制备脂质体的方法

文档序号:26359107发布日期:2021-08-20 20:34阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种制备脂质体的方法,所述方法包括使至少一种细胞与如下接触:(i)成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段;和(ii)穿梭蛋白,其任选地附接于生物活性有效载荷分子,其中,所述成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段创建贯穿所述至少一种细胞的磷脂双层的孔,且所述穿梭蛋白与所述成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段相互作用,并被内化至所述细胞中而由此产生脂质体,可选地,所述脂质体装载有生物活性有效载荷分子。

2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述方法进一步包括自所述细胞分离所述脂质体。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述脂质体包含囊泡。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述脂质体包含细胞外囊泡(ev)、细胞内囊泡或管腔内囊泡(ilv)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述脂质体包含外泌体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述脂质体具有10nm至500nm、或20nm至400nm、或30nm至300nm、或40nm至200nm、或50nm至150nm、或60nm至120nm的平均直径。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述细胞包括生物细胞,可选地包括哺乳动物或人细胞。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段包含或者衍生自无毒蛋白。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段衍生自炭疽杆菌或蓖麻毒蛋白。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段衍生自炭疽杆菌毒力因子保护性抗原(pa)。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段衍生自炭疽杆菌83或63。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述成孔蛋白、或成孔结构域或其变体或片段包含基本上如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:5至seqidno:10中任一个所示的氨基酸序列或其变体或片段,或由基本上如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:5至seqidno:10中任一个所示的氨基酸序列或其变体或片段组成。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述穿梭蛋白配置为便于通过所述预成形蛋白的孔而优选地将生物活性有效载荷分子运输通过所述孔。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述穿梭蛋白包含减毒毒素蛋白。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述穿梭蛋白为衍生自炭疽杆菌的致死因子(lf)或水肿因子(ef)。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述穿梭蛋白包含基本上如seqidno:11所示的氨基酸序列或其变体或片段,或由基本上如seqidno:11所示的氨基酸序列或其变体或片段组成。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述穿梭蛋白包含连接子蛋白。

18.根据权利要求17所述的方法,其中,在所述减毒毒素中,至少一个毒性结构域,可选地炭疽杆菌致死因子蛋白毒素的毒性结构域ii-iv中的一个或多个,被所述连接子蛋白取代。

19.根据权利要求17所述的方法,其中,所述连接子蛋白包含核酸结合结构域。

20.根据权利要求19所述的方法,其中,所述核酸结合结构域为酿酒酵母gal4。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述穿梭蛋白包含基本上如seqidno:12或seqidno:13所示的氨基酸序列或其变体或片段,或由基本上如seqidno:12或seqidno:13所示的氨基酸序列或其变体或片段组成。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述生物活性有效载荷分子是在细胞胞质内、细胞核内、诸如囊泡或液泡的细胞器或细胞内结构内、细胞表面脂质膜或细胞内脂质膜内具有活性的治疗活性分子。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述生物活性化合物的分子量为1da至10mda。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述生物活性分子为:(i)小分子、蛋白质、核苷酸、dna或dna构建体、质粒、rna或rna构建体、mrna、mirna、指导rna、snrna、sirna、反义寡核苷酸(aso);或(ii)大分子,比如蛋白质或酶或其片段、核酸酶、或抗体或其抗原结合片段。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述生物活性有效载荷分子包含基因组编辑工具,所述基因组编辑工具可选地为核酸酶,优选cas9、cpf1、talen或锌指核酸酶。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述生物活性分子包含基本上如seqidno:14所示的氨基酸序列或其变体或片段,或由基本上如seqidno:14所示的氨基酸序列或其变体或片段组成。

27.一种通过权利要求1-26中任一项所述的方法获得或能够获得的脂质体。

28.一种脂质体,其包含:围绕着腔、成孔蛋白或成孔结构域或其变体或片段的磷脂双层,和穿梭蛋白。

29.根据权利要求28所述的脂质体,其中,所述脂质体为如权利要求1-26中任一项所定义的。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的脂质体,其用在治疗或诊断中。

31.根据权利要求27-29中任一项所述的脂质体,其用在治疗、预防或改善疾病中。

32.根据权利要求31所用的脂质体,其中,待治疗的所述疾病为肥胖,更优选地为fmo5-调节的肥胖。

33.根据权利要求31所用的脂质体,其中,待治疗的所述疾病为前列腺素d2调节的疾病,所述前列腺素d2调节的疾病选自:雄激素性脱发(aga);粉刺;红斑痤疮;和前列腺癌。

34.根据权利要求31所用的脂质体,其中,所述脂质体是用于治疗、预防或改善:寨卡热(或寨卡病毒疾病)、埃博拉病毒疾病、获得性免疫缺陷综合症(人免疫缺陷病毒)、stat3-响应性癌、p53-缺乏癌、病毒介导的宫颈癌(即人乳头瘤病毒)、家族性高胆固醇血症、杜氏型肌营养不良症、脊髓性肌肉萎缩、克罗恩病、或炎性疾病,特别是与细胞内粘附分子-1(icam-1)的过表达有关的肠病。

35.根据权利要求30-34中任一项所用的脂质体,其中,用于构建脂质体的所述细胞从被治疗的受试者中获得。

36.根据权利要求35所用的脂质体,其中,从干细胞系或从所述受试者的靶组织获得健康细胞,并将所述健康细胞在培养中扩增,然后用于生产装载有适于治疗临床症状的治疗性化合物的脂质体。

37.根据权利要求35所用的脂质体,其中,自所述受试者获得的细胞,可选地自患者活检获得的细胞,不包含健康细胞。

38.一种试剂盒,其包含根据权利要求27-29中任一项所述的脂质体,和使用说明书。

39.根据权利要求27-29中任一项所述的脂质体,其用在基因组编辑技术中。

40.一种基因组编辑方法,所述方法包括使根据权利要求27-29中任一项所述的脂质体装载有:(i)指导rna,和/或(ii)核酸酶或编码核酸酶的基因构建体,和将装载后的脂质体用在基因编辑治疗中。

41.根据权利要求40所述的方法,其中,所述核酸酶包含cas9或cpf1或talen或锌指核酸酶。

42.一种穿梭蛋白,其包含与蛋白激酶r(pkr)附接的减毒毒素蛋白。

43.根据权利要求42所述的穿梭蛋白,其中,所述蛋白包含基本上如seqidno:11所示的氨基酸序列或其片段或变体,或由基本上如seqidno:11所示的氨基酸序列或其片段或变体组成。


技术总结
本申请涉及脂质体、生产脂质体的方法以及使细胞衍生的脂质体装载货物分子的方法。本发明延伸到此类脂质体本身,并延伸到将这些脂质体用作细胞递送系统,用于将生物和治疗活性有效载荷分子,比如小分子、RNAi分子(如siRNA)、生物活性蛋白、基因组编辑工具(如Cas9)和药物递送至细胞中以治疗一系列疾病。还可以将脂质体用在一系列诊断和治疗诊断应用中。本发明延伸到包含此类脂质体的药物组合物,脂质体包含细胞外囊泡(EV)的群组、外泌体,以及延伸到融合蛋白。

技术研发人员:西蒙·理查德森;贝内迪塔·费龙
受保护的技术使用者:格林威治大学
技术研发日:2019.08.09
技术公布日:2021.08.20
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