血浆激肽释放酶抑制剂的结晶盐的制作方法
相关申请
本申请要求于2018年11月2日申请的美国临时专利申请序列号62/754,983的优先权益；该申请的内容以引用方式并入本文中。
背景技术：
丝氨酸蛋白酶构成最大且最广泛研究的蛋白水解酶群组。它们在生理过程中的重要作用遍及如凝血、纤维蛋白溶解、补体活化、生殖、消化以及生理活性肽释放等不同领域。这些重要过程中有许多是以前体蛋白或肽中的单一肽键或若干肽键的裂解开始。连续限制性蛋白水解反应或级联涉及凝血、纤维蛋白溶解和补体活化。也可控制并扩增开始这些级联的生物信号。类似地，受控蛋白水解可通过单键裂解来使蛋白质或肽分解或灭活。
激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶亚群。在人体中，血浆激肽释放酶(klkb1)并无已知的同源物，而组织激肽释放酶相关肽酶(klk)编码一组十五种紧密相关的丝氨酸蛋白酶。血浆激肽释放酶参与涉及凝血、炎症和补体系统的内在路径的多个路径。
凝血是血液形成凝块以例如停止出血的过程。凝血的生理学有点复杂，因为它包括两个单独初始路径，这些路径汇聚成导致凝块形成的最终共同路径。在该最终共同路径中，凝血酶原转化成凝血酶，凝血酶又将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，而纤维蛋白是形成止血栓子的交联纤维蛋白聚合物的主要结构单元。在最终共同路径上游的两个初始路径中，一各路径称为接触活化或内在路径，且另一个路径称为组织因子或外在路径。
内在路径以高分子量激肽原(hmwk)、前激肽释放酶(prekallikrein)和fxii(因子xii；哈格曼因子(hagemanfactor))在胶原上形成主要复合物开始。前激肽释放酶转化为激肽释放酶，并且fxii被活化而变成fxiia。然后，fxiia将因子xi(fxi)转化为fxia，而fxia又活化因子ix(fix)，该因子与辅因子fviiia一起形成因子x酶(tenase)复合物，该复合物活化因子x(fx)得到fxa。fxa在最终共同路径内负责将凝血酶原转化为凝血酶。
前激肽释放酶是血浆激肽释放酶的无活性前体，在肝脏内合成并在血浆中结合至hmwk或以游离酶原形式循环。前激肽释放酶被活化因子xii(fxiia)裂解而释放活化的血浆激肽释放酶(pk)。活化的血浆激肽释放酶对精氨酸(优选)和赖氨酸之后的肽键展现内肽酶活性。然后，pk在反馈环路中又生成fxiia，该因子进而活化因子xi(fxi)得到fxia以连接至共同路径。尽管内在路径的初始活化是通过少量fxiia活化少量pk实现，但pk对fxii的后续反馈活化将控制内在路径的活化程度并因此控制下游凝血。hathaway，w.e.等人(1965)blood26：521-32。
活化的血浆激肽释放酶也裂解hmwk以释放有效的血管舒张肽缓激肽。它还能够裂解许多无活性前体蛋白以生成活性产物，诸如血纤维蛋白溶酶(来自血纤维蛋白溶酶原)和尿激酶(来自前尿激酶)。作为凝血调节剂的血纤维蛋白溶酶将纤维蛋白以蛋白水解方式裂解为抑制过量纤维蛋白形成的纤维蛋白降解产物。
罹患急性心肌梗塞(mi)的患者显示呈高血液凝固(促凝血)状态的临床证据。另外，此高血液凝固性(hypercoagulability)反常地在接受纤维蛋白溶解疗法的患者中加重。如通过凝血酶-抗凝血酶iii(tat)水平所测量，与在仅接受肝素的患者中观测到的高水平相比，在经历这些治疗的患者中观测到凝血酶生成增加。hoffmeister，h.m.等人(1998)circulation98：2527-33。已提出凝血酶的增加是血纤维蛋白溶酶直接活化fxii引起血纤维蛋白溶酶介导的内在路径活化的结果。
纤维蛋白溶解诱导的高血液凝固性不仅导致再阻塞比率增加，而且还可能至少部分地导致无法达成凝块(血栓)的完全纤维蛋白溶解，这是纤维蛋白溶解疗法的主要缺点(keeley，e.c.等人(2003)lancet361：13-20)。纤维蛋白溶解疗法的另一问题是伴随的颅内出血风险升高。menon，v.等人(2004)(chest126：549s-575s；fibrinolytictherapytrialists′collaborativegroup(1994)lancet343：311-22。因此，不会增加出血风险但抑制新血栓形成的辅助抗凝血剂疗法将极为有利。
血浆激肽释放酶抑制剂还具有用于治疗遗传性血管性水肿(hae)的治疗潜力。hae是严重且可能威胁生命的罕见遗传性疾病，由位于染色体11q上的c1-酯酶抑制剂(c1inh)基因的突变引起。hae是作为常染色体显性病状遗传，不过有四分之一的诊断病例由新突变引起。在欧洲，hae已被分类为罕见疾病，据估计，其患病率为1/50,000。患有hae的个体经历令人痛苦的面部、喉部、胃肠道、肢体或生殖器皮下或黏膜下水肿的反复急性发作，如果不治疗，则可能持续长达5天。发作的频率、严重性和位置可发生改变且可能威胁生命。具有窒息可能性的喉部发作造成最大风险。腹部发作尤其令人痛苦，并且常常导致探索性程序或不必要手术。面部和周边发作会引起容貌受损且使人虚弱。
hae具有许多亚型。i型hae由产生低水平c1-抑制剂的c1inh基因突变定义，而ii型hae由产生正常水平无效c1蛋白的突变定义。iii型hae具有不同的病因，由编码称为因子xii的丝氨酸蛋白酶的f12基因的突变引起。区分hae各亚型以及区分hae与其它血管性水肿的诊断标准可见于annallergyasthmalmmunol2008；100(增补版2)：s30-s40以及jallergyclinlmmunol2004；114：629-37，以引用的方式并入本文。
当前hae治疗分为两种主要类型。包括雄性素和抗纤维蛋白溶解剂在内的较早的非特异性治疗与显著副作用(特别是在女性中)相关。最新治疗是基于对疾病的分子病理学的理解，即，c1inh是人血浆中激肽释放酶的最重要的抑制剂，并且c1inh缺乏会导致激肽释放酶-缓激肽级联的不受抑制地活化，其中缓激肽是血管通透性(这是发作标志)局部增加的最重要媒介。所有当前可用的靶向疗法均通过静脉内或皮下注射施用。目前不存在针对hae的特异性靶向口服长期疗法。
因此，需要开发pk抑制剂，这些pk抑制剂可使阻塞血栓处的纤维蛋白溶解/血栓形成平衡趋向溶解，由此促进再灌注并且减弱高血液凝固性状态，从而预防血栓再形成和再阻塞血管。确切地说，形成具有特异性并能够被配制成在体内使用的血浆舒血管素抑制剂可产生一类新的治疗剂。因此，需要用于制备并配制血浆舒血管素抑制剂的改良的组合物和方法。
技术实现要素：
本发明一个方面涉及一种化合物i的结晶盐，
本发明另一方面涉及用于制备化合物i的结晶盐的方法。在这些方面中，所述方法包括a)提供化合物i于第一有机溶剂中的游离碱混合物；b)将该游离碱混合物与包含酸和第二有机溶剂的试剂溶液在足以形成包含化合物i的盐的混合物的条件下组合；以及c)使化合物i的盐自包含化合物i的盐的混合物结晶。
在某些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含化合物i的结晶盐和一种或多种药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，药物组合物可用于治疗或预防以异常血浆激肽释放酶活性为特征的病状或疾病。
附图说明
图1是化合物i·2(hcl)的x射线粉末衍射(xrpd)图。
图2是展示化合物i·2(hcl)的tg-ir分析的光谱。
图3展示在每日一次(qd)经口施用125、250和500mgqd化合物i·2(hcl)后第7日；以及在qd经口施用350mgqd化合物i·2(hcl)后第14日化合物i·2(hcl)的血浆浓度相对于时间的曲线。
具体实施方式
在某些实施方案中，本发明提供一种化合物i的结晶盐，
化合物i是wo2015/134998和美国专利申请公布第2017/0073314a1号所述的血浆激肽释放酶的强效抑制剂，这些专利的内容以引用方式并入本文中。
化合物i的结晶形式可用于调节/改善该化合物的生理化学特性，包括但不限于固态特性(例如结晶性、吸湿性、熔点或水合作用)、药物特性(例如溶解度/溶出率、稳定性或相容性)以及结晶特征(例如纯度、产率或形态)。例如，使化合物i结晶能够获取具有一致且可预测的纯度水平的化合物。另外，由结晶产生的均匀粒度使得固体结晶化合物的加工性能相对于固体非晶形式有所改善。化合物i的结晶形式还表现出有利的药物动力学特性；晶形的均匀度产生一致且可预测的药物动力学特征。
在某些实施方案中，结晶盐是盐酸盐，例如双(盐酸)盐。
在某些实施方案中，结晶盐的多形体是通过x-射线粉末衍射(xrpd)表征。θ表示以度为单位量度的衍射角。在某些实施方案中，xrpd中所用衍射计测量的衍射角是衍射角θ的两倍。因此，在某些实施方案中，本文所述的衍射图是指针对角度2θ测量的x-射线强度。
在衍射角θ或衍射角θ两倍(2θ)处的峰值可因测量所采用的xrpd仪器或条件而表现出微小测量误差。因此，在某些实施方案中，xrpd图的特征峰具有值°2θ±0.2°。在某些实施方案中，xrpd图的特征峰具有值°2θ±0.1°。在某些实施方案中，xrpd图的特征峰具有值°2θ±0.06°。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ±0.2°)值5.3、9.0和22.0处的特征峰。在某些实施方案中，化合物i的结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ)值5.3、9.0和22.0处的特征峰。
在其它实施方案中，结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ±0.2°)值5.3、9.0、19.8、21.2、22.0和23.3处的特征峰。在某些实施方案中，结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ)值5.3、9.0、19.8、21.2、22.0和23.3处的特征峰。
在其它实施方案中，结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ±0.2°)值5.3、9.0、14.3、16.2、19.8、21.2、22.0、23.3、24.6和30.3处的特征峰。在某些实施方案中，结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ)值5.3、9.0、14.3、16.2、19.8、21.2、22.0、23.3、24.6和30.3处的特征峰。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ±0.2°)值5.28、8.96和22.01处的特征峰。在某些实施方案中，化合物i的结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ)值5.28、8.96和22.01处的特征峰。
在其它实施方案中，结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ±0.2°)值5.28、8.96、19.79、21.16、22.01和23.31处的特征峰。在某些实施方案中，化合物i的结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ)值5.28、8.96、19.79、21.16、22.01和23.31处的特征峰。
在其它实施方案中，结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ±0.2°)值5.28、8.96、14.27、16.18、19.79、21.16、22.01、23.31、24.64和30.31处的特征峰。在某些实施方案中，化合物i的结晶盐在x-射线粉末衍射(xrpd)图中具有在2θ(°2θ)值5.28、8.96、14.27、16.18、19.79、21.16、22.01、23.31、24.64和30.31处的特征峰。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐具有基本上类似于图1所示xrpd图的xrpd图。
尽管结晶形式相同，但上文所述以及如图1中所示xrpd图中各峰的相对强度以及2θ值可在某些条件下改变或偏移。通过比较xrpd数据集，本领域普通技术人员应能够容易确定给定结晶形式是否与上文所述和图1所示的结晶形式相同。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐与水以1∶1的结晶盐与水摩尔比复合。在某些此类实施方案中，晶格不包含水分子。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐与水以1∶2的结晶盐与水摩尔比复合。在某些此类实施方案中，晶格不包含水分子。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐与水以1∶2.5的结晶盐与水摩尔比复合。在某些此类实施方案中，晶格不包含水分子。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐具有基本上类似于图2中所示热重-红外光谱的热重-红外光谱。
如本文所用，术语“基本上纯的”是指结晶多形体大于90％纯，这意味着其含有少于10％的任何其它化合物，包括相应的非晶形化合物或结晶盐的替代性多形体。优选地，结晶多形体大于95％纯或甚至大于98％纯。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐在xrpd图中具有在如上文所述2θ(°2θ)值处的特征峰并且为基本上纯的。例如，结晶盐形式可为至少90％纯的，优选为至少95％纯的，或更优选为至少98％纯的。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐具有基本上与图1所示xrpd图相同的xrpd图并且为基本上纯的。例如，结晶盐形式可为至少90％纯的，优选为至少95％纯的，或更优选为至少98％纯的。
制成结晶盐的方法
在某些实施方案中，本发明涉及一种用于制备化合物i的结晶盐的方法，该方法包括a)提供化合物i于第一有机溶剂中的游离碱混合物；b)将该游离碱混合物与包含酸和第二有机溶剂的试剂溶液在足以形成包含化合物i的盐的混合物的条件下组合；及c)使化合物i的盐自包含化合物i的盐的混合物结晶。
在某些实施方案中，结晶盐是盐酸盐，例如双(盐酸)盐。
在某些实施方案中，第一有机溶剂包含极性非质子性溶剂，诸如乙腈、n，n-二甲基乙酰胺(dma)、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲亚砜(dmso)、乙醚、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲基乙基酮、甲基叔丁基醚(mtbe)、n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)、四氢呋喃。优选地，极性非质子性溶剂是甲基叔丁基醚。
在某些实施方案中，第一有机溶剂进一步包含非极性溶剂。非极性溶剂包括例如苯、庚烷、己烷和甲苯。在某些实施方案中，非极性溶剂是甲苯。
在某些实施方案中，酸是盐酸。
在某些实施方案中，第二有机溶剂是极性质子性溶剂，诸如乙醇、甲醇、2-丙醇、1-丁醇、水或其任何组合。优选地，极性质子性溶剂是甲醇。
在某些实施方案中，步骤b)中形成的包含化合物i的盐的混合物是溶液。
在某些实施方案中，包含化合物i的盐的混合物是溶液，并且使该盐自该混合物结晶的步骤包括使该溶液过饱和以使化合物i自溶液沉淀。
在某些实施方案中，使包含化合物i的盐的混合物过饱和包含缓慢添加反溶剂，诸如庚烷、己烷、乙醇或与有机溶剂混溶的另一种极性或非极性液体；使该溶液冷却(在加或不加晶种于该溶液中的情况下)；减小溶液的体积；或其任何组合。在某些实施方案中，使包含化合物i的盐的混合物过饱和包含添加反溶剂、使该溶液冷却至周围温度或更低温度以及例如通过自溶液蒸发溶剂来减小溶液体积。在某些实施方案中，使溶液冷却可为被动的(例如使溶液在周围温度下静置)或主动的(例如在冰浴或冷冻器中冷却溶液)。
在某些实施方案中，制备方法进一步包括诱导结晶。该方法也可包含例如在减压下干燥晶体的步骤。在某些实施方案中，诱导沉淀或结晶包含二次成核，其中成核在种晶或与环境(结晶器壁、搅拌叶轮、音波处理等)的相互作用存在下发生。在某些实施方案中，诱导结晶包括用化合物i的盐的晶种接种溶液中。
在某些实施方案中，制备方法进一步包括例如通过过滤晶体、通过自晶体倾析出流体、或通过任何其它适合的分离技术来分离盐晶体。在其它实施方案中，制备方法进一步包括洗涤晶体。
在某些实施方案中，洗涤晶体包含用选自以下的液体洗涤：反溶剂、乙腈、乙醇、庚烷、己烷、甲醇、四氢呋喃、甲苯、水或其组合。如本文所用，“反溶剂”意指盐晶体不可溶、微溶或部分可溶的溶剂。实际上，将反溶剂添加至溶解盐晶体的溶液中将减小盐晶体在溶液中的溶解度，从而刺激盐沉淀。在某些实施方案中，用反溶剂和有机溶剂的组合洗涤晶体。在某些实施方案中，反溶剂是水，而在其它实施方案中，反溶剂是烷烃溶剂，诸如己烷或戊烷；或芳烃溶剂，诸如苯、甲苯或二甲苯。
在某些实施方案中，洗涤晶体包含用上文所述的一种溶剂或一种或多种溶剂的混合物洗涤化合物i的结晶盐。在某些实施方案中，在洗涤前冷却溶剂或溶剂混合物。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括干燥结晶盐。
本文所述的结晶盐可根据上文所述的方法制成。
药物组合物
本发明提供药物组合物，所述药物组合物各自包含一种或多种本发明的结晶盐和药学上可接受的载剂。在某些实施方案中，所述药物组合物包含一种本发明的结晶盐和药学上可接受的载剂。在某些实施方案中，所述药物组合物包含多种本发明的结晶盐和药学上可接受的载剂。
如本文所用，术语“载剂”和“药学上可接受的载剂”是指与化合物一起施用或被配制成供施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。这些药学上可接受的载剂的非限制性实例包括液体，诸如水、盐水和油；及固体，诸如阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶态二氧化硅、脲及其类似物。另外，还可使用佐剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂、调味剂和着色剂。适合药物载剂的其它实例也描述于e.w.martin所著的remington′spharmaceuticalsciences中，该文献以全文引用方式并入本文中。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物除包含本发明的化合物外，还包含至少一种额外药物活性剂。所述至少一种药物活性剂可为适用于治疗以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状的药剂。例如，所述至少一种额外药物活性剂可为抗凝剂、抗血小板剂或血栓溶解剂。
抗凝剂预防血液组分凝聚并因此预防凝块形成，例如在心房震颤中的凝块形成。抗凝剂包括但不限于肝素、华法林(warfarin)、香豆素(coumadin)、双羟香豆素、苯丙香豆素、醋硝香豆醇、双香豆素乙酯、蚂蟥素、比伐努定(bivalarutin)、直接凝血酶抑制剂以及二氢茚二酮衍生物。
抗血小板剂抑制血小板凝集并且常用于预防经历短暂缺血性发作、中风或心房震颤的患者的血栓栓塞性中风。抗血小板剂包括但不限于阿司匹林、噻吩并吡啶类衍生物(诸如噻氯匹定(ticlopodine)和氯吡格雷(clopidogrel))、双嘧达莫和苯磺唑酮，以及rgd模拟物。
血栓溶解剂溶解引起血栓栓塞现象，诸如引起中风、心肌梗塞和肺动脉血栓栓塞的凝块。血栓溶解剂包括但不限于血纤维蛋白溶酶原、a2-抗血纤维蛋白溶酶、链激酶、复合纤溶酶链激酶(antistreplase)、tnk、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(tpa)和尿激酶。组织血纤维蛋白溶酶原活化剂包括天然tpa和重组tpa，以及保留天然tpa的酶促或纤维蛋白溶解活性的修饰形式的tpa。
本发明的药物组合物可通过将一种或多种本发明的结晶盐与药学上可接受的载剂和任选地一种或多种额外药物活性剂组合来制备。
在某些实施方案中，本发明提供被配制用于预防性或治疗性治疗以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状的药物组合物。
使用方法
本发明提供这样一类化合物，所述化合物通过内在路径抑制凝血酶形成并因此减小新致病性血栓形成(血管阻塞或再阻塞)风险，并且在作为使用纤维蛋白溶解方案的辅助疗法给予时，还改善纤维蛋白溶解诱导的再灌注。可使用本发明的化合物治疗的疾病和病状包括但不限于中风、炎症、再灌注损伤、急性心肌梗塞、深静脉血栓形成、纤维蛋白溶解治疗后的病状、心绞痛、水肿、血管性水肿、遗传性血管性水肿、败血症、关节炎、出血、在体外心肺循环期间的失血、炎症性肠病、糖尿病、视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性黄斑变性、年龄相关黄斑水肿、年龄相关黄斑变性、增生性视网膜病变、神经病变、高血压、脑水肿、白蛋白分泌增加、大量白蛋白尿以及肾病。
例如，在患有血管性水肿病状的患者中，小多肽pk抑制剂dx-88(艾卡拉肽(ecallantide))减轻患有遗传性血管性水肿(hae)的患者的水肿。williams，a.等人(2003)transfus.apher.sci.29：255-8；schneider，l.等人(2007)jallergyclinimmunol.120：416-22；以及levy，j.h.等人(2006)expertopin.invest.drugs15：1077-90。缓激肽b2受体拮抗剂艾替班特(icatibant)也有效治疗hae。bork，k.等人(2007)j.allergyclin.immunol.119：1497-1503。因为血浆激肽释放酶生成缓激肽，所以预期抑制血浆激肽释放酶能抑制缓激肽的产生。
例如，在由纤维蛋白溶解治疗(例如使用组织血纤维蛋白溶酶原活化剂或链激酶的治疗)引起的凝血中，在经历纤维蛋白溶解的患者中发现较高水平的血浆激肽释放酶。hoffmeister，h.m.等人(1998)j.cardiovasc.pharmacol.31：764-72。经显示，内在路径中血纤维蛋白溶酶介导的活化发生于血浆和血液中并且在来自缺乏任何内在路径组分的个体的血浆中明显减弱。ewald，g.a.等人(1995)circulation91：28-36。
已发现，患有急性mi的个体具有较高水平的活化血浆激肽释放酶和凝血酶。hoffmeister，h.m.等人(1998)circulation98：2527-33。
dx-88在缺血性中风的动物模型中减小脑水肿、梗塞体积和神经功能缺损。storini，c.等人(2006)j.pharm.exp.ther.318：849-854。c1-抑制剂在大脑中动脉阻塞(mcao)小鼠模型中减小梗塞大小。desimoni，m.g.等人(2004)am.j.pathol.164：1857-1863；和akita，n.等人(2003)neurosurgery52：395-400)。已发现，b2受体拮抗剂减小梗塞体积、脑肿胀和中性粒细胞积聚并且在mcao动物模型中具有神经保护作用。zausinger，s.等人(2003)actaneurochir.suppl.86：205-7；lumenta，d.b.等人(2006)brainres.1069：227-34；ding-zhou，l.等人(2003)br.jpharmacol.139：1539-47。
关于在体外心肺循环(cpb)期间的失血，已发现，激肽释放酶-激肽(即接触)系统在cabg期间活化。wachtfogel，y.t.(1989)rlood73：468。在cpb期间接触系统的活化使血浆缓激肽增加多达20倍。cugno，m.等人(2006)chest120：1776-82；和campbell，d.j.等人(2001)am.j.physiol.reg.integr.comp.physiol.281：1059-70。
还发现血浆舒血管素抑制剂p8720和pksi-527在关节炎大鼠模型中减轻关节肿胀。delacadena，r.a.等人(1995)fasebj.9：446-52；fujimori，y.(1993)agentsaction39：42-8。也已发现，关节炎动物模型中的炎症伴随接触系统的活化。blais，c.jr.等人(1997)arthritisrheum.40：1327-33。
另外，已发现血浆舒血管素抑制剂p8720在炎症性肠病(ibd)的急性和慢性大鼠模型中减轻炎症。stadnicki，a.等人(1998)fasebj.12：325-33；stadnicki，a.等人(1996)dig.dis.sci.41：912-20；以及delacadena，r.a.，等人(1995)fasebj.9：446-52。接触系统在急性和慢性肠炎症期间活化。sartor，r.b.等人(1996)gastroenterology110：1467-81。已发现，b2受体拮抗剂，即抗高分子量激肽原抗体，或激肽原水平降低可减少ibd动物模型中的临床病理学。同前注；arai，y.等人(1999)dig.dis.sci.44：845-51；和keith，j.c.等人(2005)arthritisres.therapy7：r769-76。
已发现，作为pk和fxii抑制剂和生理学抑制剂(c1-抑制剂)的h-d-pro-phe-arg-氯甲基酮(cmk)可降低动物多种器官中的血管通透性并减少脂多糖(lps)诱发或细菌诱发的败血症的病变。liu，d.等人(2005)blood105：2350-5；persson，k.等人(2000)j.exp.med.192：1415-24。在用c1-抑制剂治疗的败血症患者中观测到临床改善。zeerleder，s.等人(2003)clin.diagnost.lab.immunol.10：529-35；caliezi，c.等人(2002)crit.caremed.30：1722-8；以及marx，g.等人(1999)intensivecaremed.25：1017-20。已发现，败血症的致死性病例具有较高程度的接触活化。martinez-brotons，f.等人(1987)thromb.haemost.58：709-713；和kalter，e.s.等人(1985)j.infect.dis.151：1019-27。
也已发现，prepk水平在糖尿病患者中，尤其是在患有增生性视网膜病变的患者中较高并且与果糖胺水平相关。gao，b.-b.等人(2007)naturemed.13：181-8；和kedzierska，k.等人(2005)archivesmed.res.36：539-43。还发现prepk在患有感觉运动神经病变的患者中最高。christie，m.等人(1984)thromb.haemostas.(stuttgart)52：221-3。prepk水平在糖尿病患者中升高并且与血压增加相关。prepk水平独立地与白蛋白分泌率相关，并且在出现大量白蛋白尿之糖尿病患者中升高，这表明prepk可能是进行性肾病的标记物。jaffa，a.a.等人(2003)diabetes52：1215-21。已发现，b1受体拮抗剂在用链脲佐菌素治疗的大鼠中减少血浆渗漏。lawson，s.r.等人(2005)eur.j.pharmacol.514：69-78。b1受体拮抗剂还可预防用链脲佐菌素治疗的小鼠发展血糖过多症和肾功能障碍。zuccollo，a.等人(1996)can.j.physiol.pharmacol.74：586-9。
在某些方面，本发明提供一种用作药物的化合物i的结晶盐。
在某些方面，本发明提供了治疗或预防以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状的方法。该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的化合物i的结晶盐，从而治疗或预防以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状的步骤。通过减小受试者体内的血浆激肽释放酶活性，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状得到治疗。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”意指预防受试者的疾病或病状、停止或减慢该疾病或病状的进展、或消除该疾病或病状。在一些实施方案中，术语“治疗”意指停止或减慢受试者的疾病或病状的进展、或消除该疾病或病状。在一些实施方案中，术语“治疗”意指减少受试者的疾病或病状的至少一种客观临床表现。
如本文所用，术语“有效量”是指足以引起所要生物作用的量。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以引起所要治疗作用的量。
如本文所用，术语“抑制”意指减少主观可测量的量或程度。在不同实施方案中，“抑制”意指与相关对照相比减少至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一个实施方案中，“抑制”意指减少100％，即停止或消除。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物。在不同实施方案中，受试者是小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、羊、马、牛或非人灵长类动物。在一个实施方案中，受试者是人。
或者，在某些方面，本发明提供一种用于治疗以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状的化合物i的结晶盐。
或者，在某些方面，本发明提供化合物i的结晶盐用于制备供治疗以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状用的药物的用途。
如本文所用，“以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状”是指希望减小血浆激肽释放酶活性的任何疾病或病状。例如，可能希望在激肽释放酶不适当活化或过度活化情况下减小血浆激肽释放酶活性。作为另一个实例，可能希望在高血液凝固状态情况下减小血浆激肽释放酶活性。作为另一个实例，可能希望在与血栓的存在或形成相关的组织缺血情况下减小血浆激肽释放酶活性。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状选自由以下组成的组：中风、炎症、再灌注损伤、急性心肌梗塞、深静脉血栓形成、纤维蛋白溶解治疗后的病状、心绞痛、水肿、血管性水肿、遗传性血管性水肿、败血症、关节炎、出血、在体外心肺循环期间的失血、炎症性肠病、糖尿病、视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性黄斑变性、年龄相关黄斑水肿、年龄相关黄斑变性、增生性视网膜病变、神经病变、高血压、脑水肿、白蛋白分泌增加、大量白蛋白尿以及肾病。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是血管性水肿。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是获得性血管性水肿或遗传性血管性水肿(hae)。
获得性血管性水肿(aae)(caldwelljr等人clinimmunolimmunopathol.1972；1：39-52)以若干种方式表征，包括以c1抑制剂(c1-inh)的获得性缺乏、人补体经典路径的超活化以及由不适当活化接触-激肽系统而释放的缓激肽介导的血管性水肿症状表征。aae以两种形式1型aae(通常与另一种疾病相关)和ii型aae(通常与自体免疫疾病相关)存在。aae可由许多因素引起，包括但不限于自体免疫疾病(例如抗c1inh抗体的产生)或c1inh的获得性突变。另外，化合物i的结晶盐可用于治疗血管紧张素转化酶(ace)抑制剂治疗的副作用。ace抑制剂阻断分解缓激肽的主要路径。通过使用本发明的结晶盐抑制激肽释放酶形成将减少缓激肽形成。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是遗传性血管性水肿(hae)。在某些实施方案中，遗传性血管性水肿是i型遗传性血管性水肿。或者，遗传性血管性水肿可为ii型遗传性血管性水肿。或者，遗传性血管性水肿可为iii型遗传性血管性水肿。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐被用于预防性治疗hae。在其它实施方案中，化合物i的结晶盐被用于急性治疗hae。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐被用于预防或治疗患有hae的受试者的血管性水肿发作。在某些实施方案中，化合物i的结晶盐被用作减小患有hae的受试者的血管性水肿发作频率的预防性治疗。在其它实施方案中，化合物i的结晶盐被用于治疗患有hae的受试者的急性血管性水肿发作。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是中风。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是再灌注损伤。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是急性心肌梗塞。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是出血。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状是在体外心肺循环期间的失血。
在某些实施方案中，以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状选自由以下组成的组：视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性黄斑变性、年龄相关黄斑水肿、年龄相关黄斑变性和增生性视网膜病变。
配制物、施用途径和剂量
本文所述的化合物i的结晶盐可被配制成药物组合物并以多种适合于所选施用途径，例如适于经口或肠胃外、通过静脉内、腹膜内、肌肉内、表面或皮下途径施用的形式施用给哺乳动物宿主，诸如人类患者。本发明也涵盖额外施用途径。
因此，化合物i(在本文中又称为“活性化合物”)的结晶盐可与药学上可接受的媒剂，诸如与惰性稀释剂或可吸收的可食用载剂组合以全身性施用，例如经口施用。其可包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，可压制成片剂，或可直接掺入患者膳食的食物中。关于经口治疗性施用，活性化合物可与一种或多种赋形剂组合并且以可摄取片剂、颊含片、口含片、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸等形式使用。这些组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可变化，并且宜在给定单位剂型的重量的约2％至约60％之间。这些治疗上有用的组合物中的活性化合物的量应使得获得有效剂量水平。
片剂、口含片、丸剂、胶囊等也可含有以下稀释剂和载剂：可添加黏合剂，诸如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；以及甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜糖；或调味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃味调味剂。当单位剂型是胶囊时，除以上类型的材料以外，其也可含有液体载剂，诸如植物油或聚乙二醇。多种其它材料可作为包衣存在或可存在而以其它方式修饰固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用明胶、蜡、虫胶或糖等包覆。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料以及调味剂，诸如樱桃或橙味调味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料均应为药学上可接受的并且在所用量下基本上无毒。此外，活性化合物可并入持续释放制剂和装置中。
活性化合物也可通过输注或注射以静脉内或腹膜内方式施用。活性化合物溶液可在水或生理学上可接受的水溶液中制备，任选地混有无毒表面活性剂。也可于甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯和其混合物中以及于油中制备分散液。在一般储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适用于注射或输注的药物剂型可包括含活性化合物的无菌水溶液或分散液或无菌粉末，无菌粉末适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液，任选地囊装于脂质体中。在所有情况下，最终剂型均应在制造和储存条件下为无菌、流体且稳定的。液体载剂或媒剂可为包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油或无毒甘油酯，及其适合混合物的溶剂或液体分散介质。适当流动性可例如通过形成脂质体、在分散液的情况下通过维持所需粒度或通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在这些组合物中使用延迟吸收的试剂，例如使用单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液通过将所需量的活性化合物与所需的在上文列举的多种其它成分一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可包括真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术产生活性化合物加上存在于先前无菌过滤的溶液中的任何额外所要成分的粉末。
关于表面施用，化合物i的结晶盐可以纯形式应用，即当这些盐是以液体制备时。然而，一般来说，希望将其与皮肤学上可接受的固体或液体载剂组合以组合物或配制物形式施用至皮肤。
有用的固体载剂包括精细分散的固体，诸如滑石、黏土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载剂包括水、醇或二醇、或水-醇/二醇混合物，其中本发明的结晶盐可以有效水平溶解或分散，任选地借助于无毒表面活性剂进行溶解或分散。可添加诸如芳香剂和额外抗微生物剂之类佐剂以优化针对既定用途的特性。所得液体组合物可自吸收垫施加，用于浸渍绷带和其它敷料，或使用泵型或气雾剂喷雾器喷洒于受影响区域上。
增稠剂，诸如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性的纤维素或改性的矿物材料，也可与液体载剂一起形成直接施加于使用者的皮肤的可涂敷糊剂、凝胶、软膏、皂类等。
可用于将本发明的结晶盐递送至皮肤的有用皮肤病学组合物的实例是本领域中已知的；例如，参见jacquet等人(美国专利第4,608,392号；以引用方式并入本文)、geria(美国专利第4,992,478号；以引用方式并入本文)、smith等人(美国专利第4,559,157号；以引用方式并入本文)以及wortzman(美国专利第4,820,508号；以引用方式并入本文)。
化合物i的结晶盐的有用剂量可至少部分通过在动物模型中比较其体外活性与体内活性来确定。用于将小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人类的方法是本领域中已知的；例如，参见美国专利第4,938,949号(以引用方式并入本文)。
用于治疗所需的化合物i的结晶盐的量不仅将随所选特定结晶盐而变化，而且还将随施用途径、所治疗的病状的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终将由巡诊医师或临床医师判断。
然而，一般而言，适合剂量的范围将为每日每公斤接受者体重0.5至约100mg，例如每日每公斤体重约3至约90mg、每日每公斤体重约6至约75mg、每日每公斤体重约10至约60mg、或每日每公斤体重约15至约50mg。
化合物i的结晶盐宜配制为单位剂型；例如每单位剂型含有5至1000mg、10至750mg、50至500mg、75mg至350mg、75mg至300mg、75mg至250mg、75mg至200mg、75mg至175mg、75mg至150mg、75mg至125mg、100mg至750mg、100mg至500mg、100mg至350mg、100mg至300mg、100mg至250mg、100mg至200mg、100mg至175mg、100mg至150mg、100mg至125mg、125mg至350mg、125mg至300mg、125mg至250mg、125mg至200mg、125mg至175mg、125mg至150mg，包括例如5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg以及在以上单位剂量范围内的其它此类单位剂量的活性化合物。在一个实施方案中，本发明提供一种组合物，该组合物包含配制成此单位剂型的化合物i的结晶盐。所要剂量宜以单次剂量提供或以适当时间间隔施用的分次剂量形式，例如以每日两次、三次、四次或更多次子剂量形式提供。子剂量自身可进一步分成例如多次不连续宽松间隔的施用。
化合物i的结晶盐也可与其它治疗剂，例如可用于治疗或预防缺血、失血或再灌注损伤的其它药剂组合施用。
其它递送系统可包括定时释放、延迟释放或持续释放递送系统，诸如本领域中众所周知的。这些系统可避免重复施用活性化合物，从而为受试者和医师增加便利。许多类型的释放递送系统都是可用的并且是本领域普通技术人员众所周知的。使用长期持续释放植入物可能是合意的。如本文所用，长期释放意指递送系统或植入物被构造和布置成递送治疗水平的活性化合物至少30日且优选地60日。
在某些实施方案中，化合物i的结晶盐被配制成供眼内施用，例如直接注射或插入眼内医疗装置内或与该装置结合。
化合物i的结晶盐可被配制用于沉积到医疗装置中，该医疗装置可包括多种常规移植物、支架(包括支架移植物)、导管、球囊、篮或其它可部署或永久性植入体腔内的装置中的任一种。作为一个特定实例，将希望装置和方法可将本发明的结晶盐递送至已通过介入技术治疗的身体区域。
在示范性实施方案中，化合物i的结晶盐可沉积于医疗装置，诸如支架内，并且被递送至治疗部位以治疗身体一部分。
支架已被用作治疗剂(即，药物)的递送媒剂。血管内支架一般永久性植入冠状或周边血管内。支架设计包括美国专利第4,733,655号(palmaz)、美国专利第4,800,882号(gianturco)或美国专利第4,886,062号(wiktor)中的设计。这些设计包括金属和聚合物支架，以及自扩张式和球囊扩张式支架。支架也可用于将药物递送于与血管接触的部位，例如，如美国专利第5,102,417号(palmaz)、美国专利第5,419,760号(narciso，jr.)、美国专利第5,429,634号(narciso，jr.)以及国际专利申请第wo91/12779号(medtronic，inc.)和第wo90/13332号(cedars-sanaimedicalcenter)中所公开的那些。
术语“沉积”意指活性化合物被涂覆、吸附、放置或通过本领域中已知的方法以其它方式并入该装置中。例如，化合物可包埋于医疗装置内且自其释放(“基质型”)，或被涂覆或跨越医疗装置的聚合材料包围并通过聚合物材料释放(“储库型”)。在后一实例中，化合物可使用本领域已知的用于产生这些材料的一种或多种技术截留在聚合物材料内或与聚合物材料偶合。在其它配制物中，化合物无需涂覆即可连接至医疗装置表面，例如通过可拆卸结合，并且随时间释放，或可通过主动的机械或化学方法移除。在其它配制物中，化合物可呈在植入部位提供化合物的永久固定的形式。
在某些实施方案中，活性化合物可在医疗装置(诸如支架)的生物相容性涂层形成期间并入聚合物组合物中。由这些组分产生的涂层典型地是均匀的并且可用于涂覆设计用于植入的许多装置。
取决于所要释放速率或所要聚合物稳定性程度，聚合物可为生物稳定性聚合物或生物可吸收聚合物，但对于此实施方案而言，生物可吸收聚合物往往是优选的，因为与生物稳定性聚合物不同，它在植入后将不会长期存在以免引起任何不良的长期局部反应。可使用的生物可吸收聚合物包括但不限于聚(l-乳酸)、聚己内酯、聚乙交酯(pga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plla/pga)、聚(羟基丁酸酯)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)、聚二噁烷酮、聚原酸酯、聚酐、聚(乙醇酸)、聚(d-乳酸)、聚(l-乳酸)、聚(d，l-乳酸)、聚(d，l-丙交酯)(pla)、聚(l-丙交酯)(plla)、聚(乙醇酸-共-三亚甲基碳酸酯)(pga/ptmc)、聚氧乙烯(peo)、聚二噁烷酮(pds)、聚磷酸酯、聚磷酸酯氨酯、聚(氨基酸)、氰基丙烯酸酯、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(亚氨基碳酸酯)、共聚(醚-酯)(例如peo/pla)、聚草酸亚烷基酯、聚膦腈和生物分子(诸如纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维素、淀粉、胶原和透明质酸)、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯、水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物，以及本领域中已知的其它适合生物可吸收聚合物。此外，也可使用具有相对较低的慢性组织反应的生物稳定性聚合物，诸如聚氨酯、硅酮和聚酯，并且如果其它聚合物可在医疗装置上溶解并固化或聚合，则也可使用其它聚合物，诸如聚烯烃、聚异丁烯、和乙烯-α-烯烃共聚物；丙烯酸系聚合物和共聚物；乙烯基卤化物聚合物和共聚物，诸如聚乙烯氯；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醚，诸如聚乙烯甲基醚；聚偏二卤乙烯，诸如聚偏二氟乙烯和聚偏二氯乙烯；聚丙烯腈；聚乙烯酮；聚乙烯芳族烃，诸如聚苯乙烯；聚乙烯酯，诸如聚乙酸乙烯酯；乙烯基单体彼此以及与烯烃的共聚物，诸如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙腈-苯乙烯共聚物、abs树脂和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；吡喃共聚物；聚羟基-丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚；聚羟基乙基-天冬酰胺-苯酚；被棕榈酰基残基取代的聚氧乙烯-聚赖氨酸；聚酰胺，诸如尼龙66和聚己内酰胺；烷基化树脂、聚碳酸酯；聚氧亚甲基；聚酰亚胺；聚醚；环氧树脂；聚氨酯；嫘萦；嫘萦-三乙酸酯；纤维素、乙酸纤维素、丁酸纤维素；乙酸丁酸纤维素；赛璐玢(cellophane)；硝酸纤维素；丙酸纤维素；纤维素醚；以及羧甲基纤维素。
聚合物和半透性聚合物基质可成形为成型制品，诸如阀、支架、管、假体等。
在本发明的某些实施方案中，化合物i的结晶盐偶合至成形为支架或支架-移植物装置的聚合物或半透性聚合物基质。
通常，聚合物通过旋涂、浸涂或喷雾施加至可植入装置表面。本领域中已知的额外方法也可用于此目的。喷洒方法包括传统方法以及使用喷墨型施配器进行的微沉积技术。另外，聚合物可使用光刻图形技术沉积在可植入装置上以将聚合物仅置于该装置的特定部分上。装置的这一涂层在该装置周围提供均匀层，由此允许改善不同分析物扩散穿过装置涂层。
在本发明的某些实施方案中，活性化合物被配制用于自聚合物涂层释放到放置医疗装置的环境中。优选地，使用若干种众所周知的涉及聚合物载剂或层控制洗脱的技术中的至少一种，以受控方式在较长时段(例如数月)内释放化合物。这些技术中有一些描述于美国专利申请2004/0243225a1中，该专利的完整公开内容全文并入本文。
此外，如例如以全文并入本文中的美国专利第6,770,729号所述，聚合物组合物的试剂和反应条件可被操纵，以使得能控制活性化合物自聚合物涂层释放。例如，可调节一个或多个聚合物涂层的扩散系数以控制化合物自聚合物涂层释放。在此方案的变化形式中，可控制一个或多个聚合物涂层的扩散系数，以调节存在于放置医疗装置的环境中的分析物(例如促进聚合物某一部分分解或水解的分析物)接近聚合物组合物内的一种或多种组分的能力(并且例如由此调节化合物自聚合物涂层释放)。本发明的另一个实施方案包括具有多个聚合物涂层的装置，各涂层具有多个扩散系数。在本发明的这些实施方案中，可通过多个聚合物涂层调节活性化合物自聚合物涂层的释放。
在本发明的另一个实施方案中，通过调节聚合物组合物的一种或多种特性，诸如一种或多种内源性或外源性化合物的存在，或替代地，调节聚合物组合物的ph值来控制活性化合物自聚合物涂层的释放。例如，某些聚合物组合物可被设计成响应于聚合物组合物的ph值减小而释放化合物。
试剂盒
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包含化合物i的结晶盐、至少一种其它治疗剂、包装材料以及关于向哺乳动物施用化合物i的结晶盐和一种或多种其它治疗剂以治疗或预防以异常血浆激肽释放酶活性为特征的疾病或病状的说明书。在一个实施方案中，哺乳动物是人。
实施例
材料和方法
x射线粉末衍射
使用panalyticalx′pertprompd衍射计，使用以optix长路径、细焦点源产生的cu辐射的入射束收集xrpd图。使用椭圆分级多层镜使cukαx射线聚焦穿过试样并到达检测器上。在分析前，分析硅试样(nistsrm640e)以证实所观测的si111峰的位置与nist验证的位置一致。将样品的试样夹在3μm厚的膜之间并以透射几何学分析。使用波束阻挡、短防散射器展延部和防散射器刀式涂布机来使空气产生的背景最小化。使用针对入射束和衍射束的索勒狭缝(sollerslit)使来自轴向发散的增宽最小化。使用位于距离试样240mm处的扫描位置敏感性检测器(x′celerator)和datacollector软件v.2.2b来收集衍射图。
热重分析
使用具有ir炉的tainstrumentsdiscovery热重分析仪进行tg分析。使用镍和alumeltm进行温度校准。在铝盘上放置各样品。气密密封该样品，将盖钻孔，然后插入到tg炉中。将炉在氮气下加热。在热分析图页眉中记录采集扫描速率，而加热范围可由个别图确定。
红外(ir)光谱学
在与配备ever-glo中/远红外光源、溴化钾(kbr)分束器、和碲镉汞(mct-a)检测器的magna-ir
实施例1：外消旋化合物54e的合成方案
根据wo2015/134998和美国专利申请公布第2017/0073314a1号(二者均以引用地方式并入)重现
1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(54e)的制备
步骤1：3-((3-氨基-4-氟苯基)(羟基)甲基)苯甲腈(54b)的制备
向冷却至0℃的3-甲酰基苯甲腈(54a)(29g，217mmol)于四氢呋喃(200ml)中的溶液中添加新鲜制备的格里纳试剂(grignardreagent)(52c)(245ml，221mmol，约0.9m于thf中)，在0℃下搅拌1小时，并在室温下搅拌18小时。将反应混合物用1nhcl(水溶液440ml)淬灭，搅拌3小时，用naoh(2n，水溶液)中和至ph＝约8。用乙酸乙酯(600，300ml)萃取反应混合物。将合并的萃取物用盐水(120ml)洗涤，经mgso4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过快速柱色谱[硅胶，用己烷/乙酸乙酯(1∶0至1∶1)洗脱]纯化粗产物，以得到呈棕色胶状物的3-((3-氨基-4-氟苯基)(羟基)甲基)苯甲腈(54b)(36.28g)，其按原样用于下一个步骤；ms(es+)265.3(m+23)。
步骤2：3-(5-(5-((3-氰基苯基)(羟基)甲基)-2-氟苯基氨甲酰基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基)苄基氨基甲酸叔丁酯(54c)的制备
向3-((3-氨基-4-氟苯基)(羟基)甲基)苯甲腈(54b)(24.682g，102mmol)于dmf(480ml)中的溶液中添加1-(3-((叔丁氧基羰基氨基)甲基)苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酸(10d)(35.0g，91mmol)、n-乙基-n-异丙基丙烷-2-胺(132ml，758mmol)、溴代三吡咯烷-1-基磷六氟磷酸盐(v)(pybrop，42.8g，91mmol)，并在室温下搅拌19小时。将反应混合物用乙酸乙酯(1000ml)稀释，用水(500，400ml)、盐水(400ml)洗涤，经mgso4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过快速柱色谱[硅胶，用己烷/乙酸乙酯(1∶0至1∶1)洗脱]纯化粗产物，以得到呈黄色固体的3-(5-(5-((3-氰基苯基)(羟基)甲基)-2-氟苯基氨甲酰基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基)苄基氨基甲酸叔丁酯(54c)(4.583g，两个步骤为5％)；1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ10.57(s，1h)，7.81(t，j＝1.7hz，1h)，7.73-7.66(m，2h)，7.64-7.19(m，10h)，6.25(d，j＝4.0hz，1h)，5.78(d，j＝4.0hz，1h)，4.19(d，j＝6.1hz，2h)，1.37(s，9h)；19fnmr(282mhz，dmso-d6)δ-60.81，-123.09；ms(es+)632.3(m+23)。
步骤3：3-(5-(5-((3-氰基苯基)(环丙基甲基氨基)甲基)-2-氟苯基氨甲酰基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基)苄基氨基甲酸叔丁酯(54d)的制备
在0℃下向3-(5-(5-((3-氰基苯基)(羟基)甲基)-2-氟苯基氨甲酰基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基)苄基氨基甲酸叔丁酯(54c)(1.333g，2.187mmol)于二氯甲烷(40ml)中的溶液中添加亚硫酰氯(0.340ml，4.59mmol)并在2小时内升温至室温。将反应混合物用三乙胺(2.0ml，14.35mmol)淬灭，在室温下搅拌1小时。然后，将其用环丙基甲胺(4.30ml，48.0mmol)处理，浓缩以去除大部分二氯甲烷，随后添加乙腈(30ml)，在70℃下搅拌14小时，并在真空中浓缩至干燥。将残余物用氯仿(200ml)处理，用水(100ml)洗涤，经mgso4干燥，随后过滤并浓缩。通过快速柱色谱[硅胶，使用己烷/乙酸乙酯(1∶0至2∶1)洗脱]纯化粗产物，以得到呈无色胶状物的3-(5-(5-((3-氰基苯基)(环丙基甲基氨基)甲基)-2-氟苯基氨甲酰基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基)苄基氨基甲酸叔丁酯(54d)(184mg，13％)；1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ10.56(s，1h)，7.89(t，j＝1.7hz，1h)，7.77-7.71(m，1h)，7.70-7.30(m，10h)，7.22(dd，j＝10.3，8.5hz，1h)，4.93(s，1h)，4.19(d，j＝6.2hz，2h)，2.26(d，j＝6.6hz，2h)，1.37(s，9h)，1.00-0.80(m，1h)，0.45-0.28(m，2h)，0.12--0.01(m，2h)；19fnmr(282mhz，dmso-d6)δ-60.80，-123.20；ms(es+)663.4(m+1)。
步骤4：1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(54e)的制备
向3-(5-(5-((3-氰基苯基)(环丙基甲基氨基)甲基)-2-氟苯基氨甲酰基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-1-基)苄基氨基甲酸叔丁酯(54d)(161mg，0.243mmol)于1，4-二噁烷(18ml)中的溶液中添加氯化氢(2.60ml，10.40mmol，4m于1，4-二噁烷中)并在室温下搅拌16小时。将反应混合物用己烷处理，倾析，用己烷洗涤，并再次倾析。通过快速柱色谱[硅胶，用氯仿/cma80(1∶0至2∶1)洗脱]纯化不溶性粗产物，以得到1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(54e)。将纯产物溶解于甲醇(10ml)中并添加4nhcl(水溶液0.14ml)，随后在真空中浓缩至干，以得到呈白色固体的1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(54e)(74mg，48％)的hcl盐；1hnmr(300mhz，dmso-d6，d2oexnmr)δ8.13(t，j＝1.7hz，1h)，7.98-7.84(m，3h)，7.73-7.64(m，3h)，7.63-7.48(m，4h)，7.44(dd，j＝10.2，8.6hz，1h)，5.75(s，1h)，4.12(s，2h)，2.76(d，j＝7.2hz，2h)，1.17-0.94(m，1h)，0.68-0.47(m，2h)，0.34-0.24(m，2h)；19fnmr(282mhz，dmso-d6)δ-60.82，-120.02；ms(es+)：563.3(m+1)；c30h26f4n6o·2.0hcl·3.0h2o的分析计算值：c，52.26；h，4.97；n，12.19；实测值：c，52.26；h，5.00；n，11.72。
实施例2：外消旋化合物54e的对映异构体的分离
根据wo2015/134998和美国专利申请公布第2017/0073314a1号(二者均以引用的方式并入)重现
(+)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(化合物i)和(-)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺((-)-对映异构体)的分离
通过使用制备型sfc方法，使用所提供的以下条件分离外消旋1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(54e)(0.4g)的异构体：
所使用的制备型sfc方法：
通过以下分析性sfc方法确定峰的手性纯度：
峰-1(化合物i)2.1min144mg＞95％ee(uv254)
98.6％纯度(uv254)
峰-2((-)-对映异构体)2.4min172mg95.5％ee(uv254)
96.5％纯度(uv254)
1.峰-1被指定为呈白色固体的(+)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(化合物i)(144mg，＞95％ee)；旋光度：[α]d＝(+)6.83[ch3oh，1.2]；1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ10.53(s，1h，d2o可交换)，7.88(t，j＝1.7hz，1h)，7.77-7.71(m，1h)，7.67(dt，j＝7.7，1.4hz，1h)，7.63(dd，j＝7.5，2.1hz，1h)，7.56(s，1h)，7.54-7.47(m，2h)，7.47-7.38(m，2h)，7.34(ddt，j＝8.6，5.9，2.8hz，2h)，7.22(dd，j＝10.3，8.5hz，1h)，4.93(s，1h)，3.77(s，2h)，2.31-2.21(m，2h)，0.97-0.80(m，1h)，0.42-0.33(m，2h)，0.10--0.02(m，2h)；19fnmr(282mhz，dmso-d6)δ-60.73，-123.20；ms(es+)563.3(m+1)，561.3(m-1)。向(+)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(化合物i)(120mg)的游离碱混合物于甲醇(15ml)中的溶液中添加氯化氢(0.969ml，1.938mmol)，在室温下搅拌10分钟，蒸发至干，以得到呈白色固体的(+)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺(化合物i)(100mg)盐酸盐；1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ10.84(s，1h，d2o可交换)，10.44(s，2h，d2o可交换)，8.44(s，3h，d2o可交换)，8.30(s，1h，d2o可交换)，8.09(d，j＝7.9hz，1h)，7.99(d，j＝6.8hz，1h)，7.91-7.83(m，1h)，7.80-7.50(m，7h)，7.42(dd，j＝10.3，8.6hz，1h)，5.78(d，j＝6.9hz，1h)，4.13(d，j＝5.7hz，2h)，2.88-2.62(m，2h)，1.42-0.99(m，1h)，0.73-0.46(m，2h)，0.32(d，j＝4.4hz，2h)；19fnmr(282mhz，dmso-d6)δ-60.81，-119.99；ms(es+)：ms(es+)563.3(m+1)，ms(es-)561.3(m-1)，597.3(m+cl)；c30h26f4n6o·2hcl·1.75h2o的分析计算值：c，54.02；h，4.76；cl，10.63；n，12.60；实测值：c，54.12；h，4.83；cl，10.10；n，11.97。
2.峰-2被指定为呈游离碱的(-)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺((-)-对映异构体)(172mg，95.5％ee)，将其通过快速柱色谱(硅胶12g，以0-30％meoh/氯仿洗脱15分钟)再纯化以得到呈灰白色固体的(-)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺((-)-对映异构体)游离碱；旋光度：[α]d＝(-)5.44[ch3oh，1.25]；1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ7.88(t，j＝1.6hz，1h)，7.74(d，j＝8.1hz，1h)，7.70-7.61(m，2h)，7.57(s，1h)，7.54-7.47(m，2h)，7.45-7.41(m，2h)，7.34(ddq，j＝8.7，6.1，3.5，2.8hz，2h)，7.22(dd，j＝10.3，8.5hz，1h)，4.93(s，1h)，3.78(s，2h)，2.25(d，j＝6.9hz，2h)，0.90(ddd，j＝9.8，8.0，5.2hz，1h)，0.47-0.29(m，2h)，0.04(dd，j＝5.0，1.5hz，2h)；19fnmr(282mhz，dmso-d6)δ-60.73，-123.19；ms(es+)563.3(m+1)，ms(es-)，561.3(m-1)。向(-)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺((-)-对映异构体)(0.124g，0.220mmol)的游离碱于甲醇(15ml)中的溶液中添加氯化氢(1.102ml，2.204mmol)，在室温下搅拌10分钟，蒸发至干，以得到呈灰白色固体的(-)-1-(3-(氨基甲基)苯基)-n-(5-((3-氰基苯基)(环丙基-甲基氨基)甲基)-2-氟苯基)-3-(三氟甲基)-1h-吡唑-5-甲酰胺((-)-对映异构体)(0.121g)盐酸盐；1hnmr：1hnmr(300mhz，dmso-d6)δ10.82(s，1h，d2o可交换)，10.36(s，2h，d2o可交换)，8.38(s，3h，d2o可交换)，8.27(s，1h)，8.06(d，j＝7.9hz，1h)，7.98(d，j＝6.7hz，1h)，7.87(d，j＝7.7hz，1h)，7.78-7.49(m，7h)，7.48-7.37(m，1h)，5.78(s，1h)，4.13(d，j＝5.7hz，2h)，2.72(s，2h)，1.14(s，1h)，0.56(d，j＝7.7hz，2h)，0.31(d，j＝5.0hz，2h)；19fnmr(282mhz，dmso-d6)δ-60.82，-120.03；ms(es+)：ms(es+)563.3(m+1)，ms(es-)，561.3(m-1)，597.2(m+cl)；c30h26f4n6o.2hcl.1.75h2o的分析计算值：c，54.02；h，4.76；cl，10.63；n，12.60；实测值：c，54.12；h，4.83；cl，10.10；n，11.97。
实施例3：化合物i·2(hcl)的种晶的制备
将化合物i(参见实施例2)于甲基叔丁基醚(mtbe)(1当量)中的溶液添加至hcl(水溶液)(2当量)于甲醇(冷)中的溶液中，随后加热至约30℃，并将其在约30℃下保持不超过5小时，同时在约115rpm下搅拌。通过过滤收集化合物i双盐酸盐并干燥。所获得的结晶物质可用作实施例4中所述结晶方案的晶种。
实施例4：化合物i·2(hcl)的大规模合成和结晶方案
将37％盐酸水溶液(38.1kg，32.3l，2.14当量)装入干净的空结晶容器中，添加甲醇(228.9kg，39.5当量)，并将内容物冷却至-7±3℃。在温度-5±5℃下，使化合物i游离碱(大约101.8kg；180.9摩尔)于mtbe(大约1,300l)中的溶液经精密过滤器过滤到结晶容器中。在用mtbe冲洗后，将预先称量的化合物i·2(hcl)晶种(1.39kg，0.012当量；实施例3)通过修理孔装入结晶容器中。将容器内容物加热至30-33℃并将搅拌速率设定为25-50rpm。在确定结晶后，再搅拌浆料三至四小时。将产物浆料转移至离心机上并通过离心机分离。将产物用mtbe(585l)洗涤。在对潮湿产物，即化合物i·2(hcl)干式离心后，将其自离心机排出，并将产物在锥型干燥器中在≤40℃下真空干燥。产物化合物i·2(hcl)产率：100kg；157.4mol；大约85％。
1hnmr(300mhz，dmso-d6)，数据展示于下表中：
19fnmr(282mhz，dmso-d6)，数据展示于下表中：
化合物i具有两个碱性位点。计算伯胺的共轭酸具有pka值8.89，并且计算仲胺的共轭酸具有pka值7.86。
化合物i·2(hcl)的xrpd展示于图1中。化合物i·2(hcl)在xrpd图中具有在2θ(ο2θ)值5.28、8.96、14.27、16.18、19.79、21.16、22.01、23.31、24.64和30.31处的特征峰。
tg-ir分析指示两个不同的重量减轻区域：第一区域在125℃完成，而第二区域在大约208℃开始。对来自此实验的废气的ir分析在初始重量减轻时仅检测到痕量水，而在208℃事件下检测到hcl气体。在样品中未检测到其它溶剂。因此，确定化合物i·2(hcl)最初在加热时失去水，并在加热至超过200℃时，盐开始分解并放出hcl气体。所有这些事件的ir信号极弱，表明它们是在一定个范围内发生而非在指定温度下发生。示范性tg-ir光谱展示在图2中。
实施例5：化合物测定
在测量人血浆激肽释放酶活性的抑制的体外生物化学测定中测定化合物i。实验方案和测定结果见于wo2015/134998和美国专利申请公布第2017/0073314a1号(二者均以引用的方式并入)。此生物化学测定的结果表明化合物i是人血浆激肽释放酶活性的强效抑制剂。
实施例6：化合物i·2(hcl)于健康受试者中的药物动力学
作为第1期、双盲、安慰剂对照的剂量范围研究的一部分，在健康受试者中评价多个递增口服剂量的化合物i·2(hcl)的药物动力学。招募四个递增剂量组，以依序方式给药。在开始时，将十二名受试者随机分到各组中以根据以下剂量方案施用7日或14日疗程的研究药物(n＝10名/组接受化合物i·2(hcl)且n＝2名/组接受相配的安慰剂)：在组1中每日一次(qd)125mg化合物i·2(hcl)或安慰剂，持续7日；在组2中250mg化合物i·2(hcl)或化合物qd，持续7日；在组3中500mg化合物i·2(hcl)或安慰剂qd，持续7日；或在组4中350mg化合物i·2(hcl)或安慰剂qd，持续14日。总之，接受多次剂量的化合物i·2(hcl)的40名受试者中有37名完成其对应剂量方案并且可用于评定在第7日或第14日的pk参数。
在第7日或第14日剂量施用前以及在随后的24小时内抽取系列血液样品进行药物动力学分析。通过使用验证的lc-ms/ms(液相色谱联合串联质谱法)生物分析测定来分析血浆样品以确定化合物i·2(hcl)的浓度。
图3展示在qd经口施用125、250和500mgqd化合物i·2(hcl)后第7日；以及在qd经口施用350mgqd化合物i·2(hcl)后第14日血浆化合物i·2(hcl)浓度相对于时间的曲线。
表1提供在7日或14日多次口服剂量的化合物i·2(hcl)之后血浆药物动力学参数的汇总[最大(峰值)血浆药物浓度(cmax)、在药物施用后达到最大(峰值)血浆药物浓度的时间(观测时间点)(tmax)、在给药间隔结束时观测到的谷值血浆浓度(ctau)以及在给药间隔内血浆浓度-时间曲线下面积(auctau)]。
表1.健康受试者在7日或14日多次口服剂量的化合物i·2(hcl)之后的血浆药物动力学参数的汇总(第7日或第14日)。
a数据以几何平均值(几何平均值的cv％)报导。
btmax以中值(min，max)报导。
在给药后大约2至6小时达到最大血浆化合物i·2(hcl)浓度。剂量自125mg至250mgqd以及自250mg至500mgqd的增加赋予合理的剂量比例。在全部4倍剂量范围内，暴露以略微大于剂量比例的方式增加，其中auctau和cmax的几何平均值分别增加5.1倍和5.3倍。
以引用的方式并入
本文中提及的所有美国专利以及美国和pct公开专利申请都据此以全文引用的方式并入本文中，其引用的程度就如同特定且个别地指示将各个别专利或公开申请以引用的方式并入本文中一般。假若有冲突，则以本申请为准(包括本文中的任何定义)。
等效物
虽然已讨论本发明的特定实施方案，但以上说明书是说明性的而非限制性的。本领域技术人员在查阅本说明书和权利要求书后将对本发明的许多变化显而易知。本发明的完整范围应通过参考权利要求书连同其等效内容的完整范围，以及说明书连同这些变化来确定。
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