胶，形成了缓慢释放的贮库。因而，所述非凝胶可溶性替维瑞克是立即可用的，提供了作用的几乎立即起效，而所述凝胶可溶性和不溶性替维瑞克(微晶)有助于提供替维瑞克的持续释放。
[0041]
因此，使用本发明的替维瑞克-tfa组合物，可以通过调节添加到所述可重构组合物中的三氟乙酸根的量并由此改变所述注射组合物中不溶性与可溶性替维瑞克的比率，从而简单地调节替维瑞克的释放曲线，。
[0042]
尽管优选所述替维瑞克tfa组合物以干燥状态(例如，作为通过冻干或喷雾干燥获得的粉末)储存，也可能有必要允许最终的水性药物制剂储存一定的时间段。然而，由于替维瑞克当与水和高浓度的酸接触时会去酰胺化，因此在制剂内会少量出现不希望的降解产物(杂质)并可能潜在影响所述制剂的质量、安全性和功效，从而潜在导致严重的健康危害。
[0043]
本发明的发明人已经发现，当在最终的微晶水性悬浮液中替维瑞克与tfa的摩尔比低于1:2.8时，杂质的水平保持在可接受的水平。因此，在流体乳状微晶水性悬浮液中的最佳摩尔比优选在1:2.2(或1:2.4)和1:2.8之间。
[0044]
在本发明的一个简单且优选的实施方式中，所述可重构的替维瑞克-tfa组合物作
为单位剂量提供(例如，以粉末的形式)，并具有预定的替维瑞克与抗衡离子tfa摩尔比，所述摩尔比低于微晶形成所需的摩尔比，优选在1:1至1:1.85之间，更加优选高于1:1.3且低于1:1.6，并且其中所述单位剂量在使用前即刻通过添加含有足量三氟乙酸根的固定量的水性重构溶液进行重构，从而在所提供的药物制剂中达到预定的替维瑞克与三氟乙酸根摩尔比。所述预定的摩尔比优选为至少1:2.1，优选至少1:2.2，并更加优选约1:2.4，由此确保所提供的重构悬浮液基本上不含凝胶，或者至少凝胶浓度足够低使所述重构的悬浮液可以被用于注射。
[0045]
因此，本发明的另一个方面的特征为一种充有单位剂量的所述可重构的替维瑞克-tfa组合物的包装，例如注射器或小瓶。在本发明的上下文内，术语“单位剂量”是在单剂量中施用于患者的活性成分(替维瑞克)的量。所述单位剂量被例如放置在合适的注射器中以便提供容易的施用。
[0046]
已经发现，不同患者中替维瑞克的血浆浓度基本上与患者体重无关，因此相信，替维瑞克的单位剂量被认为是所有对象(男性/女性)通用的。因此，悬浮液中替维瑞克的剂量取决于要治疗的病症。
[0047]
优选地，在所述单位剂量中替维瑞克的浓度在30mg/ml和100mg/ml之间，更加优选在45mg/ml和90mg/ml之间，例如约75mg/ml。在一些情况下，替维瑞克的浓度可高于约100mg/ml。所述单位剂量的体积可在0.4ml和1.6ml之间，例如约1.2ml。已证明以该浓度和体积皮下和/或肌内给予注射只产生轻微的注射部位反应。
[0048]
本发明的最终流体乳状微晶水性悬浮液，例如，当包含在药物组合物中时，尤其适合于通过抑制促性腺激素例如睾酮和双氢睾酮(dht)来治疗前列腺癌。然而，该悬浮液同样可以同样好地用于至少部分改善与促性腺激素释放有关的其它疾病或病症。所述疾病或病症可以是良性前列腺肥大；急性尿潴留；子宫内膜异位症；乳腺或宫颈癌症；激素失衡；雄激素敏感性病症；雌激素敏感性病症；或其组合。
[0049]
在一个优选的实施方式中，本发明还涉及一种药盒，其包含填充有单位剂量的替维瑞克-tfa组合物的第一包装，和填充有重构溶液的第二包装，所述重构溶液包含足够量的tfa以获得至少1:2.1、优选至少1:2.2并更加优选约为或高于1:2.4的期望摩尔比。优选所述摩尔比不超过1:2.8，即，对于每摩尔的替维瑞克而言，tfa的摩尔含量等于或低于2.8。所述第一包装可以例如是注射器，并且所述第二包装可以与所述注射器物理连接，以确保获得正确的替维瑞克与tfa摩尔比。作为彼此物理连接的第一和第二包装的一个例子，可以提及用于冻干产品的常规双腔注射器。这样的双腔注射器是本领域公知的。
[0050]
在一个实施方式中，所述药盒被安排用于提供最终的替维瑞克-tfa制剂，所述制剂的替维瑞克与抗衡离子摩尔比为1:2.4，替维瑞克浓度为约75mg/ml。
[0051]
本发明中提供的组合物和制剂制造起来便宜，并且由于容易使用，它提供了非常简单的剂量方案。
[0052]
可以预见上述原理和组合的修改和组合在本发明的范围内。
具体实施方式
[0053]
实施例：
[0054]
为了确定替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根的摩尔比的影响，进行了许多测试。
b1，b2，b31:1.85是否否-c1，c2，c31:2.1否是是否d1，d2，d31:2.36否是是是e1，e2，e31:2.61否是是是f1，f2，f31:2.86否是是是g1，g2，g31:3.12否是是是
[0072]
在法国realux供应的偏光显微镜下进一步观察了1号试管中替维瑞克-tfa水性组合物的微晶含量。相应的摩尔比的结果示于图1a-图1g中。从这些观察结果清楚看出，在摩尔比为1:1.85及以下时，未观察到微晶形成，因此，为了引发期望的微晶形成，替维瑞克与抗衡离子tfa的摩尔比必须高于1:1.85。
[0073]
因此，优选在本发明的可重构组合物中，替维瑞克与三氟乙酸根(tfa)的摩尔比低于1:1.85，并优选低于1:1.6。
[0074]
此外，从表3明显看出，直到摩尔比高于1:2.1才得到替维瑞克-tfa的均匀悬浮液，因此，相应地优选在重构的替维瑞克-tfa水性悬浮液中的摩尔比高于1:2.1并优选更高，例如至少1:2.2，并更加优选至少1:2.4。
[0075]
实施例2：可溶性替维瑞克和不溶性替维瑞克的含量与摩尔比的关系
[0076]
为了确定相应的试管中可溶性替维瑞克相对于不溶性替维瑞克的含量，将各摩尔比的2号和3号试管以10,000rpm离心10至20分钟，并使用hplc分析来测量上清液和沉淀团中的替维瑞克浓度。
[0077]
hplc分析的色谱条件示于表4。
[0078]
表4
[0079][0080]
通过称量59.9mg替维瑞克乙酸盐(批次080113)到容量瓶中，并用水:乙腈65:35v/v将体积补足至100ml，制备两个100％标准。用相同的溶剂将10ml的该溶液补足至50ml，提供浓度为0.1mg/ml的替维瑞克肽。
[0081]
通过用相同的溶剂将2ml的100％标准稀释至200ml来提供0.001mg/ml替维瑞克肽的浓度，制备1％标准溶液。
[0082]
使用所述两个100％标准进行内部标准化。所述1％标准用于检查响应的线性。用100％标准的回收率必须在95％-105％的区间内。
[0083]
将离心后得到的沉淀团溶解在65:35v/v的水:乙腈中，并用相同的溶剂将体积补足至100ml。将该溶液稀释5倍(10ml加入50ml中)，并进行hplc。
[0084]
将上清液转移至容量瓶中，并用相同的溶剂(即，水:乙腈65:35v/v)将体积补足至100ml。将该溶液稀释5倍(10ml加入50ml中)，并进行hplc。hplc分析的结果示于表5。
[0085]
表5
[0086][0087]
计算各摩尔比的平均浓度，见表6，结果在图2和图3中描绘。
[0088]
表6
[0089][0090]
从表5和6以及图2和图3明显看出，当三氟乙酸根的量相对于替维瑞克增加时，不溶性替维瑞克的程度增加，因此在1:2.1的摩尔比(1mol替维瑞克比2.1mol tfa)下，药物制剂的约50％由不溶性替维瑞克组成，而在药物制剂中，在1:2.36(～1:2.4)的摩尔比下，不溶性替维瑞克的量为约82％。
[0091]
实施例3：血浆浓度与摩尔比的关系
[0092]
为了评估摩尔比对替维瑞克血浆浓度的相关性，如实施例1中所述制备了五个含有不同摩尔比的玻璃小瓶，提供了包含表7中所示的替维瑞克-tfa水性组合物的试管：
[0093]
表7
[0094]
试管iiiiiiivv
摩尔比1:1.641:2.11:2.361:2.611:2.86
[0095]
每个摩尔比测试五只大鼠。使用25mm 21g luer 6％常规斜角针(可从比利时leuven的terumo获得)和100μl luer滑动注射器(可从美国reno的hamilton公司获得)向每只大鼠注射60μl相应的溶液。在施用前、然后在施用后1小时、6小时、24小时、48小时、7天、10天、14天、21天和28天测量血浆浓度。
[0096]
注射到每只个体大鼠中之后替维瑞克的峰值血浆浓度(cmax)示于表8，并在图4中描绘。
[0097]
表8
[0098][0099]
从这些结果清楚地看出，直至摩尔比为1:2.1之前，替维瑞克的cmax增加，此后血浆浓度基本稳定。
[0100]
还通过定期采集血样来测量四周期间内的血浆浓度。
[0101]
图5显示了四周期间的平均血浆水平，显然，替维瑞克的释放曲线取决于摩尔比。例如，摩尔比为1:2.1的悬浮液显示出较高的替维瑞克血浆浓度。因此，可以简单地通过调节添加到本发明的可重构组合物中的三氟乙酸根的量、从而改变药物制剂中的替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比，来调节替维瑞克的释放曲线。
[0102]
在临床上，这提供了针对例如关于不同的适应症、年龄和/或性别的各个患者群的需求来优化治疗的潜力。一个患者群可能需要作用的立即起效，则需要高浓度的可溶性替维瑞克，而另一个患者群可能需要替维瑞克的持续释放，则需要低浓度的可溶性替维瑞克。以类似的方式，可以在患者治疗的不同阶段施用具有不同摩尔比的不同药物制剂。此外，针对不同患者群的具体需要来调节摩尔比的可能性将会增加患者的治疗接受性和依从性。
[0103]
实施例4：替维瑞克的稳定性与摩尔比的关系
[0104]
为了确定替维瑞克与抗衡离子三氟乙酸根的摩尔比对替维瑞克稳定性的影响，进行了以下测试。
[0105]
以两种浓度：10mg/ml(按碱替维瑞克表示)和1mg/ml(按碱替维瑞克表示)，制备替维瑞克与tfa不同摩尔比(低：1:1.7；中范围：1:2.16；高：1:2.8；极高：1:4.0)的四个批次替维瑞克tfa溶液。
[0106]
获得作为干粉提供的可重构替维瑞克tfa组合物。所述批次的特性示于表9：
[0107]
表9
[0108]
替维瑞克含量79.8％tfa含量13.5％水含量3.1％
[0109]
起始材料的摩尔比使用以下计算来确定：
[0110][0111]
如下制备八个批次，10mg/ml的四个摩尔比各一个，1mg/ml的四个摩尔比各一个。
[0112]
10mg/ml时的低摩尔比(1:1.7)
[0113]
1.将0.312g的替维瑞克tfa(替维瑞克净重)用注射用水重构，使该悬浮液达到3.0ml以形成104mg/ml的均匀乳状悬浮液。以前的研究证明，在该浓度下，96％的替维瑞克将形成固体替维瑞克，因此，离心后大约300mg的替维瑞克将作为固体替维瑞克回收。
[0114]
2.将该制备物立即在4℃下以10,000rpm(8,500g)离心10分钟。
[0115]
3.弃去离心材料的上清液。以前的研究证明，该固体替维瑞克具有大约1:1.7的替维瑞克与tfa摩尔比。
[0116]
4.将离心沉淀团用注射用水重悬，并补足到30ml，以形成约10mg/ml并且摩尔比为约1:1.7的溶液。
[0117]
10mg/ml时的中摩尔范围比(1:2.16)
[0118]
1.将0.1g替维瑞克tfa(替维瑞克净重)在10ml锥形瓶中用注射用水重构，制成10.0ml体积的溶液以形成替维瑞克为10mg/ml并且替维瑞克与tfa的摩尔比为1:2.16的溶液。
[0119]
10mg/ml时的高摩尔比(1:2.8)
[0120]
1.将0.1g替维瑞克tfa(替维瑞克净重)在10ml锥形瓶中用5ml的含0.0097m三氟乙酸的注射用水重构。
[0121]
2.将该溶液用注射用水补足到10.0ml以形成替维瑞克为10mg/ml并且替维瑞克与tfa的摩尔比为1:2.8的溶液。
[0122]
10mg/ml时的极高摩尔比(1:4.0)
[0123]
1.将0.1g替维瑞克tfa(替维瑞克净重)在10ml锥形瓶中用5ml的含0.0252m三氟乙酸的注射用水重构。
[0124]
2.将该溶液用注射用水补足到10.0ml以形成替维瑞克为10mg/ml并且替维瑞克与tfa的摩尔比为1:4.0的溶液。
[0125]
1mg/ml时的低摩尔比(1:1.7)
[0126]
1.将0.312g的替维瑞克tfa(替维瑞克净重)用注射用水重构，使该悬浮液达到3.0ml以形成104mg/ml的均匀乳状悬浮液。
[0127]
2.将该制备物立即在4℃下以10,000rpm(8,500g)离心10分钟
[0128]
3.弃去离心材料的上清液
[0129]
3.将离心沉淀团在注射用水中重悬(终体积300ml)，以制成约1mg/ml并且替维瑞克与tfa的摩尔比为约1:1.7的溶液。
[0130]
4.将10.0ml转移到10ml锥形瓶中。
[0131]
1mg/ml时的中摩尔范围比(1:2.16)
[0132]
1.制备替维瑞克tfa在注射用水中的1mg/ml溶液。
[0133]
1mg/ml时的高摩尔比(1:2.8)
[0134]
1.将0.010g替维瑞克tfa(替维瑞克净重)在10ml锥形瓶中用5ml的含0.001m三氟乙酸的注射用水重构。
[0135]
2.用注射用水将体积补足至10ml。
[0136]
1mg/ml时的极高摩尔比(1:4.0)
[0137]
1.将0.010g替维瑞克tfa(替维瑞克净重)在10ml锥形瓶中用5ml的含0.0205m三氟乙酸的注射用水重构。
[0138]
2.用注射用水将体积补足至10ml。
[0139]
在分析替维瑞克纯度之前，所有溶液均保持在实验室温度(20℃)下。
[0140]
从每个溶液中一式两份取样品，并使用常规rp-hplc方法分析替维瑞克纯度。色谱条件如表10所示：
[0141]
表10
[0142][0143]
制备后，即零时间，溶液中的替维瑞克纯度示于表11：
[0144]
表11
[0145][0146]
为了评价随时间的稳定性，然后将相应的溶液在有塞子的玻璃锥形瓶中储存在+40℃和相对湿度75％的舱室中。
[0147]
在所述10mg/ml溶液一个月后，和所述1mg/ml溶液两周后，使用已描述的方法重复替维瑞克纯度分析。下表12显现了所述溶液在相关时间段后的纯度。
[0148]
表12
[0149][0150]
稳定性结果示于图6和图7中，并根据悬浮液的摩尔比描绘了储存期间杂质百分比的增加。
[0151]
从所述图中明显看出，悬浮液中较高浓度的三氟乙酸根提供了明显较高的杂质浓度，因此结果证实，当替维瑞克与高浓度的酸(三氟乙酸根)接触时，将少量出现不希望的降解产物(杂质)，并可潜在影响制剂的质量、安全性和功效，从而潜在地引起严重的健康危害。因此，为了获得稳定的替维瑞克-tfa制剂，不管作为干粉还是作为悬浮液/溶液，重要的是提供具有低三氟乙酸根浓度/含量的组合物，即，对于每摩尔替维瑞克而言，三氟乙酸根的摩尔含量应保持尽可能低。
[0152]
从图6和图7可以看出，当悬浮液中替维瑞克与三氟乙酸根的摩尔比低于1:2.8(即，1mol替维瑞克比少于或等于2.8mol tfa)时，杂质(即不希望的降解产物，例如由去酰胺化产生的)的水平保持在可接受的水平。
[0153]
从所述图还清楚看出，替维瑞克的浓度也与杂质水平有关。然而，为了减少注射量，关系到使悬浮液包含的替维瑞克浓度为至少10mg/ml，优选至少30mg/ml，因此实际上不可能简单降低最终的流体乳状水性悬浮液中的替维瑞克浓度。然而，为了提供更稳定的产品，该因素只是使得组合物中酸(三氟乙酸根)的浓度在储存期间更加重要，在干燥和液体状态下均如此。