血浆和血浆组分用于改善疼痛、伤口愈合和术后恢复的用途的制作方法

血浆和血浆组分用于改善疼痛、伤口愈合和术后恢复的用途
1.i.相关申请的交叉引用
2.根据35u.s.c.
§
119(e)，本申请要求2018年10月26日提交的美国临时专利申请第62/751,448号和2019年5月2日提交的美国临时专利申请第62/842,403号的优先权；其公开内容通过引用并入本文。
ii.技术领域
3.本发明涉及疾病和衰老相关疾病的预防和治疗。本发明涉及血液制品的使用，血液制品例如血浆和血浆组分，以改善和加速手术的恢复，包括与手术相关的病症和适应症的恢复。本发明还涉及血液制品的使用，以缓解慢性疼痛或神经病变和治疗与伤口愈合有关的适应症，血液制品例如血浆和血浆组分。
iii.

背景技术：

4.以下仅作为背景技术信息提供，不承认为本发明的现有技术。
5.手术经常伴随疼痛、心肺问题、感染、血栓栓塞问题和术后伤口愈合的并发症。此外，伤口愈合需要时间，无论是手术本身引起的伤口(例如切口)，还是意外、暴力或疾病引起的并随后通过手术进行治疗。这种并发症通常会随着年龄的增长而加重。手术应激反应和随后对器官功能的需求可能会引起其他并发症，手术应激反应以及随后对器官功能的需求可能会引起其他并发症，这通常是由创伤引起的内分泌代谢变化和级联反应(细胞因子、补体、花生四烯酸代谢产物、一氧化氮和游离氧自由基)激活所介导的。(kehlet h.等人,br.j.anaesthesia,78:606
‑
17(1997))。在手术应激反应中，交感神经系统被激活。(starkweather a等人,topics in pain management,32(8):1
‑
11(2017))。垂体激素分泌增加，导致通过分解代谢调动能量。这反过来导致盐和水的滞留。促肾上腺皮质激素(acth)分泌增加，导致去甲肾上腺素增多和交感神经活性增强。这导致心血管反应例如心动过速和高血压，胰高血糖素释放导致高血糖症。生长激素和皮质醇的升高也会抑制单核细胞向巨噬细胞的分化。反过来，这会干扰t细胞信号传导/组胺的产生，减少免疫细胞的迁移。(相同的)
6.目前对术后恢复的治疗包括减少术后疼痛和多模式干预。(相同的)在多种类型的手术康复中，疼痛管理是重要的，并预计会有急性疼痛出现。(pinto pr,j pain res,10:1087
‑
98(2017))。进行普通手术的患者在很大程度上会出现术后疼痛。(couceiro tc,rev bras anestesiol,59(3):314
‑
20(2009))。疼痛对临床结果也起着消极的作用，因为它会削弱愈合和恢复。相同的。髋关节和膝关节置换术特别引起慢性疼痛(例如骨关节炎)和急性疼痛。相同的。因此，无论是在住院过程中还是在家庭康复中，术后恢复中通常会使用镇痛药。
7.术后加速康复(eras)是一种多模式干预。(starkweather a,supra)。eras致力于多种手术，例如结肠直肠手术、骨科、妇科、泌尿外科、头颈癌、膀胱癌、肝疾病、直肠/盆腔疾病、结肠病理、胰十二指肠切除术、胃切除术以及肥胖症治疗和妇科肿瘤外科。相同的。作为
多模式干预，它强调：术前技术(咨询服务、液体/碳水化合物负荷；禁食期缩短)；围手术期技术(短效麻醉剂；正常体温；抗生素预防；血栓栓塞预防；预防盐/水过负荷；呕吐预防)；和术后技术(早期口服饮食；运动；非阿片类镇痛；以及出院后支持)。相同的。
8.然而，目前的治疗方法未能消除术后发病率和死亡率。多模式技术的本质是时间和资源的消耗。同时没有任何单一的技术或药物治疗可以匹配这种多模式治疗。由于这些不足，需要新的治疗方法来改善术后恢复。
iv.

技术实现要素：

9.本发明基于用于治疗影响手术恢复的症状和状况的血液制品的生产和使用，其中所述症状和状况包括例如疼痛和伤口愈合。除其他外，本发明认识到需要新的治疗方法来治疗与术后恢复相关的不良状况，并改善术后恢复。本发明的组合物来源于血液和血浆，其涉及通过使用血浆组分解决目前治疗方法的失败和不足的解决方案，所述血浆组分在治疗与术后恢复相关的不良状况中具有功效并用于改善术后恢复。
10.本发明还基于用于治疗与急性或慢性疼痛相关的症状和状况的血液制品的生产和使用。除其他外，本发明认识到需要新的治疗方法来缓解疼痛。虽然有治疗急性疼痛和慢性疼痛的方法，许多这类疗法例如阿片类镇痛药的成瘾、滥用和相关的发病率和死亡率都很高。
11.v.援引并入
12.本说明书中涉及的所有出版物和专利申请在此通过引用并入本文，并入的程度如同特定和单个指出的每个单独的出版物或专利申请是通过引用其整体并入的。
vi.附图说明
13.图1描述了慢性压迫性损伤(cci)实验。在ppf1、加巴喷丁、重组人白蛋白(rhalb)或载剂对照组，对二十三月龄的野生型小鼠在进行连续7天的脉冲式给药前24小时经由结扎施用cci或假手术。在第二周至第五周进行行为评估，并在第五周期间收集组织进行组织学检测。
14.图2是对二十二月龄的野生型小鼠施用cci的位置的图示。如图所示，在坐骨神经上进行结扎。该图改编自suter mr等人的anesthesiology res and practice,(2011)，其全部内容通过引用并入本文。
15.图3显示了根据图1所示的cci或假手术治疗的野生型小鼠的机械性冯弗雷(von frey)痛觉超敏试验数据。向对象坐骨神经衰弱的后爪施用冯弗雷细丝刺激，对疼痛行为的分析有用。在图3中测量并绘制了小鼠缩回后爪时的压力。该图显示，在cci后用ppf1治疗的小鼠比在cci后用载剂治疗的对照小鼠疼痛明显减轻(可以承受更大的压力)。相对于在cci后用载剂对照治疗的动物，假手术后用载剂治疗的动物的疼痛也明显减轻。这说明ppf1对机械性伤害感受缺陷有积极影响。
16.图4显示了如图1所示的野生型小鼠的海马组织学数据。使用双皮质素(dcx)标志物测定神经发生。接受cci手术并使用ppf1治疗的小鼠与接受载剂治疗的小鼠相比，海马体的神经发生显著增加。接受假手术加载剂的小鼠比接受cci并在术后接受载剂的小鼠有更大的神经发生趋势。因此，ppf1具有慢性神经损伤后恢复神经发生的能力。
17.图5显示了如图1所示的野生型小鼠的海马组织学数据。对cd68的表达进行量化，给予cci加载剂的小鼠海马体中cd68阳性细胞的数量明显多于给予cci加ppf1的小鼠。在cci加载剂和假手术加载剂的小鼠之间观察到相似程度的差异。这说明ppf1有助于抑制慢性神经损伤引起的神经炎症。
18.图6显示了二十二月龄的c57bl/6j小鼠的机械性冯弗雷(von frey)痛觉超敏试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图1所示的时间轴进行测试。在cci或假手术后的数周内，评估小鼠撤回后爪时的压力，并示于图6中。该图说明了在cci手术后施用ppf1的小鼠在所有评估的时间点上对机械伤害感受的耐受性均显著高于在cci后用载剂治疗的小鼠。相反，施用加巴喷丁的小鼠只在cci手术后2周时的机械伤害感受有显著改善，并在其他所有时间点的机械伤害感受与使用载剂治疗的小鼠相似。假手术小鼠在手术处理后3周和5周时对机械伤害感受的反应显著增加。总之，这些数据表明，与护理治疗标准(加巴喷丁)相比，ppf1在更长的时间中改善外周性疼痛。
19.图7显示了二十二月龄的野生型小鼠的热板试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图1所示的时间轴进行测试。本试验按照woolfe和macdonald描述的方法进行。(woolfe g.和macdonald ad,j.pharmacol.exp.ther.80:300
‑
07(1944)，其全部内容通过引用并入本文)。将热板的温度设定成55℃。将小鼠放置于透明圆筒中30分钟以使其适应。将圆筒放置在热板上并启动计时器。当首次观察到疼痛反应行为(例如舔舐后爪或后爪跳跃)时，将该时间记为潜伏期。图7显示了cci或假手术5周后的热板疼痛反应潜伏期。与进行cci加载剂治疗的对照组相比，ppf1治疗组对热板刺激的敏感性显著降低，表明ppf1具有拯救效果。而护理效果基准(加巴喷丁)与载剂的效果相似。
20.图8显示了野生型小鼠的热板试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图1所示的时间轴进行测试。图8显示了cci或假手术5周后的热板疼痛反应潜伏期。与进行cci加载剂治疗的对照组相比，ppf1治疗和rhalb的小鼠对热板刺激的敏感性显著降低。
21.图9显示了c57bl/6j小鼠的机械性冯弗雷(von frey)痛觉超敏试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图1所示的时间轴进行测试。图9说明了在cci手术后施用ppf1的小鼠在所有评估的时间点上对机械伤害感受的耐受性均显著高于在cci后用载剂治疗的小鼠。相反，在所有时间点上，施用rhalb的小鼠对机械性痛觉超敏的反应与载剂治疗的小鼠相似。
22.图10显示了接受cci或假手术的c57bl/6j小鼠中髓鞘碱性蛋白(mbp)表达的坐骨神经组织学分析数据(距离最后结扎线约1000μm)，并在如图1所示的第35天收集组织后进行分析。图10说明cci手术后施用ppf1的小鼠mbp强度显著增加，表明与用载剂治疗的动物相比，其髓鞘表达增加。与cci后用载剂治疗的小鼠相比，假手术处理的小鼠也表达出更多的mbp。
23.图11显示了接受cci或假手术的c57bl/6j小鼠中s
‑
100蛋白(由施万细胞表达)的坐骨神经组织学分析数据(距离最后结扎线约1000μm)，并在如图1所示的第35天收集组织后进行分析。图11说明cci手术后施用ppf1的小鼠s
‑
100强度显著增加，表明与用载剂治疗的动物相比，其施万细胞(外周神经中产生髓鞘的细胞)增多。与cci后用载剂治疗的小鼠相比，假手术处理的小鼠也表达出更多的s
‑
100。
24.图12是选自坐骨神经组织学分析的图像，这些图像确定了图10和11中用于量化的
位置(距离最后结扎线约1000μm)，以及c57bl/6j小鼠的s
‑
100蛋白(由施万细胞表达)和髓鞘碱性蛋白的典型强度，其中这些c57bl/6j小鼠接受了cci手术并使用载剂或ppf1治疗，并在如图1所示的第35天后用于坐骨神经组织的定性分析。
25.图13显示了接受cci或假手术的c57bl/6j小鼠的脊髓组织学分析数据(对从l4
‑
l6腰椎节段收集的脊髓组织进行分析)，并在如图1所示的第35天后收集组织进行分析。图13显示，cci手术后施用ppf1的小鼠脊髓背角内的bdnf强度显著降低，表明脊髓内小胶质细胞的活性降低。由于bdnf是一种由激活的小胶质细胞释放的促炎性细胞因子，这些发现表明ppf1减少了脊髓内疼痛状态的基本调节因子，使其水平恢复到假手术(无cci损伤)小鼠的水平。
26.图14显示了接受cci或假手术的c57bl/6j小鼠的脊髓组织学分析数据(对从l4
‑
l6腰椎节段收集的脊髓组织进行分析)，并在如图1所示的第35天后收集组织进行分析。图14显示，cci手术后施用ppf1的小鼠脊髓背角内的cd68强度显著降低，表明脊髓内小胶质细胞的活性降低。由于cd68蛋白由活化的小胶质细胞表达，这表明ppf1降低了脊髓内诱导疼痛状态的基本细胞类型的激活，使其水平恢复到假手术(无cci损伤)小鼠的水平。图13和图14所示的数据表明，ppf1在中枢调节由坐骨神经损伤引起的疼痛状态，缓解或阻止外周神经和大脑之间疼痛信号的建立，也称为中枢敏化。
27.图15是选自脊髓组织学分析的图像，这些图像确定了图14中用于量化的背角位置(对从l4
‑
l6腰椎节段收集的脊髓组织进行分析)，以及c57bl/6j小鼠的cd68蛋白(由活化的小胶质细胞表达)的典型强度，其中这些c57bl/6j小鼠接受了cci手术并使用载剂或ppf1治疗，并在如图1所示的第35天后用于脊髓组织的定性分析。
28.图16是选自脊髓组织学分析的图像，这些图像确定了c57bl/6j小鼠中图13中用于量化的背角位置(对从l4
‑
l6腰椎节段收集的脊髓组织进行分析)，以及bdnf蛋白(由激活的小胶质细胞释放的细胞因子)的典型强度，其中这些c57bl/6j小鼠接受了cci手术并使用载剂或ppf1治疗，并在如图1所示的第35天后用于脊髓组织的定性分析。
29.图17描述了慢性压迫性损伤(cci)实验。在ppf1、rhalb或载剂对照组，对二十二月龄的野生型小鼠在进行连续7天的脉冲式给药前2周经由结扎施用cci或假手术。在第二周至第七周每周进行行为评估，并在第七周收集组织进行组织学检测。
30.图18显示了c57bl/6j小鼠的机械性冯弗雷(von frey)痛觉超敏试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图17所示的时间轴进行测试。图18说明了在cci手术后两周施用ppf1的小鼠在ppf1治疗停止后一周的时间点开始对机械伤害感受的耐受性显著增加，该耐受性在整个研究期间保持不变。图18中的研究结果表明，ppf1治疗启动以纵向方式降低对机械性痛觉超敏反应敏感性的过程，因为耐受性的改善直到治疗后一周才得到证实(与仅在治疗期间提供益处的治疗方法相反，例如阿片类镇痛药)，并且持续至少28天。相反，在所有时间点上，施用rhalb的小鼠对机械性痛觉超敏的反应与载剂治疗的小鼠的反应相似。
31.图19显示了野生型小鼠的热板试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图17所示的时间轴进行测试。图19显示了cci或假手术5周后的热板疼痛反应潜伏期。与进行cci加载剂治疗的对照组相比，ppf1治疗的小鼠对热板刺激的敏感性显著降低。
32.图20显示了野生型小鼠的热板试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图17所示的时间轴进行测试。图20显示了cci或假手术7周后的热板疼痛反应潜伏期。与进行cci
加载剂治疗的对照组相比，ppf1治疗的小鼠对热板刺激的敏感性显著降低。
33.图21a和图21b是未治疗(图21a)和经ppf1治疗(图21b)的糖尿病伤口(b6.bks(d)
‑
lepr
db
/j糖尿病小鼠模型)的组织学对比。黑色条表示伤口床厚度(表皮层加颗粒层)。箭头表示伤口边界。通过伤口床厚度确定，ppf1治疗的小鼠伤口床厚度增加。因此证明ppf1改善了伤口愈合。
34.图22a和图22b是未治疗(图22a)和经ppf1治疗(图22b)的糖尿病伤口(b6.bks(d)
‑
lepr
db
/j糖尿病小鼠模型)的组织学对比。黑色条表示颗粒层。蓝色条表示表皮层。ppf1治疗的伤口表现出表皮层相对于未治疗的伤口的表皮层更厚，而ppf1治疗的伤口的颗粒层和未治疗的伤口的颗粒层则表现出更明显的差异趋势(即ppf1治疗的伤口的颗粒层相对于未治疗的伤口的颗粒层更厚)。
35.图23是图24至图28中糖尿病伤口愈合实验的总体设计。采集血液时，滴血指示测量空腹血糖水平。在第2天制造皮肤伤口，并在第1天至第7天进行静脉(iv)注射。在处死后进行组织学检查(用显微镜显示)。
36.图24显示了在第一项研究(研究1)中受伤后的数个时间点仍然开放的伤口的百分比。使用ppf1(150μl)或生理盐水对照对小鼠进行治疗7天。10天后，与生理盐水对照组相比，使用ppf1治疗的动物的开放性伤口尺寸显著降低。(**p<0.006，非配对t检验)。
37.图25显示了在第二项类似研究(研究2)中受伤后的数个时间点仍然开放的伤口的百分比。使用ppf1(150μl)或生理盐水对照对小鼠进行治疗7天。8天后，与生理盐水对照组相比，使用ppf1治疗的动物的开放性伤口尺寸显著降低。(**p<0.0018，非配对t检验)。
38.图26结合了研究1和研究2的数据，显示了受伤后11天仍处于开放状态的伤口的百分比。ppf1治疗的小鼠在11天后仍开放的伤口的百分比有统计学意义的降低。(**p<0.006，非配对样本t检验)。在第10天，经ppf1治疗的动物和经载剂治疗的动物之间的差异同样显著(**p<0.006，非配对样本t检验)。
39.图27显示了对b6 ob/ob(b6.cg
‑
lepob/j小鼠)伤口局部施用ppf1或载剂的研究结果。图27显示了每天向伤口局部施用30μl ppf1或载剂对照的研究范式。根据图10所示进行受伤处理。
40.图28显示了局部研究的结果，在治疗10天后最初伤口剩余面积的百分比。图15显示，与载剂对照相比，ppf1在10天后显著减少了剩余的开放伤口的百分比。
41.vii.发明内容
42.a.引言
43.本发明涉及确认和发现的用于治疗与术后恢复相关的不良状况和用于改善术后恢复的方法和组合物。术语“改善术后恢复”指加快对象的术后恢复，即与没有本发明的实施方案干预的情况相比，对象可能在更短的时间内可以行动或从住院病人护理中出院。术语“不良状况”指例如但不限于疼痛、心肺问题、感染、血栓栓塞问题、炎症和伤口愈合延迟引起的状况或症状。本发明的方面是本文描述的用于治疗患有术后恢复相关的不良状况的对象，以及用于改善术后治疗的方法和组合物。本文还描述了给药方案，所述给药方案引起患有术后恢复相关的不良状况的对象的改善，以及用于改善术后治疗。本文描述的方法和组合物可用于：预防术后恢复并发症；缓解术后恢复的症状或预防术后恢复并发症；加速术后恢复。本发明的方法和组合物可以在术前(手术之前)使用或施用；围手术期(手术期间)；
或术后(手术之后)。
44.本发明的另一方面是用于治疗更广泛的慢性疼痛/神经病变，而不仅仅是与术后恢复相关的慢性疼痛/神经病变。本文所述的本发明的方法和组合物可以用来治疗慢性疼痛和神经病变。“慢性疼痛和神经病变”的含义是通过主观或客观手段评估，施用了本发明的组合物的对象所感受的慢性疼痛程度被轻微地、适度地或显著地减轻。所述手段可以包括自施用的测试或由医疗技术人员施用的测试，例如，举例来说而不限于：x射线；mri、ct扫描；对象对疼痛的评估或描述；活动度；反应、肌肉力量；敏感度(例如对象移开承受压力或其他刺激的肢体需要多长时间)；炎症标志物的血液检测；肌电描记图(emg)；和神经传导速度。
45.本发明的实施方式包括使用血浆组分作为治疗方法，例如从血液分级分离过程中获得的一种或多于一种级分或流出物，所述血液分级分离过程例如是如下文所述的科恩分级分离法。本发明的实施方案包括使用血浆组分(单独地或复合地包含正常人类白蛋白、α球蛋白和β球蛋白、γ球蛋白和其他蛋白质的溶液，以下称为“血浆组分”)。本发明的另外的实施方案包括采用血浆蛋白组分(ppf)治疗。本发明的另外的实施方案包括采用人类白蛋白溶液(has)组分治疗。另外的实施方案包括采用血液分级分离过程中的流出物，如下文所述的流出物i或流出物ii/iii。附加的实施方案包含基本上除去了所有凝血因子的血浆组分，以在降低血栓形成风险的同时保留功效(例如，参见美国专利申请第62/236710号和第63/376529号，其全部内容通过引用并入本文)。
46.在详细描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定方法或组合物，当然，可以有所改变。还应该理解的是，本文使用的术语仅仅是出于描述特定实施方案的目的而非旨在限制特定实施方案，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限制。
47.在此提供本文所讨论的出版物仅是因为其公开早于本申请的申请日。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于所述出版物。此外，本文提供的出版日期可能与实际出版日期不同，实际出版日期可能需要独立确认。
48.在提供数值范围的情况下，应当理解的是，除非上下文另有明确规定，在该范围的上限和下限之间的每个中间值，直到下限单位的十分之一，也具体地被公开。在指定范围内的任何指定值或中间值和指定范围内的任何其他指定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本发明内。所述较小范围的上限值和下限值可以独立地包括在所述较小范围内或从所述较小范围内排除，包括在所述较小范围内的范围的两个极限值之一、都不或两者也包括在本发明内，以在指定范围内有任何明确排除的极限值为准。如果指定范围包含极限值之一或两者，不包含所述被包含的极限值之一或两者的范围也包括在本发明中。
49.应当指出，权利要求书可以被撰写为排除任何可选要素。因此，这种陈述旨在作为与权利要求要素的陈述或“否定式”限定的使用有关的“单独”、“仅”等排除式术语的引用基础。
50.本领域的技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施方案具有离散的部分和特征，其可以容易地与任何其他几个实施方案中的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围或精神。任何所述的方法都可以按所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
51.b.定义
52.除非另外限定，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是现在描述的是一些潜在的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开内容取代所并入出版物的任何公开内容。
53.必须注意，如在本文和所附的权利要求书中所使用的，不适用数量词包括了复数的对象，除非上下文中另有明确规定。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，提及“肽”包括提及一个或多于一个肽及本领域技术人员已知的其等同物例如多肽，如此等等。
54.在描述本发明的方法时，术语“宿主”、“对象”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指根据所公开的方法需要这种治疗的任何哺乳动物。所述哺乳动物例如包括人类、绵羊、牛、马、猪、犬、猫、非人灵长类、小鼠和大鼠。在一些实施方案中，对象是非人类哺乳动物。在一些实施方案中，对象为家畜。在其他实施方案中，对象是宠物。在一些实施方案中，对象为哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人类。其他对象可以包括家养宠物(例如狗和猫)、家畜(例如牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(例如小鼠、豚鼠和大鼠，例如在是疾病的动物模型中的)以及非人灵长类动物(例如黑猩猩和猴)。因此，本发明的对象包括但不限于哺乳动物例如人类和其他灵长类动物如黑猩猩和其他猿和猴的种；以及诸如此类，其中在特定实施方案中对象是人类。术语“对象”还旨在包括具有任何年龄、体重或其他身体特征的人或有机体，其中所述对象可以是成年人、儿童、婴儿或新生儿。
[0055]“年轻人”或“年轻个体”指时序年龄为40岁或小于40岁的个体，例如35岁或小于35岁，包括30岁或小于30岁，例如25岁或小于25岁，或22岁或小于22岁。在一些情况下，包含年轻血浆的血液制品的来源个体是10岁或小于10岁的个体，例如5岁或小于5岁，包括1岁或小于1岁。在一些情况下，对象是新生儿，血浆制品的来源为脐带，其中血浆制品是从新生儿的脐带中获取的。因此，“年轻”或“年轻个体”可以指年龄是0岁至40岁的对象，例如是0岁、1岁、5岁、10岁、15岁、20岁、25岁、30岁、35岁或40岁。在其他情况下，“年轻”或“年轻个体”可以指生物年龄(而不是时序年龄)，例如血浆未表现出年龄相对较大人群所表现出的血浆炎性细胞因子水平的个体。相反地，“年轻”或“年轻个体”可以指生物年龄(而不是时序年龄)，例如于年龄较大的个体所表现出的血浆炎性细胞因子水平相比，表现出更高的血浆炎性细胞因子水平的个体。举例来说但不作为限制，所述炎性细胞因子是嗜酸细胞活化趋化因子，年轻对象或年轻个体与老年个体之间的倍数差异至少是1.5倍。类似地，在其他炎性细胞因子中老年个体与年轻个体之间的倍数差异可用于参考生物年龄。(详见美国专利申请第13/575437号，其通过引用并入本文)。一般地，所述个体是健康的，例如，该个体在采集时没有血液系统恶性肿瘤或自身免疫性疾病。
[0056]
本文所用的“治疗”是指以下任何一种：(i)预防疾病或病症，或(ii)减轻或消除疾病或病症的症状。治疗可以预防性地(发病前)或治疗性地(发病后)作用。这种作用可以是完全或部分预防疾病或其症状的预防性作用，和/或可以是部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应的治疗性作用。因此，本文使用的术语“治疗”涵盖与哺乳动物术后恢复相关的任何状况的治疗，包括：(a)预防对象发生该状况；(b)抑制这种状况，即阻止其发生；或(c)缓解状况，即导致状况消退。治疗可以导致多种不同的身体临床表现，例如，基因表达
的调节、组织或器官恢复活力、炎症减轻等。治疗药物可以在发病前、发病期间或发病后施用。对象的治疗可以在状况的症状阶段期间以及在某些情况下在状况的症状阶段之后施用。
[0057]
包含血浆成分的血液制品。在实践对象方法时，将包含血浆成分的血液制品施用给需要的个体，例如例如患有术后状况的个体。因此，根据本发明实施方案的方法包括将包含来自个体(“供体个体”，或“供体”)的血浆成分的血液制品施用给患有术后状况的个体(“受体个体”或“受体”)。“包含血浆成分的血液制品”指来源于包含血浆的血液(例如全血、血浆或其组分)的任何制品。术语“血浆”以其常规的含义使用，指血液中淡黄色/浅黄色的液体成分，其组成为约92％的水，7％的蛋白质例如白蛋白、γ球蛋白、抗血友病因子和其他凝血因子，和1％的矿物质盐、糖、脂肪、激素和维生素。适用于对象方法使用的包含血浆的血液制品的非限制性实例包括：使用抗凝剂(例如edta、柠檬酸盐、草酸盐、肝素等)处理的全血，通过过滤全血以去除白细胞而产生的血液制品(“减白”)，由血浆除去衍生的或单采血液衍生的的血浆组成的血液制品，新鲜冷冻血浆，基本上由纯化血浆组成的血液制品和基本上由血浆组分组成的血液制品。在一些情况下，使用的血浆制品是非全血血浆制品，即该制品不是全血，即该制品缺少全血中的一种或多于一种组分例如红细胞、白细胞等，范围是至少这些成分存在于全血中。在一些情况下，血浆制品是如果不是完全无细胞的，则是大体上是无细胞的，其中在这种情况下，细胞含量可以是5体积％或少于5体积％，例如是1体积％或少于1体积％，包括0.5体积％或少于0.5体积％，其中在某些情况下，无细胞血浆组分是完全不含细胞的组合物，即其不包含细胞。
[0058]
包含血浆成分的血液制品的收集。本文描述方法的实施方案包括包含血浆成分的血液制品的施用，所述血浆成分可来源于供体，包括人类志愿者。术语“来源于人类”可用来指这样的制品。收集包含来源于供体的血浆的血液制品的方法在本领域是众所周知的。(参见，例如aabb technical manual，(mark a.fung等人,eds.,18th ed.2014)，其通过引用并入本文)。
[0059]
在一个实施方案中，通过静脉穿刺获得捐献品。在另外的实施方案中，静脉穿刺只是一次静脉穿刺。在另外的实施方案中，不采用盐水体积置换。在优选地实施方案中，使用血浆除去法获得包含血浆的血液制品。血浆除去法可以包括移除根据重量校正的体积的血浆，同时将细胞成分返回给供体。在优选的实施方案中，血浆除去过程中使用柠檬酸钠以防止细胞凝结。使用柠檬酸盐后，从受体采集血浆的体积优选地是690ml至880ml，并且优选地与受体的体重相协调。
[0060]
c.血浆组分
[0061]
在第二次世界大战期间，出现了对稳定的血浆膨胀剂的需求，其可以在战场上士兵大量失血时使用。因此，开发出了冻干血浆的制备方法。然而，由于冻干血浆的复溶需要无菌水，因此难以在战场上使用。作为替代，e.j.cohn博士建议可以使用白蛋白，并配制了可立即引入用于治疗休克的即用稳定溶液。(参见johan,current approaches to the preparation of plasma fractions in(biotechnology of blood)165(jack goldstein编辑,第一版1991))。cohn博士的纯化血浆组分的方法使用了预冷乙醇，利用其变性作用，并通过改变ph值和温度来实现分离。
[0062]
本发明所述方法的实施方案包括向对象施用血浆组分。分级分离是指将特定蛋白
质亚群从血浆中分离的过程。分级分离技术是本领域已知的技术，其依赖于cohn等人在1940年代开发出来的步骤。(e.cohn,preparation and properties of serum and plasma proteins.iv.a system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids.68j am chem soc 459(1946)，其通过引用并入本文)。该过程涉及多个步骤，每个步骤都包含特定的乙醇浓度以及ph值、温度和渗量变化，从而导致蛋白质选择性沉淀。沉淀物也可以通过离心或沉淀分离。最初的“科恩分级分离过程”涉及通过沉淀将蛋白质分离成五个组分，分别称为组分i、组分ii+iii、组分iv
‑
1、组分iv
‑
4和组分v。白蛋白是该过程中最初确定的终点(组分v)产物。根据本发明的实施方案，每个组分(或前述分离步骤的流出物)包含或可能包含可用于治疗的蛋白质组分。(参见thierry burnouf,modern plasma fractionation,21(2)transfusion medicine reviews 101(2007)；adil denizli,plasma fractionation:conventional and chromatographic methods for albumin purification,4j.biol.&chem.315,(2011)；和t.brodniewicz
‑
proba,human plasma fractionation and the impact of new technologies on the use and quality of plasma
‑
derived products,5blood reviews 245(1991),和u.s.专利第3869431号、第5110907号、第5219995号、第7531513号和第8772461号，其全部通过引用并入本文)。可以对上述实验参数进行调整，以获得特定的蛋白质组分。
[0063]
最近，分级分离已变得更加复杂，并且因此构成了本发明其他实施方案。最近复杂性的增加是通过：色谱法的引入导致从现有的组分例如冷沉淀物、冷沉淀物减少的血浆和cohn组分中离析出新的蛋白质；通过结合色谱和乙醇分级分离过程提高igg的回收率；和病毒减少/灭活/去除。(同样的)可以使用阴离子交换色谱法以在生理性ph和离子强度下捕获蛋白质。这保存了蛋白质和/或蛋白质组分的功能活性。肝素和单克隆抗体也用于亲和层析。此外，使用了凝胶过滤分级分离、盐分级分离和聚乙二醇分级分离。(hosseini m iran jbiotech,14(4):213
‑
20(2016)，其通过引用并入本文)。本领域一般技术人员应当认识到，可以调整上述的参数和技术，以获得特定需要的含血浆蛋白的组分。
[0064]
也可以基于硫酸铵进行血浆分级分离。(参见，例如，odunuga oo,biochem compounds,1:3(2013)；wingfield pt,curr protoc protein sci,appx.3(2001)，其通过引用并入本文)。除了获得特定的血液组分外，基于硫酸铵的分级分离还被用于减少血浆中丰富的蛋白质。(saha s等人,j.proteomics bioinform,5(8)(2012)，其通过引用并入本文)。
[0065]
在本发明实施方案中，血浆是在工业环境中分级分离的。冷冻血浆在1℃至4℃解冻。对解冻的血浆和分离的冷沉淀物进行连续冷冻离心。回收的冷沉淀物在
‑
30℃或低于
‑
30℃的温度下冷冻并保存。立即处理冷沉淀物减少的血浆以捕获(例如通过初级色谱法)不稳定的凝血因子，例如因子ix复合物及其组分以及蛋白酶抑制剂如抗凝血酶和c1酯酶抑制剂。后续步骤中可以使用连续离心和沉淀分离。这些技术是本领域一般技术人员已知的，例如描述于美国专利第4624780号、第5219995号、第5288853号和美国专利申请第20140343255号和第20150343025号，其全部公开内容通过引用并入本文。
[0066]
在本发明的实施方案中，所述血浆组分可以包含含有高浓度白蛋白的血浆组分。在本发明的另一个实施方案中，所述血浆组分可以包含含有高浓度igg或静脉内免疫球蛋
白(igiv)的血浆组分(例如gamunex
‑
)。在本发明的另一个实施方案中，所述血浆组分可以包含igiv血浆组分，例如gamunex
‑
其中已经通过本领域一般技术人员周知的方法充分去除了免疫球蛋白(igg)，例如，蛋白a介导的去除。(参见keshishian,h.等人,multiplexed,quantitative workflow for sensitive biomarker discovery in plasma yields novel candidates for early myocardial injury,molecular&cellular proteomics,14在2375
‑
93(2015))。在另外的实施方案中，血浆组分可以是其中基本上所有凝血因子被移除的血浆组分，以在降低血栓形成风险的同时保留组分的功效。例如，血浆组分可以是如2016年8月18日申请的美国专利第62/376529号所述的血浆组分；其全部公开内容通过引用并入本文。
[0067]
d.白蛋白制品
[0068]
对于本领域一般技术人员，白蛋白血浆制品(app)有两大类：血浆蛋白组分(ppf)和人白蛋白溶液(has)。ppf来源于比has具有更高产率但比has具有更低的最低白蛋白纯度(ppf大于83％，has大于95％)的工艺中得到的。(production of human albumin solution:a continually developing colloid,p.matejtschuk等人,british j.of anaesthesia 85(6):887
‑
95,在888(2000))。在某些情况下，ppf的白蛋白浓度是83％至95％，或者是83％和96％。白蛋白纯度可以通过电泳或其他定量分析方法例如质谱分析法来测定。此外，有人指出ppf有一个缺点，因为存在蛋白质“污染物”，例如pka。相同的。因此，ppf制剂作为白蛋白血浆制品已经不受欢迎，甚至已经从某些国家的药典中除名。相同的。与这些问题相反，本发明有益地利用了这些“污染物”。除α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白以及上述pka以外，本发明的方法利用其他蛋白质或“污染物”内的其他因子促进诸如神经发生、神经元细胞存活、改善认知或运动功能和减少神经炎症等过程。
[0069]
本领域技术人员将认识到，存在或曾经存在几种商业来源的ppf(“商用ppf制剂”)。其中包括plasma
‑
plex
tm
ppf(armour pharmaceutical co.,塔里敦,纽约州)、plasmanate
tm
ppf(grifols,克莱顿,北卡罗来纳州)、plasmatein
tm
(alpha therapeutics,洛杉矶,加利福尼亚州)和protenate
tm
ppf(baxter labs,inc.迪尔菲尔德,伊利诺伊州)。本领域技术人员还将认识到，存在或曾经存在几种商业来源的has(“商用has制剂”)。其中包括albuminar
tm
(csl behring)、alburx
tm
(csl behring)、albutein
tm
(grifols,克莱顿,北卡罗来纳州)、buminate
tm
(baxatla,inc.,班诺克本,伊利诺伊州)、flexbumin
tm
(baxalta,inc.,班诺克本,伊利诺伊州)和plasbumin
tm
(grifols,克莱顿,北卡罗来纳州)。
[0070]
1.血浆蛋白组分(人类)(ppf)
[0071]
根据美国食品药品监督管理局(“fda”)，“血浆蛋白组分(人类)”或ppf是产品的专有名称，定义为“来源于人血浆的包含白蛋白和球蛋白的无菌蛋白溶液”。(美国联邦法规“cfr”21cfr 640.90，其通过引用并入本文)。ppf的原料是从按照21cfr 640.1
‑
640.5(通过引用并入本文)规定制备的全血中重新获得的血浆，或按照21cfr 640.60
‑
640.76(通过引用并入本文)规定制备的原料血浆。
[0072]
对ppf进行测试以确定其符合21cfr 640.92(通过引用并入本文)的以下标准：
[0073]
(a)最终制品应为百分之5.0+/
‑
0.30的蛋白质溶液；和
[0074]
(b)最终制品的总蛋白应由至少百分之83的白蛋白和不超过百分之17的球蛋白组成。γ球蛋白应不超过总蛋白的百分之1。蛋白质组成的确定方法已经由食品药品管理局生
物制品评价和研究中心主任为每个制造商批准。
[0075]
本文使用的“血浆蛋白组分”或“ppf”指包含白蛋白和球蛋白的无菌蛋白质溶液，其来源于人血浆，其中白蛋白含量是至少83％，球蛋白(包括α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白)和其他血浆蛋白的含量不超过17％，并且经电泳检测γ球蛋白含量不超过1％。(hink,j.h.,jr.等人,preparation and properties of a heat
‑
treated human plasma protein fraction,vox sanguinis2(174)(1957))。ppf也可以指固体形式，其悬浮在溶剂中时具有相似的组成。总球蛋白组分可以日通过从总蛋白中提取白蛋白来测定。(busher,j.,serum albumin and globulin,clinical methods:the history,physical,and laboratory examinations,第十章,walker hk,hall wd,hurst jd编辑(1990))。
[0076]
2.白蛋白(人类)(has)
[0077]
根据fda，“白蛋白(人类)”(本文中也称为“has”)是产品的专有名称，定义为“来源于人血浆的白蛋白无菌溶液”(美国联邦法规“cfr”21cfr640.80，其通过引用并入本文)。白蛋白(人类)的原料是从按照21cfr640.1
‑
640.5(通过引用并入本文)规定制备的全血中重新获得的血浆，或按照21cfr 640.60
‑
640.76(通过引用并入本文)规定制备的原料血浆。白蛋白(人类)的其他要求列于21cfr 640.80
‑
640.84(通过引用并入本文)。
[0078]
对白蛋白(人类)进行测试以确定其符合21cfr 640.82(通过引用并入本文)的以下标准：
[0079]
(a)蛋白质浓度。最终制品应符合下列浓度之一：百分之4.0+/
‑
0.25；百分之5.0+/
‑
0.30；百分之20.0+/
‑
1.2；百分之25.0+/
‑
1.5的蛋白质溶液。
[0080]
(b)蛋白质组成。最终制品中至少百分之96的总蛋白应当是球蛋白，其确定方法已经由食品药品管理局生物制品评价和研究中心主任为每个制造商批准。
[0081]
本文使用的“白蛋白(人类)”或“has”指包含白蛋白和球蛋白的无菌蛋白质溶液，其来源于人血浆，其中白蛋白含量是至少95％，球蛋白(包括α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白)和其他血浆蛋白的含量不超过5％。has也可以指固体形式，其悬浮在溶剂中时具有相似的组成。总球蛋白组成可以通过从总蛋白中提取白蛋白来测定。
[0082]
本领域一般技术人员可以认识到，ppf和has组分也可以是冻干的或是其他固体形式。例如，这些制剂加以适当的添加剂可用于制造片剂、粉末、颗粒或胶囊。所述固体形式可通过将其溶解、悬浮或乳化于含水溶剂或非水溶剂中而配制成注射用制剂，所述非水溶剂例如是植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇；并且如果需要，还可以使用常规添加剂例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
[0083]
e.凝血因子减少的组分
[0084]
本发明另外的实施方案中使用了其中基本上所有凝血因子被移除的血浆组分，以在降低血栓形成风险的同时保留血浆组分的功效。方便的是，血液制品可以从年轻供体或年轻供体池中获得，并且可以使其不含igm，以便提供abo相容的年轻血液制品。目前，输血的血浆是abo血型匹配的，因为天然存在的a和b抗原抗体会导致输血反应。当患者接受abo血型不匹配的血浆时，igm似乎是导致输血反应的原因。将igm从血液制品或血液组分中去除有助于消除施用本发明的血液制品和血浆制品的对象的输血反应。
[0085]
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗患有与术后恢复相关的不良状况的对象的方法。所述方法包括：向对象施用来源于个体或个体池的全血的血液制品或血液
properties of a heat
‑
treated human plasma protein fraction,vox sanguinis 2(174)(1957)，其通过引用并入本文)。根据所述方法，混合物可在2℃至8℃下收集。随后血浆可在7℃离心分离，取出并在
‑
20℃保存。随后血浆可以在37℃解冻和分级分离，优选地在从
‑
20℃保存状态取出后的8小时内进行。
[0092]
血浆可以是在ph 7.2、温度
‑
2℃至
‑
2.5℃、蛋白质浓度百分之5.1至百分之5.6的条件下，使用8％乙醇从组分i中分离的。可以在降低血浆温度至
‑
2℃过程中，使用喷射器以例如450ml/分钟的速率添加冷的百分之53.3乙醇(176ml/l的血浆)和乙酸盐缓冲液(200ml的4m乙酸钠，230ml的冰醋酸，加足量h2o至1l)。组分i可以通过超速离心从流出物(流出物i)分离并去除。纤维蛋白原可以根据本领域一般技术人员周知的方法从组分i中获得。
[0093]
组分ii+iii可以是在ph＝6.8、温度
‑
6℃、蛋白质浓度百分之4.3的条件下，通过调节流出物至百分之21乙醇，从流出物i中分离的。可以在降低血浆温度至
‑
6℃过程中，使用喷射器以例如500ml/分钟的速率添加冷的百分之95乙醇(176ml/l的流出物i)和用于调节ph的10m乙酸。产生的沉淀物(组分ii+iii)可以在
‑
6℃下通过离心去除。γ球蛋白可以根据本领域一般技术人员周知的方法从组分ii+iii中获得。
[0094]
组分iv
‑
1可以是在ph＝5.2、温度
‑
6℃、蛋白质浓度百分之3的条件下，通过调节流出物至百分之19乙醇，从流出物ii+iii(“流出物ii/iii”)中分离的。在将流出物ii+iii在
‑
6℃保温6小时的同时，可使用喷射器添加水和用于调节ph的10m乙酸。沉淀组分vi
‑
1可在
‑
6℃下静置6小时，随后在相同温度下通过离心从流出物中分离。在ph＝4.65、温度
‑
7℃、蛋白质浓度百分之2.5的条件下，通过调节乙醇浓度至百分之30，可以从流出物iv
‑
1中回收稳定的血浆蛋白组分。这可以通过使用冷的酸
‑
醇(2份2m乙酸和1份百分之95乙醇)调节流出物iv
‑
1的ph值来实现。在保持
‑
7℃温度的同时，在每升已调节的流出物iv
‑
1中添加170ml的冷乙醇(95％)。允许沉淀的蛋白质静置36小时，随后在
‑
7℃下通过离心去除。
[0095]
回收的蛋白质(稳定的血浆蛋白组分)可以进行干燥(例如冷冻干燥)以去除乙醇和h2o。获得的干燥粉末可以溶解在无菌蒸馏水中，例如每千克粉末使用15升水，并使用1m naoh调节溶液ph至7.0。通过添加含有乙酰色氨酸钠、辛酸钠和nacl的无菌蒸馏水，调节至0.004m乙酰色氨酸钠、0.004m辛酸钠和0.112m钠的最终浓度，可获得百分之5的蛋白质最终浓度。最后，将溶液在10℃下过滤得到清液，随后在60℃下进行至少10小时的热处理使病原体失活。
[0096]
本领域一般技术人员应认识到，上述任何一个不同的组分和流出物可以用于本发明的方法以治疗与术后恢复相关的状况。例如但不作为限制，流出物i或流出物ii/iii可用于治疗与术后恢复相关的状况或加速术后恢复，并是本发明的实施方案。
[0097]
上述制备血浆组分和血浆蛋白组分(ppf)的方法仅是示例性的，并仅涉及本发明的实施方案。本领域一般技术人员应认识到，这些方法可以做出改变。例如，在本发明的不同实施方案和方法中，除其他外，可以调整ph、温度和乙醇浓度等以产生血浆组分和血浆蛋白组分的不同变化。在另一个实施例中，本发明的其他实施方案考虑使用纳滤以从血浆组分和血浆蛋白组分中去除/灭活病原体。
[0098]
本发明的附加实施方案中考虑使用和/或包含其他血浆组分的方法和组合物。例如，除其他外，本发明认为特定浓度的白蛋白对于治疗与术后恢复相关的状况或加速术后恢复并不关键。因此，本发明预期使用降低的白蛋白浓度的组分，例如白蛋白含量低于83％
的组分。
[0099]
h.治疗
[0100]
本文所述本发明的方法的方面包括使用包含血浆的血液制品治疗对象，其中所述血液制品例如是血浆组分，其中所述血浆组分例如是如上所述的血浆组分。实施方案包括使用包含血浆的血液制品治疗人类对象。本领域技术人员应当认识到，使用包含血浆的血液制品治疗对象的方法在本领域是公认的。举例来说但不作为限制，本发明所述方法的一个实施方案包括向对象施用新鲜冷冻血浆以治疗与术后恢复相关的状况。在一个实施方案中，所述包含血浆的血液制品是立即施用给患有术后恢复相关状况的患者，例如是在从供体采集后约12小时至48小时内施用的。这种情况下，该产品可以冷藏保存，例如是在0℃至10℃保存。在另外的实施方案中，新鲜冷冻血浆是冷冻在
‑
18℃或低于
‑
18℃的温度下保存(冷冻保存)的血浆。在施用之前，将新鲜冷冻血浆解冻，并且解冻后，在解冻过程开始后的60分钟至75分钟内施用给对象。每个对象优选接受单个单位的新鲜冷冻血浆(200ml至250ml)，新鲜冷冻血浆优选地来源于预先确定年龄范围的供体。在本发明的一个实施方案中，所述新鲜冷冻血浆是年轻个体捐献的(来源于年轻个体)。在本发明的另外的实施方案中，所述新鲜冷冻血浆是相同性别的供体捐献的(来源于相同性别的供体)。在本发明的另外的实施方案中，所述新鲜冷冻血浆是年龄是18岁至22岁的供体捐献的(来源于年龄是18岁至22岁的供体)。
[0101]
在本发明的实施方案中，本发明的组合物(例如包含血浆的血液制品，其中血液制品例如是血浆组分)是通过静脉注射施用的。本发明的组合物也可以腹膜内递送。在本发明的另外的实施方案中，本发明的组合物可以通过口服、皮下或局部递送。如本领域已知的，用于治疗伤口和促进伤口愈合的典型制剂是凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、纱布、贴片等，并且本发明的组合物可以如此配制。(参见,例如,kahn aw等人,pharmacogn mag,9(suppl 1):s6
‑
s10(2013)；美国专利申请第5641483号；美国专利申请第4885163号；美国专利申请第8313764号，其全部内容通过引用并入本文)。
[0102]
在本发明的实施方案中，包含血浆的血液制品在捐献后按血型进行筛选。在本发明的另外的实施方案中，根据21cfr 640.33的要求和fda指导文件中包含的建议，对包含血浆的血液制品进行传染病病原体筛查，其中传染病病原体例如是hiv i&ii、hbv、hcv、htlv i&ii、抗hbc。
[0103]
在本发明另外的实施方案中，对象接受血浆组分治疗。在本发明的实施方案中，血浆组分是ppf或has。在本发明另外的实施方案中，血浆组分是商用ppf制剂或商用has制剂之一。在本发明另外的实施方案中，血浆组分是衍生自特定年龄范围个体库、例如是衍生自年轻个体的ppf或has，或者是经过额外分级分离或处理的改良ppf或has组分(例如其中一种或多种特定蛋白质部分地或实质上被去除的ppf或has)。在本发明另外的实施方案中，血浆组分是已经基本去除免疫球蛋白(igg)的igiv血浆组分。被“基本去除”或其特定蛋白质如igg被“基本去除”的血液组分，是指含有少于参考制品或全血血浆中存在含量的约50％的血液组分，例如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、.25％、.1％、不可检测的水平，或这些值之间的任何整数，所述百分值使用本领域周知的标准测量方法进行测定。
[0104]
i.施用
[0105]
本文所述本发明的方法的各个方面包括使用包含血浆的血液制品治疗对象，其中所述血液制品例如是血浆或血浆组分，其中所述血浆或血浆组分例如是如上所述的血浆或血浆组分。实施方案包括使用包含血浆的血液制品治疗人类对象。本领域技术人员应当认识到，使用包含血浆的血液制品治疗对象的方法在本领域是公认的。举例来说但不作为限制，本发明所述方法的一个实施方案包括向对象施用新鲜冷冻血浆以治疗与术后恢复相关的状况。在一个实施方案中，所述包含血浆的血液制品是立即施用给患有术后恢复相关不良状况的患者的，例如是在从供体采集后约12小时至48小时内施用的。这种情况下，该产品可以冷藏保存，例如是在0℃至10℃保存。在另外的实施方案中，新鲜冷冻血浆是冷冻在
‑
18℃或低于
‑
18℃的温度下保存(冷冻保存)的血浆。在施用之前，将新鲜冷冻血浆解冻，并且解冻后，在解冻过程开始后的60分钟至75分钟内施用给对象。每个对象优选接受单个单位的新鲜冷冻血浆(200ml至250ml)，新鲜冷冻血浆优选地来源于预先确定年龄范围的供体。在本发明的一个实施方案中，所述新鲜冷冻血浆是年轻个体捐献的(来源于年轻个体)。在本发明的另外的实施方案中，所述新鲜冷冻血浆是相同性别的供体捐献的(来源于相同性别的供体)。在本发明的另外的实施方案中，所述新鲜冷冻血浆是年龄是18岁至22岁的供体捐献的(来源于年龄是18岁至22岁的供体)。
[0106]
在本发明的实施方案中，包含血浆的血液制品在捐献后按血型进行筛选。在本发明的另外的实施方案中，根据21cfr 640.33的要求和fda指导文件中包含的建议，对包含血浆的血液制品进行传染病病原体筛查，其中传染病病原体例如是hiv i&ii、hbv、hcv、htlv i&ii、抗hbc。
[0107]
在本发明另外的实施方案中，对象接受血浆组分治疗。在本发明的实施方案中，血浆组分是ppf或has。在本发明另外的实施方案中，血浆组分是商用ppf制剂或商用has制剂之一。在本发明另外的实施方案中，血浆组分是来源于特定年龄范围个体库、例如是来源于年轻个体的ppf或has，或者是经过额外分级分离或处理的改良ppf或has组分(例如其中一种或多于一种特定蛋白质部分地或基本上被去除的ppf或has)。在本发明另外的实施方案中，血浆组分是已经基本去除免疫球蛋白(igg)的igiv血浆组分。被“基本上去除”或其特定蛋白质如igg被“基本上去除”的血液组分，是指含有少于参考制品或全血血浆中存在含量的约50％的血液组分，例如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、.25％、.1％、不可检测的水平，或这些值之间的任何整数，所述值是使用本领域周知的标准测量方法进行测定的。
[0108]
本发明的实施方案包括通过向对象施用有效量的血浆或血浆组分来治疗患有术后恢复相关状况的对象。本发明的另一个实施方案包括施用有效量的血浆或血浆组分，随后监测对象的功能改善、伤口愈合、标志物存在、疼痛减轻或炎症减轻。本发明的另一个实施方案包括通过向对象施用有效量的血浆或血浆组分来治疗患有术后恢复相关状况的对象，其中在达到血浆蛋白或血浆组分蛋白的平均半衰期或中位半衰期后，相对于最近的施用剂量，以实现功能改善、伤口愈合、标志物存在、疼痛减轻或炎症减轻的方式施用血浆或血浆组分(本文中称为“脉冲式给药”或“脉冲给药”))(参见美国专利第10357513号美国专利申请第15/961618号和第62/701411号，其全部内容通过引用并入本文)。本发明的另一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案施用所述血浆或血浆组分，并且在最后一次施用日期后至少3天监测对象的功能改善或hsc标志物水平。本发明的其他实施方案包括通过
至少连续3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的给药方案施用所述血浆或血浆组分，并且在最后一次施用日期后至少3天监测对象的功能改善、伤口愈合、标志物存在、疼痛减轻或炎症减轻。本发明的其他实施方案包括通过至少连续2天的给药方案施用所述血浆或血浆组分，并且在最后一次施用日期后，当血浆或血浆组分达到平均半衰期后，监测对象的功能改善、伤口愈合、标志物存在、疼痛减轻或炎症减轻。本发明的其他实施方案包括通过连续2天至14天的给药方案施用所述血浆或血浆组分，其中每次给药之间的间隔可以是0天至3天。
[0109]
在某些情况下，根据本发明的脉冲式给药包括施用第一组剂量，例如如上所述的第一组剂量，然后是不施用的时段，例如“不给药”时段，随后施用另一次剂量或另一组剂量。在一些实施方案中，所述“不给药”时段的持续时间可变更地是7天或多于7天，例如是10天或多于10天，包括14天或多于14天，其中某些情况下所述不给药时段是15天至365天，例如是30天至90天，包括30天至60天。因此，该方法的实施方案包括非长期(即非连续)给药，例如，血浆制品的非长期施用。在一些实施方案中，脉冲式给药之后跟随不给药时段的模式根据需要会重复多次，其中在某些情况下，这种模式持续1年或长于1年，例如2年或长于两年，直至并包括对象的终生。本发明的其他实施方案包括通过至少连续5天的给药方案施用所述血浆或血浆组分，随后是2天至3天的不给药时段，然后再施用连续2天至14天。
[0110]
在生物化学上，活性成分的“有效量”或“有效剂量”是指该活性成分的剂量抑制、拮抗、减少、降低或压制约20％或多于20％，例如30％或多于30％、40％或多于40％、或50％或多于50％、在某些情况下60％或多于60％、70％或多于70％、80％或多于80％、或90％或多于90％、在某些情况下约100％的与术后恢复相关的不良状况，即使其可忽略不计，并且在某些情况下逆转与术后恢复相关的不良状况。
[0111]
j.血浆蛋白组分
[0112]
在本发明的实施方法中，将血浆组分施用于对象。在实施方案中，所述血浆组分是血浆蛋白组分(ppf)。在另外的实施方案中，ppf选自商用ppf制剂。
[0113]
在另外的实施方案中，ppf包含通过电泳检测的88％的正常人白蛋白、12％的α球蛋白和β球蛋白和不超过1％的γ球蛋白。用于本发明的实施方法的该实施方案的进一步实施方案包括，例如，该实施方案是用碳酸钠缓冲并用0.004m辛酸钠和0.004m乙酰色氨酸稳定的5％ppf溶液。在本发明的实施方法中可以使用其他的配方，包括调整溶液中ppf的百分比(例如，约1％至约10％、约10％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％)以及溶剂和稳定剂的浓度。
[0114]
k.特定供体年龄的血浆组分
[0115]
本发明的其他实施方案包括施用来源于特定年龄范围的个体的血浆的血浆蛋白组分。实施方案包括施用来源于年轻个体的血浆的pps或has。本发明的其他实施方案中，所述年轻个体是具有单个特定年龄或特定的年龄范围的。本发明另外的实施方案中，供体的平均年龄小于对象的平均年龄或者小于治疗对象的平均年龄。
[0116]
本发明的特定实施方案包括汇集来自特定年龄范围的个体的血液或血浆，并按照上述描述对血浆进行分级分离以获得血浆蛋白组分制品，例如ppf或has。在本发明替代的实施方案中，血浆蛋白组分或特定血浆蛋白组分是从符合特定年龄范围的特定个体获得的。
oncology,5(5):750,(2019))。2％至3％的创伤患者发生与压迫和创伤相关的周围神经病变，而美国有300万例创伤患者。尽管外科手术通常有效，但仍然需要新的药物。(american association for the surgery of trauma
–
trauma facts，可获得于http://www.aast.org/trauma
‑
facts；和novakcb,medscapeperipheral nerve injuries,(oct5,2018)，可获得于https://emedicine.medscape.com/article/1270360
‑
overview)。
[0122]
还发现本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分可用于治疗其他周围神经系统适应症包括糖尿病性神经病。在美国，糖尿病患者约有3000万，其中8％至26％的患者患有神经病变。(risson v等人,incidence and prevalence of painful diabetic neuropathy and postherpetic neuralgia in major 5european countries,the united states and japan,value in health(20):a339
‑
a811 psy18(2017),可获得于https://www.valueinhealthjournal.com/article/s1098
‑
3015(17)31179
‑
8/pdf)。fda批准的糖尿病性神经痛的治疗方案包括普瑞巴林、度洛西汀、氟西汀和他喷他多，许多患者对这些药物均无反应，且没有一种药物能直接治疗神经损伤。
[0123]
还发现与带状疱疹相关的周围神经病变(带状疱疹后遗神经痛)可以通过本发明的方法和产品进行治疗。带状疱疹患者中会有百分之二十会遭受带状疱疹后遗神经痛，而在美国每年有100万例。(参见https://emedicine.medscape.com/article/1143066
‑
overview#a6 https://www.cdc.gov/shingles/hcp/clinical
‑
overview.html.)加巴喷丁和普瑞巴林已被批准用于治疗这种疾病，但疼痛通常难以治疗。(sacks gm,am j manag care 19(1suppl):s207
‑
13(2013))。
[0124]
可以使用本发明的方法和组合物治疗其他周围神经病变适应症，例如复杂区域疼痛综合征和三叉神经痛。每100000人口中会发生五点五例至二十六例。它伴有严重的疼痛和残疾，对治疗的反应是多变的，这表明其需求远未满足。(complex region pain syndrome fact sheet,美国国立卫生研究院
‑
美国国立神经疾病和卒中研究所，可获得于https://www.ninds.nih.gov/disorders/patient
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caregiver
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education/fact
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sheets/com plex
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regional
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pain
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syndrome
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fact
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sheet)。每100000人中有4.2人至28.9人患有三叉神经痛。它对生活质量有重大影响，而且随着时间的推移会对治疗产生抗药性，需要患者尝试多种不同的治疗方法。(wu n等人,j pain,18(suppl4):s69,(2017))。唯一批准的治疗方法是卡马西平。因此，治疗这些患者遭受的疼痛的需求未得到满足。
[0125]
可以使用本发明的方法和组合物治疗的其他适应症包括以下示例：中枢性卒中后疼痛；多发性硬化症中枢性疼痛；外伤后头痛；代
‑
罗二氏综合征；视神经炎；线粒体视神经病；缺血性视神经病变；视神经脊髓炎；遗传性视神经病变；酒精性神经病；格林
‑
巴利综合征；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病(cidp)；多灶性运动神经病(mnn)；副肿瘤性自主神经病变；结节病相关的周围神经病变；类风湿性关节炎相关的周围神经病变；系统性红斑狼疮相关的周围神经病变；舍格伦综合征相关的周围神经病变；乳糜泻相关的周围神经病变；贝尔麻痹；莱姆病相关的周围神经病变；麻风病相关的周围神经病变；乙型肝炎相关的周围神经病变；丙型肝炎相关的周围神经病变；hiv/aids相关的周围神经病变；淀粉样变相关的周围神经病变；抗
‑
mag相关的周围神经病变；冷球蛋白血症相关的周围神经病变；poems相关的周围神经病变；中毒性周围神经病；肾病相关的周围神经病变；血管炎相关的周围神经病变；维生素和营养缺乏相关的周围神经病变；腓骨肌萎缩征(cmt)；特发性周围
神经病变；纤维肌痛；和副肿瘤性周围神经病变。
[0126]
还发现本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分可用于治疗与伤口愈合相关的适应症。作为示例而不是限制，所述伤口可以是擦伤、撕脱伤、割伤、撕裂伤和刺伤。所述适应症可以包括慢性伤口和急性伤口。作为示例而不是限制，伤口适应症包括：慢性伤口，如糖尿病溃疡、压迫溃疡、静脉性溃疡、动脉性溃疡；和急性伤口，如外科伤口、创伤性伤口和烧伤。但是任何类型的慢性伤口或急性伤口都可以用本发明的方法和组合物治疗。
[0127]
在美国，糖尿病溃疡影响了超过220万人，全球发病率是6.4％。(chun d等人,j clin med,8:748(2019))。尽管有清创术和医用敷料等几种治疗选项，但许多患者仍遭受感染并最终需要截肢，这凸显了对新疗法、特别是药物疗法的需求。
[0128]
压迫溃疡在住院患者的总发病率是1.8％，每年的病例总数是数十万。(bauer k等人,ostomy wound manage,62(11):30
‑
38(2016))。像糖尿病溃疡一样，有清创术和医用敷料等治疗选项，但许多患者会遭受感染，并且溃疡会导致死亡。
[0129]
静脉性溃疡主要发生在腿部，构成了老年人的巨大负担，发生在全世界约1％的人口中。(nelzen o,phlebolymphology,15(4)(2008))。与其他慢性溃疡相比，静脉性溃疡很难愈合，而且有明显的复发倾向。与糖尿病溃疡和压迫溃疡一样，存在清创和医用敷料等治疗选项，但它的复发凸显了对新治疗方法、特别是基于药物的治疗方法的需求。动脉性溃疡的发病率约为静脉性溃疡的四分之一。(gabriel a,vascular ulcers,(2018),可获得于https://emedicine.medscape.com/article/1298345
‑
overview#a6)。治疗选项还包括清创和医用敷料，但缺乏批准的药物制剂。
[0130]
每年大约有130万患者发生手术伤口。(参见mediwound
–
innovating solutions for wound&burn care(2019)在19可获得于http://ir.mediwound.com/static
‑
files/cd547017
‑
d1ed
‑
460e
‑
8cb2
‑
0550b1e18a29)。手术伤口通常是手术中手术刀在皮肤上造成的割伤或切口，但也可能是手术中放置引流管造成的。手术伤口的愈合是手术的关键结果。术后伤口破裂或具有筋膜破裂的伤口层分离可能成为严重的并发症。(参见hospital harm improvement resource
–
wound disruption(2016),可获得于https://www.patientsafetyinstitute.ca/en/toolsresources/hospital
‑
harm
‑
measure/do cuments/resource
‑
library/hhir％20wound％20disruption.pdf)。此外，与较年轻个体相比，较年老的患者的外科伤口愈合需要更长的时间。(gerstein ad,dermatol clin,11(4):749
‑
57(1993))。
[0131]
创伤性伤口主要是割伤、撕裂伤、刺伤或擦伤，其已对皮肤和底层组织造成损伤。创伤性伤口通常分为三类：急性伤口；割伤，和贯通伤。急性伤口是指皮肤撕破或撕裂，伤口呈锯齿状，通常含有玻璃、金属、砾石、沙子或污垢等异物。割伤是锐器穿透皮肤和底层皮下组织造成的。贯通伤是三种类型中最深也是最严重的。典型的例子是刺伤和枪弹伤。(参见traumatic wounds，可获得于https://www.woundcarecenters.org/article/wound
‑
types/traumatic
‑
wounds；和leaper dj,bmj,332(7540):532
‑
35(2006))。尽管有几种物理治疗选项(例如缝合)，但仍需要药物干预。
[0132]
据世界卫生组织估计，每年有180000人死于烧伤。发病的主要原因是非致命烧伤，包括长期住院。(https://www.who.int/news
‑
room/fact
‑
sheets/detail/burns)。典型的治疗方法包括外科手术治疗和敷料。药物治疗的重点是镇痛、控制感染、镇静、置换循环血
量、抗凝和营养。(green a等人,clinical pharmacist,2:249
‑
54(2010))。本发明的方法和组合物可填补未满足的对促进皮肤和底层组织损伤愈合的药物干预需求。
[0133]
本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分可用于在不同时间点治疗与术后恢复相关的状况和适应症。作为示例而不是限制，向对象的施用可以在术前、围手术期(外科手术期间)或术后进行。
[0134]
本发明的一个实施方案是本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分可以用来治疗疼痛。作为示例而不是限制，所述疼痛可以包括急性疼痛和慢性疼痛。本发明另外的实施方案是本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分也可以用来治疗中枢性疼痛或中枢神经病。中枢性疼痛包括中枢神经系统(cns)损伤或功能障碍引起的神经系统疾病，其中中枢神经系统(cns)包括大脑、脑干和脊髓。它可能影响身体的很大一部分，也可能局限于特定区域。疼痛可以是持续性的或者间歇性的。疼痛的程度可以是中度至重度。这种疼痛也可能受到触摸、运动、情绪和温度变化的影响。疼痛也可能在病因事件发生后立即发作，也可能延迟数月或数年。(参见central pain information page
–
national institute of neurological disorders and stroke,central pain syndrome information page,可获得于https://www.ninds.nih.gov/disorders/all
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disorders/central
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pain
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syndrome
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informatio n
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page；和colloca l等人,nat rev dis primers,3:17002(2017))。本发明另外的实施方案是使用本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分治疗：脊髓损伤(sci)；脊髓病；神经丛病；颈神经根病；坐骨神经痛(腰椎神经根病)；中枢性卒中后疼痛；多发性硬化症中枢性疼痛；外伤后头痛；代
‑
罗二氏综合征；视神经炎；线粒体视神经病；缺血性视神经病变；视神经脊髓炎；和遗传性视神经病变。
[0135]
本发明另外的实施方案是本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分也可以用来治疗外周性疼痛或周围神经病变。周围神经病变可指几种涉及周围神经系统损害的情况。已经确定了100多种周围神经病变，这些病变取决于受损的神经类型，可包括运动神经、感觉神经和自主神经。(参见central page information page
–
national institute of neurological disorders and stroke,peripheral neuropathy fact sheet,可获得于https://www.ninds.nih.gov/disorders/patient
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caregiver
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education/fact
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sheets/peri pheral
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neuropathy
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fact
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sheet；和colloca l等人,nat rev dis primers,3:17002(2017))。本发明的其他实施方案包括使用本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分治疗：腕管综合征；化疗诱导的周围神经病变；压迫和创伤；糖尿病性神经病；与带状疱疹相关的周围神经病变(带状疱疹后遗神经痛)；复杂区域疼痛综合征；三叉神经痛；酒精性神经病；格林
‑
巴利综合征；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)；多灶性运动神经病(mnn)；副肿瘤性自主神经病变；结节病相关的周围神经病变；类风湿性关节炎相关的周围神经病变；系统性红斑狼疮相关的周围神经病变；舍格伦综合征相关的周围神经病变；乳糜泻相关的周围神经病变；贝尔麻痹；莱姆病相关的周围神经病变；麻风病相关的周围神经病变；乙型肝炎相关的周围神经病变；丙型肝炎相关的周围神经病变；hiv/aids相关的周围神经病变；淀粉样变相关的周围神经病变；抗
‑
mag相关的周围神经病变；冷球蛋白血症相关的周围神经病变；poems相关的周围神经病变；中毒性周围神经病；肾病相关的周围神经病变；血管炎相关的周围神经病变；维生素和营养缺乏相关的周围神经病变；腓骨肌萎缩征(cmt)；特发性周围神经病变；纤维肌痛；和副肿瘤性周围神经病变。
[0136]
本发明的一个实施方案是本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分可以通过促进伤口愈合来治疗伤口。本发明的其他实施方案包括施用本发明的方法和包含血浆的血液制品及血浆组分治疗慢性或急性伤口。本发明的其他实施方案包括治疗：糖尿病溃疡；压迫溃疡；静脉性溃疡；动脉性溃疡；外科伤口；创伤性伤口；和烧伤。
[0137]
m.试剂、装置和试剂盒
[0138]
本发明还提供了用于实施上述一种或多于一种发放的试剂、装置及其试剂盒。本发明的试剂、设备及其试剂盒可能有很大差异。
[0139]
目标的试剂和装置包括上述关于制备包含血浆的血液制品的方法的试剂和装置，所述血液制品用于输血到需要例如抗凝剂、冷冻保护剂、缓冲剂、等渗溶液等的对象。
[0140]
试剂盒还可以包括采血袋、导管、针、离心管等。在其他实施方案中，本发明的试剂盒包括两个或多于两个血浆制品容器例如血浆蛋白组分容器，例如是三个或多于三个、四个或多于四个、五个或多于五个、包括六个或多于六个的血浆制品容器。在某些情况下，试剂盒中不同血浆制品容器的数量可以是9个或多于9个、12个或多于12个、15个或多于15个、16个或多于16个、21个或多于21个、24个或多于24个、30个或多于30个，包括36个或多于36个，例如是48个或多于48个。每个容器可具有与其相关联的识别信息，所述识别信息包括关于其中所包含的血浆制品的各种数据，该识别信息可以包括血浆制品的供体年龄、血浆制品的处理细节、血型信息等的一个或多于一个，其中血浆制品的处理细节例如血浆制品是否经过处理以去除平均分子量以上的蛋白质(例如如上所述)。在某些情况下，试剂盒中的每个容器都包含有关其中所含血浆的识别信息，其中识别信息包括关于血浆制品的供体年龄的信息，例如，识别信息提供与血浆制品供体的年龄相关的确认数据(其中该识别信息可以是供体在采集时的年龄)。在某些情况下，试剂盒中每个容器含有来自年龄基本相同的供体的血浆制品，即，所有的容器都包含来自年龄完全相同或如果不同的情况下年龄基本相同的供体的制品。年龄基本相同是指作为试剂盒中血浆制品来源的各个供体的彼此年龄差异在某些情况下是5年或小于5年，例如是4年或小于4年，如3年或小于3年，包括2年或小于2年，例如1年或小于1年，如9个月或小于9个月、6个月或小于6个月、3个月或小于3个月，包括1个月或小于1个月。识别信息可以显示在容器的任何方便的组件上，例如标签、rfid芯片等。识别信息根据需要可以是人类可读的、计算机可读的等。容器可以具有任何方便的配置。容器的体积可以改变，在某些情况下容器的体积是10ml至5000ml，例如是25ml至2500ml，例如50ml至1000ml，包括100ml至500ml。容器可以是刚性的或者柔性的，并且可以由任何方便的材料制成，例如聚合物材料，包括医用级塑料材料。在某些情况下，容器具有袋或袋状构造。除容器外，试剂盒还可以包括例如如上所述的施用装置。所述试剂盒的组件可设置在配置为容纳容器和其他试剂盒组件的任何合适的包装中，例如盒子或类似结构。
[0141]
除了以上组分之外，本发明的试剂盒还可以包括用于实行本发明方法的说明。这些说明可以以各种形式存在于本发明的试剂盒中，其中的一种或多于一种可能存在于试剂盒中。这些说明可以存在的一种形式是作为在试剂盒包装、包装插页等中的适当介质或基质上的印刷信息，例如是在上面印有信息的一张纸或几张纸。另一种方式是在其上记录了信息的计算机可读介质，例如软盘、cd、便携式闪存驱动器等。另一种可以存在的方式是可以通过使用因特网在远程站点读取信息的网站地址。试剂盒中可以存在任何方便的方式。
[0142]
n.实验实施例
[0143]
1.疼痛模型
[0144]
a)受伤前疼痛治疗
[0145]
(1)神经性神经损伤的改变
[0146]
采用慢性压迫性损伤(cci)的慢性疼痛模型来测定22月龄c57bl/6j小鼠所经历的疼痛水平，所述小鼠接受以下治疗：(1)cci后用ppf1治疗；(2)cci后用载剂治疗；或(3)假手术后用载剂治疗。使用这种模型，神经系统被调节到一种持续的高反应状态，从而在最初的损伤发生后很长时间内降低疼痛阈值。(参见，例如,safakhah,h.a.等人,journal of pain,10:1457
‑
66和suter mr等人,anesthesiology res and practice(2011)，其全部内容通过引用并入本文)。
[0147]
ppf1是一种ppf，其经电泳测定含有大约88％的正常人白蛋白(相对于总蛋白)、12％的α球蛋白和β球蛋白以及不超过1％的γ球蛋白。除特别注明外，本实施例中ppf1使用5％溶液(重量/体积，50g/l)在体内施用。ppf2是与ppf1不同批的ppf。ppf2与ppf1具有相同的蛋白含量和浓度指标。
[0148]
图1描述了cci实验的时间轴。在ppf1或载剂对照组，对二十三月龄的野生型小鼠在进行连续7天150ul/天的脉冲式给药(静脉注射尾静脉)前24小时经由结扎进行cci或假手术。在第四周进行行为评估，并在第五周收集组织进行组织学检测。
[0149]
图2是对二十三月龄的野生型小鼠施用cci的位置的图示。如图所示，在坐骨神经上进行结扎。该图改编自suter mr等人的anesthesiology res and practice,(2011)，其全部内容通过引用并入本文。
[0150]
图3显示了如图1所示的cci或假手术4周后野生型小鼠的机械性冯弗雷痛觉超敏试验数据。为了确定动物对机械压力的耐受性，通过不同厚度的冯弗雷细丝刺激受实验对象坐骨神经衰弱的后爪。在图3中测量并绘制了小鼠缩回后爪时的压力。该图说明，在cci后用ppf1治疗的小鼠比在cci后用载剂治疗的对照小鼠疼痛明显减轻(可以承受更大的压力)。用假手术治疗的动物也比在cci后用载剂治疗的动物的疼痛明显减轻。主要发现是ppf1对cci引起的机械性伤害感受缺陷有积极影响。***p<0.001在cci后用ppf1治疗相对于在cci后用载剂治疗，*p<0.05假手术载剂相对于cci载剂；单因素anova与图基事后检验法。
[0151]
图4显示了如图1所示的野生型小鼠的海马组织学数据。使用双皮质素(dcx)标志物测定神经发生。接受cci手术并使用ppf1治疗的小鼠与接受载剂治疗的小鼠相比，海马齿状回区的神经发生显著增加。接受假手术的小鼠相对于接受cci手术的小鼠趋于更强的神经发生，两组均在术后接受载剂的治疗。因此，ppf1具有慢性神经损伤后恢复神经发生的能力。*p<0.05cci后用ppf1治疗相对于cci后用载剂治疗；非配对t检验。
[0152]
图5显示了如图1所示的野生型小鼠的海马组织学数据。以cd68表达测定炎症标志物。我们研究表明，相对于cci手术后使用ppf1治疗的小鼠，接受cci手术和载剂治疗的小鼠海马中表达的cd68阳性细胞数量明显更多。ppf1治疗的动物具有与假手术组相当的炎症水平。这说明ppf1有助于减轻慢性神经损伤引起的神经炎症。*p<0.05在cci后用ppf1治疗相对于在cci后用载剂治疗，假手术载剂相对于cci载剂；单因素anova与图基事后检验法。
[0153]
图6显示了c57bl/6j小鼠的机械性冯弗雷痛觉超敏试验数据，这些小鼠接受cci或假手术，并按照图1所示的时间轴进行测试。对ppf1组和载剂对照组的二十二月龄小鼠施用连续7天150ul/天的脉冲式给药方案(静脉注射尾静脉)。另一组接受加巴喷丁，每日75mg/
kg(腹腔施用)，连续7天。所有治疗均在cci或假手术24小时后开始。为了确定动物对机械压力的耐受性，通过不同厚度的冯弗雷细丝刺激受实验对象坐骨神经衰弱的后足。在cci或假手术后的几周内，评估小鼠缩回后爪时的压力，如图6所示。该图说明了在cci手术后施用ppf1的小鼠在所有评估的时间点上对机械伤害感受的耐受性均显著高于在cci后用载剂治疗的小鼠。相反，施用加巴喷丁的小鼠只在cci手术后2周的机械伤害感受有显著改善，并在其他所有时间点的机械伤害感受与使用载剂治疗的小鼠相似。假手术小鼠在手术处理后3周和5周对机械伤害感受的反应显著增加。总之，这些数据表明，与护理治疗基准(加巴喷丁)相比，ppf1可在更长的时间中改善外周性疼痛。***,****p<0.001,p<0.0001ppf1相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。*p<0.05加巴喷丁相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。*,**p<0.05,p<0.01假手术相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。
[0154]
图7显示了来自热板试验的数据，该热板试验是针对如图1以及woolfe和macdonald所述的野生型小鼠进行的。(woolfe g.和macdonald ad,j.pharmacol.exp.ther.80:300
‑
07(1944)，其全部内容通过引用并入本文)。将热板的温度设定成55℃。将小鼠放置于透明圆筒中30分钟以使其适应。将圆筒放置在热板上并启动计时器。当首次观察到疼痛反应行为(例如舔舐后爪或后爪跳跃)时，将该时间记为潜伏期。如果没有观察到疼痛反应行为，则在预定的截止时间例如30秒时将动物移除以预防组织损伤。仅在cci手术后2周和5周对小鼠进行测试，因为已经证明反复暴露于测试会改变敏感性。图7显示了cci或假手术5周后的热板疼痛反应潜伏期。与进行cci加载剂治疗的对照组相比，ppf1治疗组对热板刺激的敏感性显著降低，表明ppf1具有拯救效果。**p<0.01假手术相对于cci手术，****p<0.0001ppf1相对于载剂治疗的cci小鼠。anova和图基事后检验法。
[0155]
(2)脊髓神经炎症的预防
[0156]
在22月龄的c57bl/6j小鼠上进行了与上述研究(如上所述)类似的独立研究。各组小鼠的治疗方法如下：(1)在cci后用ppf(ppf2)治疗；(2)在cci后用载剂治疗；(3)在cci后用重组人白蛋白(rhalb)治疗；或(4)在假手术后用载剂治疗。对ppf2组、重组人白蛋白组或载剂对照组的小鼠施用连续7天150ul/天的脉冲式给药方案(静脉注射尾静脉)。所有治疗均在cci或假手术24小时后开始。
[0157]
图8显示了来自热板试验(如上所述)的数据，该热板试验按照图1所示的时间轴在cci的三十五(35)天后进行测试。与进行cci加载剂对照治疗的对照组相比，ppf2治疗的小鼠对热板刺激的敏感性显著降低。使用重组人白蛋白治疗的小鼠与进行cci加载剂的对照组相比对热板刺激的敏感性也显著降低，但没有达到使用ppf2治疗的小鼠的降低程度。*p<0.05rhalb相对于载剂治疗的cci小鼠，***p<0.001ppf2相对于载剂治疗的cci小鼠。anova和图基事后检验法。
[0158]
图9显示了相同小鼠在cci前(起点)和cci后的不同时间间隔的机械性冯弗雷痛觉超敏试验的数据。在cci或假手术后的数周内，评估小鼠缩回后爪时的压力，如图9所示。该图说明了在cci手术后施用ppf2的小鼠在所有评估的时间点上对机械伤害感受的耐受性均显著高于在cci后用载剂或重组人白蛋白(rhalb)治疗的小鼠。这表明与载剂对照组和白蛋白对照组相比，ppf(ppf2)可在更长的时间中改善疼痛，而白蛋白是ppf的主要蛋白质成分。因此，这些作用似乎不是通过白蛋白介导的，而是通过ppf中存在的其他蛋白质介导的。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。
[0159]
图10显示了针对22月龄小鼠进行的如上所述实验的另一个类似实验中，在最后一剂ppf(ppf1)五周后，坐骨神经远端的髓鞘碱性蛋白(mbp，通过abcam,ab40390抗兔抗体检测)的相对水平。*p<0.05；***p<0.001相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。
[0160]
图11显示了这些小鼠s
‑
100施万细胞标志物的相对水平。在这两种情况下，与对照组cci小鼠相比，cci小鼠中的ppf提高了这些标志物的相对水平。这表明ppf通过增加髓鞘蛋白和s
‑
100蛋白的表达促进了坐骨神经修复机制。其还表明ppf诱导了髓鞘形成修复机制。**p<0.01；***p<0.001相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。
[0161]
图12是图10和图11中传达的数据的荧光显微镜定性表示。
[0162]
图13和图14分别显示了对在cci损伤24小时后治疗的小鼠的脊髓背角中bdnf和cd68的检测。脑源性神经营养因子(bdnf，经abcam,ab108319抗兔抗体检测)由活化的小胶质细胞分泌，并且已被证明通过突触促进和类中枢敏化机制的参与来增强脊髓伤害感受(疼痛刺激的检测)。外周损伤诱发的神经性疼痛常伴有bdnf脊髓表达增加(garraway sm等人，neural plast.article id 9857201(2016))。cd68水平(经biorad mca1957 ga抗大鼠抗体检测)也进行了测定。cd68是活化的小胶质细胞的标志物。图13和图14显示，在cci损伤后24小时进行ppf治疗会导致脊髓背角的bdnf和cd68标志物显著减少，这表明其可以防止小胶质细胞活化并阻断与神经性疼痛发展相关的有害下游事件发生。**p<0.01；***p<0.001相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。
[0163]
图15和图16分别是图13和图14中传达的数据的荧光显微图像。矩形突出显示了在l4
‑
l6腰椎节段进行分析的脊髓背角。图右侧的图像是每个图左侧矩形区域的较高倍焦度图像。
[0164]
b)受伤后十四天疼痛治疗
[0165]
图17显示了用于22月龄的c57bl/6j小鼠的方案。在cci或假手术前3天至4天，测量用于衡量机械性痛觉超敏的初始冯弗雷缩爪阈值。各组小鼠的治疗方法如下：(1)在cci后14天用ppf(ppf1)治疗；(2)在cci后14天用载剂治疗；(3)在cci后14天用重组人白蛋白(rhalb)治疗；或(4)在假手术后14天用载剂治疗。对ppf1组、重组人白蛋白组或载剂对照组的小鼠施用连续7天150ul/天的脉冲式给药方案(静脉注射尾静脉)。所有治疗均在cci或假手术后14天开始。
[0166]
图18显示了在起点、cci后14天、cci后21天、cci后28天、cci后35天、cci后42天和cci后49天的冯弗雷缩爪阈值。在第14天，除了假手术组外，其余各组均出现明显的损伤，表明损伤2周后所有cci组均出现中枢敏化。这种情况直到停止ppf治疗后7天(第28天)才会逆转，这表明在该模型中，ppf没有起到简单的镇痛作用。相反，ppf治疗产生了一种机制作用，而载剂或重组人白蛋白(rh白蛋白)没有观察到这种作用。这表明，与载剂对照组相比，ppf使得在ppf治疗前完全确定的疼痛(其必然涉及中枢成分)明显减轻。**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001相对于载剂对照；anova和图基事后检验法。
[0167]
图19和图20显示了cci术后35天(图19)和49天(图20)的热板潜伏期。两组结果都表明ppf治疗的小鼠对热板疼痛的敏感性有持续性的降低。这也支持了ppf通过一种机制作用起作用而不是简单地提供镇痛作用的观点。**p<0.01；anova和图基事后检验法。
[0168]
2.伤口愈合模型
[0169]
用糖尿病小鼠模型(b6.bks(d)
‑
lepr
db
/j)观察ppf1对伤口愈合的影响。第
‑
1天对
六周龄b6.bks(d)
‑
leprdb/j小鼠进行背部剃毛。第0天使小鼠背部的两个位置受伤。从第0天(皮肤受伤后立即开始)至第6天，小鼠接受载剂(150μl)或ppf1(150μl)的日常治疗(iv)。
[0170]
使皮肤受伤的方法如下：在皮肤受伤前一天对动物使用脱毛膏脱毛，然后用温水温柔地清洗皮肤。使用吸入用异氟醚麻醉动物，将手术部位剃毛并用聚维酮碘(“betadine”)或洗必泰防腐产品(或类似的擦洗液)和70％乙醇进行预处理。在小鼠下面放置热水加热垫(或类似的外科产品)。使用永久性标记在其背部皮肤上用直径5mm的圆圈标记两个受伤部位。用干净的镊子提起背部皮肤，并用精细的手术剪沿着标记的圆圈进行切割。使用vetbond和尼龙缝合线将直径15毫米、中央有直径6毫米切口的硅胶夹板固定在伤口周围。皮肤受伤后，给小鼠称重(初始体重)，并将其放在一个干净的家笼中，在下面放置加热垫，并放置软化的食物。将小鼠保持在加热垫上并进行监测，直至老鼠变得聪明、警觉和反应灵敏。
[0171]
术后每天评估伤口愈合情况，直至缝合线拆除。术后即刻腹腔注射丁丙诺啡并每隔12小时注射一次，一共注射三次。在术前和术后24小时腹腔注射美洛昔康。手术后将软化的食物和干净的h2o恢复凝胶放置在笼的底部。术后每日测量小鼠体重。如果小鼠术后体重下降超过1克，则施用500ul/天生理盐水。
[0172]
每日通过使用卡尺测量伤口大小以评估伤口闭合量。第10天和第14天处死小鼠。小鼠经阿佛丁(250mg/kg)深度麻醉后进行心脏穿刺，并用预填充edta的注射器采集血液样本。然后将血液/edta注入微离心管。微离心管在冰上保存，并尽快在1000g(+4℃)下离心分离15分钟以分离血浆。将每只小鼠的血浆以每小瓶100μl等分，其剩余血浆放入下一个小瓶，并在
‑
80℃储存。
[0173]
收集每只小鼠的皮肤，用4％多聚甲醛固定，然后在pbs中清洗2次，随后石蜡包埋。通过标准的组织学和生化方法，包括qrt
‑
pcr、免疫印迹、elisa和免疫组织化学，对组织进行切片或溶解，并分析炎症标志物。
[0174]
图21是未治疗(图21a)和经ppf1治疗(图21b)的糖尿病伤口(b6.bks(d)
‑
lepr
db
/j糖尿病小鼠模型)的组织学对比。黑色条表示伤口床厚度(表皮层加颗粒层)。箭头表示伤口边界。通过伤口床厚度确定，ppf1治疗的小鼠伤口床厚度增加。因此证明ppf1改善了伤口愈合。
[0175]
图22是未治疗(图22a)和经ppf1治疗(图22b)的糖尿病伤口(b6.bks(d)
‑
lepr
db
/j糖尿病小鼠模型)的组织学对比。黑色条表示颗粒层。蓝色条表示表皮层。ppf1治疗的伤口的表皮层相对于未治疗的伤口的表皮层更厚，而ppf1治疗的伤口的颗粒层和未治疗的伤口的颗粒层则表现出更明显的差异趋势(即ppf1治疗的伤口的颗粒层相对于未治疗的伤口的颗粒层更厚)。
[0176]
图23至图26显示了来自b6 ob/ob(b6.cg
‑
lepob/j小鼠)糖尿病小鼠模型的结果，评估了ppf1相对于载剂在糖尿病伤口愈合中的疗效。使用九周龄雄性b6 ob/ob小鼠。小鼠在受伤前一天称重，禁食5小时以从尾血中测定空腹血糖。将小鼠按体重、血糖水平平均分成2个不同的治疗组。在受伤方面，小鼠被剃毛，涂上脱毛膏(nair
tm
)，在背部两个部位受伤(直径5mm的切口)，然后装上浸有70％酒精的硅胶环(外周长12mm，内周长6mm)。用vectabond
tm
使硅胶环附着在开放伤口上。在每个环上缝合四针，以确保在整个实验过程中硅胶环一直附着在伤口上。将30μl的ppf1和对照直接涂于伤口上，并用一块tegaderm
tm
密封
两个伤口。通过在覆盖伤口的tegaderm
tm
内注射ppf1和对照进行日常治疗。为了对伤口进行成像，将刚刚覆盖伤口的tegaderm
tm
切掉，并用一块新的tegaderm
tm
重新密封伤口。处死时取下硅胶环，并从背面切开伤口以进行组织学检查。
[0177]
每天通过测量伤口闭合量来评估伤口愈合情况。伤口大小通过使用相机和精密尺测量。在第10天和第14天进行末期组织收集。通过标准的组织学方法，包括免疫组织化学、qrt
‑
pcr和h&e及其他特殊染色对组织进行切片或溶解，并分析炎症标志物。
[0178]
图23描述了实验的总体设计。采集血液时，滴血指示测量空腹血糖水平。在第2天制造皮肤伤口，并在第1天至第7天进行静脉注射(iv)给药。图24显示了在第一项研究(研究1)中受伤后的几个时间点仍然开放的伤口的百分比。使用ppf1(150μl)或生理盐水对照对小鼠进行治疗。10天后，与生理盐水对照组相比，使用ppf1治疗的动物的开放性伤口尺寸显著降低。(**p<0.006，非配对t检验)。
[0179]
图25显示了在第二项类似研究(研究2)中受伤后的几个时间点仍然开放的伤口的百分比。使用ppf1(150μl)或生理盐水对照对小鼠进行治疗。8天后，与生理盐水对照组相比，使用ppf1治疗的动物的开放性伤口尺寸显著降低。(**p<0.0018，非配对样本t检验)。
[0180]
图26结合了研究1和研究2的数据，显示了受伤后11天仍处于开放状态的伤口的百分比。ppf1治疗的小鼠在11天后仍开放的伤口的百分比有统计学意义的降低。(**p<0.006，非配对t检验)。在第10天，经ppf1治疗的动物和经载剂治疗的动物之间的差异同样显著(**p<0.006，非配对t检验)。
[0181]
图27和图28显示了对b6 ob/ob(b6.cg
‑
lepob/j小鼠)伤口局部施用ppf1或载剂的研究结果。图27显示了每天向伤口施用30μl局部ppf1或载剂对照的研究范式。根据图23所示进行受伤处理。图28显示了局部研究的结果，在治疗10天后最初伤口剩余的百分比。图28显示，与载剂对照相比，ppf1在10天后显著减少了剩余的开放伤口的百分比。
[0182]
在至少一些前述实施方案中，实施方案中使用的一个或多于一个要素可以互换地用于另一个实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将认识到，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有这些修改和改变都将落入所附权利要求书所限定的主题的范围内。
[0183]
本领域技术人员将理解，通常，本文中，尤其是在所附权利要求书(例如所附权利要求书的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“含有”应解释为“至少含有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。本领域的技术人员还将理解，如果引入的权利要求描述的特定数量是有意图的，则该意图将在该权利要求中被明确地描述，而在没有明确描述的情况下则无此意图。例如，为了帮助理解，本文所附权利要求可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多于一个”的使用以引入权利要求的描述。然而，这种短语的使用不应该被解释为暗示由不使用数量词引入的权利要求描述将任何包含这种引入的权利要求描述的特定权利要求限制为仅包含一个所述描述的实施方案，即使当同一权利要求包括介绍性短语“一个或多于一个”或“至少一个”以及不使用数量词(例如，不使用数量词应解释为“至少一个”或“一个或多于一个”)；对于用于引入权利要求描述时不使用数量词也是如此。另外，即使明确描述了引入权利要求描述的具体数量，本领域技术人员将认识到，这样的描述应被解释为至少是所描述的数量(例如，仅仅描述“两个描述”，而没有其他修饰时，是指至少两个描述，或两个或多于两个描
述)。此外，在使用类似于“a、b和c等中的至少一个”的惯例下，一般来说，这样的结构是为了让本领域技术人员能够理解这种惯例(例如，“具有a、b和c中至少一个的系统”将包括但不限于是只有a、只有b、只有c、a和b都有、a和c都有、b和c都有和/或a、b、c都有的系统，等等)。在使用类似于“a、b或c等中的至少一个”的惯例下，一般来说，这样的结构是为了让本领域技术人员能够理解这种惯例(例如，“具有a、b或c中至少一个的系统”将包括但不限于是只有a、只有b、只有c、a和b都有、a和c都有、b和c都有和/或a、b、c都有的系统，等等)。本领域的技术人员还将理解，事实上，无论是在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或多于两个可替代术语的任何反意连接词和/或短语都应被理解为考虑包含其中一个术语、术语之一或全部术语的可能性。例如，短语“a或b”应理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
[0184]
此外，在根据markush组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此根据markush组的任何单个成员或成员子组来描述。
[0185]
本领域技术人员将理解，对于任何和所有目的，例如提供书面描述，本文公开的所有范围还包括其任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被认为是充分描述并使同一范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。在非限制性的实例中，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言均包括所叙述的数字，并且是指随后可分解为如上所述的子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，含有1个至3个物品的组指含有1个、2个或3个物品的组。类似地，含有1个至5个物品的组指含有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，以此类推。
[0186]
尽管出于使理解清楚的目的已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，对于本领域一般技术人员，显而易见的是，可以在不背离所附权利要求书的精神或范围的前提下进行某些改变和修改。
[0187]
因此，前面所述仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管没有在本文明确描述或示出，但其体现了本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围之内。此外，本文所述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展所贡献的概念，并且应被解释为不限于具体所述的示例和条件。此外，本文中描述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实施例的所有描述意在包括其结构的和功能的等同物。此外，此类等同物预期包括目前已知的等同物和未来开发的等同物，即，开发的任何具有相同功能的元件，而无论其结构如何。此外，本文中公开的任何内容都不旨在向公众提供，无论所述公开是否在权利要求书中明确提及。
[0188]
因此，本发明的范围不旨在限于本文所示和所描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书呈现。在权利要求书中，仅当在权利要求书中的限定开始处描述确切短语“的手段”或确切短语“的步骤”时，才为权利要求书中的明确限定的援引35u.s.c.
§
112(f)或35u.s.c.
§
112(6)；如果权利要求中的限定中未使用该确切短语，则不援引35u.s.c.
§
112(f)或35u.s.c.
§
112(6)。