用于寨卡病毒感染预后的治疗和生物标志物的制作方法

用于寨卡病毒感染预后的治疗和生物标志物
发明领域
[0001]
本发明提供了用于测定寨卡病毒感染预后的方法、生物标志物和试剂盒，该预后与寨卡病毒感染对骨代谢的影响(例如关节痛、骨质疏松和颅缝早闭)所导致的症状的严重程度有关。本发明还提供治疗寨卡病毒感染的方法，特别是治疗关节痛、骨质疏松和颅缝早闭。


背景技术：

[0002]
寨卡病毒是一种节肢动物传播的(虫媒)病毒，属于黄病毒科。它有一个编码单个多蛋白的单链rna基因组。通常，虫媒病毒在树突细胞中复制。另据报道，zikv感染是高度嗜神经性的。
[0003]
自1947年在乌干达被发现以来，zikv已经入侵了世界各地的不同领土。2015年，巴西发现了zikv病毒，导致美洲和加勒比地区出现了规模空前的流行(1)。大多数人类zikv感染似乎是无症状的。然而，妊娠期间观察到zikv感染引起的严重并发症，包括先天性畸形，如小头畸形和皮质下钙化(3)。在成人中，急性症状性zikv感染的典型特征是自限性疾病，包括发热、皮疹、结膜炎、肌痛和关节痛/关节炎(4)。格林-巴利综合征是一种罕见的并发症。
[0004]
可用诊断测试检测zikv感染。然而，由于许多受感染者将保持无症状，因此需要工具来预测感染的预后，特别是预测症状的发展和/或预测将发展的症状的严重程度。在决定是否在患者出现症状之前或者是否只出现轻微症状时开始治疗，这一点尤为重要。本发明解决了这些需要。
[0005]
目前还需要对zikv感染进行新的治疗，特别是预防或减轻关节痛、骨质疏松或颅缝早闭的治疗。特别是，需要基于导致这些症状的潜在分子机制的治疗。本发明解决了这些需要。
[0006]
发明概述
[0007]
在一方面，本发明提供用于测定感染寨卡病毒(zikv)的个体的预后的方法，特别是用于预测感染对骨代谢的影响引起的并发症的方法。优选地，其中测定预后包括预测一种或多种症状的严重程度和/或发生一种或多种症状的风险。优选地，这些症状是zikv感染对骨代谢影响的结果。所述方法包括测定样品中指示成骨细胞和/或破骨细胞功能的一种或多种生物标志物的表达和/或活性，其中成骨细胞和/或破骨细胞功能的扰动指示骨代谢的扰动和所述个体的不良预后。这种扰动引起的症状包括与成骨细胞矿化减少有关的疾病，如关节痛和骨质疏松，以及骨发育问题，如颅缝早闭。
[0008]
在一些实施方式中，一种或多种生物标志物选自干扰素γ或i型干扰素信号转导途径的一种或多种标志物、碱性磷酸酶、骨钙素、rankl/opg比率、il-6、il-1β、ctx-i、dpd、成纤维细胞生长因子受体途径的一种或多种标志物，bmp信号转导途径的一种或多种标志物，wnt信号转导途径的一种或多种标志物。
[0009]
在一些实施方式中，症状是关节痛或骨质疏松，并且样品来自所述个体。在一些实
施方式中，症状为颅缝早闭，样品来自所述个体或个体是胎儿，样品来自携带胎儿的对象。
[0010]
在优选实施方式中，本发明提供了一种用于预测感染寨卡病毒(zikv)的个体中发生关节痛或骨质疏松的严重程度和/或风险的方法，所述方法包括测定样品中指示成骨细胞和/或破骨细胞功能的一种或多种生物标志物的表达和/或活性水平，其中成骨细胞和/或破骨细胞功能的扰动指示所述个体的不良预后，例如，个体可能发展为关节痛或骨质疏松。优选地，一种或多种生物标志物选自干扰素γ或i型干扰素信号转导途径的一种或多种标志物、碱性磷酸酶、rankl/opg比率、il-6、il-1β、ctx-i或dpd。更优选地，一种或多种生物标志物选自干扰素-γ、碱性磷酸酶、il-6或rankl/opg比率。优选该方法包括：
[0011]-测定mx1、oas1、g1p3、ifit1、g1p2、ifit3、ifitm1、ifi35、stat1、tap1、irf9、psmb8、ifitm3、stat2或irf1中一种或多种的表达；
[0012]-测定干扰素γ的表达；
[0013]-测定il-6的表达；
[0014]-测定碱性磷酸酶的表达，和/或
[0015]-测定rankl/opg比率。
[0016]
在优选实施方式中，本发明提供了一种用于预测感染寨卡病毒(zikv)的个体中发生颅缝早闭的严重程度和/或风险的方法，所述方法包括测定样品中指示成骨细胞和/或破骨细胞功能的一种或多种生物标志物的表达和/或活性水平，其中成骨细胞和/或破骨细胞功能的扰动指示所述个体的不良预后，例如，个体可能发展颅缝早闭。优选地，所述一种或多种生物标志物选自碱性磷酸酶、rankl/opg比率、il-6、il-1β、ctx-i、dpd、成纤维细胞生长因子受体途径的一种或多种标志物、bmp信号转导途径的一种或多种标志物或wnt信号转导途径的一种或多种标志物。更优选地，所述一种或多种生物标志物选自碱性磷酸酶、rankl/opg比率、il-6、成纤维细胞生长因子受体途径的一种或多种标志物、bmp信号转导途径的一种或多种标志物或wnt信号转导途径的一种或多种标志物。优选该方法包括：
[0017]-测定碱性磷酸酶的表达；
[0018]-测定rankl/opg比率；
[0019]-测定il-6的表达；
[0020]-测定fgfr2、fgf18、erf、spry1、spry2、spry4、fgf2、frs2、fgfr1、fgfr2、fgfrl1、thbs1、fgf5、fgf14、fgfr3和/或fgf7的表达；
[0021]-测定amh、fst、bmp2、tgif1、bmp8b、tgif2、acvr2b、bmp4、jag2、inhbb、smad7、smad6、jag1、tgfb11i、nog和/或bmp6的表达；
[0022]-测定sos9、sox4、sox15、tle1、sox6、ep300、crebbp、fzd8、sfrp2、myc、tle3、axin1和/或pp2rc的表达；和/或
[0023]-测定crebbp、fzd8、nfkb2、nfatc2、axin1、plcb4和/或plce1的表达。
[0024]
在一方面，本发明提供了一种用于预防或减少感染寨卡病毒的个体中骨代谢扰动的影响的方法。在一些实施方式中，所述方法用于治疗例如关节痛、骨质疏松或颅缝早闭。在一些实施方式中，方法包括向有需要的个体施用改变成骨细胞和/或破骨细胞功能的组合物。
[0025]
在一个方面中，本发明提供了一种治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的方法，所述方法包括确定如本文公开的个体预后以及用关节痛治疗来治疗确定预后不良的个体。优选
地，提供一种用于治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的关节痛的方法，所述方法包括测定指示样品中成骨细胞和/或破骨细胞功能的一种或多种生物标志物的表达和/或活性水平，其中所述一种或多种生物标志物选自i型干扰素信号转导途径的一种或多种标志物、干扰素γ、il-6、碱性磷酸酶或rankl/opg比率，以及用关节痛治疗治疗确定预后不良的个体。
[0026]
在一个方面中，本发明提供了一种治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的方法，所述方法包括确定如本文公开的个体预后以及用骨质疏松治疗来治疗确定预后不良的个体。优选地，提供一种用于治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的骨质疏松的方法，所述方法包括测定指示样品中成骨细胞和/或破骨细胞功能的一种或多种生物标志物的表达和/或活性水平，其中所述一种或多种生物标志物选自i型干扰素信号转导途径的一种或多种标志物、干扰素γ、il-6、碱性磷酸酶或rankl/opg比率，以及用骨质疏松治疗治疗确定预后不良的个体。
[0027]
在一个方面中，本发明提供了一种治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的方法，所述方法包括确定如本文公开的个体预后以及用颅缝早闭治疗来治疗确定预后不良的个体。优选地，提供一种用于治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的颅缝早闭的方法，所述方法包括测定指示样品中成骨细胞和/或破骨细胞功能的一种或多种生物标志物的表达和/或活性水平，其中所述一种或多种生物标志物选自碱性磷酸酶、rankl/opg比率、il-6、成纤维细胞生长因子受体途径的一种或多种标志物、bmp信号转导途径的一种或多种标志物或wnt信号转导途径的一种或多种标志物，以及用颅缝早闭治疗来治疗确定预后不良的个体。
[0028]
在本文公开方法的优选实施方式中，该方法还包括从所述个体获得样品，或者如果个体是胎儿，则从携带胎儿的个体获得样品。优选样品是体液。
[0029]
在一些实施方式中，本发明提供适于确定感染寨卡病毒(zikv)的个体的预后的试剂盒，其中优选确定预后包括预测症状的严重程度，所述试剂盒包括以下至少三种：
[0030]-一种或多种结合干扰素γ的结合剂，
[0031]-一种或多种结合碱性磷酸酶(alp)的结合剂或一种或多种用于测定alp活性的化合物，
[0032]-一种或多种结合骨钙素的结合剂，
[0033]-一种或多种结合rankl的结合剂和一种或多种结合opg的结合剂，
[0034]-一种或多种结合il-6的结合剂，
[0035]-一种或多种结合il-1β的结合剂，
[0036]-一种或多种结合ctx-i的结合剂，
[0037]-一种或多种结合dpd的结合剂，
[0038]-一种或多种结合成纤维细胞生长因子受体途径成员的结合剂，优选fgfr2，
[0039]-一种或多种结合bmp信号转导途径成员的结合剂，优选bmp4，和
[0040]-一种或多种结合wnt信号转导途径成员的结合剂。
[0041]
优选地，所述试剂盒包含以下至少三种：
[0042]-一种或多种结合ifnγ的结合剂或一种或多种结合i型干扰素信号转导途径成员的结合剂，
[0043]-一种或多种结合碱性磷酸酶(alp)的结合剂或一种或多种用于测定alp活性的化合物，
[0044]-一种或多种结合rankl的结合剂和一种或多种结合opg的结合剂，
[0045]-一种或多种结合il-6的结合剂，
[0046]-一种或多种结合成纤维细胞生长因子受体途径成员的结合剂，优选fgfr2，
[0047]-一种或多种结合bmp信号转导途径成员的结合剂，优选bmp4，和
[0048]-一种或多种结合wnt信号转导途径成员的结合剂。
[0049]
在一个方面，本发明提供一种扰动成骨细胞和/或破骨细胞功能的药物组合物，用于治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的关节痛或骨质疏松，其中所述组合物包括：
[0050]-降低ifnγ表达或活性的一种或多种化合物，优选其中所述一种或多种化合物选自抗ifnγ中和抗体和糖皮质激素；
[0051]-一种或多种增加碱性磷酸酶(alp)表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是alp酶替代疗法，更优选阿司福酶α(asfotase alfa)；
[0052]-一种或多种降低骨钙素表达或活性的化合物；
[0053]-一种或多种降低rankl/opg比率的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是抗rankl的抗体；
[0054]-一种或多种降低il-6表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是抗il-6的抗体；
[0055]-一种或多种降低il-1β表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是抗il-1β的抗体；
[0056]-一种或多种增加成纤维细胞生长因子受体途径的表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物为fgf2或编码fgf2的核酸分子；
[0057]-一种或多种增加bmp信号转导途径的表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物选自bmp2、bmp4、卵泡抑素和编码bmp2、bmp4和卵泡抑素的核酸；
[0058]-一种或多种增加wnt信号转导途径的表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物选自wnt(优选wnt3a或wnt5)、小分子chir99021和氯化锂；
[0059]-包含骨合成代谢疗法的一种或多种化合物，优选地，骨合成代谢疗法包含提供骨硬化蛋白(sost)或编码骨硬化蛋白的核酸分子；或
[0060]-一种或多种破骨细胞活性抑制剂，优选其中所述抑制剂为二磷酸盐。
[0061]
优选所述组合物包含：
[0062]-降低ifnγ表达或活性的一种或多种化合物，优选其中所述一种或多种化合物选自抗ifnγ中和抗体和糖皮质激素；
[0063]-一种或多种化合物，其降低i型干扰素信号转导途径成员的表达或活性，优选其中所述化合物为糖皮质激素；
[0064]-一种或多种增加碱性磷酸酶(alp)表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是alp酶替代疗法，更优选阿司福酶α；
[0065]-一种或多种降低rankl/opg比率的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是抗rankl的抗体；
[0066]-一种或多种降低il-6表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是抗il-6的抗体；
[0067]-包含骨合成代谢疗法的一种或多种化合物，优选地，骨合成代谢疗法包含提供骨
硬化蛋白(sost)或编码骨硬化蛋白的核酸分子；或
[0068]-一种或多种破骨细胞活性抑制剂，优选其中所述抑制剂为二磷酸盐。优选地，通过施用治疗有效量的药物组合物或本文公开的一种或多种化合物来提供用于治疗有需要的个体的方法。
[0069]
在一个方面，本发明提供一种扰乱成骨细胞和/或破骨细胞功能的药物组合物，用于治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的颅缝早闭，其中所述组合物包括：
[0070]-一种或多种降低碱性磷酸酶(alp)表达或活性的化合物；
[0071]-一种或多种降低骨钙素表达或活性的化合物；
[0072]-一种或多种提高rankl/opg比率的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是rankl或编码rankl的核酸；
[0073]-一种或多种降低成纤维细胞生长因子受体途径的表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物为中和性fgfr抗体或fgf阱；
[0074]-降低bmp信号转导途径的表达或活性的一种或多种化合物，优选其中所述一种或多种化合物是bmp信号转导的小分子抑制剂，优选选自k02288、ldn-193189和背吗啡(dorsomorphin)；头蛋白、gremlin 1、腱蛋白或编码头蛋白、gremlin 1或腱蛋白的核酸分子；
[0075]-一种或多种降低wnt表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物为dkk1或骨硬化蛋白，或编码dkk1或骨硬化蛋白的核酸；
[0076]-一种或多种刺激骨更新的化合物，优选其中所述化合物为甲状旁腺激素(pth)。
[0077]
优选所述组合物包含：
[0078]-一种或多种降低碱性磷酸酶(alp)表达或活性的化合物；
[0079]-一种或多种提高rankl/opg比率的化合物，优选其中所述一种或多种化合物是rankl或编码rankl的核酸；
[0080]-一种或多种降低成纤维细胞生长因子受体途径的表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物为中和性fgfr抗体或fgf阱；
[0081]-降低bmp信号转导途径的表达或活性的一种或多种化合物，优选其中所述一种或多种化合物是bmp信号转导的小分子抑制剂，优选选自k02288、ldn-193189和背吗啡；头蛋白、gremlin 1、腱蛋白或编码头蛋白、gremlin 1或腱蛋白的核酸分子；
[0082]-一种或多种降低wnt表达或活性的化合物，优选其中所述一种或多种化合物为dkk1或骨硬化蛋白，或编码dkk1或骨硬化蛋白的核酸；
[0083]-一种或多种刺激骨更新的化合物，优选其中所述化合物为甲状旁腺激素(pth)。优选地，通过施用治疗有效量的药物组合物或本文公开的一种或多种化合物来提供用于治疗有需要的个体的方法。
[0084]
在一些实施方式中，所述治疗包括通过本文公开的方法确定所述个体的预后。
[0085]
附图简要说明
[0086]
图1：zikv在成骨细胞中的复制。在zikv感染原代成骨细胞后不同时间点收集培养上清(moi＝5)。a)供体4266(实心圆形)和供体3520(空心方块)成骨细胞在分化3周期间zikv感染的生长动力学曲线。误差线表示平均值的标准偏差(s.e.m)。b)zikv感染组(右图)和未感染对照组(左图)的代表性免疫荧光图像。
[0087]
图2：zikv感染对成骨细胞分化和成熟的影响。zikv感染对成骨细胞分化的影响通过a)供体4266和b)供体3520培养物中碱性磷酸酶(alp)活性测定，对矿化的影响通过c)供体4266和d)供体3520培养物中存在的钙浓度测定。比较zikv感染组(白色条)和未感染对照组(黑色条)的结果，alp水平对总蛋白进行标准化。误差线表示平均值的标准偏差(s.e.m)。*＝p<0.05斯氏t检验。
[0088]
图3：zikv感染后分析基因的基因表达水平。(a-c)供体4266和(d-f)供体3520中zikv感染成骨细胞(白色条)与未感染对照(黑色条)关键转录因子的基因表达。对管家基因gapdh校正基因表达。误差线表示平均值的标准偏差(s.e.m)。*＝p<0.05斯氏t检验。
[0089]
图4：zikv感染后分析基因的基因表达水平。zikv感染的成骨细胞rankl和opg的基因表达。对管家基因gapdh校正基因表达。误差线表示平均值的标准偏差(s.e.m)。
[0090]
图5：zikv感染后分析基因的基因表达水平。zikv感染成骨细胞fgfr2的基因表达。对管家基因gapdh校正基因表达。误差线表示平均值的标准偏差(s.e.m)。*＝p<0.05斯氏t检验。
具体实施方式
[0091]
本发明部分地基于识别与寨卡病毒(zikv)感染患者的预后相关的生物标志物。本文提供的实例证明成骨细胞受到zikv感染的影响。如本文进一步所述，实施例描述使用人骨髓来源的间充质干细胞(msc)的关节痛和骨质疏松的体外模型。实施例还描述了一种利用人成骨细胞研究颅缝早闭过程的体外模型。骨重塑是一个受严格调控的过程，需要破骨细胞和成骨细胞分别在骨吸收和骨形成中保持平衡(20)。这种平衡的破坏会导致异常骨重塑和多种病理状况的出现。成骨细胞在骨重塑中起着关键作用，既可以直接参与骨合成，也可以通过调节骨吸收间接参与。成骨细胞来源于间充质干细胞。破骨细胞是参与骨吸收的多核细胞。一些炎性细胞因子如il-6和il-1β与关节炎有关。这些关键的炎症介导物已被证明在成骨细胞系的细胞中诱导rankl的表达。rank在破骨细胞前体和成熟破骨细胞上均有表达，rankl的结合分别诱导破骨细胞的形成和活化。opg作为诱饵受体与rank竞争结合rankl。因此，rankl/opg比率的变化可影响骨吸收。rankl的诱导导致rankl/opg比率升高，随后破骨细胞分化和活化增加。
[0092]
尽管不希望受到理论的束缚，本文提出了一个假设，即msc的zikv感染影响其向成骨细胞的分化和/或分化的成骨细胞的感染通过诱导il-6使rankl的旁分泌功能和opg表达失调。
[0093]
因此，本发明的一个方面提供用于确定感染寨卡病毒(zikv)的个体的预后的方法，包括确定指示成骨细胞和/或破骨细胞功能的一种或多种生物标志物的表达和/或活性。在一些实施方式中，预后涉及预测zikv感染对骨代谢的影响和由骨代谢扰动引起的症状。优选地，本文所公开的方法用于在zikv感染个体中预测一种或多种症状的严重程度和/或发生一种或多种症状的风险，包括关节痛、骨质疏松和颅缝早闭。
[0094]
关节痛的部分原因是由于成骨细胞功能受损导致的病理性骨损失(n.c.walsh等人，炎症性关节炎局灶性骨侵蚀部位的成骨细胞功能受损).j bone miner res 24,1572-1585(2009)。关节痛/关节炎已在超过70％的zikv病例中报告(t.e.colombo等人，地方虫媒病毒地区疑似zikv患者的临床、实验室和病毒学数据j clin virol 96,20-25(2017))。这
些病例中的大多数被认为是轻度和自限性的，急性感染期间有3-5天的关节痛报告，但也有超过30天的持续或复发性关节痛报告(j.f.chan,等j infect 72,507-524(2016))。关节痛症状包括僵硬、关节疼痛、发红和关节活动能力下降。关节痛通常不以关节肿胀为特征。相反，关节炎是关节炎症，与关节肿胀有关。本文所公开的方法和生物标志物提供与寨卡感染个体发生关节痛，尤其是更严重和/或持续形式的关节痛的可能性有关的预后信息。
[0095]
骨质疏松的特征是正常矿化骨密度降低。这会导致骨骼变脆弱，并增加骨折和骨骼断裂的风险。
[0096]
小头畸形的特点是脑容量至少有两个标准差的减少，智力和运动障碍，和行为问题。大脑容量的减少会导致头围减小。在zikv流行地区，产前小头畸形显著增加。有人认为zikv具有穿过胎盘并感染胎儿神经组织的能力(sharma和lal，frontiers in microbiology 2017 8:1-14)。小头畸形的长期后果取决于潜在的大脑异常，可能从轻微的发育迟缓到严重的运动和智力缺陷，如脑瘫。
[0097]
导致小头畸形的一个原因是颅缝早闭。颅缝早闭是一条或多条颅缝的过早融合。颅骨中过早的成骨细胞分化可能导致颅骨缝线的融合和早期闭合(颅缝早闭)，并导致大脑发育减少。高达25％的产前感染了zikv的新生儿据报道有颅缝早闭的迹象(m.del campo等人，先天性zika综合征的表型谱。am j med genet a 173,841-857(2017))。各种报告推测病毒的神经向性作用可能在小头畸形中起作用。虽然不希望受到理论的束缚，但我们假设，由于寨卡病毒感染成骨细胞，颅骨结构的过早关闭是导致大脑发育问题发生的第二种机制。本文所公开的方法和生物标志物提供与寨卡感染新生儿发生颅缝早闭，尤其是更严重的颅缝早闭的可能性有关的预后信息。
[0098]
在一些实施方式中，本文公开的生物标志物和应用所述生物标志物的方法提供关于骨代谢的扰动的指示。虽然不希望受到理论的束缚，但骨代谢的扰动会导致各种症状。因此，本文公开的生物标志物和应用所述生物标志物的方法提供关于症状发生的风险的指示和/或所述症状的未来严重程度的指示(即，出现严重形式症状的风险)。
[0099]
指示成骨细胞和/或破骨细胞功能的生物标志物包括干扰素γ或i型干扰素信号转导途径的一个或多个标志物、碱性磷酸酶、骨钙素、rankl/opg比率、il-6、il-1β、ctx-i、dpd、成纤维细胞生长因子受体途径的标志物、bmp信号转导途径的标志物，和wnt信号转导途径的标志物。在一些实施方式中，确定至少两种生物标志物的表达和/或活性。在一些实施方式中，生物标志物表示为干扰素γ或i型干扰素信号转导途径中的一种或多种标志物(1)、碱性磷酸酶(2)、骨钙素(3)、rankl/opg比率(4)、il-6(5)、il-1β(6)、ctx-i(7)、dpd(8)、成纤维细胞生长因子受体途径的一种标志物(9)，bmp信号转导途径的一种标志物(10)和wnt信号转导途径的一种标志物(11)，其中所述生物标志物包括1和2；1和3；1和4；1和5；1和6；1和7；1和8；1和9；1和10；或1和11。在一些实施方式中，生物标志物包括2和3；2和4；2和5；2和6；2和7；2和8；2和9；2和10；或2和11。在一些实施方式中，生物标志物包括3和4；3和5；3和6；2和7；3和8；3和9；3和10；或3和11。在一些实施方式中，生物标志物包括4和5；4和6；4和7；4和8；4和9；4和10；或4和11。在一些实施方式中，生物标志物包括5和6；5和7；5和8；5和9；5和10；或5和11。在一些实施方式中，生物标志物包括6和7；6和8；6和9；6和10；或6和11。在一些实施方式中，生物标志物包括7和8；7和9；7和10；或7和11。在一些实施方式中，生物标志物包括8和9；8和10；或8和11。在一些实施方式中，生物标志物包括9和10；或9和11。在
一些实施方式中，生物标志物包括10和11。
[0100]
在一些实施方式中，确定至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或全部11种生物标志物。多种生物标志物的使用可提高预后的可信度。因此，当使用多个标志物时，并非所有的生物标志物都需要表现出显著的改变。对于技术人员来说，例如，两种被测生物标志物中的一种的表达和/或活性的改变也提供了预后(例如，个体将发展为严重形式症状的指示)。
[0101]
i型干扰素信号转导途径包含多种干扰素α亚型，信号转导的激活导致许多不同靶基因的转录。i型干扰素信号转导途径的优选成员包括mx1、oas1、g1p3、ifit1、g1p2、ifit3、ifitm1、ifi35、stat1、tap1、irf9、psmb8、ifitm3、stat2和irf1，更优选标志物为mx1、oas1、g1p3、ifit1、g1p2或ifit3。这些标志物基因表达增加表明关节痛和骨质疏松的预后不良。
[0102]
ifnγ(干扰素γ)是一种可溶性细胞因子，参与先天性和适应性免疫，是炎症的标志物。另据报道，ifn-γ刺激破骨细胞形成和骨损失(gao等人，j clin invest.2007 117:122-132)。干扰素-γ的示例性人类序列如下：
[0103]
mkytsyilaf qlcivlgslg cyc qdpyvke aenlkkyfna ghsdvadngt lflgilknwkeesdrkimqs qivsfyfklfknfkddqsiq ksvetikedm nvkffnsnkk krddfekltnysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktg krkrsqmlfr grrasq(下划线为信号肽)
[0104]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_000619.2(2018年4月16日)。
[0105]
优选地，确定干扰素γ蛋白表达水平。用于检测人ifn-γ的elisa试剂盒是市售的(例如，来自invitrogen
tm
的ifn-γ人elisa试剂盒和pelikine
tm
的人ifn-γelisa试剂盒)。基于流式细胞术的试验也被描述，其中细胞透化后通过流式细胞术检测细胞内ifn-γ(andersson等，j.immunol methods 1988 112:139-142)。还描述了测量ifn-γmrna的方法(参见例如，hein等，scand.j.immunol.200154:285-291)。
[0106]
碱性磷酸酶(alp)是一种膜结合的糖基化酶，在各种组织中均有表达(即alpl：碱性磷酸酶，肝/骨/肾)。这种酶已知能使化合物去磷酸化。这种酶在成骨细胞分化中起作用。alpl的突变与低磷酸酶症有关，其特征是高钙血症和骨骼缺损(mochizuki等人，eur j pediatr.2000 159(5):375-9)。
[0107]
alpl的示例性人类序列如下：
[0108]
mispflvlaigtcltnslvpekekdpkywrdqaqetlkyalelqklntnvaknvimflgdgmgvstvtaarilkgqlhhnpgeetrlemdkfpfvalsktyntnaqvpdsagtataylcgvkanegtvgvsaatersrcnttqgnevtsilrwakdagksvgivtttrvnhatpsaayahsadrdwysdnemppealsqgckdiayqlmhnirdidvimgggrkymypknktdveyesdekargtrldgldlvdtwksfkprykhshfiwnrtelltldphnvdyllglfepgdmqyelnrnnvtdpslsemvvvaiqilrknpkgffllveggridhghhegkakqalheavemdraigqagsltssedtltvvtadhshvftfggytprgnsifglapmlsdtdkkpftailygngpgykvvggerenvsmvdyahnnyqaqsavplrhethggedvavfskgpmahllhgvheqnyvphvmayaaciganlghcapassagslaagplllalalyplsvlf
[0109]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_000478.5(2018年4月5日)。
[0110]
在一些实施方式中，确定alpl蛋白表达水平。优选确定活性水平。碱性磷酸酶的活性水平可通过市售碱性磷酸酶试验(如梅奥医学实验室)确定。一个相关的测试是alp同工
酶测试，以测量血液中不同类型alp的含量。该测试通常基于电泳，且是市售的(如梅奥医学实验室)。市场上有各种实验室测试，例如abcam(比色法)、sigma-aldrich(荧光法)、rockland immunochemicals(elisa)。试剂盒，尤其是elisa试剂盒可从广泛的供应商获得。
[0111]
骨钙素也被称为骨骼含γ-羧基谷氨酸蛋白(bglap)，是在骨和牙本质中发现的蛋白质激素。这种因子由成骨细胞分泌，调节骨重塑和能量代谢。骨钙素被用作骨形成过程的标志物，因为较高的血清骨钙素水平与骨密度的增加相对较好地相关。
[0112]
骨钙素的示例性人类序列如下：
[0113]
mraltllallalaalciagqagakpsgaesskgaafvskqegsevvkrprrylyqwlgapvpypdpleprrevcelnpdcdeladhigfqeayrrfygpv
[0114]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_199173.5(2018年5月1日)。
[0115]
优选地，确定骨钙素蛋白表达水平。骨钙素水平可通过elisa试剂盒测定。elisa试剂盒是市售的，例如骨钙素人elisa试剂盒(thermofisher scientific)、人骨钙素elisa试剂盒(abcam)和人骨钙素quantikine elisa试剂盒(r&d systems)。此外，如vermeulen等人1989年所述，骨钙素可以通过组织化学方法检测(j histochem cytochem)。
[0116]
核因子-κb配体受体激活剂(rankl)又称肿瘤坏死因子配体超家族成员11(tnfsf11)。rankl是肿瘤坏死因子超家族的一种膜蛋白。其表达与免疫系统和控制骨代谢有关。rankl是破骨细胞分化和活化的关键因子。诱导rankl表达导致骨损失增加。
[0117]
rankl的示例性人类序列如下：
[0118]
mrrasrdytkylrgseemgggpgaphegplhappppaphqppaasrsmfvallglglgqvvcsvalffyfraqmdpnrisedgthciyrilrlhenadfqdttlesqdtklipdscrrikqafqgavqkelqhivgsqhiraekamvdgswldlakrskleaqpfahltinatdipsgshkvslsswyhdrgwakisnmtfsngklivnqdgfyylyanicfrhhetsgdlateylqlmvyvtktsikipsshtlmkggstkywsgnsefhfysinvggffklrsgeeisievsnpslldpdqdatyfgafkvrdid
[0119]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_003701.3(2018年4月1日)。
[0120]
opg也被称为tnf受体超家族成员11b(tnfrsf11b)。这种蛋白是一种成骨细胞分泌的诱饵受体，作为骨吸收的负调节因子发挥作用。opg作为rankl的诱饵受体，中和rankl在骨代谢中的作用。
[0121]
opg的示例性人类序列如下：
[0122]
mnnllccalvfldisikwttqetfppkylhydeetshqllcdkcppgtylkqhctakwktvcapcpdhyytdswhtsdeclycspvckelqyvkqecnrthnrvceckegryleiefclkhrscppgfgvvqagtperntvckrcpdgffsnetsskapcrkhtncsvfgllltqkgnathdnicsgnsestqkcgidvtlceeaffrfavptkftpnwlsvlvdnlpgtkvnaesverikrqhssqeqtfqllklwkhqnkdqdivkkiiqdidlcensvqrhighanltfeqlrslmeslpgkkvgaediektikackpsdqilkllslwrikngdqdtlkglmhalkhsktyhfpktvtqslkktirflhsftmyklyqklflemignqvqsvkiscl
[0123]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_002546.3(2018年5月1日)。
[0124]
opg与rankl的比率在成骨调控中起重要作用(rankl/opg比率)。优选地，确定
rankl/opg蛋白表达的比率。用elisa检测rankl的表达水平。测定人rankl水平的试剂盒是市售的(人tnfsf11 elisa试剂盒，abcam；rankl(总)，可溶性(人)elisa试剂盒enzo lifesciences)。用elisa测定opg的表达水平。用于测定人opg水平的试剂盒可从市场上买到(人骨保护素elisa试剂盒，abcam；tnfrsf11b人即时elisa
tm
试剂盒，thermofisher scientific)。elisa检测结果可用于计算rankl/opg比率。
[0125]
白细胞介素6(il-6)是炎症反应的介导物。il-6是一种在炎症和b细胞成熟中起作用的细胞因子。il-6的功能与多种炎症相关疾病有关。il-6细胞因子被描述为作用于骨细胞并在骨骼中发挥重要作用(blanchard等人，细胞因子生长因子综述。2009).
[0126]
il-6的示例性人类序列如下：
[0127]
mnsfstsafgpvafslglllvlpaafpapvppgedskdvaaphrqpltsseridkqiryildgisalrketcnksnmcesskealaennlnlpkmaekdgcfqsgfneetclvkiitgllefevyleylqnrfesseeqaravqmstkvliqflqkkaknldaittpdpttnaslltklqaqnqwlqdmtthlilrsfkeflqsslralrqm
[0128]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_000600.4(2018年3月29日)。
[0129]
优选地，确定il-6蛋白表达水平。用于检测人il-6的elisa试剂盒是市售的(例如，pelikine
tm
集成人il-6elisa试剂盒；人il-6elisa试剂盒(白细胞介素-6)高灵敏度试剂盒，abcam；il-6人elisa试剂盒，thermofisher scientific)。此外，最近开发的用于检测il-6的生物传感器可用于检测il-6的水平(huang等，procedia engineering，2013)。
[0130]
白细胞介素-1β(il-1β)是一种细胞因子，作为前蛋白由活化的巨噬细胞产生，由胱冬酶1加工成其活性形式。il1β是炎症反应的介导物。此外，据报道il1β在病理和生理条件下参与骨吸收(lee等人，international immunology.2010)。
[0131]
il-1β的示例性人序列如下：
[0132]
maevpelasemmayysgneddlffeadgpkqmkcsfqdldlcpldggiqlrisdhhyskgfrqaasvvvamdklrkmlvpcpqtfqendlstffpfifeeepiffdtwdneayvhdapvrslnctlrdsqqkslvmsgpyelkalhlqgqdmeqqvvfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwyistsqaenmpvflggtkggqditdftmqfvss
[0133]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_000576.2(2018年5月1日)。
[0134]
优选地，确定il-1β蛋白表达水平。用于检测人il-1b的elisa试剂盒是市售的(例如，il-1β人elisa试剂盒，thermofisher scientific；人il-1βelisa试剂盒，abcam)。另一种检测il-1β蛋白表达水平的方法是基于荧光的singleplex试剂盒(il-1β人singleplex试剂盒，thermo fisher scientific)。
[0135]
羧基/末端胶原交联物(ctx-1)，也称为c末端尾肽(telopeptide)，是i型胶原的降解产物，是众所周知的骨吸收生物标志物。用于检测ctx-i的elisa分析在市场上可以买到，例如检测交联ekahd-β-ggr序列的血清crosslaps
tm
。
[0136]
脱氧吡啶啉(dpd)是羟基吡啶的衍生物，在骨吸收过程中释放到血流中，经尿液可不经修饰消除。该分子用作骨吸收的生物标志物，并且可以在例如尿液或血浆中测量。
[0137]
优选确定dpd水平。用于测定dpd水平的elisa试剂盒可在市场上买到(例如，人dpd(脱氧吡啶啉)elisa试剂盒，elabscience)。另外，还可以使用一种称为microvue的商业试
剂盒(quidel)来测定尿液中的dpd水平。dpd的水平也可以使用hplc测量，例如在尿液中。
[0138]
成纤维细胞生长因子受体途径影响细胞的有丝分裂和分化。已知fgf信号转导途径也参与骨发育，参见cell biol int.2012年8月1日；36(8)：691-6的综述。成纤维细胞生长因子受体2(fgfr2)是该途径的主要参与成员之一。fgfr2是成纤维细胞生长因子(fgf)的受体。
[0139]
fgfr2的示例性人类序列如下：
[0140]
mvswgrficlvvvtmatlslarpsfslvedttlepeepptkyqisqpevyvaapgeslevrcllkdaaviswtkdgvhlgpnnrtvligeylqikgatprdsglyactasrtvdsetwyfmvnvtdaissgddeddtdgaedfvsensnnkrapywtntekmekrlhavpaantvkfrcpaggnpmptmrwlkngkefkqehriggykvrnqhwslimesvvpsdkgnytcvveneygsinhtyhldvversphrpilqaglpanastvvggdvefvckvysdaqphiqwikhvekngskygpdglpylkvlkaagvnttdkeievlyirnvtfedageytclagnsigisfhsawltvlpapgrekeitaspdyleiaiycigvfliacmvvtvilcrmknttkkpdfssqpavhkltkriplrrqvtvsaessssmnsntplvrittrlsstadtpmlagvseyelpedpkwefprdkltlgkplgegcfgqvvmaeavgidkdkpkeavtvavkmlkddatekdlsdlvsememmkmigkhkniinllgactqdgplyviveyaskgnlreylrarrppgmeysydinrvpeeqmtfkdlvsctyqlargmeylasqkcihrdlaarnvlvtennvmkiadfglardinnidyykkttngrlpvkwmapealfdrvythqsdvwsfgvlmweiftlggspypgipveelfkllkeghrmdkpanctnelymmmrdcwhavpsqrptfkqlvedldriltlttneeyldlsqpleqyspsypdtrsscssgddsvfspdpmpyepclpqyphingsvkt
[0141]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_000141.1(2018年4月10日)。
[0142]
优选地，确定成纤维细胞生长因子受体途径活性的水平。优选地，确定fgfr2蛋白表达水平。用于测定fgfr2表达水平的elisa试剂盒可在市场上买到(例如，成纤维细胞生长因子受体2elisa试剂盒，sigma-aldrich；fgfr2(人类)elisa试剂盒，biovision)。此外，用于检测fgfr2的抗体是市售的(例如，抗fgfr2抗体(ab58201)、abcam)。一种通用的fgf-elisa试剂盒可用于测定该途径的活性，并可在市场上买到(人fgf-basic quantikine elisa试剂盒，r&d systems)。
[0143]
本发明中可用的成纤维细胞生长因子受体途径的其他成员包括fgf18、erf、spry1、spry2、spry4、fgf2、frs2、fgfr1、fgfr2、fgfrl1、thbs1、fgf5、fgf14、fgfr3和fgf7。优选地，成纤维细胞生长因子受体途径的一个或多个标志物选自fgf18和erf。这些标志物基因表达的增加表示在颅缝早闭方面的预后不良。
[0144]
骨形态发生蛋白(bmp)是一类生长因子。最初通过其诱导骨和软骨形成的能力发现了这些因子。bmp信号转导途径在软骨和骨形成中起作用。
[0145]
优选确定bmp信号转导途径活化水平。bmp4生物测定试剂盒可测定bmp信号转导途径的水平。用于测定bmp4水平的elisa试剂盒可在市场上买到(例如bmp-4人elisa试剂盒，thermo fisher scientific；人bmp-4 quantikine elisa试剂盒，r&d systems)。bmp信号转导途径活化水平可通过同时测量多种骨形态发生蛋白的生物测定来确定，例如herrera等人(bmc cell biol.2009)所述的。.在此公开的本发明中可使用的bmp信号转导途径的其它成员包括amh、fst、bmp2、tgif1、bmp8b、tgif2、acvr2b、bmp4、jag2、inhbb、smad7、smad6、jag1、tgfb11i1、nog和bmp6。优选地，bmp信号转导途径的一个或多个标志物选自amh、fst和bmp2。这些标志物基因表达的增加表示在颅缝早闭方面的预后不良。
[0146]
已知wnt/β-连环蛋白信号转导途径与胚胎发育和成体组织稳态有关。此外，wnt信号是维持干细胞群体的关键因素。在krishnan等人的综述(j.clin.invest.2006)中讨论了wnt信号转导在骨量调节中的作用。
[0147]
优选确定wnt途径活化水平。细胞和组织中wnt途径活性的水平可通过wnt/b-连环蛋白报道物检测来测量，例如响应β-连环蛋白水平的荧光素酶报道物分析。wnt报道物试剂盒可在市场上买到(例如leadingwnt报道物测试起始试剂盒、enzo life sciences)。wnt信号转导途径的效应蛋白β-连环蛋白的表达可通过蛋白质印迹或免疫组化染色进行测定。抗β-连环蛋白的抗体可在市场上买到(例如，抗β-连环蛋白抗体(ab16051)abcam、β-连环蛋白抗体#9562cellsignaling)。wnt途径激活水平可通过分析axin2(下游靶基因)的表达来确定。axin2的特异性抗体是市售的(例如，抗axin2抗体(ab32197)abcam)。本发明中有用的wnt/β-连环蛋白信号转导途径的其他成员包括sos9、sox4、sox15、tle1、sox6、ep300、crebbp、fzd8、sfrp2、myc、tle3、axin1和pp2rc。优选地，从sox9和sox4中选择一个或多个标志物。这些标志物基因表达的增加表示在颅缝早闭方面的预后不良。
[0148]
wnt/ca2+信号转导途径的成员也可用于本发明。该信号转导途径的优选成员包括crebbp、fzd8、nfkb2、nfatc2、axin1、plcb4和plce1。这些标志物基因表达的增加表示在颅缝早闭方面的预后不良。
[0149]
提供了其中成骨细胞和/或破骨细胞功能的扰动指示不良预后的方法。可以通过测量一个或多个生物标志物的表达和/或活性水平来鉴定功能的扰动。对于本文公开的一些生物标志物，高表达/活性水平表示预后不良，而对于其他生物标志物，低表达/活性水平表示预后不良。术语“高”和“低”是相对术语。然而，本领域技术人员将认识到，对于高表达/活性水平指示预后不良的生物标志物，高表达/活性水平是指例如显著高于在没有预后不良的对象(例如，健康对象或出现轻微症状的对象)中观察到的水平和/或类似于(或低于)在预后不良对象中观察到的水平。相反，本领域技术人员将认识到，对于低表达/活性水平指示预后不良的生物标志物，低表达/活性水平是指例如显著低于在没有预后不良的对象(例如，健康对象或出现轻微症状的对象)中观察到的水平和/或类似于(或高于)在预后不良对象中观察到的水平。
[0150]
在示例性实施方式中，将来自样品的一个或多个生物标志物的表达和/或活性与参考值进行比较。如本领域技术人员所知，不需要为每个个体分别确定参考值。在一些实施方式中，可以最初确定一个值，并将其用作以后测试的比较值。在一些实施方式中，参考值可以是在来自健康的，即zikv阴性的(优选年龄匹配的)个体的可比样品(例如，来自与测试组织相同类型的组织，例如血液或血清)中中确定的生物标志物表达/活性水平。此外，可以使用健康对象的集合或群体，并且参考值可以是来自群体的测量的平均值或均值。这种参考值在本文中被称为良好预后参考值，因为健康对象(平均而言)在骨代谢中没有扰动，并且不存在由于这种扰动而引起并发症的风险。在一些实施方式中，参考值来自zikv阳性(优选年龄匹配)个体或zikv阳性对象的集合或群体。在一些实施方式中，参考值来自出现特定症状或出现特定症状严重程度的zikv阳性个体(优选年龄匹配)或zikv阳性个体的集合或群体。例如，可在zikv阳性对象中测量表达/活性水平。可以监测症状的发展和疾病进程，然后根据症状发生/严重程度对对象进行分层。可以确定一个参考值，该值与后来出现轻微症状的对象的表达/活性水平有关。这样的参考值在本文中被称为良好预后参考值。可以确定
一个参考值，该值与后来出现例如严重症状的对象的表达/活性水平有关。这样的参考值在本文中被称为不良预后参考值。
[0151]
在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的增加指示不良预后。与良好预后参考值(例如，从健康对象获得的值)相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著增加，或与不良预后参考值(例如，从后来出现严重症状的zikv感染对象获得的值)相比降低或类似的水平表明个体预后不良。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的降低指示不良预后。与良好预后参考值相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著降低，或与不良预后参考值相比，生物标志物的表达和/或活性水平升高或相似，表明个体预后不良。
[0152]
在一些实施方式中，症状是颅缝早闭。虽然在妊娠期zikv感染的病例中观察到了严重的并发症，但并非所有受影响婴儿都会表现出颅缝早闭，也不是所有婴儿都会表现出相同程度的颅缝早闭。本文所揭示的生物标志物可用于确定zikv感染的胎儿将发生颅缝早闭的风险的方法。本领域技术人员理解，处于发生颅缝早闭风险中表明个体比年龄匹配的个体人群具有更高的发生颅缝早闭的风险，或者更确切地说，个体具有比发生颅缝早闭的平均风险更高的风险。本文所揭示的生物标志物还可用于确定zikv感染的胎儿发生严重颅缝早闭的风险的方法。本领域技术人员很清楚颅缝早闭严重程度的不同。例如，较轻的颅缝早闭只涉及四条骨缝中的一条提前闭合。
[0153]
在一些实施方式中，预后指胎儿发生颅缝早闭的风险。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的降低指示不良预后。在一个示范性实施方式中，与良好预后参考值相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著降低，或与不良预后参考值相比，生物标志物的表达和/或活性水平显著升高或相似，表明个体具有或有风险发生颅缝早闭。早期发现/预测对颅缝早闭很重要，因为及时发现可以治疗。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的增加指示不良预后。在一个示范性实施方式中，与良好预后参考值相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著增加，或与不良预后参考值相比，生物标志物的表达和/或活性水平显著降低或相似，表明个体具有或有风险发生颅缝早闭。在一些实施方式中，良好预后参考值来自zikv阴性个体或个体集合或来自未发生颅缝早闭的zikv阳性个体或个体集合。在一些实施方式中，不良预后参考值来自发生颅缝早闭的zikv阳性个体或个体集合。
[0154]
在一些实施方式中，预后指zikv感染的胎儿将发生的颅缝早闭的严重程度。在示例性实施方式中，将来自样品的一个或多个生物标志物的表达和/或活性与参考值进行比较。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的增加指示不良预后。在一个示范性实施方式中，与良好预后参考值相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著增加，或与不良预后参考值相比，生物标志物的表达和/或活性水平显著降低或相似，表明个体有发生严重颅缝早闭的风险。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的降低指示不良预后。在一个示范性实施方式中，与良好预后参考值相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著下降，或与不良预后参考值相比，生物标志物的表达和/或活性水平显著增加或相似，表明个体有发生严重颅缝早闭的风险。在一些实施方式中，良好预后参考值来自zikv阴性个体或个体集合或来自未发生或仅发生轻微颅缝早闭症状的zikv阳性个体或个体集合。在一些实施方式中，不良预后参考值来自发生严重颅缝早闭的zikv阳性
个体或个体集合。
[0155]
优选地，用于预测颅缝早闭严重程度的一种或多种生物标志物选自：
[0156]-ifnγ，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性降低或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0157]-碱性磷酸酶(alp)，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性下降或无变化表明不良预后；
[0158]-骨钙素，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0159]-rankl/opg比率，与良好预后参考值相比比率下降或与不良预后参考值相比比率增加或无变化表明不良预后；
[0160]-il-6，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性降低或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0161]-il-1β，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性降低或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0162]-ctx-1，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性降低或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0163]-dpd，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性减少或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0164]-成纤维细胞生长因子受体途径的标志物，优选fgfr2，或选自fgfr2、fgf18和erf，且优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0165]-bmp信号转导途径的标志物，优选bmp4，或选自amh,fst,或bmp2,最优选amh，且优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；和
[0166]-wnt信号转导途径的标志物，优选选自sox9、sox4和sox15，且优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后。
[0167]
在一些实施方式中，预后指zikv感染的个体将发生关节痛或骨质疏松的严重程度。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的降低指示不良预后。在一个示范性实施方式中，与良好预后参考值相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著下降，或与不良预后参考值相比，生物标志物的表达和/或活性水平显著增加或相似，表明个体有发生严重关节痛或骨质疏松的风险。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的增加指示不良预后。在一个示范性实施方式中，与良好预后参考值相比，样品中生物标志物的表达和/或活性水平显著增加，或与不良预后参考值相比，生物标志物的表达和/或活性水平显著下降或相似，表明个体有发生严重关节痛或骨质疏松的风险。在一些实施方式中，良好预后参考值来自zikv阴性个体或个体集合或来自未发生或仅发生轻微关节痛或骨质疏松的zikv阳性个体或个体集合。在一些实施方式中，不良预后参考值来自发生严重关节痛或骨质疏松的zikv阳性个体或个体集合。
[0168]
优选地，用于预测关节痛或骨质疏松的严重程度的一个或多个生物标志物选自：
[0169]-ifnγ，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0170]-i型干扰素信号转导途径的标志物，优选选自mx1、oas1、g1p3、ifit1、g1p2和ifit3，且优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0171]-碱性磷酸酶(alp)，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性减少或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0172]-骨钙素，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性减少或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0173]-rankl/opg比率，与良好预后参考值相比比率增加或与不良预后参考值相比比率减少或无变化表明不良预后；
[0174]-il-6，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0175]-il-1β，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0176]-ctx-1，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0177]-dpd，优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性增加或与不良预后参考值相比表达和/或活性减少或无变化表明不良预后；
[0178]-成纤维细胞生长因子受体途径的标志物，优选fgfr2，且优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性减少或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；
[0179]-bmp信号转导途径的标志物，优选bmp4，且优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性减少或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后；和
[0180]-wnt信号转导途径的标志物，且优选地，与良好预后参考值相比表达和/或活性减少或与不良预后参考值相比表达和/或活性增加或无变化表明不良预后。
[0181]
本文公开的方法和用途可用于确定感染zikv的个体的预后。据报道，zikv至少有两个地理上不同的谱系，即非洲株和亚洲株。本领域技术人员已知用于检测寨卡病毒感染的诊断方法，并且包括例如检测样品中的寨卡病毒rna以及检测受感染个体产生的针对寨卡病毒的抗体。参见sharma和lal，frontiers in microbiology 2017 8:110和singh等，frontiers in microbiology 2018:2677有关zikv诊断和传播的综述。在一些实施方式中，本文描述的方法包括确定个体感染zikv的步骤。当个体是新生儿时，这些方法包括确定母亲和/或新生儿是否感染zikv。如技术人员所理解的，本文所描述的方法并不需要建立zikv感染的确定诊断。相反，如果个体基于例如早期症状或与受感染个体的接触而怀疑感染zikv，则可实施此类方法。因此，本文所使用的“感染zikv的个体”也包括怀疑感染zikv的个体。
[0182]
从样品(即，生物样品)确定一个或多个生物标志物的表达和/或活性。优选地，在体外测定表达和/或活性。在一些实施方式中，样品是生物液体(例如，血液、尿液、唾液、脑脊液(csf)、滑液、精液、淋巴液、羊水)。
[0183]
本文所述方法涉及确定一个或多个生物标志物的表达和/或活性。无需测定样品中生物标志物蛋白的绝对量。相反，如本领域技术人员所理解的，可以在个体和参考值之间比较生物标志物的表达和/或活性水平，因此可以确定相对表达水平。
[0184]
在一些实施方式中，生物标志物的表达水平是指确定样品中生物标志物的蛋白质水平。在一些实施方式中，结合剂用于结合和检测本文公开的生物标志物。优选地，确定生物标志物水平的步骤也可以表示为确定结合剂与来自个体的生物样品的结合量。
[0185]
结合剂包括抗体以及非免疫球蛋白结合剂，例如噬菌体展示衍生的肽结合剂和抗体模拟物，例如亲和体、四连接素(ctld)、阿迪连接素(单体)、抗运载蛋白、darpin(锚蛋白)、avimer、imab、微体、肽适体、kunitz结构域、适体和粘附素。
[0186]
在一些实施方式中，在免疫测定中测定蛋白质表达。合适的免疫测定包括例如放射免疫测定、elisa(酶联免疫吸附测定)、夹心免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、凝血测定等)、补体结合测定，免疫荧光分析、蛋白a分析和免疫电泳分析。除了使用基于抗体的分析外，还可以使用其他结合生物标志物的化合物进行分析。例如，生物标志物结合肽可以固定在诸如芯片的固体载体上。使生物样品通过固体载体。然后使用任何合适的方法检测结合的生物标志物，例如表面等离子体共振(spr)(参见例如wo 90/05305，本文通过引用并入)。
[0187]
可以通过本领域已知的方法产生结合特定表位的抗体。例如，可通过免疫哺乳动物(例如，兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊)的常规方法制备多克隆抗体。因此多克隆抗体可包含在免疫动物的血清中，并且可以使用标准程序(例如亲和层析、免疫沉淀、尺寸排阻层析和离子交换层析)来分离。单克隆抗体可通过哺乳动物的常规免疫方法，随后分离产生所需单克隆抗体的血浆b细胞并与骨髓瘤细胞融合来制备(参见，例如，mishell，b.b.等人，selected methods in cellular immunology,(w.h.freeman，编)san francisco(1980))。
[0188]
在一些实施方式中，蛋白质表达的测定包括检测所述生物标志物的肽片段。理解肽片段为长度为10到100个氨基酸，优选长度为10到50个氨基酸。肽片段可通过质谱等方法检测。质谱法能根据分子量检测和定量分析物。
[0189]
确定表达水平还包括确定核酸的表达。优选地，核酸是rna，例如mrna或mrna前体。如本领域技术人员所理解的，所确定的rna表达水平可直接检测或间接确定，例如，通过首先产生cdna和/或通过扩增rna/cdna。在一些实施方式中，从样品中纯化核酸。核酸表达水平可通过本领域已知的任何方法来确定，所述方法包括rt-pcr、定量pcr、rna印迹、基因测序(尤其是rna测序)和基因表达谱技术。在一些实施方式中，使用微阵列来确定核酸的水平。
[0190]
在一些实施方式中，确定生物标志物表达水平还包括使所述生物标志物的表达水平标准化。此类方法对于技术人员来说是众所周知的，并且将取决于所使用的蛋白质/核酸测量方法。通常，参比蛋白/mrna的表达与生物标志物表达平行测定。所述生物标志物的标准化表达水平可确定为所述生物标志物与参比蛋白的比率。优选的参比蛋白质包括管家蛋白质，例如肌动蛋白、β-微管蛋白和甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)。也可以通过其它已知的方法来执行标准化，例如通过按细胞总数来标准化表达水平。优选地，来自个体的表达水平和参考值二者被归一化以允许直接比较。
[0191]
本发明还提供可在本文所述方法中使用的试剂盒。尤其是，所述试剂盒可用于确
定感染寨卡病毒(zikv)的个体的预后。优选试剂盒可用于预测zikv感染对骨代谢的影响和由骨代谢扰动引起的症状。优选地，所述试剂盒可用于确定包括预测症状(例如，关节痛、骨质疏松或颅缝早闭)的严重程度的预后。在一些实施方式中，试剂盒包含用于扩增本文公开的标志物的引物对。优选地，试剂盒包含用于扩增本文公开的标志物中的至少一种、至少两种或至少三种的引物对。在一些实施方式中，试剂盒还包括下述一种或多种：dna聚合酶、脱氧核苷三磷酸酯、缓冲液和mg2+。在一些实施方式中，试剂盒包含对照cdna，优选cdna跨越至少一个内含子-外显子边界，使得所述引物对能够区分cdna与基因组dna。
[0192]
在一些实施方式中，药物组合物、所述组合物的用途和方法用于治疗感染zikv的个体。在一些实施方式中，本文公开的化合物可用于制造用于治疗感染zikv的个体的药物。
[0193]
在一些实施方式中，所述个体没有或仅表现出关节痛或骨质疏松的轻微症状。虽然不希望受到理论的约束，但本发明提供了成骨细胞和/或破骨细胞功能的扰动导致关节痛或骨质疏松的发展和严重程度。在一些实施方式中，提供了包括治疗个体或基于通过本文公开的方法确定的预后确定治疗方案的方法。在示例性实施方式中，例如通过使用一种或多种生物标志物来确定感染zikv个体的预后，并在此公开。被预后有发展为严重关节痛的风险的个体可以在出现关节痛症状(或显著症状)之前进行治疗。被预后有发展为严重骨质疏松的风险的个体可以在出现骨质疏松症状(或显著症状)之前进行治疗。在这方面，关节痛或骨质疏松的治疗也指预防发展为关节痛/骨质疏松或预防发展为严重形式的关节痛/骨质疏松，或降低关节痛/骨质疏松进展速度。因此，本发明提供了治疗感染zikv的个体关节痛或骨质疏松的方法，包括首先确定所述个体是否可能发展为关节痛/骨质疏松或关节痛/骨质疏松的严重形式。由于并非所有感染zikv的个体都会发展出关节痛或骨质疏松，因此这些方法允许仅对有需要的个体进行个性化的定向治疗。这允许及早治疗，并避免“过度治疗”不需要这种治疗的个体。
[0194]
此外，本领域技术人员了解骨质疏松的风险因素(例如，年龄增加、身为女性、有骨质疏松家族史、使用导致骨质变薄的药物、处于更年期的妇女或雌激素水平较低的妇女)，这可以为确定预后提供进一步的信息。
[0195]
在一些实施方式中，所述方法和组合物可用于治疗胎儿。虽然不希望受到理论的约束，但本发明提供了成骨细胞和/或破骨细胞功能的扰动导致颅骨早闭的发生和严重程度，作为小头畸形的病因。在一些实施方式中，提供了包括治疗个体或基于通过本文公开的方法确定的预后确定治疗方案的方法。在示例性实施方式中，例如通过使用一种或多种生物标志物来确定感染zikv胎儿的预后，并在此公开。如果胎儿被预测有发生颅缝早闭或严重颅缝早闭的风险，可以在出现颅缝早闭症状(或明显症状)之前进行治疗，或者可以进行更积极的治疗。在这方面，颅缝早闭的治疗也指预防发展为颅缝早闭或预防发展为严重形式的颅缝早闭，或降低颅缝早闭进展速度。因此，本发明提供了治疗感染zikv的个体颅缝早闭的方法，包括首先确定所述个体是否可能发展为颅缝早闭或颅缝早闭的严重形式。由于并非所有感染zikv的个体都会发展出颅缝早闭，因此这些方法允许仅对有需要的个体进行个性化的定向治疗。这允许及早治疗，并避免“过度治疗”不需要这种治疗的个体。
[0196]
本公开还提供了新的治疗。特别是，这些治疗用于改变成骨细胞和/或破骨细胞功能。
[0197]
关节痛和骨质疏松治疗
[0198]
在一个实施方式中，本发明提供了对治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的关节痛或骨质疏松症特别有用的药物组合物。在一些实施方式中，提供降低ifn-γ的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制ifn-γ的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗ifn-γ抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员已知合适的抗体，并且在ep1975180中还描述了人类治疗中的实例。在一些实施方式中，抑制剂是结合ifn-γmrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。在一些这样的实施方式中，抑制剂是糖皮质激素。众所周知，糖皮质激素尤其是地塞米松，可抑制ifn-γ信号转导(参见，例如，hu等，j immunol.2003 70:4833-9)。在另一实施方式中，该治疗减少i型干扰素信号转导。可用糖皮质激素减少i型干扰素信号转导。
[0199]
在一些实施方式中，提供提高碱性磷酸酶(alp)的表达或活性的治疗。据报道，alp酶活性降低可导致低磷酸酶血症，并伴有高钙血症和骨骼缺损(mochizuki 2000eur j pediatr)。恢复碱性磷酸酶的酶活性或表达可能是恢复健康的骨发育或稳态的潜在策略。优选地，其中所述一种或多种化合物是碱性磷酸酶替代疗法，例如阿司福酶α(strensiq
tm
)。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供alp或编码alp的核酸。本文描述了示范性的alp人蛋白和mrna序列。
[0200]
在一些实施方式中，提供提高骨钙素的表达或活性的治疗。骨钙素是一种蛋白质，由成骨细胞分泌，调节骨重塑和能量代谢。该蛋白质包含gla结构域，其可与钙和羟基磷灰石结合。骨钙素水平被用作活性骨转换指标。提高骨钙素的表达水平可能是恢复健康的骨发育或稳态的潜在策略。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供骨钙素或编码骨钙素的核酸。本文描述了示范性的骨钙素人蛋白和mrna序列。
[0201]
在一些实施方式中，提供降低rankl/opg比率的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制rankl的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗rankl抗体或其抗原结合片段。优选抗体是地舒单抗。在一些实施方式中，抑制剂是结合rankl mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。
[0202]
在一些实施方式中，治疗包括向个体提供opg或编码opg的核酸。本文描述了示范性的opg人蛋白和mrna序列。
[0203]
在一些实施方式中，提供降低il-6的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制il-6的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗il-6抗体或其抗原结合片段。优选抗体是司妥昔单抗。优选抗体是欧罗克珠单抗(olokizumab)。优选抗体是伊斯立莫单抗(elsilimomab)。优选抗体是克拉杂单抗(clazakizumab)。优选抗体是希鲁库单抗(sirukumab)。在一些实施方式中，抑制剂是结合il-6 mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。
[0204]
在一些实施方式中，抑制剂是抗il-6受体抗体或其抗原结合片段。优选抗体是托珠单抗(tocilizumab)。优选抗体是萨立鲁单抗(sarilumab)。
[0205]
在一些实施方式中，提供降低il-1β的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制il-1β的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗il-1β抗体或其抗原结合片段。优选抗体是卡纳单抗(canakinumab)。在一些实施方式中，抑制剂是结合il-1βmrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。
[0206]
在一些实施方式中，il-1信号转导的抑制剂是il-1受体拮抗剂，优选阿那白滞素
(anakinra)。在一些实施方式中，il-1信号转导的抑制剂是可溶性诱饵受体，优选利纳西普(rilonacept)。
[0207]
在一些实施方式中，提供提高成纤维细胞生长因子受体途径的表达或活性的治疗。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供fgfr2或编码fgfr2的核酸。本文描述了示范性的fgfr2人蛋白和mrna序列。在一些实施方式中，治疗包括用fgfr2受体的配体激活fgfr途径。例如成纤维细胞生长因子(fgf)，例如fgf1和fgf2。在一些实施方式中，治疗包括通过介导受体二聚(例如通过刺激二聚的抗体)来激活fgfr2受体。
[0208]
在一些实施方式中，提供提高bmp信号转导途径的表达或活性的治疗。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供bmp2、bmp4、卵泡抑素或编码bmp2、bmp4或卵泡抑素的核酸。本文描述了示范性的bmp4人蛋白和mrna序列。在一些实施方式中，治疗包括用小分子活化剂激活bmp途径，例如异甘草素、4
’-
羟基查尔酮、芹菜素和/或香叶木素(diosmetin)(vrijens等人2013plos one)或腹啡肽(genthe等，2017acs chem biol)。
[0209]
在一些实施方式中，提供提高wnt信号转导途径的表达或活性的治疗。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供wnt(优选wnt3a或wnt5)或编码wnt的核酸。在一些实施方式中，治疗包括提供chir99021以抑制激酶gsk3。在一些实施方式中，所述治疗包括提供氯化锂。在一些实施方式中，所述治疗包括提供wnt激动剂1。
[0210]
wnt3a的示例性人类序列如下：
[0211]
maplgyflllcslkqalgsypiwwslavgpqysslgsqpilcasipglvpkqlrfcrnyveimpsvaegikigiqecqhqfrgrrwncttvhdslaifgpvldkatresafvhaiasagvafavtrscaegtaaicgcssrhqgspgkgwkwggcsediefggmvsrefadarenrpdarsamnrhnneagrqaiashmhlkckchglsgscevktcwwsqpdfraigdflkdkydsasemvvekhresrgwvetlrprytyfkvpterdlvyyeaspnfcepnpetgsfgtrdrtcnvsshgidgcdllccgrghnaraerrrekcrcvfhwccyvscqectrvydvhtck
[0212]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_033131.3(2018年4月23日)。
[0213]
wnt5a的示例性人类序列如下：
[0214]
mkksigilspgvalgmagsamsskfflvalaiffsfaqvvieanswwslgmnnpvqmsevyiigaqplcsqlaglsqgqkklchlyqdhmqyigegaktgikecqyqfrhrrwncstvdntsvfgrvmqigsretaftyavsaagvvnamsracregelstcgcsraarpkdlprdwlwggcgdnidygyrfakefvdarererihakgsyesarilmnlhnneagrrtvynladvackchgvsgscslktcwlqladfrkvgdalkekydsaaamrlnsrgklvqvnsrfnspttqdlvyidpspdycvrnestgslgtqgrlcnktsegmdgcelmccgrgydqfktvqterchckfhwccyvkckkcteivdqfvck
[0215]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_003392.4(2018年5月7日)。
[0216]
wnt1的示例性人类序列如下：
[0217]
mglwallpgwvsatlllalaalpaalaanssgrwwgivnvasstnlltdskslqlvlepslqllsrkqrrlirqnpgilhsvsgglqsavreckwqfrnrrwncptapgphlfgkivnrgcretafifaitsagvthsvarscsegsiesctcdyrrrgpggpdwhwggcsdnidfgrlfgrefvdsgekgrdlrflmnlhnneagrttvfsemrqeckchgmsgsctvrtcwmrlptlravgdvlrdrfdgasrvlygnrgsnrasraellrlepedpahkppsphdlvyfekspnfctysgrlgtagtagracnssspaldgcellccgrghrtrtqrvtercnctfhwcchvscrncthtrvlhecl
[0218]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_005430.3(2018年3月29日)。
[0219]
在一些实施方式中，提供骨合成代谢疗法。在一些实施方式中，骨合成代谢疗法包括提供骨硬化蛋白(sost)或编码骨硬化蛋白的核酸分子。
[0220]
sost的示例性人类序列如下：
[0221]
mqlplalclvcllvhtafrvvegqgwqafkndateiipelgeypepppelennktmnraenggrpphhpfetkdvseyscrelhftryvtdgpcrsakpvtelvcsgqcgparllpnaigrgkwwrpsgpdfrcipdryraqrvqllcpggeaprarkvrlvasckckrltrfhnqselkdfgteaarpqkgrkprprarsakanqaelenay
[0222]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_025237.2(2018年4月16日)。
[0223]
其他合适的骨合成代谢疗法为技术人员所熟知，并且包括生长激素、胰岛素样生长因子(igf)1、锶、氟化物、骨形态发生蛋白(bmp)-2、bmp-7(即，成骨蛋白-1[op-1])、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)(尤其是fgf-2)，和血管内皮生长因子(vegf)。有关骨合成代谢疗法的综述，参见lane和kelman，arthritis res ther.2003；5(5):214
–
222。示范性疗法包括短期或间歇使用甲状旁腺激素(pth)。重组人甲状旁腺激素(rhpth)能增加骨量和强度，已被用于治疗骨质疏松。
[0224]
在一些实施方式中，提供破骨细胞活性抑制剂。在一些实施方式中，破骨细胞活性抑制剂是双膦酸盐或地舒单抗。
[0225]
颅缝早闭治疗
[0226]
在一个实施方式中，本发明提供了对治疗感染寨卡病毒(zikv)的个体的颅缝早闭特别有用的药物组合物。如本领域技术人员所清楚的，本文提供的化合物和组合物可给予个体或携带个体(胎儿)的个体，例如妊娠母亲。
[0227]
在一些实施方式中，提供提高ifnγ的表达或活性的治疗。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供ifnγ或编码ifnγ的核酸。本文描述了示范性的ifnγ人蛋白和mrna序列。人类重组ifnγ也可在市场上买到(例如，stemcell
tm technologies)。该治疗还包括ifn-γ变体，例如美国专利604603中描述的具有增加的稳定性的那些变体。
[0228]
在一些实施方式中，提供降低碱性磷酸酶(alp)的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制alp的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗alp抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抑制剂是结合alp mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。
[0229]
在一些实施方式中，提供降低骨钙素的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制骨钙素的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗骨钙素抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抑制剂是结合骨钙素mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。
[0230]
在一些实施方式中，提供提高rankl/opg比率的治疗。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供rankl或编码rankl的核酸。本文描述了示范性的rankl人蛋白和mrna序列。在一些实施方式中，治疗包括向个体提供糖皮质激素。糖皮质激素影响骨重塑并增加rankl表达(francisco j.a.de paula等，摘自威廉姆斯内分泌教科书(第十三版)，骨质疏松和骨生物学2016)
[0231]
在一些实施方式中，提供降低opg的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制opg的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗opg抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抑制剂是结合opg mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。
[0232]
在一些实施方式中，提供减少成纤维细胞生长因子受体途径的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制该途径的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗fgfr2抗体或其抗原结合片段。例如，hugal-fr21是人源化抗-fgfr2。在一些实施方式中，抑制剂是结合fgfr2 mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。在一些实施方式中，抑制剂是能够结合和隔离fgf的“fgf配体阱”(参见presta等pharmacol ther.2017年11月；179:171-187，有关fgf配体阱的综述)。
[0233]
在一些实施方式中，提供减少bmp信号转导途径的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制该途径的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗bmp2、bmp4或卵泡抑素的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抑制剂是结合bmp2、bmp4或卵泡抑素的mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。优选地，所述抑制剂是bmp信号转导的小分子抑制剂，优选地选自k02288、ldn-193189和背吗啡(参见，例如，sanvitale等人，2013plos one 8(4)：e62721)。
[0234]
在一些实施方式中，抑制剂是头蛋白、gremlin 1、腱蛋白或编码头蛋白、gremlin 1或腱蛋白的核酸分子。
[0235]
头蛋白的示例性人类序列如下：
[0236]
mercpslgvtlyalvvvlglratpaggqhylhirpapsdnlplvdliehpdpifdpkekdlnetl lrsllgghydpgfmatsppedrpgggggaaggaedlaeldqllrq rpsgampseikglefsegla qgkkqrlskklrrklqmwlw sqtfcpvlya wndlgsrfwp ryvkvgscfskrscsvpegm vckpsksvhl tvlrwrcqrr ggqrcgwipi qypiiseckc sc(信号肽下划线)
[0237]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_005450.4(2018年4月23日)。
[0238]
gremlin-1的示例性人类序列如下：
[0239]
msrtaytvga lllllgtllp aaegkkkgsq gaipppdkaq hndseqtqsp qqpgsrnrgrgqgrgtampg eevlessqea lhvterkylk rdwcktqplk qtiheegcns rtiinrfcygqcnsfyiprh irkeegsfqs csfckpkkft tmmvtlncpe lqpptkkkrv trvkqcrcisidld
[0240]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_060565.1(2018年3月28日)。
[0241]
腱蛋白的示例性人类序列如下：
[0242]
mpslpappapllllgllllgsrpargagpeppvlpirsekeplpvrgaagctfggkvyaldetwhpdlgepfgvmrcvlcaceapqwgrrtrgpgrvscknikpecptpacgqprqlpghccqtcpqerssserqpsglsfeyprdpehrsysdrgepgaeerargdghtdfvalltgprsqavararvsllrsslrfsisyrrldrptrirfsdsngsvlfehpaaptqdglvcgvwravprlslrllraeqlhvalvtlthpsgevwgplirhralaaetfsailtlegppqqgvggitlltlsdtedslhflllfrglleprsggltqvplrlqilhqgqllrelqanvsaqepgfaevlpnltvqemdwlvlgelqmalewagrpglrisghiaarkscdvlqsvlcgadalipvqtgaagsasltllgngsliyqvqvvgtss
evvamtletkpqrrdqrtvlchmaglqpgghtavgicpglgargahmllqnelflnvgtkdfpdgelrghvaalpycghsarhdtlpvplagalvlppvksqaaghawlsldthchlhyevllaglggseqgtvtahllgppgtpgprrllkgfygseaqgvvkdlepellrhlakgmaslmittkgsprgelrgqvhianqcevgglrleaagaegvralgapdtasaappvvpglpalapakpggpgrprdpntcffegqqrphgarwapnydplcslctcqrrtvicdpvvcpppscphpvqapdqccpvcpekqdvrdlpglprsrdpgegcyfdgdrswraagtrwhpvvppfglikcavctckggtgevhcekvqcprlacaqpvrvnptdcckqcpvgsgahpqlgdpmqadgprgcrfagqwfpesqswhpsvppfgemscitcrcgagvphcerddcslplscgsgkesrccsrctahrrpapetrtdpelekeaegs(信号肽下划线)
[0243]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：nm_003741.3(2017年10月3日)。
[0244]
在一些实施方式中，提供减少wnt途径的表达或活性的治疗。因此，该治疗提供一种或多种抑制该途径的化合物。在一些实施方式中，抑制剂是抗wnt3a、wnt5或wnt激动剂1的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抑制剂是结合wnt3a、wnt5或wnt激动剂1的mrna或mrna前体的核酸分子，优选所述抑制剂是反义寡核苷酸、mirna或sirna。在一些实施方式中，抑制剂为dkk1或骨硬化蛋白或编码dkk1或骨硬化蛋白的核酸分子。
[0245]
dkk1的示例性人类序列如下：
[0246]
mmalgaagatrvfvamvaaalgghpllgvsatlnsvlnsnaiknlppplggaaghpgsavsaapgilypggnkyqtidnyqpypcaedeecgtdeycasptrggdagvqiclacrkrrkrcmrhamccpgnyckngicvssdqnhfrgeieetitesfgndhstldgysrrttlsskmyhtkgqegsvclrssdcasglccarhfwskickpvlkegqvctkhrrkgshgleifqrcycgeglscriqkdhhqasnssrlhtcqrh
[0247]
可在genbank中找到相应的mrna序列，ncbi参考序列：ay359005.1(2003年10月3日)。
[0248]
在一些实施方式中，所述治疗刺激骨转化。示范性治疗包括长期服用甲状旁腺激素(pth)，这导致骨吸收。
[0249]
在本文公开的一些实施方式中，所述治疗增加蛋白质或信号转导途径的活性或表达。在一些实施方式中，这是通过提供包含如本文所公开的蛋白质的药物组合物来实现的。可从天然来源分离和纯化用于治疗用途的蛋白质。或者，可以使用技术人员已知的分子克隆技术重组表达此类蛋白质。所述蛋白质可包含氨基酸取代，例如，使其能在宿主系统中可溶性表达、优化蛋白质稳定性和/或调节免疫原性。所述蛋白质还可包含表位或纯化标签，或出于药代动力学目的与其它治疗性蛋白质或诸如fc或血清白蛋白的蛋白质融合。优选地，所述蛋白质具有与本文公开的序列具有至少90％、至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列。优选地，所述蛋白质来源与所述个体物种相匹配，或者更确切地说，在治疗人类时使用人类蛋白质。
[0250]
还提供编码本文公开的蛋白质的核酸。所述核酸可操作地连接到诸如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列的额外序列。启动子序列编码组成型或诱导型启动子。
[0251]
还提供包含所述核酸的载体。“载体”是一种重组核酸构建体，如质粒、噬菌体基因组、病毒基因组、粘粒或人工染色体，其上可附连另一个dna区段。术语“载体”包括用于将核酸分子体外、体内或离体引入细胞中的病毒和非病毒手段。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染素)、dna蛋白质复合物和生物聚合物。病毒载体包括逆转录病毒、腺相
关病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、eb病毒和腺病毒载体。载体序列还可包含一个或多个调控区和/或可选择标志物，用于选择、测量和监测核酸转移结果。
[0252]
还提供包含所述核酸或载体的细胞。引入方法在很大程度上取决于靶细胞类型，包括例如，capo4沉淀、脂质体融合、脂转染素、电穿孔、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、病毒感染、脂质体中多核苷酸的包封，直接显微注射dna到细胞核中。核酸可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，也可以瞬时或稳定地存在于细胞质中。
[0253]
所述蛋白质可通过培养用含有编码蛋白质的核酸的表达载体转化的宿主细胞产生。合适的宿主细胞包括酵母、细菌、古细菌、真菌、昆虫和动物细胞，包括哺乳动物细胞。优选在哺乳动物细胞中表达蛋白质。哺乳动物表达系统在本领域中也是已知的，并且包括逆转录病毒系统。
[0254]
编码蛋白质的核酸也可用于基因治疗。在基因治疗应用中，将基因导入细胞以实现治疗有效的基因产物的体内合成。“基因治疗”既包括传统基因治疗，即通过单一治疗获得持久效果，也包括基因治疗剂的施用，即一次或多次施用治疗有效的dna或mrna。优选地在适于基因治疗的病毒载体中提供核酸分子。病毒载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(aav)、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、eb病毒和腺病毒载体。合适载体和递送方法为技术人员所知，并且例如在schlachetzki等，neurology,gene therapy of the brain.(2004)62:1275-1281和richardson等neurosurg clin n am.2009 20(2):205-10中描述。
[0255]
有多种技术可用于将核酸导入活细胞。根据核酸是在体外转移到培养的细胞中，还是在体内转移到预期宿主的细胞中，技术各不相同。适合核酸体外转移到哺乳动物细胞中的技术有脂质体法、电穿孔法、显微注射法、细胞融合法、deae-葡聚糖法、磷酸钙沉淀法等。目前优选的体内基因转移技术包括用病毒(通常是逆转录病毒)载体转染和病毒包衣蛋白-脂质体介导的转染(dzau等人，trends in biotechnology 11:205-210(1993))。
[0256]
在一些实施方式中，所述治疗降低生物标志物或信号转导途径的活性或表达。因此，治疗可包括提供一种或多种活性和/或表达抑制剂。术语“抑制剂”最广义使用，并且包括例如部分或完全阻断、抑制或中和生物标志物的生物活性或降低生物标志物mrna或功能蛋白的表达的任何分子。合适的抑制剂包括特异性结合所述蛋白质并抑制其各自功能或导致其降解的分子(例如，抗体、小化合物)以及影响mrna转录、mrna剪接或蛋白质翻译的化合物(例如，反义寡核苷酸和sirna)。抑制剂包括多肽、小分子和基于核酸的抑制剂。
[0257]
优选地，抑制剂是抗体，尤其是拮抗或“中和”抗体。如本文所用，术语“抗体”包括例如天然存在和非天然存在的抗体、多克隆和单克隆抗体、嵌合抗体和完全合成的抗体及其片段，例如，fab'，f(ab')2、fv或fab片段，或其他抗原识别性免疫球蛋白片段。制备抗体的方法在本领域中是众所周知的，并且许多合适的抗体是市售的。优选地，本文公开的抗体包括抗原结合片段(例如，fab'，f(ab')2、fv或fab片段)。
[0258]
优选地，所述抑制剂是核酸分子，尤其是以序列特异性方式引起生物标志物的降解或抑制其功能、转录或翻译的分子。示例性核酸分子包括适体、sirna、人工小rna、干扰rna或rnai、dsrna、核酶、反义寡核苷酸和编码所述核酸分子的dna表达盒。
[0259]
在一些实施方式中，核酸分子是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸(aso)通常通过结合
靶mrna并通过阻断核糖体来空间阻断表达来抑制其靶标。aso也可用于“外显子跳跃”。aso还可以通过结合靶mrna从而形成dna-rna杂合体来抑制其靶标，该杂合体可以是rna酶h的底物。在一些实施方式中，核酸分子是rnai分子，即rna干扰分子。优选rnai分子包括sirna、shrna和人工mirna。设计和生产合适的核酸抑制剂的方法在本领域是众所周知的。参见例如，crooke等“rna靶向疗法”2018cell metabolism 27:714-739中核酸抑制剂的综述。
[0260]
核酸分子抑制剂可以化学合成并直接提供给感兴趣的细胞。核酸化合物可作为基因递送载剂的一部分提供给细胞。这种载剂优选为脂质体或病毒基因递送载剂。脂质体在本领域是众所周知的，并且许多变体可用于基因转移目的。
[0261]
本文所述的药物组合物优选地包含一种或多种药学上可接受的运载体、防腐剂、增溶剂、稀释剂和/或赋形剂等。合适的药学上可接受的运载体、防腐剂、增溶剂、稀释剂和/或赋形剂可例如在《remington药物科学和实践》，第20版baltimore,md:lippincott williams&wilkins,2000中找到。
[0262]
当向个体施用药物组合物时，优选将一种或多种化合物溶解在与递送方法相容的溶液中。对于静脉内、皮下、肌肉内、鞘内和/或脑室内给药，溶液优选生理盐水溶液。优选赋形剂，其能够形成复合物、囊泡和/或脂质体，所述复合物、囊泡和/或脂质体通过细胞膜在囊泡或脂质体中递送如本文所定义的化合物。合适的赋形剂是本领域已知的。
[0263]
药物组合物的实际剂量水平可以改变，以便获得有效实现特定个体的期望治疗反应的活性成分的量，同时避免/最小化毒性。所选剂量水平取决于多种因素，包括特定化合物的活性，给药途径，给药时间，所用特定化合物的排泄率，治疗持续时间，组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病症、整体健康状况和先前病史，以及医学领域熟知的类似因素。具有本领域普通技能的医师或兽医可容易地测定并开出所需药物组合物的有效量。
[0264]
在一些实施方式中，本文公开的治疗包括组合治疗。在一些实施方式中，提供两种或两种以上化合物作为治疗的部分。可依次或同时施用所述化合物，或所述治疗可包括例如用第一化合物进行第一治疗(例如，跨越数天或数周)和用第二化合物进行第二治疗。在一些实施方式中，两种或两种以上化合物配制在单一药物组合物中。
[0265]
在一些实施方式中，本文公开的治疗性处理还包括使用本文公开的生物标志物监测所述治疗。一种或多种生物标志物的表达和/或活性可与本文所述的参考值或先前在所述个体中确定的水平(例如，在治疗开始之前)进行比较。基于生物标志物表达/活性来确定个体是否对治疗有反应属于本领域技术人员的范畴内。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的增加指示不良预后。与先前水平相比，个体中样品中的表达/活性水平显著降低，表明所述个体对治疗有反应。在一些实施方式中，提供生物标志物，其中表达/活性的降低指示不良预后。与先前水平相比，个体中样品中的表达/活性水平显著增加，表明所述个体对治疗有反应。
[0266]
定义
[0267]
本文所使用的“个体”包括但不限于哺乳动物，包括例如人类、非人灵长类动物、小鼠、猪、牛、山羊、猫、兔子、大鼠、豚鼠、仓鼠、八齿鼠、马、猴、绵羊。优选地，个体是人。在一些实施方式中，个体是人胎儿。优选携带胎儿的对象(即个体)是怀孕的母亲。
[0268]
如本文所使用的值中的“显著”改变可指使用本领域中适当且众所周知的统计方
法确定的可再现或统计显著的差异，其概率值通常小于由随机变化引起的改变的百分之五。优选地，显著增加比参考值高至少20％、至少40％或至少50％。确定被认为是显著的增加或相似性量完全在技术人员的权限之内。
[0269]
如本文中所使用的，“包括”及其变形在其非限制性意义上用来表示包括该词之后的项目，但是不排除未特别提及的项目。此外，“由
……
组成”可以由“由
……
基本上组成”代替，意指本文定义的化合物或辅助化合物可以包含除具体测定的化合物之外的其他组分，所述其他组分不会改变本发明的独特特征。
[0270]
本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例而言，“一种元件”表示一个元件或者一个以上的元件。
[0271]
词语“约”或“近似”当与数值(约10，近似10)联用时优选表示该值可以是给定值或比该值多或少1％。
[0272]
如本文所用，术语“治疗”是指如本文所述逆转、减轻、延迟疾病或紊乱或其一种或多种症状的发生或抑制其进展。在一些实施方式中，可在出现一种或多种症状之后施用治疗。在其它实施方式中，可在没有症状的情况下施用治疗。例如，可在症状出现之前对易感个体施用治疗(例如，根据症状史和/或根据遗传或其他易感因素)。症状消失后也可继续治疗，例如预防或延缓复发。如本文所用，治疗感染zikv的个体，优选地指治疗、预防、减缓进展和/或减少感染的一种或多种症状。尤其是，一种或多种症状与骨代谢有关，如关节痛、骨质疏松和颅缝早闭。
[0273]
本说明书中所引用的所有专利和文献通过参引全文纳入本文。
[0274]
在以下实施例中进一步解释本发明。这些实施例不限制本发明的范围，而仅用于阐明本发明。
[0275]
实施例
[0276]
实施例1a
[0277]
材料和方法
[0278]
原代细胞培养：从lonza(pt-2501)购买两名健康供体的人骨髓来源的间充质干细胞(hmsc)。如前所述，hmsc分化为成骨细胞(15)。简单地说，hmsc在补充有10％热灭活胎牛血清a(fcs，sigma)、20mm肝素(sigma)、链霉素/青霉素(thermofisher)和1.8mm cacl2(sigma)的αmem培养基(gibco，thermofisher)中37％和5％co2的湿润空气中培养。接种后第3天(d＝-3)的培养基中添加100mm地塞米松(dex)和10mmβ-甘油磷酸酯，在2-3周内分化为矿化成骨细胞。每周更新培养基两次。vero细胞(非洲绿猴肾表皮细胞，atcc ccl-81)在添加10％热灭活胎牛血清(fbs，greiner bio one，奥地利)、2mm l-谷氨酰胺(lonza)、1％碳酸氢钠(lonza)、1％肝素(lonza)、100u/ml青霉素(lonza)，100μg/ml链霉素(lonza)的dulbecco改良eagle培养基(dmem，lonza，荷兰)中37％和5％co2下在湿润空气中培养。
[0279]
病毒：寨卡病毒苏里南zikvnl00013(zikvas-sur16)是从荷兰的一名患者(evag编号011v-01621)中分离出来的(12)。本研究中使用的病毒库在vero细胞中生长，第3代用于本研究。上清液中的病毒滴度如前所述(16)由vero细胞的终点滴定测定。简单地说，进行10倍连续稀释并接种到96孔板(2x104细胞/孔)中的vero细胞单层上。在感染后5天(dpi)读取并测定细胞病变效应(cpe)，并使用spearman-法(17)计算50％组织培养感染剂量(tcid50)的病毒滴度。上清液的初始1:10稀释导致检测限为10
1.5
tcid50/ml。
[0280]
zikv的复制动力学
[0281]
hmsc在感染前3天接种(d＝-3)。接种后3天(第0日)，用含有成骨刺激物的培养基更新成骨细胞前体细胞。刺激6小时后，细胞以5的感染倍数(moi)在37℃和5％的co2中感染zikv 1小时。孵育后，去除上清，用含10％热灭活fcs的αmem培养基洗涤细胞3次。加入含10％热灭活fcs的αmem培养基，并添加100nm地塞米松(dex)和10mmβ-甘油磷酸酯，根据实验培养细胞3周。未感染的对照组接受治疗并平行实验。在不同时间点收集细胞上清液，96小时后固定感染细胞，进行免疫荧光分析(ifa)染色以确认感染来确定zikv感染滴度。上清液在-80℃下保存待用。实验由两个不同的供体一式三份进行。
[0282]
免疫荧光显微术
[0283]
在感染后第4天，用4％pfa固定复制生长动力学试验中感染的细胞，用70％乙醇渗透，并如前所述进行ifa染色(16)。简言之，在与小鼠单克隆抗体抗黄病毒组抗原(mab10216)克隆d1-4g2-4-15(德国密理博)孵育后的细胞用偶联alexa fluor 488的山羊抗小鼠igg染色(荷兰life technologies)。孵育后，用dapi(life technologies,usa)将细胞置于diamond防褪色固定剂中。以用小鼠同种型igg2a抗体(dako,丹麦)染色的zikv感染细胞和未感染细胞作为阴性对照。zikv感染的细胞通过安装在axio observer z1倒置显微镜(蔡司)上的蔡司lsm 700共焦激光扫描显微镜进行鉴定。所有图像均使用zen2010软件(蔡司)处理。
[0284]
碱性磷酸酶、矿物化和蛋白质分析
[0285]
alp和钙的测量如前所述(18)。简而言之，通过酶反应测定alp活性，其中在405nm处测量37℃下10分钟内alp介导的对硝基苯磷酸酯(pnpp)[西格玛]转化为对硝基苯酚(pnp)。对于钙测量，细胞裂解物与0.24m hcl在4℃下孵育过夜。钙含量用钙测定试剂通过比色法测定，该试剂由1m乙醇胺缓冲液(ph 10.6)与0.35mm 0-甲酚酞络合物1以1:1混合而成。根据细胞裂解物的蛋白质含量调整alp结果。对于蛋白质测量，向25μl细胞裂解液中添加200μl工作试剂。将混合物在37℃下孵育30分钟，冷却至室温(rt)10分钟，并在595nm处测量吸光度。所有测量均使用victor2平板阅读器进行。
[0286]
mrna表达的定量
[0287]
在分化和成熟期(感染后第7天、14天、18、21天)的不同时间点，用100mm地塞米松和10mmβ-甘油磷酸酯连续处理zikv感染和未感染的培养物。rna分离、cdna合成和pcr反应如前所述进行(15)。寡核苷酸引物对设计成在外显子边界上或跨越至少一个内含子(表1)。针对管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)校正基因表达。
[0288]
统计学分析
[0289]
使用graphpad prism 5.01软件进行统计学分析。所有结果以平均值+平均值标准误差(sem)表示。采用斯氏t检验和mann-whitney u检验对两组(感染组和未感染组)进行比较。认为p值≤0.05是显著的。
[0290]
结果：
[0291]
关节痛和骨质疏松的人类msc模型的应用：
[0292]
通过研究与干细胞决策、成骨细胞分化和矿化相关的分子和细胞过程，人骨髓来源的间充质干细胞(msc)已被证明是一种具有洞察力的骨形成模型。除了成骨细胞外，这些细胞还可以驱动为脂肪细胞和软骨细胞，取决于对这些干细胞的刺激。研究成骨细胞分化
和成熟的常规方法包括碱性磷酸酶活性分析、细胞外基质(ecm)中矿物质沉积分析、标志物基因表达和矿化的几种染色分析(curr protoc stem cell biol.2011年6月；第一章)。这清楚地表明，msc是多能的，正是这一点使得该模型可以用于研究关节痛和骨质疏松(另见。j cell physiol.2018jun；233(6):4895-4906.doi:10.1002/jcp.26298电子出版2018年1月15日)。事实上，关节内注射msc是一种治疗骨关节炎的方法(am j sports med.2017年10月；45(12):2774-2783.doi:10.1177/0363546517716641电子出版2017年7月26日)。因此，msc在培养第0天的感染代表了研究关节痛和骨质疏松的多能性的合适模型。
[0293]
颅缝早闭的人成骨细胞模型的应用：
[0294]
当用正确的生长因子刺激msc时，细胞会向成骨细胞分化。大量的研究为msc向成骨细胞分化和矿化的分子机制提供了新的见解(stem cell reports.2017年4月11日；8(4):947-960.doi:10.1016/j.stemcr.2017年2月18日.电子出版2017年3月23日；jbmr plus.2017年4月28日；1(1):16-26.doi:10.1002/jbm4.10003.电子选集2017年8月.；proc natl acad sci u s a.2015年10月13日；112(41):12711-6.doi:10.1073/pnas.1501597112.电子出版2015年9月29日)我们选择的zikv感染研究颅缝早闭的时间点(第7天)代表了多能msc已被驱动为均一的成骨细胞基因型和表型的情形，代表了骨形成和矿化培养物。该模型非常适合监测骨矿化能力的变化，例如颅缝早闭的情形。颅缝早闭是一种典型的由成骨细胞矿化改变的疾病，导致主要由成骨细胞尔不是其它msc衍生的细胞类型组成的颅骨板过早融合(biomed res int.2013；2013:292506.doi:10.1155/2013/292506.epub 2013 5月9日；bmc med genet.2018年5月30日；19(1):91.doi:10.1186/s12881-018-0607-8.)。因此，我们的第7天感染模型理想地反映了颅骨形成的情况，并允许研究颅缝早闭的过程。
[0295]
zikv的复制动力学
[0296]
为了确定成骨细胞是否易受zikv感染，我们用zikv感染成骨细胞前体培养物(moi＝5)。感染的培养物没有表现出zikv感染引起的细胞病变作用。感染后第4天用ifa确认细胞内zikv感染，用终点滴定法确认感染病毒滴度。zikv能有效地感染分化性成骨细胞，并在感染后2天内产生107tcid
50
/ml的高感染滴度。分化期间的病毒生长动力学表明，成骨细胞前体培养物持续被zikv感染，并且在感染后三周内在两个供体中都观察到感染性病毒颗粒脱落(图1)。
[0297]
alp和矿化分析：
[0298]
在moi为5(d＝0)时感染培养物，并在感染后不同时间点测定alp活性和矿物质含量，以确定zikv感染对成骨细胞分化和成熟的影响。在感染zikv的成骨细胞中，与未感染的对照组相比alp活性在感染后第11天显著降低(p值<0.05，图2)。此外，与未感染的对照组相比，感染zikv的成骨细胞在成熟过程中的晚期时间点，即感染后第18天和第21天，就矿物质含量而言显著降低了成熟(p值<0.05)。
[0299]
mrna表达分析：
[0300]
为了量化zikv感染对zikv感染过程中关键转录因子表达水平(其在决定成骨细胞表型中起着重要作用)的影响，我们在接种后第3天以5moi用zikv感染成骨细胞(d＝0)。我们量化了成骨细胞分化过程中感染后不同时间点成骨细胞增殖、分化、成熟和骨稳态的关键生物标志物的基因表达(见图4和图5)。检测alp、runt相关转录因子2(runx2，成骨细胞分
化的关键转录因子)和经典炎症介导物白细胞介素6(il-6)的基因表达。与未感染的对照组相比，zikv感染的分化性成骨细胞中的alp和runx2表达显著降低(约2倍)(p值<0.05)(图3)。有趣的是，感染的成骨细胞il-6水平显著升高(p值<0.05)。
[0301]
实施例1b
[0302]
确定其他预后标志物：
[0303]
细胞培养和总rna分离与产生pcr数据的实验相同。采用无偏倚的方法，对第0天(关节痛)和第7天感染模型(颅缝早闭)进行下一代测序(ngs)以产生与zikv感染相关的基因列表和细胞途径。该方法与之前广泛描述的方法相同(j cell biochem，2014年10月；115(10)：1816-28)。根据ngs和一些质量对照，与对照条件相比，严格筛选得到的基因列表的表达水平、表达显著性和zifv感染导致的倍数调控。鉴于这种严格性和应用的临界值，在两种细胞培养模型中，列表中提供的所有基因都被视为zikv感染后与特别确定的途径相关的高优先级基因。
[0304]
对zikv感染的msc进行宿主转录组分析。对差异表达的mrna进行注释分析，确定干扰素信号转导途径是zikv感染期间激活的顶级标准途径(见表1)。
[0305]
表1：zikv感染后成骨细胞干扰素信号转导途径基因表达的倍数变化
[0306][0307][0308]
对zikv感染的成骨细胞进行宿主转录组分析。在第7天感染zikv后，我们发现了一组fgf信号转导途径的基因(见表2)、一组bmp信号转导途径的基因(见表3)和一组wnt信号转导途径的基因(见表4和5)，这些基因都受到了强烈调控，指向增强的骨形成。
[0309]
表2：zikv感染时第7天的成骨细胞内fgf途径的活化。
[0310][0311]
表3：zikv感染时第7天的成骨细胞内bmb信号转导途径的活化。对zikv感染的成骨细胞进行宿主转录组分析。
[0312][0313]
表4：
[0314]
zikv感染时第7天的成骨细胞内wnt/β-连环蛋白信号转导途径的基因表达的改变。
[0315][0316]
[0317]
表5：zikv感染后在第7天的成骨细胞中wnt/ca
2+
信号转导途径基因表达的倍数变化
[0318]
基因号倍数改变crebbp2.475980582fzd82.398279828nfkb22.318191904nfatc22.267338826axin12.0363704plcb40.477641468plce10.40332088
[0319]
讨论：
[0320]
在观察到zikv感染可导致持续或复发性关节痛以及zikv感染患者滑液中zikv的检测后，有必要探讨zikv感染对骨重塑和稳态的影响。目前，还没有一个生物相关的体外骨模型来研究zikv的发病机制和随后的骨关节并发症。因此，在本研究中，我们研究了成骨细胞对zikv感染的敏感性以及感染对成骨细胞分化和成熟的影响。
[0321]
目前的发现与最近报道的一项研究一致，该研究证实了人类成骨细胞样细胞系(hobit)对两种zikv菌株(亚洲：prvabc59和非洲：mr766)的敏感性，并产生10
7.9
tcid
50
/ml的感染性病毒滴度，并在96小时内观察到cpe(14)。然而，我们在zikv感染的原代成骨细胞中在3周时间内没有观察到任何cpe。这种差异可能是由于在体外模型中的差异造成的，因为在目前的研究中，其他研究使用了成骨样细胞系与原代成骨细胞进行比较。此外，黄病毒的存在和复制可能不会完全抑制宿主细胞大分子合成，从而导致无细胞病变的持续感染(19)。在目前的研究中，zikv感染的复制动力学显示成骨细胞在感染后3周内持续感染，类似于chikv(7)，这可能是病毒在关节中持续存在的促成因素。
[0322]
在两个供体中，与未感染的对照组相比，zikv感染根据alp和矿物质含量方面减少了分化和成熟，这表明zikv感染与对照组相比影响了分化性成骨细胞的表型。这些功能分析提供了zikv感染干扰成骨细胞功能的线索，成骨细胞功能对骨形成至关重要，可导致zikv感染引起的骨相关疾病。在早期分化过程中(感染后第7天)，alp和runx2的mrna表达显著降低，进一步证实了这些发现。
[0323]
除骨分化标志物外，我们还观察了zikv感染的成骨细胞中il-6(一种促炎细胞因子)水平的改变。在两名供体中观察到il-6持续高表达。一些研究表明，感染关节源性α病毒，包括ross河病毒(rrv)和chikv，导致细胞因子水平升高，尤其是il-6和il-β水平升高。这些关键的炎症介导物刺激成骨细胞培养物中rankl表达的诱导。rankl/opg比率升高导致破骨细胞分化和活化增加，这在rrv和chikv感染期间使骨损失和关节炎症增加(5，7)。骨重塑是一个受严格调控的过程，需要破骨细胞和成骨细胞分别在骨吸收和骨形成中保持平衡(20)。这种平衡的破坏会导致异常骨重塑和多种病理状况的出现。关节炎的部分原因是由于成骨细胞功能受损导致的病理性骨损失。因此，骨重塑旁分泌细胞因子和几种炎症细胞因子(如il-6)的失衡与关节炎有关(5)。在目前的研究中，zikv感染的成骨细胞中il-6水平的升高，与先前的研究结果相似，强调了zikv感染对骨代谢的影响。总之，这些数据清楚地表明成骨细胞易受zikv感染，感染导致分化和成熟程度降低，从而导致受感染个体中骨相
hagen pm,等羟基氯喹在体外降低人msc来源的成骨细胞分化和矿化。2018；22(2):873-82.
[0340]
16.anfasa f,siegers jy,van der kroeg m,mumtaz n,raj vs,de vrij fm,等亚洲和非洲品系寨卡病毒在人神经祖细胞中的表型差异。msphere.2017；2(4):e00292-17.
[0341]
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[0342]
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[0343]
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[0344]
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[0345]
实施例2：
[0346]
为了证明在zikv感染成骨细胞期间阻断il-6和il-1β将导致rankl/opg表达水平的恢复，将用zikv感染成骨细胞培养物，且在感染之前或之后的不同时间点，将用针对il-6、il-1β的中和抗体或il-6和il-1β的组合处理这些培养物。我们将测定rankl和opg在上清液中的表达。
[0347]
实施例3：小鼠模型
[0348]
已建立的鼠zikv模型将用于产生zikv介导的出生前和出生后骨骼发病机制的翻译数据。此外，我们将进行原代骨髓来源的成骨细胞和破骨细胞培养。
[0349]
胚胎脑内寨卡病毒感染可导致出生后小头畸形。该模型以前被用来研究神经发育及其在小头畸形中的作用。在此我们将重点放在另一种假设，即小头畸形是过早颅骨融合的结果。将仔细检查新生儿的小头畸形和其他表型，如生长受限。在感染后的不同时间点，我们将对寨卡病毒感染后的胎鼠和新生小鼠进行广泛的颅骨和长骨表型分析。其中包括研究长骨和颅骨微结构的微机化断层扫描(μct)和筛选颅缝早闭的组织学。最后，将在感染后不同时间点在母体和胎儿组织及血清中测量本文所揭示的生物标志物。
[0350]
通过在后额缝融合之前培养后颅缝的方法在小鼠中研究了颅缝融合，其由下方的硬脑膜促使[bradley，j.p.等人，《颅缝生物学研究：区域硬脑膜决定体外颅缝融合》。plast reconstr surg,，1997年。100(5)：第1091-1099页；讨论；1100-1100]。我们将在3周时将后额缝与下面的硬脑膜一起移植，并在体外培养30天。zikv感染后，我们将每隔3天用perkin elmer的μct(quantum fx)扫描动物设施中的这些外植体，以监测与未感染外植体相比的融合过程。此外，我们将进行组织学检查，比较后额缝融合的程度。收获后，我们将进行基因表达研究，寻找已知的颅缝早闭信号转导途径(fgf，bmp)。与目标1a中的实验类似，我们将在这些培养物中加入中和抗体或干扰素信号转导抑制药物或抑制fgf和/或bmp信号转导的化合物。
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实施例4：
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将评估慢病毒敲减(使用shrna)或敲除(使用crispr-cas9)受zikv影响基因的后
果。此外，将测试在zikv感染后阻断msc和ncc来源的成骨细胞中i型和ii型干扰素信号转导途径的具体药物。
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实施例5：
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作为欧盟zikalliance项目的一部分，将评估美国和加勒比地区孕妇队列中成人和胎儿/新生儿的骨和软骨结果。zikalliance是一个跨学科项目，在全球范围内关注妊娠期zikv感染的影响和人类zikv的自然史。它的目标是招募10000名来自美国的参与者，其中母亲和儿童的zikv感染将在怀孕期间和之后受到密切监测。从有颅缝早闭和/或小头畸形以及zikv感染证据的病例中收集临床样品(包括来自母亲和儿童的血清，以及流产或死胎时的胎儿组织)。
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在本研究中，收集的临床样品将用于通过比较患有或不患有颅缝早闭或其他骨畸形以及患有或不患有zikv感染的儿童样品来确定母子对中生物标志物的表达/活性水平。