1.产生异源二聚体抗体的方法,其包括:
a)提供包含含有第一ch3区的免疫球蛋白的第一fc区的第一同源二聚体抗体和包含含有第二ch3区的免疫球蛋白的第二fc区的第二同源二聚体抗体,其中所述第一ch3区与所述第二ch3区的氨基酸序列不同,并且使得所述第一ch3区与所述第二ch3区之间的异源二聚体相互作用比所述第一ch3区之间的同源二聚体相互作用或所述第二ch3区之间的同源二聚体相互作用更强;
b)将所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体组合成混合物;以及
c)在还原剂和环境溶氧(do2)存在下温育所述混合物以产生所述异源二聚体抗体,其中该方法在产生所述异源二聚体抗体期间缺乏一个或多个以下步骤:测量所述混合物中的百分比(%)do2,控制所述混合物中的%do2,或将氧加入所述混合物中。
2.权利要求1的方法,其中在步骤1b)时,所述混合物中%do2为约30%或更高。
3.权利要求1或2的方法,其中在产生所述异源二聚体抗体期间,所述%do2为约10%至约90%。
4.权利要求1至3中任一项的方法,其中步骤1b)中将所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体以约1:1至约1:2的摩尔比组合成所述混合物。
5.权利要求1至3中任一项的方法,其中步骤1b)中将所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体以约1.05:1的摩尔比组合成所述混合物。
6.权利要求1至5中任一项的方法,其中所述混合物中免疫球蛋白的总浓度为约8g/l至约13g/l,如约10.5g/l。
7.权利要求1至6中任一项的方法,其中所述混合物在所述还原剂存在下温育约10分钟或更久。
8.权利要求7的方法,其中所述混合物在所述还原剂存在下温育约10分钟至约24小时。
9.权利要求1至8中任一项的方法,其中所述还原剂是2-巯基乙胺(2-mea)、2-mea的化学衍生物、l-半胱氨酸或d-半胱氨酸。
10.权利要求9的方法,其中所述混合物中2-mea的浓度为约20mm至40mm,如约35mm。
11.权利要求1至10中任一项的方法,其中所述混合物包含缓冲液。
12.权利要求11的方法,其中所述缓冲液包含乙酸钠缓冲液。
13.权利要求12的方法,其中所述缓冲液还包含nacl。
14.权利要求13的方法,其中所述缓冲液包含约100mm乙酸钠和约30mmnacl。
15.权利要求14的方法,其中所述缓冲液的ph为约7.3。
16.权利要求1至15中任一项的方法,其包括从所述混合物中去除所述还原剂的步骤。
17.权利要求16的方法,其中所述还原剂通过过滤去除。
18.权利要求17的方法,其中所述过滤是渗滤。
19.权利要求1至18中任一项的方法,其中所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体是igg1,igg2或igg4同种型。
20.权利要求19的方法,其中与seqidno:1的野生型igg1,seqidno:2的野生型igg2或seqidno:3的野生型igg4相比时,所述第一ch3域和所述第二ch3域包含以下突变:f405l/k409r、野生型/f405l_r409k、t350i_k370t_f405l/k409r、k370w/k409r、d399afghilmnrstvwy/k409r、t366adefghilmqvy/k409r、l368adeghnrstvq/k409agrh、d399fhkrq/k409agrh、f405iklstvw/k409agrh、y407lwq/k409agrh、t366y/f405a、t366w/f405w、f405w/y407a、t394w/y407t、t394s/y407a、t366w/t394s、f405w/t394s、t366w/t366s_l368a_y407v、l351y_f405a_y407v/t394w、t366i_k392m_t394w/f405a_y407v、t366l_k392m_t394w/f405a_y407v、l351y_y407a/t366a_k409f、l351y_y407a/t366v_k409f、y407a/t366a_k409f、t350v_l351y_f405a_y407v/t350v_t366l_k392l_t394w、k409d/d399k、k409e/d399r、k409d_k360d/d399k_e356k、k409d_k360d/d399e_e356k、k409d_k370d/d399k_e357k、k409d_k370d/d399e_e357k、k409d_k392d/d399k_e356k_e357k或k409d_k392d/d399e_e356k_e357k。
21.权利要求20的方法,其中与seqidno:1的野生型igg1,seqidno:2的野生型igg2或seqidno:3的野生型igg4相比时,所述第一fc区和/或所述第二fc区包含调节所述第一fc区和/或所述第二fc区与fcγ受体(fcγr),fcrn或蛋白a结合的一个或多个突变。
22.权利要求21的方法,其中所述fcγr是fcγri,fcγriia,fcγriib或fcγriii。
23.权利要求21的方法,其中所述调节第一fc区和/或第二fc区与fcγ结合的一个或多个取代是l234a_l235a、f234a_l235a、s228p_f234a_l235a、s228p_l234a_l235a、v234a_g237a_p238s_h268a_v309l_a330s_p331s、v234a_g237a、h268q_v309l_a330s_p331s、s267e_l328f、l234f_l235e_d265a、l234a_l235a_g237a_p238s_h268a_a330s_p331s或s228p_f234a_l235a_g237a_p238s。
24.权利要求21的方法,其中所述调节第一fc区和/或第二fc区与fcrn结合的一个或多个取代是m428l_n434s、m252y_s254t_t256e、t250q_m428l、n434a和t307a_e380a_n434a、h435a、p257i_n434h、d376v_n434h、m252y_s254t_t256e_h433k_n434f、t308p_n434a或h435r。
25.权利要求21的方法,其中所述调节第一fc区和/或第二fc区与蛋白a的结合的一个或多个取代是q311r、q311k、t307p_l309q、t307p_v309q、t307p_l309q_q311r、t307p_v309q_q311r、h435r或h435r_y436f。
26.权利要求1至25中任一项的方法,其中在符合gmp的条件下进行产生所述异源二聚体抗体的步骤。
27.权利要求26的方法,其中在制造包含所述异源二聚体抗体的原料药期间进行产生所述异源二聚体抗体的步骤。
28.权利要求1至27中任一项的方法,其中所述异源二聚体抗体是双特异性抗体。
29.权利要求28的方法,其中所述双特异性抗体结合cd3、cd123、bcma、egfr或c-met或其任何组合。
30.权利要求1至29中任一项的方法,其中所述混合物中所述还原剂与总免疫球蛋白的质量比为约1.0至约5.0。
31.权利要求30的方法,其中所述质量比为约1.4至约3.8。
32.权利要求30的方法,其中所述质量比为约3.3至约4.4。
33.产生异源二聚体抗体的方法,其包括:
a)提供包含含有第一ch3区的免疫球蛋白的第一fc区的第一同源二聚体抗体和包含含有第二ch3区的免疫球蛋白的第二fc区的第二同源二聚体抗体,其中所述第一ch3区与所述第二ch3区的氨基酸序列不同,并且使得所述第一ch3区与所述第二ch3区之间的异源二聚体相互作用比所述第一ch3区之间的同源二聚体相互作用或所述第二ch3区之间的同源二聚体相互作用更强;
b)将所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体组合成混合物;
c)在还原剂存在下温育所述混合物;以及
d)去除所述还原剂以产生所述异源二聚体抗体,其中在步骤c),步骤d)或步骤c)和步骤d)两者中将百分比(%)溶氧(do2)控制为约30%或更低。
34.权利要求33的方法,其中所述混合物中%do2为约25%或更低,约20%或更低,约15%或更低,约10%或更低,约9%或更低,约8%或更低,约7%或更低,约6%或更低,约5%或更低,约4%或更低,约3%或更低,约2%或更低,或约1%或更低。
35.权利要求34的方法,其中%do2由氮气覆盖层控制。
36.权利要求34或35的方法,其中在步骤b)中将所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体以约1:1至约1:2的摩尔比组合成所述混合物。
37.权利要求34或35的方法,其中在步骤b)中将所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体以约1.05:1的摩尔比组合成所述混合物。
38.权利要求33至37中任一项的方法,其中所述混合物中免疫球蛋白的总浓度为约10.5g/l。
39.权利要求33至38中任一项的方法,其中在所述还原剂存在下温育所述混合物约10分钟或更久。
40.权利要求33至39中任一项的方法,其中在所述还原剂存在下温育所述混合物约10分钟至约24小时。
41.权利要求33至40中任一项的方法,其中所述还原剂是2-巯基乙胺(2-mea)、2-mea的化学衍生物、l-半胱氨酸或d-半胱氨酸。
42.权利要求41的方法,其中所述混合物中2-mea的浓度为约35mm。
43.权利要求33至42中任一项的方法,其中所述混合物包含缓冲液。
44.权利要求43的方法,其中所述缓冲液包含乙酸钠缓冲液。
45.权利要求44的方法,其中所述缓冲液还包含nacl。
46.权利要求45的方法,其中所述缓冲液包含约100mm乙酸钠和约30mmnacl。
47.权利要求46的方法,其中所述缓冲液的ph为约7.3。
48.权利要求33至47中任一项的方法,其包括从所述混合物中去除所述还原剂的步骤。
49.权利要求48的方法,其中通过过滤去除所述还原剂。
50.权利要求49的方法,其中所述过滤是渗滤。
51.权利要求33至50中任一项的方法,其中所述第一同源二聚体抗体和所述第二同源二聚体抗体是igg1、igg2或igg4同种型。
52.权利要求51的方法,其中与seqidno:1的野生型igg1,seqidno:2的野生型igg2或seqidno:3的野生型igg4相比时,所述第一ch3域和所述第二ch3域包含以下突变:f405l/k409r、野生型/f405l_r409k、t350i_k370t_f405l/k409r、k370w/k409r、d399afghilmnrstvwy/k409r、t366adefghilmqvy/k409r、l368adeghnrstvq/k409agrh、d399fhkrq/k409agrh、f405iklstvw/k409agrh、y407lwq/k409agrh、t366y/f405a、t366w/f405w、f405w/y407a、t394w/y407t、t394s/y407a、t366w/t394s、f405w/t394s、t366w/t366s_l368a_y407v、l351y_f405a_y407v/t394w、t366i_k392m_t394w/f405a_y407v、t366l_k392m_t394w/f405a_y407v、l351y_y407a/t366a_k409f、l351y_y407a/t366v_k409f、y407a/t366a_k409f、t350v_l351y_f405a_y407v/t350v_t366l_k392l_t394w、k409d/d399k、k409e/d399r、k409d_k360d/d399k_e356k、k409d_k360d/d399e_e356k、k409d_k370d/d399k_e357k、k409d_k370d/d399e_e357k、k409d_k392d/d399k_e356k_e357k或k409d_k392d/d399e_e356k_e357k。
53.权利要求52的方法,其中与seqidno:1的野生型igg1,seqidno:2的野生型igg2或seqidno:3的野生型igg4相比时,所述第一fc区和/或所述第二fc区包括调节所述第一fc区和/或所述第二fc区与fcγ受体(fcγr),fcrn或蛋白a结合的一个或多个突变。
54.权利要求53的方法,其中所述fcγr是fcγri,fcriia,fcγriib或fcγriii。
55.权利要求53的方法,其中所述调节第一fc区和/或第二fc区与fcγ结合的一个或多个取代是l234a_l235a、f234a_l235a、s228p_f234a_l235a、s228p_l234a_l235a、v234a_g237a_p238s_h268a_v309l_a330s_p331s、v234a_g237a、h268q_v309l_a330s_p331s、s267e_l328f、l234f_l235e_d265a、l234a_l235a_g237a_p238s_h268a_a330s_p331s或s228p_f234a_l235a_g237a_p238s。
56.权利要求53的方法,其中所述调节第一fc区和/或第二fc区与fcrn结合的一个或多个取代是m428l_n434s、m252y_s254t_t256e、t250q_m428l、n434a和t307a_e380a_n434a、h435a、p257i_n434h、d376v_n434h、m252y_s254t_t256e_h433k_n434f、t308p_n434a或h435r。
57.权利要求53的方法,其中所述调节第一fc区和/或第二fc区与蛋白a结合的一个或多个取代是q311r,q311k,t307p_l309q,t307p_v309q,t307p_l309q_q11r,t307p_v309q_q311r,h435r或h435r_y436f。
58.权利要求33至57中任一项的方法,其中在符合gmp的条件下进行产生所述异源二聚体抗体的步骤。
59.权利要求33至57中任一项的方法,其中在制造包含所述异源二聚体抗体的原料药期间进行产生所述异源二聚体抗体的步骤。
60.权利要求33至59中任一项的方法,其中所述异源二聚体抗体是双特异性抗体。
61.权利要求60的方法,其中所述双特异性抗体结合cd3、cd123、bcma、egfr、或c-met、或其任何组合。
62.权利要求33至61中任一项的方法,其中所述混合物中所述还原剂与总免疫球蛋白的质量比为约1.0至约5.0。
63.权利要求62的方法,其中所述质量比为约1.4至约3.8。
64.权利要求62的方法,其中所述质量比为约3.3至约4.4。
65.通过权利要求1的方法产生的分离的双特异性抗体。
66.权利要求65的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体结合egfr和c-met。
67.权利要求65或66的双特异性抗体,其包含seqidno:4的第一重链(hc1),seqidno:5的第一轻链(lc1),seqidno:6的第二重链(hc2)和seqidno:7的第二轻链(lc2)。
68.权利要求65的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体结合cd3。
69.通过权利要求33的方法产生的分离的双特异性抗体。
70.权利要求69的双特异性抗体,其中所述双特异性抗体结合egfr和c-met。
71.权利要求69或70的双特异性抗体,其包含seqidno:4的第一重链(hc1),seqidno:5的第一轻链(lc1),seqidno:6的第二重链(hc2)和seqidno:7的第二轻链(lc2)。
72.权利要求69的双特异性抗体,其中双特异性抗体结合cd3。