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本申请要求基于2018年7月10日提交的10-2018-0080210号韩国专利申请的优先权权益，并将相应的韩国专利申请中公开的全部内容作为本说明书的一部分并入。
本发明涉及一种透明质酸填充剂，更具体地涉及一种同时具有单相透明质酸(HA)填充剂和双相透明质酸填充剂的性质，因此可在低注射力下注射并具有优异的提拉能力的透明质酸填充剂，及其制备方法。
背景技术：
人的皮肤组织通过包含诸如胶原蛋白、弹性蛋白等蛋白质和糖胺聚糖的细胞外基质来维持其结构，但当由于外部冲击、疾病或老化等导致出现软组织缺陷时，组织增强例如软组织增强已用于医学和美容目的。这种增强通过整形外科手术完成，或者通过将生物组织或合成的聚合物化学物质注射到该区域中来增加和扩充软组织的体积，从而以非外科方式修复和修正其形状。然后，一种作为与皮肤组织相似的组分并被插入到特定部位以扩充软组织、从而美容性扩充脸颊、嘴唇、乳房、臀部等的体积并通过减少皮肤细纹和深纹来用于抗皱或轮廓修正的物质，被称为软组织增量材料(soft tissue augmentation material)，通常被称为真皮填充剂(dermal filler)。关于这种填充剂最初开发的第一代真皮填充剂包括通过提取源自于动物、即牛或猪等的动物蛋白所制备的产品，例如Zyderm和Zyplast，以及使用人胶原蛋白的Cosmoderm或Cosmoplast，等等，但由于效果持续时间短以及在手术前一个月进行皮肤敏化测试的不便，近来已经很少运用它们。
第二代填充剂是透明质酸(以下也称为‘HA’)填充剂，效果持续时间比胶原蛋白填充剂长并由与人体组分相似的多糖(N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸)组成，因此其副作用较少且易于操作和去除，并且可以通过吸引水来维持皮肤的水分、体积和弹性，因此作为皮肤填充剂具有适合的优势。
然而，透明质酸本身显示在人体中的半衰期短，只有几个小时，因此在应用中受到限制，并由此已经进行了研究以通过交联来增加半衰期(内部持久性)。例如，美国专利号4,582,865公开了一种使用二乙烯基砜(DVS)作为交联剂而交联的透明质酸衍生物，其水凝胶形式已经以商品名上市，美国专利号5,827,937公开了一种使用多官能环氧化合物作为交联剂来制备透明质酸衍生物交联产品的方法，其中是一种使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)作为交联剂制备的水凝胶形式的透明质酸交联产品，已获美国FDA批准，并可在全球范围内作为组织增强填充剂使用。
这样的交联透明质酸填充剂包括由单相制成的填充剂(单相HA填充剂)和由双相制成的填充剂(双相HA填充剂)。单相透明质酸填充剂使用包含交联透明质酸的均质液体样水凝胶来制备，因而通常具有低弹性和高内聚性。因此，当将单相透明质酸填充剂注射到皮肤中时，不太可能偏离注射部位，但问题在于不能长时间维持注射形式并且术后的形状(形式)保留时间仅为约2个月。
双相透明质酸填充剂是通过将交联透明质酸粒子单独或与接近于液体的非交联透明质酸(非交联的透明质酸(线性HA))混合而制备的，因此通常具有高弹性和低内聚性。因此，当注射双相HA填充剂时，可以长时间维持其形状，但问题在于偏离注射部位的可能性高。双相HA填充剂的代表性实例是前述的(Galderma产品)。
因此，单相HA填充剂和双相HA填充剂分别具有优点和缺点，并且常规上，有将上述填充剂混合以具有单相透明质酸填充剂和双相透明质酸填充剂的所有性质的实例，但是在这种情况下，单相透明质酸填充剂和双相透明质酸填充剂的优点也一起大为降低，因此不适合作为填充剂。因而，需要一种可以长时间维持其形状同时偏离注射部位的可能性低的填充剂。
另外，当填充剂的物理性质强时，问题在于软组织增量能力变得更好，但由于填充剂在手术期间的强物理性质使得注射力增加，因此当医生对患者操作时，注射困难并且注射力也不均匀，从而难以按精确的量注射。
技术实现要素：
【技术问题】
提出本发明来解决上述问题，本发明的目的是提供一种填充剂，其具有作为单相透明质酸填充剂和双相透明质酸填充剂两者的优点的高粘弹性和粘附性(adhesion)，因此在注射部位具有良好的提拉能力，因而偏离注射部位的可能性低、可以长时间维持其形状并且注射力低，因而可稳定地注射。
本发明的另一个目的是提供一种制备这样的填充剂的方法。
【技术解决方案】
已经发明出本申请来解决现有技术的上述问题，并发现当透明质酸满足诸如特定分子量和交联度的条件时，它同时具有单相填充剂的高内聚性和双相填充剂的高粘弹性的流变性质，因此，它显示出高提拉能力并因此易于制成期望的形式并在注射到皮肤等中时维持期望的时间，并且填充剂组分很少移动到身体的其它部位且还出色地降低了注射力，这可以使患者在注射期间的疼痛最小化，从而完成本发明。
因此，作为一个方面，本发明涉及一种透明质酸填充剂，所述填充剂显示出单相填充剂和双相填充剂两者的性质，从而具有高提拉能力和低注射力；一种填充有所述填充剂的预填充注射器；一种含有所述填充剂的用于软组织增量的生物材料；以及一种抗皱方法，所述方法包含将所述生物材料注射到生物组织中。
本发明的填充剂中包含的透明质酸(以下也称为‘HA’)是一种由N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸组成的重复单元在其中线性连接的生物聚合物，它在眼睛的玻璃体液、关节滑液、鸡冠等中大量存在，并因其具有出色的生物相容性，已被广泛用于医疗和医疗器材，例如眼科手术辅助材料、关节功能改善剂、药物递送材料、滴眼剂、抗皱剂或美容用品。具体而言，本发明的填充剂中包含的透明质酸，除透明质酸以外，还可以是指其盐。透明质酸的盐包括例如无机盐，例如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴等；以及有机盐，例如四丁基透明质酸铵等，但不限于此。
另外，优选地，透明质酸或其盐可通过适当的交联剂进行交联。
交联透明质酸衍生物可通过使用交联剂使上述透明质酸本身或其盐交联而制备。对于交联，可使用在碱性水溶液下使用交联剂的方法。所述碱性水溶液包括NaOH、KOH、优选NaOH水溶液，但不限于此。然后，在NaOH水溶液的情况下，其使用浓度可以为0.1N至0.5N。特别是，即使使用低浓度和少量的交联剂，本发明的填充剂中包含的交联透明质酸也显示出高流变性质(粘弹性，内聚性)和提拉能力，并显示出低注射力。
所述交联剂是包含两个或更多个环氧官能团的化合物并且它可以变化，作为优选的实例，它包括丁二醇二缩水甘油醚(1,4-丁二醇二缩水甘油醚：BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)、己二醇二缩水甘油醚(1,6-己二醇二缩水甘油醚)、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、二甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三甲基丙烷聚缩水甘油醚、双环氧丙氧基乙烯(1,2-(双(2,3-环氧丙氧基)乙烯)、季戊四醇聚缩水甘油醚和山梨糖醇聚缩水甘油醚等，其中，就低毒性方面而言，基于双环氧化物的1,4-丁二醇缩水甘油醚是特别优选的。
本文中，术语“修饰度(degree of modification，MOD)”是指由表示与整个透明质酸分子结合的交联剂(例如BDDE)的摩尔数相对于透明质酸单元(N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)+D-葡糖醛酸)中N-乙酰基-D-葡萄糖胺的摩尔数的数值(n)计算出的透明质酸修饰度，其可由以下等式1表示。
[等式1]
修饰度＝交联剂的总摩尔数/N-乙酰基-D-葡糖胺的总摩尔数
在本发明中，特别地，其特征在于，通过上述交联剂进行交联，这样的修饰度显示出0.01至0.07(1％～7％)的范围，优选0.03至0.05(3％～5％)的范围。
另外，在本文中，术语“交联比(CrR)”是指交联的交联剂的摩尔数相对于总交联剂的摩尔数的比率，并可由下面的等式2表示。
[等式2]
交联比＝交联的交联剂的摩尔数/总交联剂的摩尔数
在本发明中，特别地，其特征在于，通过交联，显示出0.1至0.2、优选0.14至0.17的范围。优选地，通过具有上述MOD和CrR范围，本发明的透明质酸填充剂具有同时协同地显示单相和双相填充剂性质的特征。
本文中，所述交联透明质酸的分子量可以为2,500,000Da或更高，优选2,500,000至3,500,000Da。
本文中所用的术语“弹性”是指对物体施加力时作为固体的性质，即当施加力时改变形式、但当去除力时返回原始形式的性质。该弹性由储能模量(G'：弹性模量)表示，其单位为帕斯卡(Pa)。另外，本文中所用的术语“粘度”是指作为液体的性质，即描述流体的抗流动性的量。该粘度可由损耗模量(G”：粘性模量)表示，其单位为帕斯卡(Pa)。
本文中所用的术语“内聚性”是作用于填充剂粒子之间的吸引力(粘附力)，它可导致填充剂粒子凝聚在一起。该内聚性越高，可以支撑注射了填充剂的组织的力越大。通常地，内聚性可通过压缩试验间接测量，作为加载在流变仪上后以一定速率压缩时的阻力来测量，其单位为gf(克力)。
另外，本文中所用的术语“提拉能力”是指延展或修复注射部位的能力，其可以表示为压缩期间的储能弹性模量和阻力的乘积，而高提拉能力意味着在注射后优异的组织修复能力和较少的填充剂迁移。通常，当提拉能力高时，填充剂的物理性质强，因而显示出高注射力的性质。
本文中所用的术语“注射力”表示填充剂注射期间需要的力。
通常，单相形式的透明质酸填充剂显示出具有内聚性的凝胶形式(内聚凝胶)，因此其弹性低，但内聚性高，因而表现出高注射力。实例包括Merz的和Vivavy的另外，双相形式的透明质酸填充剂显示出粒子形式，因此具有高弹性和低内聚性的特性，并且为了表现出这样的高弹性，要使粒子直径大。实例包括Galderma的然而，这样的双相透明质酸填充剂以大粒子直径通过针时需要大的力，导致注射力高。
然而，本发明的透明质酸填充剂的特征在于具有低注射力与高提拉能力，在于具有高弹性和内聚性，因此同时具有单相填充剂的性质和双相填充剂的性质。优选地，当通过流变仪测量时，本发明的透明质酸填充剂显示出10,000至50,000Pa*gf、优选12,000至44,000Pa*gf的提拉能力，并且当通过将其填充入Schott公司的1ml玻璃注射器中并使用Terumo公司的29G 1/2\"针头进行测量时，显示出10至30N、优选15至25N的注射力。
另外，在本发明的透明质酸填充剂中，透明质酸粒子、优选交联透明质酸粒子可以显示各种形状，但优选地，可以是球体形状。此外，该粒子的平均直径可以为300至400μm。当具有这样的特定粒子直径范围时，它由于优异的流变性质而可具有高提拉能力并且还显示出低注射力。
在一个优选的方面，本发明的透明质酸填充剂可包含相对于填充剂总重量1至3重量％的透明质酸。另外，除透明质酸之外，本发明的透明质酸填充剂还可包含水、麻醉剂或其组合。
所述麻醉剂包括一种或多种本领域已知的麻醉剂，优选局部麻醉剂，并且一种或多种麻醉剂的浓度是减轻注射组合物时感受到的症状的有效量。麻醉剂的实例可选自：氨布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米洛卡因(amylocaine)、丁氧普鲁卡因(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、贝托卡因(betoxycaine)、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、丁胺卡因(butethamine)、丁托西卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、可卡乙碱(cocaethylene)、可卡因(cocaine)、环美卡因(cyclomethycaine)、二丁卡因(dibucaine)、dimethysoquin、二甲卡因(dimethocaine)、地哌冬(diperodon)、dycyclonine、芽子定(ecgonidine)、芽子碱(ecgonine)、氯乙烷(ethyl chloride)、依替卡因(etidocaine)、β-优卡因(beta-eucaine)、尤普罗辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、formocaine、海克卡因(hexylcaine)、羟丁卡因(hydroxytetracaine)、对氨基苯甲酸异丁酯(isobutyl p-aminobenzoate)、甲磺酸亮氨卡因(leucinocaine mesylate)、左沙屈尔(levoxadrol)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、美普卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷(methyl chloride)、麦替卡因(myrtecaine)、纳依卡因(naepaine)、辛卡因(octacaine)、奥索卡因(orthocaine)、奥昔卡因(oxethazaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、非那卡因(phenacaine)、苯酚(phenol)、哌罗卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、普莫卡因(pramoxine)、丙胺卡因(prilocaine)、普鲁卡因(procaine)、丙泮卡因(propanocaine)、丙美卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假可卡因(psuedococaine)、吡咯卡因(pyrrocaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、水杨醇(salicyl alcohol)、丁卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、佐拉敏(zolamine)及其盐。在一个实施方式中，所述麻醉剂可以是利多卡因，例如，盐酸利多卡因的形式。
对于本发明的透明质酸填充剂，所述填充剂中包含的麻醉剂的浓度可以为相对于填充剂总重量的约0.1重量％至约1.0重量％，例如，所述组合物的约0.2重量％至约0.5重量％。优选地，其可以为0.3重量％。
本文所述的填充剂中麻醉剂的浓度可以是治疗有效的，这意味着对患者无害且适合于在操作方便和患者依从性方面提供优势的浓度。
另外，本发明的填充剂还可以包含缓冲溶液，并且所述缓冲溶液可以没有限制地使用用于制备透明质酸水凝胶的任何物质。所述缓冲溶液的优选实例可以是包含选自以下的一种或多种的缓冲溶液：柠檬酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、乙酸、二乙基巴比妥酸、乙酸钠、TAPS(三(羟甲基)甲氨基)丙磺酸)、Bicine(2-双(2-羟乙基)氨基)乙酸)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、Tricine(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]甲磺酸)和PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)，但不限于此。所述缓冲溶液中包含的上述组分的含量可以适当地调整，但优选地，相对于缓冲溶液，所包含的上述组分的浓度可以为0.3至2.0g/L。
而且，本发明的填充剂还可以包含等渗剂，并且该等渗剂可以不受限制地使用，只要其用于制备透明质酸水凝胶即可。作为优选的等渗剂，可以使用氯化钠，但不限于此。等渗剂的含量可以根据需要适当地调整，例如，相对于缓冲溶液，所包含的等渗剂的量可以为7.0至9.0g/L，但不限于此。
在本发明的一个实施例中，使用了在注射用水中包含氯化钠、磷酸一氢钠和磷酸二氢钠的缓冲溶液。
作为一个附加方面，除上述组分外，本发明的组合物还可包含在填充剂的制备中可以包含的可接受组分。
此外，其特征在于，在本发明的具有高粘弹性和内聚性的透明质酸填充剂中，几乎不包含残留的交联剂，并且残留的交联剂优选为检测极限0.5ppm以下。
本发明的这种具有高粘弹性和内聚性的透明质酸填充剂由于该与众不同的弹性性质和内聚性，可以非常有用地用于美容或治疗目的。作为一个具体实施例，该透明质酸填充剂可用于填充生物组织、通过填充皱纹来抗皱、重塑面部、或作为用于软组织增量的生物材料来修复或增加软组织诸如嘴唇、鼻子、臀部、脸颊或乳房等的体积。所述透明质酸填充剂可以按适合于这样的用途的施用形式来施用，优选地，它可以是注射剂。
作为另一方面，本发明涉及一种上述具有高粘弹性和内聚性的透明质酸填充剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过向碱性水溶液中添加透明质酸或其盐和交联剂并搅拌、然后反应来制备交联透明质酸水凝胶；
(b)切割在步骤(a)中制备的透明质酸水凝胶；
(c)制备缓冲溶液；
(d)用步骤(c)中制备的缓冲溶液洗涤和溶胀在步骤(b)中切割的透明质酸水凝胶；
(e)研磨在步骤(d)中洗涤和溶胀的透明质酸水凝胶；和
(f)将在步骤(e)中制备的水凝胶填充到注射器中，然后灭菌。
步骤(a)是通过使用交联剂使透明质酸或其盐在碱性水溶液中起交联反应来制备交联透明质酸水凝胶的步骤，并且作为与透明质酸或其盐、交联剂和交联透明质酸水凝胶有关的事项，在透明质酸填充剂中提到的那些事项同样适用。所述碱性水溶液可以没有限制地使用已知作为适合于制备透明质酸水凝胶的碱性水溶液的任何物质，例如，它可以是NaOH、KOH，NaHCO3、LiOH或其组合，并优选它可以是NaOH。该碱性水溶液的浓度可以为0.1至0.5N，但不限于此。另外，透明质酸或其盐的浓度是透明质酸或其盐相对于透明质酸或其盐和碱性水溶液的混合物的总重量的重量比，它可以为10至25重量％，并且相对于1摩尔所添加的透明质酸或其盐的单元，交联剂的浓度为1至10mol％。当交联剂浓度是以超过上述范围的高浓度使用时，获得的填充剂的弹性过高，而当浓度低于上述范围时，则弹性过低，因此它不可能表现出适当的粘弹性。具体地，步骤(a)可通过将透明质酸或其盐、交联剂和碱性水溶液混合并搅拌至均匀混合来进行。它可以在交联期间的温度即室温或更高温度下、优选在25至40℃的温度范围内进行15至22小时。
所述切割过程可以使用各种已知的透明质酸水凝胶切割方法。在一个实施例中，所得到的在反应后制备的交联凝胶是饼的形式，可以使用刀具诸如切草刀等将其分割成半月形，并且例如，可以将其分割为六份。然后，可以通过使用具有恒定间隔的刀片的粗切刀穿过(优选两次或更多次)如上所述分割的凝胶来进行所述切割过程。
步骤(c)是制备用于洗涤和溶胀在步骤(b)中切割的交联透明质酸水凝胶的缓冲溶液的步骤，所述缓冲溶液可通过已知的缓冲溶液制备方法来制备。另外，所述缓冲溶液还可额外包含麻醉剂。在本发明的一个具体实施方式中，通过将磷酸一氢钠水合物、磷酸二氢钠水合物、氯化钠和盐酸利多卡因溶解在填充有注射用水的缓冲罐中来制备所述缓冲溶液。所述缓冲溶液可以没有限制地使用，只要其用于制备透明质酸水凝胶即可。该优选的缓冲溶液的实例可以是包含选自以下的一种或多种的缓冲溶液：柠檬酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、乙酸、二乙基巴比妥酸、乙酸钠、TAPS(三(羟甲基)甲氨基)丙磺酸)、Bicine(2-双(2-羟乙基)氨基)乙酸)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、Tricine(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、TES(2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]甲磺酸)和PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)，但不限于此。
步骤(d)是用步骤(c)中制备的缓冲溶液洗涤和溶胀在步骤(b)中切割的交联透明质酸水凝胶的步骤，该步骤(d)可以重复一次或两次或更多次。当完成洗涤和溶胀时，可以除去所述洗涤溶液。
步骤(e)是研磨所述洗涤和溶胀的水凝胶的步骤，该研磨可通过各种研磨方法进行，但优选地，可以是挤出研磨。
作为一个附加的方面，在步骤(e)之后，可以使所制备的水凝胶处于诸如灭菌和/或脱气等的过程下，并且可以将其在合适的容器例如注射器中定量地填充、密封和灭菌。
【有利效果】
本发明的填充剂因为显示出高提拉能力而不仅具有低的偏离注射部位的可能性和可以长时间维持其形状，而且通过表现出不同于具有高提拉能力的常规填充剂的低注射力，还可以使注射填充剂时可引起的问题例如由于高注射力或患者的疼痛引起医生在操作过程中的困难最小化，因此，它可以用作填充剂用于修复软组织诸如脸颊、嘴唇、乳房、臀部等，或扩充体积，通过减少皮肤细纹和深纹来抗皱，或轮廓修正。
具体实施方式
以下，将通过实施例来更详细地描述本发明。然而，这些实施例旨在示例性地说明本发明，本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1：本发明的透明质酸填充剂的制备
为了制备本发明的透明质酸填充剂，进行以下过程。
称量透明质酸钠、氢氧化钠和分子量为2.5MDa至3.5MDa的BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)。反应期间透明质酸钠的浓度为15wt％，并且相对于1摩尔所添加的透明质酸钠的单元(即N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸)，BDDE的mol％为4mol％。单独地，制备浓度为0.25N的氢氧化钠水溶液并过滤。将称量的透明质酸钠、0.25N氢氧化钠水溶液和BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)添加到混合容器中并均匀混合，将该混合容器放入恒温水浴中，并在30℃的温度下过夜完成交联反应。然后，将完成反应的交联透明质酸水凝胶进行初步研磨。另一方面，通过将盐和麻醉剂以磷酸一氢钠水合物(12水合物)1.26g/L、磷酸二氢钠水合物(一水合物)0.46g/L、氯化钠7g/L和盐酸利多卡因3g/L的浓度溶解在填充有注射用水的缓冲罐中，来制备缓冲溶液。
一部分缓冲溶液被认为是初次缓冲溶液，将其通过0.22μm过滤器转移到洗涤槽中，并将之前制备的初步切割的透明质酸凝胶转移到填充有初次缓冲溶液的洗涤槽中，然后搅拌以初次洗涤和溶胀透明质酸凝胶，然后当完成溶胀时除去洗涤溶液。然后，将二次缓冲溶液通过0.22μm过滤器转移到洗涤槽中，然后搅拌以第二次洗涤和溶胀透明质酸凝胶。当完成洗涤和溶胀时，除去洗涤溶液。然后，将40L的三次缓冲溶液通过0.22μm过滤器转移到洗涤槽中，然后搅拌以第三次洗涤和溶胀透明质酸凝胶。完成洗涤和溶胀后立刻除去洗涤溶液。
在完成第三次洗涤和溶胀之后，确认洗涤溶液的pH是否在中性范围内，并且在对完成洗涤和溶胀的透明质酸凝胶进行研磨后，将其转移到挤出机罐中并称重，并且为了使凝胶重量达到期望的重量，添加缓冲溶液来校正初次含量。当初次含量校正完成后，将透明质酸凝胶在挤出机罐中挤出并研磨。然后，将研磨过的透明质酸凝胶转移到无菌罐并均质化，然后测量含量并添加缓冲溶液进行二次含量校正。将完成了含量校正的透明质酸凝胶在121℃或更高的温度下热处理1分钟或更长，并且在填充前将透明质酸凝胶在搅拌的同时减压以进行去饱和。然后，将固定填充量的透明质酸凝胶抽真空/填充到每个注射器中，同时用橡胶塞塞住。将已填充的注射器在最后的灭菌器中在121℃或更高的温度下蒸汽灭菌8分钟或更长。
实施例2：本发明的透明质酸填充剂的制备
为了制备本发明的透明质酸填充剂，进行以下过程。
称量透明质酸钠、氢氧化钠和分子量为2.5MDa至3.5MDa的BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)。反应期间透明质酸钠的浓度为16wt％，并且相对于1摩尔所添加的透明质酸钠的单元(即N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸)，BDDE的mol％为4mol％。单独地，制备浓度为0.25N的氢氧化钠水溶液并过滤。将称量的透明质酸钠、0.25N氢氧化钠水溶液和BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)添加到混合容器中并均匀混合，将该混合容器放入恒温水浴中，在30℃的温度下过夜完成交联反应。然后，将完成反应的交联透明质酸水凝胶进行初步切割。另一方面，通过将盐和麻醉剂以磷酸一氢钠水合物(12水合物)1.26g/L、磷酸二氢钠水合物(一水合物)0.46g/L、氯化钠7g/L和盐酸利多卡因3g/L的浓度溶解在填充有注射用水的缓冲罐中，来制备缓冲溶液。
一部分缓冲溶液被认为是初次缓冲溶液，将其通过0.22μm过滤器转移到洗涤槽中，并将之前制备的初步切割的透明质酸凝胶转移到填充有初次缓冲溶液的洗涤槽中，然后搅拌以初次洗涤和溶胀透明质酸凝胶，然后当完成溶胀时除去洗涤溶液。然后，将二次缓冲溶液通过0.22μm过滤器转移到洗涤槽中，然后搅拌以第二次洗涤和溶胀透明质酸凝胶。当完成洗涤和溶胀时，除去洗涤溶液。然后，将三次缓冲溶液通过0.22μm过滤器转移到洗涤槽中，然后搅拌以第三次洗涤和溶胀透明质酸凝胶。完成洗涤和溶胀后立刻除去洗涤溶液。
在完成第三次洗涤和溶胀之后，确认洗涤溶液的pH是否在中性范围内，并且在对完成洗涤和溶胀的透明质酸凝胶进行切割后，将其转移到挤出机罐中并称重，并且为了使凝胶重量达到期望的重量，添加缓冲溶液来校正初次含量。当初次含量校正完成后，将透明质酸凝胶在挤出机罐中挤出并研磨。然后，将研磨过的透明质酸凝胶转移到无菌罐并均质化，然后测量含量并添加缓冲溶液进行二次含量校正。将完成了含量校正的透明质酸凝胶在121℃或更高的温度下热处理1分钟或更长，并且在填充前将透明质酸凝胶在搅拌的同时减压以进行脱气。然后，将固定填充量的透明质酸凝胶填充到每个注射器中，同时用橡胶塞塞住。将已填充的注射器在最后的灭菌器中在121℃或更高的温度下蒸汽灭菌10分钟或更长。
实验例1：本发明制备的透明质酸填充剂的粘弹性性质研究
为了研究所制备的实施例1和2的流变性质，使用流变仪进行分析。为了与本发明的填充剂进行比较，还分析和比较了可商购的填充剂制剂的粘弹性性质。作为比较例的可商购填充剂制剂和分析条件如下。
<比较例>
-比较例1：Belotero Intense利多卡因
-比较例2：Teosyal PureSense Ultradeep利多卡因
-比较例3：Teosyal PureSense Ultimate利多卡因
-比较例4：Stylage L利多卡因
-比较例5：Stylage XL利多卡因
-比较例6：Juvederm Volift与利多卡因
-比较例7：Juvederm Voluma与利多卡因
<分析条件>
振荡和旋转流变仪的分析条件
在储能弹性模量(G')和复数粘度(η*)测试的情况下
(1)测试设备：流变仪(Anton Paar Ltd.，MCR301)
(2)频率：1Hz
(3)温度：25℃
(4)应变：4％
(5)测量几何：25mm板/板
(9)测量间隙：1.0mm
在压缩时阻力(压缩力)的情况下
(1)测试设备：流变仪(Anton Paar Ltd.，MCR301)
(2)间隙：初始位置：2.5mm，最终位置：0.9mm
(3)速度：0.8mm/min
(4)温度：25℃
(5)测量几何：25mm板/板
(9)法向力测量间隙位置：1.5mm
在注射力测量的情况下
(1)测试设备：张力测试仪(工作台：Mecmesin.，MultiTest 2.5-xt，负荷传感器：ILC 100N)
(2)速度：10mm/min
(3)位移：0-17mm
(4)温度：25℃
(5)注射器：1mL长OVS注射器(Schott Ltd.)
(6)针头：29G，1/2\"，薄壁(Terumo Ltd.)
在所述分析条件下，储能弹性模量(G')、复数粘度(η*)、压缩力、注射力、计算的提拉能力(＝储能弹性模量*压缩力)和每注射力的提拉能力的计算数值(提拉能力/注射力)的结果值示于表1中。
【表1】
在表1中可以看出，确定了与其它可商购的填充剂相比，本发明的透明质酸水凝胶填充剂显示出更高的提拉能力。在比较例中的比较例2和3的情况下，可以表明它们显示出稍高的提拉能力，但是可以确定，与本发明相比，由于相对较高的注射力等使其在操作期间可能无法被恒定注射或需要强力来操作的操作期间问题相对较高。因此，可以确认，本发明的实施例1和2具有最大和超高的提拉能力与注射力之比，其是显示出可以表明最佳操作效果的物理性质的参数。
实验例2：本发明的透明质酸水凝胶的粒度分析
为了确认实施例1和2以及比较例1至7的透明质酸水凝胶的粒度和分布，进行以下测试。该测试的相应结果示于表2。
<分析条件>
激光衍射粒度分析仪的分析条件
(1)测试设备：激光衍射粒度分析仪(Malvern Ltd.，Mastersizer3000)
(2)分散剂：0.9％NaCl溶液
(3)搅拌器rpm：1,000
(4)激光遮蔽：5～25％
【表2】
在表2中可以看出，可以确认本发明的透明质酸填充剂显示出粒子直径(Dv50)为300至400μm，而比较例1至3以及比较例6和7具有相对较粗的粒子直径。
实验例3：本发明的透明质酸水凝胶的修饰度分析
为了确认实施例1和2以及比较例1至6的透明质酸水凝胶的修饰度，在以下条件下进行测试。该测试的结果示于表3。
<分析条件>
核磁共振的分析条件
(1)测试设备：FT-NMR系统(Jeol Ltd.，ECA500/ECZ400S)，
(2)脉冲：30°
(3)扫描：512
(4)弛豫时间(延迟)：5s
(5)温度：25℃
【表3】
在表3中可以看出，可以看出本发明的实施例1和2的透明质酸填充剂尽管如之前所确认的显示出优异的物理性质，但表现出低修饰度，这意味着它作为填充剂是非常生物相容的，表明即使在填充剂的制备期间使用少量交联剂也可以提供优异的物理性质。