用于合成肽免疫原作为免疫刺激剂的人工混杂T辅助细胞表位的制作方法
本申请是要求于2018年12月19日提交的美国临时申请序列号62/782,253的权益的pct国际申请，其通过引用以其整体并入本文。
背景
免疫反应需要抗原呈递细胞和t辅助(th)细胞之间的协同相互作用。有效抗体反应的引发需要抗原呈递细胞识别受试免疫原的目标抗原位点，且t辅助细胞识别t辅助细胞表位。通常，受试免疫原上的t辅助细胞表位有别于其b细胞表位或相关效应t细胞(例如细胞毒性t淋巴细胞或ctl)表位。b细胞和相关效应t细胞表位是位于b细胞和相关细胞所识别的期望目标免疫原上的位点，其导致针对期望目标位点的抗体或细胞因子的产生。目标的天然构象决定了抗体或相关效应t细胞直接结合的位点。th细胞反应的引发需要th细胞受体以识别位于抗原呈递细胞膜上的复合物，此复合物是在目标蛋白质的经加工的肽片段和相关ii类主要组织相容性复合体(mhc)之间形成。因此，th细胞反应需要目标蛋白质的肽加工和三向识别(three-wayrecognition)。难以定义三部分复合物，原因在于1)关键的ii类mhc接触残基在不同的mhc结合肽(th表位)内被可变地定位；2)不同的mhc结合肽具有可变的长度和不同的氨基酸序列；和3)ii类mhc分子可高度多样化，这取决于宿主的遗传构成。针对特定th表位的免疫反应部分地是由宿主的mhc基因所决定，且th表位的反应性在群体的个体之间有所不同。难以鉴定跨物种和单一物种内的个体的具有反应性的th表位(即混杂的th表位)。
t细胞识别的每个组成步骤都需要多个因子，例如通过抗原呈递细胞的适当肽加工、通过遗传决定的ii类mhc分子呈递肽，以及通过位于th细胞上的受体识别mhc分子和肽复合物。对于用以提供广泛反应性的混杂th表位识别的要求可能难以确定。
显然，为了诱导针对免疫反应的抗体和相关细胞因子，免疫原必须包含b细胞表位/效应t细胞表位和th细胞表位。通常，载体蛋白(例如锁孔血蓝蛋白；klh)与目标免疫原偶联以提供th反应，用以增加目标免疫原的免疫原性。然而，使用大载体蛋白来增强目标免疫原的免疫原性存在许多缺点。特别是难以制备明确、安全且有效的肽-载体蛋白缀合物，原因在于(a)化学偶联涉及可导致大小和组成异质性的反应，例如与戊二醛的缀合(borras-cuestaetal.，eurjimmunol，1987；17：1213-1215)；(b)载体蛋白引入了非期望免疫反应的可能性，例如过敏和自身免疫反应(bixlereta1.，wo89/06974)；(c)大的肽-载体蛋白引发无关的免疫反应，其主要是错误地针对载体蛋白而不是目标位点(ceaseetal.，procnatlacadsciusa，1987；84：4249-4253)；且(d)载体蛋白还在先前利用包含相同载体蛋白的免疫原免疫的宿主中引入表位抑制的可能性。当宿主随后利用另一种免疫原免疫时，其中相同的载体蛋白与不同的半抗原偶联，对于载体蛋白而言所得到的免疫反应是增强的，但对半抗原而言所得到的免疫反应是抑制的(schutzeetal.，jimmunol，1985；135：2319-2322)。
为了避免上述风险，期望在不使用传统载体蛋白的情况下引发t细胞辅助。
技术实现要素：
本公开提供混杂人工t辅助细胞(th)表位，用以刺激针对目标抗原的功能性定点抗体，以用于预防和治疗用途。本公开也关于含有此th表位的肽免疫原构建体、含有此th表位的组合物、制备和使用此th表位的方法，以及利用含有此th表位的肽免疫原构建体所产生的抗体。
公开的人工t辅助细胞(th)表位可通过任选的间隔子连接至b细胞表位和/或效应t细胞表位(“目标抗原位点”)以产生肽免疫原构建体。公开的th表位赋予肽免疫原诱发强t辅助细胞介导的免疫反应的能力，产生高水平的抗体和/或针对目标抗原位点的细胞反应。利用公开的人工th表位(此人工th表位是专门设计用于改善目标抗原位点的免疫原性)，公开的肽免疫原构建体提供肽免疫原中大载体蛋白和病原体衍生的t辅助细胞位点的有利替代。含有公开的th表位的相对短的肽免疫原构建体引发针对特定目标抗原位点的高水平抗体和/或效应细胞相关细胞因子，而不引起针对th表位的显著炎症反应或免疫反应。
可以通过改变以下项来调节由肽免疫原构建体引起的免疫反应(包括抗体效价、cmax、抗体产生的开始、反应的持续时间等)：(a)选择与b细胞表位化学缀合的th表位，(b)b细胞表位的长度，(c)在含有肽免疫原构建体的制剂中使用的佐剂，和/或(d)给药方案，其包括每次免疫的剂量以及供每次免疫的初次免疫和加强免疫的时间点。因此，可以使用公开的th表位设计针对目标抗原位点的特异性免疫反应，其有助于定制针对任何患者或受试者的个体特征的个人化医疗。
可利用以下分子式代表含有本发明公开的人工th表位的肽免疫原构建体：
(a)n-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
{(a)n-(th)p-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)p-(a)n-x}m
其中：
每个a独立地为氨基酸；
每个b独立地为异源性间隔子；
每个th独立地为人工th表位；
目标抗原位点为b细胞表位、ctl表位、肽半抗原、非肽半抗原或其免疫反应类似物；
x为氨基酸、α-cooh或α-conh2；
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为1、2、3或4；
o为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，以及
p为0、1、2、3或4。
肽半抗原作为目标抗原位点的例子是β-淀粉样蛋白(aβ)的氨基酸1-14(aβ1-14)(seqidno：56)。非肽半抗原的例子包括肿瘤相关糖类抗原(taca)或小分子药物。
本公开还关于包含含有人工th表位的肽免疫原构建体的组合物。此类组合物能够在接受免疫接种的宿主中引发针对期望目标抗原位点的抗体反应。目标抗原位点可以衍生自病原性生物体、通常是免疫沉默的自身抗原，或肿瘤相关靶标。
公开的组合物可用于许多不同的医学和兽医学应用，包括提供传染病保护性免疫的疫苗、用于治疗由正常生理过程失常所引起的疾病的免疫疗法、用于治疗癌症的免疫疗法，以及用以期望地干预和改变正常生理过程的药剂。
可以与本发明th表位共价连接的一些目标抗原包括以下部分：用于治疗阿尔兹海默症的β-淀粉样蛋白(aβ)、用于治疗帕金森氏症的α-突触核蛋白(α-syn)、用于治疗过敏性疾病的膜结合的ige的细胞外膜近侧结构域(或igeempd)、用于治疗包括阿尔兹海默症在内的tau蛋白病的tau和用于治疗特应性皮炎的白介素-31(il-31)，仅举几例。更具体地，目标抗原包括aβ1-14(如美国第9,102,752号专利所述)、α-syn111-132(如第pct/us2018/037938号国际pct申请案所述)、igeempd1-39(如第pct/us2017/069174号国际pct申请案所述)、tau379-408(如第pct/us2018/057840号国际pct申请案所述)和il-3197-144(如第pct/us2018/065025号国际pct申请案所述)以及在表3a和表3b中描述的那些目标抗原位点。
本公开还提供通过向有此需要的受试者施用肽免疫原构建体(包含公开的人工th表位和抗原呈递表位)以预防和/或治疗受试者的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，肽免疫原构建体在受试者中产生免疫原性炎症反应，其比阳性对照的免疫原性炎症反应低至少约3倍，如实施例12中所示。
本公开还关于利用含有公开的人工th表位的肽免疫原构建体产生的抗体。由肽免疫原构建体产生的抗体对目标抗原位点具有高度特异性，而非人工th表位。
参考文献：
本申请中引用的每个专利、出版物和非专利文献在此通过引用整体并入本文，如同其各自通过引用单独地并入。
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31.internationalpctapplicationno.pct/us2018/065025bywang，“peptideimmunogensofil-31andformulationsthereofforthetreatmentand/orpreventionofatopicdermatitis”(filed2018-12-11).
附图简要说明
图1a和1b：显示本文所述t辅助细胞表位平台的例示性制剂和特征的示意图。图1a是示意性概括的成分，其可以被包含在具有含有th表位载体(包括
图2：显示用以说明使用本文所述t辅助细胞表位平台可获得的理论结果的图。
图3：利用所选个别th表位肽和衍生自α突触核蛋白(上图)和igeempd(下图)的短的非免疫原性b细胞表位肽的肽免疫原构建体的免疫原性增强。α突触核蛋白的条形图(上图)下方的数字对应表5所述肽免疫原构建体；而igeempd的条形图(下图)下方的数字对应表6所述肽免疫原构建体。
图4a和4b：显示用以说明利用如表8所示含有共价连接至个别th表位的α-syn(g111-g132)、ige-empd(g1-c39)和il-6(c73-c83)的三种个别肽免疫原构建体的混合物在免疫接种豚鼠后所获得利用elisa测定的抗α-突触核蛋白抗体效价的图。将在这些图中评估的特异性α-突触核蛋白肽免疫原构建体总结于表5中。图4a包含评估的所有肽免疫原构建体的抗体效价数据。图4b包含图4a中所示数据的子集合以强调不同的肽免疫原构建体能够以不同的速率达到相似的cmax值。
图5：显示用以说明利用如表8所示含有共价连接至个别th表位的α-syn(g111-g132)、ige-empd(g1-c39)和il-6(c73-c83)的三种个别肽免疫原构建体的混合物在免疫接种豚鼠后所获得利用elisa测定的抗igeempd抗体效价的图。将在这些图中评估的特异性igeempd肽免疫原构建体总结于表6中。
图6：显示用以说明利用如表8所示含有共价连接至个别th表位的α-syn(g111-g132)、ige-empd(g1-c39)和il-6(c73-c83)的三种个别肽免疫原构建体的混合物在免疫接种豚鼠后所获得利用elisa测定的抗il-6抗体效价的图。将在这些图中评估的特异性il-6肽免疫原构建体总结于表7中。
图7：显示用以说明利用如表9所示肽免疫原构建体在免疫接种豚鼠后所获得利用elisa测定的抗dpr(二肽重复)抗体效价的图。
图8：显示用以说明利用不同量的aβ疫苗(ub-311)(aβ疫苗(ub-311)含有aβ1-14-εk-kkk-mvf5th(seqidno：67)和aβ1-14-εk-hbsag3th(seqidno：68)两种肽免疫原)在免疫接种豚鼠后所获得利用elisa测定的抗aβ1-28抗体效价的图。
图9：显示用以说明利用aβ疫苗(ub-311)(aβ疫苗(ub-311)含有aβ1-14-εk-kkk-mvf5th(seqidno：67)和aβ1-14-εk-hbsag3th(seqidno：68)两种肽免疫原)的不同初次免疫和加强免疫剂量在免疫接种豚鼠后所获得利用elisa测定的抗aβ1-28抗体效价的图。
图10：显示用以说明在3个月加强免疫方案(上图)或6个月加强免疫方案(下图)中利用aβ疫苗(ub-311)在免疫接种人类受试者后所获得利用elisa测定的抗aβ1-28抗体效价的图。在每个图中的方框部分强调在此研究中所有人类受试者的平均效价。
图11a和11b：显示用以说明利用montanideisa50v作为佐剂利用不同量的如表10所示lhrh肽免疫原构建体(seqidno：239-241)的混合物在免疫接种猪后所获得抗lhrh抗体效价和睾酮浓度的图。图11a显示在利用100μglhrh制剂免疫接种大鼠后所获得抗体效价和睾酮浓度。图11b显示在利用300μglhrh制剂免疫接种大鼠后所获得抗体效价和睾酮浓度。
图12：显示用以说明利用在含有不同佐剂(即montanideisa51或adjuphos)的制剂中不同量seqidno：243的il-6肽免疫原构建体或安慰剂对照在免疫接种大鼠后所获得利用elisa测定的抗il-6抗体效价的图。
图13a和13b：显示用以说明利用不同量seqidno：244的ige-empd肽免疫原构建体在免疫接种猕猴后所获得抗ige-empd抗体效价的图。图13a显示使用adjuphos作为佐剂使用cpg3配制成稳定化的免疫刺激复合物所获得的抗体效价。图13b显示使用montanideisa51作为佐剂使用cpg3配制成稳定化的免疫刺激复合物所获得的抗体效价。
图14a和14b：显示用以说明利用不同佐剂利用不同量的如表10所示lhrh肽免疫原构建体(seqidno：239-241)的混合物在免疫接种猪后所获得抗lhrh抗体效价和睾酮浓度的图。图14a显示使用emulsigend作为佐剂所获得的抗体效价。图14b显示使用montanideisa50v作为佐剂所获得的抗体效价。
图15：显示在正常供体的初始
图16：显示肿瘤相关糖类抗原(taca)的结构：gd3、gd2、globo-h、gm2、fucosylgm1、psa、ley、lex、slex、slea和stn。
图17至21：显示通过固相肽合成方案例示性逐步合成聚糖缀合的
发明详述
本公开提供混杂人工t辅助细胞(th)表位，用以刺激针对目标抗原的功能性定点抗体，以用于预防和治疗用途。本公开也关于含有此th表位的肽免疫原构建体、含有此th表位的组合物、制备和使用此th表位的方法，以及利用含有此th表位的肽免疫原构建体所产生的抗体。
公开的人工t辅助细胞(th)表位可通过任选的间隔子连接至b细胞表位和/或效应t细胞表位(例如，细胞毒性t细胞；ctl)(“目标抗原位点”)以产生肽免疫原构建体。公开的th表位赋予肽免疫原诱发强t辅助细胞介导的免疫反应的能力，产生高水平的抗体和/或针对目标抗原位点的细胞反应(例如，细胞因子)，以获得治疗效果。公开的肽免疫原构建体提供肽免疫原中大载体蛋白和病原体衍生的t辅助细胞位点的有利替代，其中公开的人工th表位专门设计用于改善目标抗原位点的免疫原性。含有公开的th表位的相对短的肽免疫原构建体可引发针对特定目标抗原位点的高水平抗体和/或效应细胞相关细胞因子，而不引起针对th表位的显著炎症反应或免疫反应。
可以通过改变以下项来调节由肽免疫原构建体引起的免疫反应(包括抗体效价、cmax、抗体产生的开始、反应的持续时间等)：(a)选择与b细胞表位缀合的th表位，(b)b细胞表位的长度，(c)在含有肽免疫原构建体的制剂中使用的佐剂，和/或(d)给药方案，其包括每次免疫的剂量以及供每次免疫的初次免疫和加强免疫的时间点。因此，可以使用公开的th表位设计针对目标抗原位点的特异性免疫反应，其有助于定制针对任何患者或受试者的个体特征的个人化医疗。
公开的含有人工th表位的肽免疫原构建体能在接受免疫接种的宿主中引发针对期望目标抗原位点的抗体和/或细胞因子反应。目标抗原位点可以是特定蛋白质、癌症抗原相关糖类、小分子药物化合物或来自任何目标肽或蛋白质的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开描述可用以提供肽免疫原的混杂人工th表位，此肽免疫原可引发抗体，抗体靶向淀粉样蛋白β(aβ)、口蹄疫(fmd)衣壳蛋白、来自猪生殖和呼吸道综合征病毒(prrsv)的糖蛋白、促黄体激素释放激素(lhrh)和任何其他肽或蛋白质序列。
在某些实施方案中，目标抗原位点取自通常为免疫沉默的自身抗原或肿瘤相关新抗原靶标(例如aβ、tau、α-突触核蛋白、二肽蛋白质、igeempd、il-6、cgrp、胰岛淀粉素(amylin)、il-31、新抗原等)。在表3a中显示自身抗原和肿瘤相关新抗原位点的非限制性代表性序列。在其他实施方案中，目标抗原位点取自病原性生物体(例如fmdv、prrsv、csfv、hiv、hsv等)。在表3b中显示病原性抗原位点的非限制性代表性序列。
本发明肽或目标抗原位点可用于医学和兽医学应用。例如，含有公开的人工th表位的肽免疫原构建体可用于疫苗组合物中以提供对传染病或神经退行性疾病的保护性免疫、或用于治疗由正常生理过程失常所引起的疾病的药物组合物、用于治疗癌症、2型糖尿病的免疫疗法，或作为干预正常生理过程的药剂。
通则
本文使用的章节标题仅用于组织的目的，不应被理解为限制所述主题。本申请中引用的所有参考文献或参考文献的部分出于任何目的通过引用明确地将整体并入本文。
除非特别说明，在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中普通技术人员的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出，否则单词“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数形式。类似地，单词“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明确说明。因此，“包含a或b”是指包括a，或b，或a和b。更应被理解的是，用于给定多肽的所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的，并且被提供用于描述。尽管可以将类似或等同于本文所描述的方法和材料的方法和材料用于所公开的方法的实践和测试中，下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非意指加以限制。
肽免疫原构建体
本文使用术语“肽免疫原”或“肽免疫原构建体”是指包含通过共价连接(例如，常规肽键或硫酯)在有或无异源性间隔子的状况下共价连接至目标抗原位点的人工th表位的分子，由此形成单一较大的肽。通常，肽免疫原构建体含有(a)异源性混杂人工th表位；(b)目标抗原位点，例如b细胞表位或效应t细胞表位(例如ctl)；以及(c)任选的异源性间隔子。
在利用肽免疫原免疫接种之后在动物体内，在肽免疫原中呈递混杂人工th表位可诱发强t辅助细胞介导的免疫反应和针对目标抗原位点的高水平的抗体。公开的肽免疫原构建体提供肽免疫原中大载体蛋白和病原体衍生的t辅助细胞位点的有利替代，其中公开的人工th表位专门设计用于改善目标抗原位点的免疫原性。含有公开的th表位的相对短的肽免疫原构建体可引发针对特定目标抗原位点的高水平抗体和/或效应细胞相关细胞因子，而不引起针对th表位的显著炎症反应或免疫反应。
可利用以下分子式代表含有本发明公开的人工th表位的肽免疫原构建体：
(a)n-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
{(a)n-(th)p-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)p-(a)n-x}m
其中：
每个a独立地为氨基酸；
每个b独立地为异源性间隔子；
每个th独立地为人工th表位；
目标抗原位点为b细胞表位、ctl表位、肽半抗原、非肽半抗原或其免疫反应类似物；
x为氨基酸、α-cooh或a-conh2；
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为1、2、3或4；
o为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，以及
p为0、1、2、3或4。
本公开的肽免疫原可包含约20至约100个氨基酸。在一些实施方案中，肽免疫原构建体含有约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100个氨基酸残基。
公开的肽免疫原构建体的各种组成描述如下。
a-氨基酸
本公开的免疫原性肽中的每个a独立地为异源性氨基酸。
本文使用术语“异源性”是指并非目标抗原位点(例如，b细胞表位)野生型氨基酸序列的部分或与其同源的氨基酸序列。因此，异源性氨基酸序列a含有在目标抗原位点的蛋白质或肽中非天然存在的氨基酸序列。由于组分a的序列对目标抗原位点而言是异源性的，当组分a与目标抗原位点共价连接时，目标抗原位点的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
在一些实施方案中，每个a独立地为非天然存在或天然存在的氨基酸。
天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
非天然存在的氨基酸包括，但不限于，ε-n赖氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸、氨基苯甲酸、6-氨基己酸(aca；6-氨基己酸)、巯基丙酸(mpa)、3-硝基酪氨酸、焦谷氨酸等。
在一些实施方案中，n为0表明在分子式中的该位置不添加氨基酸。在其他实施方案中，n为1并且选自任何天然或非天然的氨基酸。在某些实施方案中，n大于1并且每个a独立地是相同的氨基酸。在其他实施方案中，n大于1并且每个a独立地是不同的氨基酸。
b-任选的异源性间隔子
本公开免疫原性肽中的每个b是任选的异源性间隔子。组分b任选的异源性间隔子独立地是氨基酸、-nhch(x)ch2sch2co-、-nhch(x)ch2sch2co(εn)lys-、-nhch(x)ch2s-琥珀酰亚胺基(εn)lys-、-nhch(x)ch2s-(琥珀酰亚胺基)-和/或其任意组合。间隔子可含有一个或多个天然或非天然存在的氨基酸残基，如上文对组分a所描述。
如上所述，术语“异源性”是指并非目标抗原位点(例如，b细胞表位)野生型氨基酸序列的部分或与其同源的氨基酸序列。因此，当间隔子是氨基酸时，间隔子含有在目标抗原位点的蛋白质或肽中非天然存在的氨基酸序列。由于组分b的序列对目标抗原位点而言是异源性的，当组分b与目标抗原位点共价连接时，目标抗原位点的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
间隔子可以是柔性铰链间隔子，以增强th表位和目标抗原位点的分离。在一些实施方案中，柔性铰链序列可以富含脯氨酸。在某些实施方案中，柔性铰链具有序列pro-pro-xaa-pro-xaa-pro(seqidno：55)，其模拟在免疫球蛋白重链中发现的柔性铰链区域。其中的xaa可以是任何氨基酸。在一些实施方案中，xaa是天冬氨酸。在一些实施方案中，由间隔子提供的构象分离可以允许呈递的肽免疫原与适当的th细胞和b细胞之间更有效的相互作用。可以增强对th表位的免疫反应以提供改善的免疫反应性。
当o＞1时，每个b独立地相同或不同。在一些实施方案中，b为gly-gly、pro-pro-xaa-pro-xaa-pro(seqidno：55)、εnlys、εnlys-lys-lys-lys(seqidno：53)、lys-lys-lys-εnlys(seqidno：54)、lys-lys-lys、-nhch(x)ch2sch2co-、-nhch(x)ch2sch2co(εnlys)-、-nhch(x)ch2s-琥珀酰亚胺基-εnlys-或-nhch(x)ch2s-(琥珀酰亚胺基)-和/或其任意组合。例示性的异源性间隔子显示在表2中。
目标抗原位点
目标抗原位点可包括来自任何目标肽或蛋白质的任何氨基酸序列，包括外源或自身肽或蛋白质、b细胞表位、ctl表位、肽半抗原、非肽半抗原或其免疫反应类似物。目标抗原位点可以是特定蛋白质、癌症抗原相关糖类、小分子药物化合物或来自任何目标肽或蛋白质的任何氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开描述可用以提供肽免疫原的混杂人工th表位，此肽免疫原可引发抗体，抗体靶向淀粉样蛋白β(aβ)、口蹄疫(fmd)衣壳蛋白、来自猪生殖和呼吸道综合征病毒(prrsv)的糖蛋白、促黄体激素释放激素(lhrh)和任何其他肽或蛋白质序列。
在某些实施方案中，目标抗原位点取自通常为免疫沉默的自身抗原或肿瘤相关新抗原靶标(例如aβ、tau、α-突触核蛋白、二肽蛋白质、igeempd、il-6、cgrp、胰岛淀粉素、il-31、新抗原等)。在表3a中显示自身抗原和肿瘤相关新抗原位点的非限制性代表性序列。在其他实施方案中，目标抗原位点取自病原性生物体(例如fmdv、prrsv、csfv、hiv、hsv等)。在表3b中显示病原性抗原位点的非限制性代表性序列。
在具体实施方案中，目标抗原位点衍生自促黄体激素释放激素(lhrh)(例如，美国第6,025,468、6,228,987、6,559，282号专利和美国第us2017/0216418号公开)；淀粉样蛋白β(aβ)(例如，美国第6,906,169、7,951,909、8,232,373和9,102,752号专利)；口蹄疫衣壳蛋白(例如，美国第6,048,538、6,107,021号专利和美国第2015/0306203号公开)；用以预防和治疗hiv感染的hiv病毒颗粒表位(例如，美国第5,912,176、5,961,976和6,090,388号专利)；来自猪环状病毒2型(pcv2)的衣壳蛋白(例如，美国第2013/0236487号公开)、来自猪生殖和呼吸道综合征病毒(prrsv)的糖蛋白(例如，美国第2014/0335118号公开)、ige(例如，美国第7,648,701和6,811,782号专利)、α-突触核蛋白(α-syn)(第pct/us2018/037938号国际pct申请)、膜结合的ige的细胞外膜近侧结构域(或igeempd)(第pct/us2017/069174号国际pct申请)、tau(第pct/us2018/057840号国际pct申请)和白介素-31(il-31)(第pct/us2018/065025号国际pct申请)、用以预防疟疾的疟原虫的cs抗原；用以预防和治疗动脉硬化的cetp；用以预防和治疗2型糖尿病的iapp(胰岛淀粉素)，以及任何其他肽或蛋白质序列的部分。所有专利和专利公开均通过引用整体并入本文。
在其他实施方案中，目标抗原位点是非肽半抗原，包括肿瘤相关糖类抗原(taca)和小分子药物化合物。taca的例子包括gd3、gd2、globo-h、gm2、fucosylgm1、gm2、psa、ley、lex、slex、slea、tn、tf和stn，如在实施例11和图16和17中进一步讨论。
th-t辅助细胞表位
肽免疫原构建体中的混杂人工t辅助细胞(th)表位可增强目标抗原位点的免疫原性，其通过合理设计促进针对优化目标b细胞表位的特异性高效价抗体的产生。
本文使用术语“混杂的”是指具有跨越物种和跨越单一物种的个体的反应性的th表位。
与th表位结合使用的术语“人工”是指在自然界中未发现的氨基酸序列。因此，本公开人工th表位具有对目标抗原位点而言是异源性的序列。如上所述，术语“异源性的”是指衍生自并非目标抗原位点野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此，异源性th表位为衍生自非天然存在于目标抗原位点的氨基酸序列的th表位。因为th表位对目标抗原位点而言是异源性的，当异源性th表位共价连接至目标抗原位点时，目标抗原位点的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
th表位可具有衍生自任何物种(例如人类、猪、牛、狗、大鼠、小鼠、豚鼠等)的氨基酸序列。th表位还可具有针对多种物种ii类mhc分子的混杂结合基序。在某些实施方案中，th表位包含多个混杂的ii类mhc结合基序，以允许t辅助细胞的最大活化，从而导致免疫反应的启动和调节。th表位本身优选为免疫沉默的(即利用肽免疫原构建体所产生的抗体(如果有的话)很少针对th表位)，因此允许针对目标抗原位点的非常集中的免疫反应。
th表位的大小范围可为约15至约50个氨基酸残基。在一些实施方案中，th表位可具有约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个氨基酸残基。th表位可共享共同的结构特征和特定的界标序列。在一些实施方案中，th表位具有两性螺旋，即α-螺旋结构，其具有疏水性氨基酸残基占据螺旋的一面，而带电和极性残基占据周围各面。
wo1999/066957的th表位和公开内容以及相对应的美国第6,713,301号专利通过引用整体并入本文。
混杂的th表位可以有效地增强免疫原性差的肽。精心设计的混杂th/b细胞表位嵌合肽可以在遗传多样性群体的大多数成员中引发具有针对b细胞位点的抗体反应的th反应。在一些实施方案中，可通过将肽-载体共价连接至充分表征的混杂th表位来将th细胞提供给目标抗原肽。
混杂th表位可含有额外的一级氨基酸模式。在一些实施方案中，混杂th表位可含有rothbard序列，其中混杂th表位含有一个带电残基(例如-gly-)，然后是2至3个疏水性残基，接着是一个带电或极性残基(rothbardandtaylor，emboj，1988；7：93-101)。混杂th表位可遵守1、4、5、8规则，其中带正电的残基在第四、第五和第八位置跟着疏水性残基，此与两性螺旋1、4、5和8位置位于同一面的情形一致。在一些实施方案中，疏水性和带电和极性氨基酸的1、4、5、8模式可以在单个th表位内重复。在一些实施方案中，混杂t细胞表位可含有rothbard序列或遵守1、4、5、8规则的表位中的至少一种。在其他实施方案中，th表位含有一个以上的rothbard序列。
衍生自病原体的混杂th表位包括，但不限于：b型肝炎表面th细胞表位(hbsagth)、b型肝炎核心抗原th细胞表位(hbcth)、百日咳毒素th细胞表位(ptth)、破伤风毒素th细胞表位(ttth)、麻疹病毒f蛋白th细胞表位(mvfth)、砂眼衣原体主要外膜蛋白th细胞表位(ctth)、白喉毒素th细胞表位(dtth)、恶性疟原虫环子孢子蛋白th细胞表位(pfth)、曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶th细胞表位(smth)和大肠杆菌tratth细胞表位(tratth)、破伤风梭菌、百日咳杆菌、霍乱毒素、流行性感冒病毒mp1、流行性感冒病毒nsp1、epstein-barr病毒(ebv)、人类巨细胞病毒(hcmv)。表1显示本公开中使用的th表位的实例。
在一些实施方案中，本公开th表位可以是包含含有相似氨基酸序列的肽的混合物的组合th表位。结构性合成抗原库(ssal)，也称为组合人工th表位，包含多个th表位，以其氨基酸序列围绕着在特定位置具有取代的不变残基的结构性架构而组成。通过保留相对不变的残基和改变其他残基来确定ssal表位的序列，以提供对多种mhc限制性元素的识别。ssal表位的序列可以通过比对混杂th的一级氨基酸序列、选择和保留负责th肽的独特结构的残基作为骨架，并根据已知的mhc限制性元素改变剩余残基来确定。具有mhc限制性元素的优选氨基酸的不变和可变位置可用于获得mhc结合基序，其可用于设计th表位的ssal。
作为组合序列呈递的异源性th表位肽包含基于此特定肽的同源物的可变残基在肽框架内的特定位置处表示的氨基酸残基的混合物。在一些实施方案中，th表位文库序列被设计为维持混杂th表位的结构基序并适应对更广范围的单倍型的反应性。在一些实施方案中，ssal的成员可以是退化的th表位ssal1th1，其是以取自麻疹病毒的f蛋白的混杂表位为模型得到的(例如seqidno：1-5)。在其他实施方案中，ssal的成员可以是退化的th表位ssal2th2，其是以取自hbsag1的混杂表位为模型得到的(例如seqidno：19-24)。
合成后存在于组合人工th表位(或ssal)的混合物中的肽总数可以通过将在每个可变位置处的可用选项的数量相乘来计算。例如，seqidno：16代表32种不同肽的组合，因为它含有5个可变位置，其中每个可变位置具有2个不同残基的选项(即2x2x2x2x2＝25＝32)。类似地，seqidno：5代表524,288种不同肽的组合(即2x4x2x4x2x4x4x4x2x4x2x4＝25x47＝524,288)。组合人工th表位序列包括(a)包含可变序列的所有肽的混合物和(b)在组合内含有单个序列的每个个别肽。
在一些实施方案中，可以在位置1处添加带电残基glu或asp以增加th的疏水面周围的电荷。在一些实施方案中，两性螺旋的疏水面可以通过位于位置2、5、8、9、10、13和16的疏水性残基加以维持。在一些实施方案中，位于位置2、5、8、9、10和13的氨基酸残基可被改变，以提供具有结合各种mhc限制元素能力的表面。在一些实施方案中，氨基酸残基的变化可扩大人工th表位的免疫反应范围。
人工th表位可包含已知混杂th表位的所有特性和特征。在一些实施方案中，人工th表位是ssal的成员。在一些实施方案中，人工th位点可与取自自身抗原和外来抗原的肽序列组合，以提供针对位点特异性目标的增强的抗体反应。在一些实施方案中，人工th表位免疫原可提供有效且安全的抗体反应，展现出高免疫效力，并表现出广泛的反应性反应。
已提供理想化的人工th表位。这些理想化的人工th表位是以wo95/11998公开的两种已知天然th表位和ssal肽原型为模型。ssals包含组合mhc分子结合基序(meisteretal.，1995)，旨在引起遗传多样性群体成员之间的广泛免疫反应。ssal肽原型是基于麻疹病毒和b型肝炎病毒抗原的th表位设计，通过引入多个mhc结合基序进行修饰。其他th表位的设计是以其他已知th表位为模型，通过简化、添加和/或修饰多个mhc结合基序以产生一系列新的人工th表位。将混杂人工th位点掺入具有多种目标抗原位点的合成肽免疫原中。得到的嵌合肽能够刺激针对目标抗原位点的有效抗体反应。
表1中示为“ssal1th1”的原型人工t辅助细胞(th)表位，其为四种肽(seqidno：1-4)的混合物，是以麻疹病毒f蛋白的混杂th表位为模型的理想化th表位(partidosetal.1991)。模型th表位，如表1所示的“mvfth
可以简化组合人工th表位以提供一系列单一序列表位。例如，seqidno：5的组合序列可简化为seqidno：1-4所代表的单一序列th表位。这些单一序列th表位可与目标抗原位点偶联以提供增强的免疫原性。
在一些实施方案中，可通过利用非极性和极性不带电的氨基酸(例如ile和ser)延伸氨基端并利用带电和疏水性氨基酸(例如lys和phe)延伸羧基端来改善th表位的免疫原性。另外，对th表位添加一个赖氨酸残基或多个赖氨酸残基(例如kkk)可改善肽在水中的溶解度。进一步的修饰包括利用共同的mhc结合基序axtxil取代羧基端(meisteretal，1995)。
人工th表位可以是已知的天然th表位或ssal肽原型。在一些实施方案中，来自ssal的th表位可以掺入组合mhc分子结合基序，其旨在引起遗传多样性群体成员之间的广泛免疫反应。在一些实施方案中，可以基于麻疹病毒和b型肝炎病毒抗原的th表位设计ssal肽原型，通过引入多个mhc结合基序进行修饰。在一些实施方案中，人工th表位可简化、添加和/或修饰多个mhc结合基序以产生一系列新的人工th表位。在一些实施方案中，可以将新改造的混杂人工th位点掺入具有多种目标抗原位点的合成肽免疫原中。在一些实施方案中，得到的嵌合肽能够刺激针对目标抗原位点的有效抗体反应。
本公开人工th表位可以是包含ii类mhc分子结合位点的天然或非天然氨基酸的连续序列。在一些实施方案中，人工th表位可增强或刺激针对目标抗原位点的抗体反应。在一些实施方案中，th表位可由连续或不连续的氨基酸区段组成。在一些实施方案中，并非th表位的每个氨基酸都参与mhc识别。在一些实施方案中，本发明th表位可包含免疫功能同源物，例如免疫增强同源物、交叉反应性同源物及其区段。在一些实施方案中，功能性th同源物可进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的保守取代、添加、缺失和插入，并提供th表位的th刺激功能。
th表位可直接地连接至靶点。在一些实施方案中，th表位可通过任选的异源性间隔子(例如肽间隔子(例如gly-gly或(ε-n)lys))连接至靶点。间隔子物理性地将th表位与b细胞表位分开，并且可破坏由于th表位或功能同源物与目标抗原位点连接所产生的任何人工二级结构的形成，从而消除对th和/或b细胞反应的任何干扰。
th表位包括理想化的人工th表位和组合理想化的人工th表位，如表1所示。在一些实施方案中，th表位是seqidno：1-52的混杂th细胞表位、其任何同源物和/或其任何免疫类似物。th表位还包括th表位的免疫类似物。免疫性th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应性类似物和任何这些th表位的区段，其足以增强或刺激针对目标抗原位点的免疫反应。
th表位肽的功能性免疫类似物也是有效的并且被包括作为本发明的一部分。功能性免疫th类似物可包括在th表位中1至约5个氨基酸残基的保守取代、添加、缺失和插入，其实质上未改变th表位的th刺激功能。如上文针对目标抗原位点所述，可以利用天然或非天然氨基酸完成保守取代、添加和插入。表1识别了th表位肽的功能类似物的另一种变化。具体而言，mvf1和mvf2th的seqidno：6和7是mvf4和mvf5th的seqidno∶16和17的功能类似物，因为利用在氨基端和羧基端将各两个氨基酸删除(seqidno：6和7)或包含(seqidno：16和17)而使其氨基酸骨架有所区别。在类似序列的这两个系列之间的差异并不会影响包含于此些序列中的th表位的功能。因此，功能免疫th类似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白mvf1-4ths(seqidno：6-18)和衍生自肝炎表面蛋白质hbsag1-3ths(seqidno：19-31)的th表位的多种版本。
在肽免疫原构建体中的th表位可共价连接于目标抗原位点的氨基端或羧基端以制造嵌合th/b细胞位点肽免疫原。在一些实施方案中，th表位可通过化学偶联或通过直接合成共价连接至目标抗原位点。在一些实施方案中，th表位是共价连接至目标抗原位点的氨基端。在其他实施方案中，th表位是共价连接至目标抗原位点的羧基端。在某些实施方案中，超过一个的th表位共价连接至目标抗原位点。当超过一个的th表位连接至目标抗原位点时，每一个th表位可具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列。另外，当超过一个的th表位连接至目标抗原位点时，th表位可以以任何顺序排列。例如，th表位可连续地连接至目标抗原位点的氨基端，或连续地连接至目标抗原位点的羧基端，或当不同的th表位共价连接至目标抗原位点的羧基端时，th表位可共价连接至目标抗原位点的氨基端。th表位相对于目标抗原位点的排列并无限制。
在一些实施方案中，th表位直接地共价连接至目标抗原位点。在其他实施方案中，th表位通过下文进一步详细描述的异源性间隔子共价连接至目标抗原位点。
合成的方法
可以使用化学方法合成本公开的肽免疫原。在一些实施方案中，可以使用固相肽合成来合成本公开的肽免疫原。在一些实施方案中，利用t-boc或fmoc以保护α-nh2或侧链氨基酸使用自动化美利弗德(merrifield)固相肽合成法来合成本发明的肽。
作为组合序列呈递的异源性th表位肽包含基于此特定肽的同源物的可变残基在肽框架内的特定位置处表示的氨基酸残基的混合物。通过在合成过程中在指定位置添加指定的受保护氨基酸的混合物而非一种特定氨基酸，可以在一个过程中合成组合肽的组装。此类组合异源性th表位肽组装可以允许对具有不同遗传背景的动物的广泛th表位覆盖。异源性th表位肽的代表性组合序列包括seqidno：5、10、13、16、24和27，其显示于表1中。本发明表位肽对来自遗传多样性群体的动物和患者提供广泛的反应性和免疫原性。
有趣的是，在th表位、b细胞表位和/或含有th表位和b细胞表位的肽免疫原构建体的合成过程中可能引入的不一致性和/或错误在接受治疗的动物中通常不会妨碍或阻止期望的免疫反应。事实上，肽合成过程中可能引入的不一致性/错误会伴随目标肽合成产生多种肽类似物。这些类似物可包括氨基酸插入、缺失、取代和提前终止。如上所述，当作为用于免疫诊断目的的固相抗原，或作为用于疫苗接种目的的免疫原用于免疫应用时，这些肽类似物适合作为肽制剂中的抗原性和免疫原性的贡献者。
包含th表位的肽免疫原构建体在与目标抗原位点串联的单一固相肽合成中同时产生。th表位还包括th表位的免疫类似物。免疫性th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应性类似物和任何这些th表位的区段，其足以增强或刺激针对目标抗原位点的免疫反应。
在完成期望肽免疫原的组装后，可以处理固相树脂以从树脂上切割肽并移除氨基酸侧链上的官能基团。可以通过hplc纯化游离肽并描绘其生物化学特性。在一些实施方案中，使用氨基酸分析描绘游离肽的生物化学特性。在一些实施方案中，使用肽序列表征游离肽。在一些实施方案中，使用质谱法表征游离肽。
本发明肽免疫原可通过形成硫醚键使用卤代乙酰化(haloacetylated)和半胱氨酸化(cysteinylated)肽来合成。在一些实施方案中，可以将半胱氨酸添加至含th肽的羧基端，并且半胱氨酸残基的硫醇基可以用于与亲电子基团(例如nα氯乙酰-修饰基团或马来酰亚胺(maleimide)衍生的赖氨酸残基的α-或ε-nh2基团)形成共价键。得到的合成中间物可连接至目标抗原位点肽的氨基端。
可以使用核酸克隆技术合成更长的合成肽缀合物。在一些实施方案中，本发明th表位可以通过表达重组dna和rna来合成。为了构建表达本发明th/目标抗原位点肽的基因，可以将氨基酸序列反向翻译成核酸序列。在一些实施方案中，利用对于其中具有待表达基因的生物体来说优化的密码子将氨基酸序列反向翻译成核酸序列。可以制备编码肽的基因。在一些实施方案中，编码肽的基因可以通过合成编码肽和必要调节元件的重叠寡核苷酸来制备。可以组装合成的基因并将其插入期望的表达载体中。
本公开的合成核酸序列可包括编码本发明th表位的核酸序列、包含th表位的肽，其免疫功能同源物，以及以非编码序列中的变化为特征的核酸构建体，其未改变肽或编码的th表位的免疫学特性。可将合成的基因插入合适的克隆载体中，并可获得且表征重组体。然后可以在适合于所选表达系统和宿主的条件下表达th表位和包含th表位的肽。可以纯化和表征th表位或肽。
药物组合物
本公开还描述包含本公开肽免疫原的药物组合物。在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以用作药学上可接受的递送系统，用于施用肽免疫原。在一些实施方案中，本公开的药物组合物可包含免疫有效量的一种或多种肽免疫原。
本发明肽免疫原可配制成免疫原性组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物可包含佐剂、乳化剂，药学上可接受的载体或疫苗组合物中常规提供的其他成分。可用于本发明的佐剂或乳化剂包括明矾、弗氏不完全佐剂(ifa)、liposyn、皂苷、角鲨烯、l121、emulsigen、单磷酸脂质a(mpl)、二甲基双十八烷基溴化铵(dda)、qs21和isa720、isa51、isa35、isa206和其他有效的佐剂和乳化剂。在一些实施方案中，本发明的组合物可以配制用于立即释放。在一些实施方案中，本发明的组合物可以配制用于持续释放。
药物组合物中使用的佐剂可包括油、铝盐、仿病毒颗粒(virosomes)、磷酸铝(例如
在一些实施方案中，药物组合物含有montanidetmisa51(由植物油和甘露醇油酸酯所组成的油质佐剂组合物，用以制造油包水乳液)、
图1a是示意性概括的成分，其可以被包含在具有含有th表位载体(包括
图1b总结本文所述t辅助细胞表位平台(包括
在一些实施方案中，配制组合物用作疫苗。疫苗组合物可以通过任何方便的途径施用，包括皮下、口服、肌肉内、腹膜内、肠胃外或肠内给药。在一些实施方案中，免疫原以单剂量施用。在一些实施方案中，免疫原以多剂量施用。
药物组合物可以以液体溶液或悬浮液形式配制成注射剂。含有肽免疫原构建体的液体媒介物也可在注射前制备。药物组合物可利用任何适合的用法施用，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等，并且可在任何适合的递送装置中施用。在某些实施方案中，可配制药物组合物供静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。也可制备适用于其他施用方式的药物组合物，包括口服和鼻内应用。
本发明的组合物可含有有效量的一种或多种肽免疫原和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，合适剂量单位形式的组合物可含有受试者每公斤体重约0.5μg至约1mg的肽免疫原。在一些实施方案中，合适剂量单位形式的组合物可含有受试者每公斤体重约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约200μg、约300μg、约400μg、约500μg、约600μg、约700μg、约800μg、约900μg或约1000μg的肽免疫原。在一些实施方案中，合适剂量单位形式的组合物可含有受试者每公斤体重约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg或约500μg的肽免疫原。在一些实施方案中，合适剂量单位形式的组合物可含有受试者每公斤体重约0.5μg至约1mg的肽免疫原。在一些实施方案中，合适剂量单位形式的组合物可含有约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约200μg、约300μg、约400μg、约500μg、约600μg、约700μg、约800μg、约900μg或约1000μg的肽免疫原。在一些实施方案中，合适剂量单位形式的组合物可含有约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg或约500μg的肽免疫原。
当以多剂量递送时，组合物可以按剂量分成适当的量。在一些实施方案中，剂量为约0.2mg至约2.5mg。在一些实施方案中，剂量为约1mg。在一些实施方案中，剂量为约1mg并通过注射施用。在一些实施方案中，剂量为约1mg并且以肌肉内方式施用。在一些实施方案中，一剂之后可以是重复(加强)剂量。可根据受试者的年龄、体重和一般健康状况优化剂量。
包含肽免疫原混合物的疫苗可在更广泛的群体中提供增强的免疫功效。在一些实施方案中，肽免疫原的混合物包含衍生自mvfth和hbsagth的th位点。在一些实施方案中，包含肽免疫原混合物的疫苗可以提供针对目标抗原位点的改善的免疫反应。
针对th/目标抗原位点缀合物的免疫反应可以藉由通过包埋于生物降解微粒中或于其上进行递送而加以改善。在一些实施方案中，肽免疫原可以在有或无佐剂的状况下进行包封，并且这种微粒可以携带免疫刺激佐剂。在一些实施方案中，微粒可与肽免疫原共同施用以增强免疫反应。
免疫刺激复合物
本公开也关于含有与cpg寡核苷酸形成免疫刺激复合物的肽免疫原构建体的药物组合物。此类免疫刺激复合物特别适合作为佐剂和肽免疫原稳定剂。免疫刺激复合物为颗粒形式，其可有效地将肽免疫原呈递给免疫系统的细胞以产生免疫反应。免疫刺激复合物可配制成用于肠胃外施用的悬浮液。免疫刺激复合物还可配制成w/o乳液形式，作为与矿物盐或原位凝胶聚合物结合的悬浮液，用于在肠胃外施用后将肽免疫原有效递送至宿主免疫系统的细胞。
稳定化的免疫刺激复合物可藉由通过静电结合将肽免疫原构建体与阴离子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其组合复合而形成。稳定化的免疫刺激复合物可作为免疫原递送系统并入药物组合物中。
在某些实施方案中，将肽免疫原构建体设计成包含阳离子部份，其在范围为5.0至8.0的ph下带有正电荷。肽免疫原构建体或构建体的混合物的阳离子部份的净电荷计算是依据，每个赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)带有+1电荷，每个天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)带有-1电荷，以及序列中其他氨基酸所带的电荷为0。将在肽免疫原构建体中的阳离子部份的电荷相加，并表示为净平均电荷。适合的肽免疫原具有具有净平均正电荷为+1的阳离子部份。优选地，肽免疫原具有范围大于+2的净正电荷。在一些实施方案中，肽免疫原构建体的阳离子部份为异源性间隔子。在某些实施方案中，当间隔子序列为(α，ε-n)lys、ε-n-lys-lys-lys-lys(seqidno：53)或lys-lys-lys-ε-n-lys(seqidno：54)时，肽免疫原构建体的阳离子部份具有+4的电荷。
如本文所述的“阴离子型分子”是指在范围为5.0至8.0的ph下带有负电荷的任何分子。在某些实施方案中，阴离子型分子是寡聚物或聚合物。寡聚物或聚合物上的净负电荷计算是依据，在寡聚物中的每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团带有-1电荷。适合的阴离子型寡核苷酸是具有8至64个核苷酸碱基的单链dna分子，其cpg基序的重复数在1至10的范围内。优选地，cpg免疫刺激性单链dna分子含有18至48个核苷酸碱基，其cpg基序的重复数在3至8的范围内。
更优选地，阴离子型寡核苷酸可以以分子式5′x1cgx23′表示，其中c和g是未甲基化的；且x1是选自由a(腺嘌呤)、g(鸟嘌呤)和t(胸腺嘧啶)组成的群组；且x2是c(胞嘧啶)或t(胸腺嘧啶)。或者，阴离子型寡核苷酸可以以分子式5′(x3)2cg(x4)23′表示，其中c和g是未甲基化的；且x3是选自由a、t或g组成的群组；且x4是c或t。在某些实施方案中，cpg寡核苷酸可以是cpg1(seqidno：146)、cpg2(seqidno：147)或cpg3(seqidno：148)。
所得到的免疫刺激复合物呈颗粒形式，其大小通常在1-50微米的范围内，且是许多因素(包括相互作用成份的相对电荷化学计量和分子量)的函数。微粒免疫刺激复合物具有提供佐剂化和在体内上调特异性免疫反应的优点。此外，稳定化的免疫刺激复合物适用于通过各种方法(包括油包水乳液、矿物盐悬浮液和聚合凝胶)制备药物组合物。
应用
含有本公开人工th表位的肽免疫原可用于医学和兽医学应用。在一些实施方案中，肽免疫原可用作疫苗以提供传染病保护性免疫、用作治疗由正常生理过程失常所引起的疾病的免疫疗法、用作治疗癌症的免疫疗法，以及用作干预或改变正常生理过程的药剂。
当与各种微生物、蛋白质或肽的目标b细胞表位组合时，本公开的人工th表位可以引发免疫反应。在一些实施方案中，本公开的人工th表位可以与一个目标抗原位点连接。在一些实施方案中，本公开的人工th表位可以与两个目标抗原位点连接。
本公开的人工th表位可以与目标抗原位点连接以预防和/或治疗各种疾病和病症。在一些实施方案中，本发明的组合物可用于预防和/或治疗神经退行性疾病、感染性疾病、动脉硬化、前列腺癌、预防公猪异味、动物的免疫去势、治疗子宫内膜异位症、乳腺癌和受性腺类固醇激素影响的其他妇科癌症，以及用于男性和女性避孕。例如，人工th表位可以与下列蛋白质的抗原位点连接：
a.生长抑素(somatostatin)以促进经济动物的生长。
b.ige以治疗过敏性疾病。
c.th细胞的cd4受体以治疗和/或预防人类免疫缺陷病毒(hiv)感染和免疫失调。
d.口蹄疫(fmd)病毒衣壳蛋白以预防fmd。
e.hiv病毒颗粒表位以预防和治疗hiv感染。
f.恶性疟原虫的环子孢子蛋白抗原以预防和治疗疟疾。
g.cetp以预防和治疗动脉硬化。
h.aβ以针对阿尔兹海默症进行治疗或疫苗接种。
i.α-突触核蛋白以针对帕金森氏症进行治疗或疫苗接种。
j.tau以针对包括阿尔兹海默症在内的tau蛋白病进行治疗和疫苗接种。
k.il-31以治疗特应性皮炎。
l.cgrp以预防和治疗偏头痛。
m.iapp(胰岛淀粉素)以预防和治疗2型糖尿病。
已发现使用异源性人工th表位对于靶向涉及神经退行性疾病的蛋白质(例如aβ、α-突触核蛋白、tau)特别重要。具体地，含有靶向神经退行性蛋白的内源性th表位的肽免疫原在施用于受试者时可引起脑部炎症。相反地，含有连接至神经退行性蛋白的抗原位点的异源性人工th表位的肽免疫原构建体不会引起脑部炎症。
图2是用以说明使用本申请中所述th表位平台所获得的理论结果的图。此图显示含有与th表位缀合的b细胞表位的肽免疫原构建体具有快速的开始时间，可迅速达到cmax。cmax在治疗范围内，其介于最小有效浓度(mec)和最小治疗浓度(mtc)之间。以下实施例表明，通过改变使用的th表位、肽免疫原构建体的剂量和佐剂，可以控制和/或调整cmax、作用持续时间、开始时间和tmax。
淀粉样蛋白β
aβ肽被认为是阿尔兹海默症发病和进展的中心。aβ寡聚物和aβ纤维的毒性形式被认为是导致阿尔兹海默症和痴呆的病症的突触和神经元死亡的原因。针对阿尔兹海默症的成功改善病程进展的治疗可包括影响脑中aβ分布的产品。
本公开的肽免疫原可包含th细胞表位和aβ靶向肽。在一些实施方案中，th细胞表位是th1或th2。在一些实施方案中，肽免疫原可包含th1和th2。aβ靶向肽或b细胞表位可以是aβ1-14、aβ1-16、aβ1-28、aβ17-42或aβ1-42。在一些实施方案中，aβ靶向肽是aβ1-14。如本文所用，术语aβx-y表示全长野生型aβ蛋白的从氨基酸x至氨基酸y的aβ序列。
本公开的肽免疫原可包含一种以上的aβ靶向肽。在一些实施方案中，肽免疫原可包含两种aβ靶向肽。在一些实施方案中，肽免疫原可包含一种aβ1-14和一种aβ1-42肽。在一些实施方案中，肽免疫原可包含两种aβ1-14靶向肽。在一些实施方案中，肽免疫原可包含两种aβ1-14靶向肽，每种肽与不同的th细胞表位连接作为嵌合肽。
本公开还提供包含两种aβ1-14靶向肽的aβ1-14肽疫苗，每种肽与不同的th细胞表位连接作为嵌合肽。在一些实施方案中，可以将嵌合aβ1-14肽配制在th1偏向递送系统中以使t细胞炎症反应性最小化。在一些实施方案中，可以将嵌合aβ1-14肽配制在th2偏向递送系统中以使t细胞炎症反应性最小化。
具体实施方案
(1)一种选自由seqidno：32-52组成的群组的混杂人工t辅助细胞(th)表位。
(2)一种利用以下分子式代表的肽免疫原构建体：
(a)n-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
{(a)n-(th)p-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)p-(a)n-x}m
其中：
每个a独立地为氨基酸；
每个b独立地为异源性间隔子；
每个th独立地为如(1)的混杂人工th表位；
目标抗原位点为b细胞表位，其来自外来抗原蛋白、自身抗原蛋白，或其免疫反应类似物；
x为氨基酸、α-cooh或α-conh2；
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为1、2、3或4；
o为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；以及
p为0、1、2、3或4。
(3)如(2)的肽免疫原构建体，其中目标抗原位点为b细胞表位，其来自选自由口蹄疫(fmd)衣壳蛋白、来自猪生殖和呼吸道综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)和单纯疱疹病毒(hsv)的糖蛋白组成的群组的外来抗原蛋白。
(4)如(2)的肽免疫原构建体，其中目标抗原位点为b细胞表位，其来自选自由下列组成的群组的自身抗原蛋白：
(a)具有seqidno：56、57、58、59或60的氨基酸序列的aβ肽；
(b)具有seqidno：61的氨基酸序列的α-syn肽；
(c)具有seqidno：62的氨基酸序列的igeempd肽；
(d)具有seqidno：63、69、70或71的氨基酸序列的tau肽；
(e)具有seqidno：64或72的氨基酸序列的il-31肽；以及
(f)具有seqidno：145的氨基酸序列的il-6肽。
(5)如(2)的肽免疫原构建体，其中组分b的异源性间隔子是选自由氨基酸、lys-、gly-、lys-lys-lys-、(α，ε-n)lys、ε-n-lys-lys-lys-lys(seqidno：53)、lys-lys-lys-εnlys(seqidno：54)、gly-gly、pro-pro-xaa-pro-xaa-pro(seqidno：55)及其任意组合组成的群组。
(6)如(2)的肽免疫原构建体，其中异源性间隔子是选自由(α，ε-n)lys、ε-n-lys-lys-lys-lys(seqidno：53)和lys-lys-lys-εnlys(seqidno：54)组成的群组。
(7)一种包含如(2)的肽免疫原构建体的药物组合物。
(8)一种在受试者中预防和/或治疗疾病、症状或病痛的方法，其包含将如(7)的药物组合物的药学有效量施用于受试者。
(9)如(8)的方法，其中目标抗原位点为b细胞表位，其来自选自由口蹄疫(fmd)衣壳蛋白、来自猪生殖和呼吸道综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)和单纯疱疹病毒(hsv)的糖蛋白组成的群组的外来抗原蛋白。
(10)如(8)的方法，其中目标抗原位点为b细胞表位，其来自选自由下列组成的群组的自身抗原蛋白：
(a)具有seqidno：56、57、58、59或60的氨基酸序列的aβ肽；
(b)具有seqidno：61的氨基酸序列的α-syn肽；
(c)具有seqidno：62的氨基酸序列的igeempd肽；
(d)具有seqidno：63、69、70或71的氨基酸序列的tau肽；
(e)具有seqidno：64或72的氨基酸序列的il-31肽；以及
(f)具有seqidno：145的氨基酸序列的il-6肽。
(11)一种利用以下分子式代表的肽免疫原构建体：
(a)n-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(a)n-x
或
(a)n-(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)m-(a)n-x
或
{(a)n-(th)p-(b)o-(目标抗原位点)-(b)o-(th)p-(a)n-x}m
其中：
每个a独立地为氨基酸；
每个b独立地为异源性间隔子；
每个th独立地为选自由seqidno：1-52组成的群组的混杂人工th表位；
目标抗原位点为ctl表位、肿瘤相关糖类抗原(taca)、来自新抗原的b细胞表位、小分子药物或其免疫反应类似物；
x为氨基酸、α-cooh或α-conh2；
n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m为1、2、3或4；
o为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；以及
p为0、1、2、3或4。
(12)如(11)的肽免疫原，其中目标抗原位点为ctl表位，其具有选自由seqidno：76-144组成的群组的氨基酸序列。
(13)如(12)的肽免疫原，其中目标抗原位点为来自hiv的ctl表位，其选自由seqidno：76-82组成的群组。
(14)如(12)的肽免疫原，其中目标抗原位点为来自hsv的ctl表位，其选自由seqidno：83-106组成的群组。
(15)如(12)的肽免疫原，其中目标抗原位点为来自fmdv的ctl表位，其选自由seqidno：107-123组成的群组。
(16)如(12)的肽免疫原，其中目标抗原位点为来自prrsv的ctl表位，其选自由seqidno：124-142组成的群组。
(17)如(12)的肽免疫原，其中目标抗原位点为来自csfv的ctl表位，其选自由seqidno：143-144组成的群组。
(18)如(11)的肽免疫原，其中目标抗原位点为taca，其选自由gd3、gd2、globo-h、gm2、fucosylgm1、gm2、psa、ley、lex、slex、slea、tn、tf和stn组成的群组。
(19)如(11)的肽免疫原，其中目标抗原位点为来自新抗原的b细胞表位，其选自由seqidno：73-75组成的群组。
(20)如(11)的肽免疫原，其中目标抗原位点为小分子药物。
(21)如(11)的肽免疫原构建体，其中组分b的异源性间隔子是选自由氨基酸、lys-、gly-、lys-lys-lys-、(α，ε-n)lys、ε-n-lys-lys-lys-lys(seqidno：53)、lys-lys-lys-εnlys(seqidno：54)、gly-gly、pro-pro-xaa-pro-xaa-pro(seqidno：55)及其任意组合组成的群组。
(22)如(11)的肽免疫原构建体，其中异源性间隔子是选自由(α，e-n)lys、ε-n-lys-lys-lys-lys(seqidno：53)和lys-lys-lys-εεnlys(seqidno：54)组成的群组。
(23)一种包含如(11)的肽免疫原构建体的药物组合物。
(24)一种在受试者中预防和/或治疗疾病、症状或病痛的方法，其包含将如(23)的药物组合物的药学有效量施用于受试者。
(25)如(24)的方法，其中疾病、症状或病痛为hiv且其中目标抗原位点为来自hiv的ctl表位，其选自由seqidno：76-82组成的群组。
(26)如(24)的方法，其中疾病、症状或病痛为hsv且其中目标抗原位点为来自hsv的ctl表位，其选自由seqidno：83-106组成的群组。
(27)如(24)的方法，其中疾病、症状或病痛为fmdv且其中目标抗原位点为来自fmdv的ctl表位，其选自由seqidno：107-123组成的群组。
(28)如(24)的方法，其中疾病、症状或病痛为prrsv且其中目标抗原位点为来自prrsv的ctl表位，其选自由seqidno：124-142组成的群组。
(29)如(24)的方法，其中疾病、症状或病痛为csfv且其中目标抗原位点为来自csfv的ctl表位，其选自由seqidno：143-144组成的群组。
(30)如(24)的方法，，其中疾病、症状或病痛为csfv且其中目标抗原位点是来自csfv的ctl表位，其选自由seqidno：143-144组成的群组。
(31)如(24)的方法，其中疾病、症状或病痛为癌症且其中目标抗原位点为taca，其选自由gd3、gd2、globo-h、gm2、fucosylgm1、gm2、psa、ley、lex、slex、slea、tn、tf和stn组成的群组。
(32)如(24)的方法，其中疾病、症状或病痛为癌症且其中目标抗原位点为来自新抗原的b细胞表位，其选自由seqidno：73-75组成的群组。
(33)一种在受试者中调整免疫反应的方法，包含：
(a)制备一种以上如(11)的肽免疫原构建体，其中在每个肽免疫原构建体上的目标抗原位点保持恒定且th表位为不同；
(b)制备一种以上的药物组合物，每种药物组合物包含在(a)中制备的肽免疫原构建体的一种和药学上可接受的佐剂或载体；
(c)将在(b)中制备的每个药物组合物施用于不同的受试者；
(d)在每个受试者监测免疫反应；以及
(e)选择产生期望免疫反应的药物组合物。
(34)如(33)的方法，其中在每个药物组合物中的药学上可接受的佐剂或载体是相同的。
(35)如(33)的方法，其中在每个药物组合物中的药学上可接受的佐剂或载体是不同的。
实施例1
肽和肽免疫原构建体的制备
使用自动化固相合成法合成肽(包括肽免疫原构建体)，通过预备的hplc进行纯化，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof)质谱仪、氨基酸分析和反相hplc描绘特性。
aβ疫苗(ub-311)包含两种肽免疫原，每种都具有氨基端aβ1-14肽，其通过氨基酸间隔子合成地连接至衍生自两种病原体蛋白质(b型肝炎表面抗原和麻疹病毒融合蛋白)的不同th细胞表位肽(
将ub-311配制在含有明矾的th2偏向递送系统中，且含有等摩尔比值的肽aβ1-14-εk-hbsag3th和aβ1-14-εk-kkk-mvf5th。将两种aβ免疫原与聚阴离子cpg寡脱氧核苷酸(odn)混合以形成微米级颗粒的稳定免疫刺激复合物。将铝矿物盐(
表3a和3b分别显示了几个例示性目标抗原位点(b细胞表位和ctl表位)的序列。表4中显示了几种例示性的肽免疫原构建体序列，其包含aβ1-14、大鼠il-672-82和ige-empd1-39作为目标抗原位点以共价连接至th表位。表5中显示肽免疫原构建体序列，其包含共价连接至各种th表位的α-突触核蛋白111-132。表6中显示肽免疫原构建体序列，其包含共价连接至各种th表位的ige-empdg1-c39。表7中显示肽免疫原构建体序列，其包含共价连接至各种th表位的人类il-673-83。表9中显示肽免疫原构建体序列，其包含共价连接至
实施例2
将α-突触核蛋白111-132、igeempd1-39和il-673-83肽免疫原构建体设计中用以增强这些选定的b细胞表位肽免疫原性的衍生自病原体的异源性t辅助细胞表位及其内含物进行排序
a.肽免疫原合成
来自α-突触核蛋白(aas111-132；seqidno：61)、igeempd(aas1-39；seqidno：62)和il-6(aas73-83；seqidno：145)的三个短b细胞表位肽，其功能特性已经被广泛地表征，用以作为代表性的目标抗原位点。根据以下所示的分子式将这三个b细胞表位制成肽免疫原构建体，以评估代表性的混杂人工th表位(选自seqidno：1-52)使三个个别的目标抗原位点具有免疫原性的能力：
(th)m-(b)o-(目标抗原位点)-x
其中：
th选自本文公开的人工th表位且m为1；
(b)o是具有seqidno：53或54氨基酸序列的间隔子；
目标抗原位点是seqidno：61、62或145的b细胞表位；以及
x是氨基酸-conh2。
产生的α-突触核蛋白、igeempd和il-6肽免疫原构建体的氨基酸序列分别显示于表5、6和7中。
b.含有肽免疫原构建体的制剂和免疫接种
在豚鼠中进行代表性的免疫原性研究，以对表1中所显示的各个异源性t辅助细胞表位的相对效力进行排序。在产生各种α-突触核蛋白、igeempd和il-6肽免疫原后，如表8所示将含有相同th表位序列的构建体以1∶1∶1比例混合在一起。例如，将包含
通过肌肉内(i.m.)注射在初次免疫后(wpi)第0、3和6周将制剂施用于豚鼠(每组3只)。在0、3、6和8wpi时采集血清样品以评估抗体效价水平。
c.免疫原性结果
将在初次免疫后第8周(8wpi)获得的结果用于对不同的α-突触核蛋白(图3的上图)、ige(图3的下图)和il-6(表15)肽免疫原构建体进行排名。包含在整个α-突触核蛋白研究中获得的免疫原性数据的图如图4a所示；包含在整个ige-empd研究中获得的免疫原性数据的图如图5所示；包含在整个il-6研究中获得的免疫原性数据的图如图6所示。
所有th表位都能够不同程度地增强三种短b细胞表位肽的免疫原性。具体而言，th表位kkkmvf3th(seqidno：13)、破伤风梭菌tt2th(seqidno：36)、ebvebna-1th(seqidno：42)、mvf5th；
对于igeempd肽(seqidno：62)而言，th表位破伤风梭菌tt4th(seqidno：38)、
对于il-673-83环状肽(seqidno：145)而言，发现th表位hbsag3th；
这些结果表明，当使用本文公开的不同人工th表位时可以获得针对单一目标b细胞表位不同的免疫原性。需要针对在不同物种(包括灵长类动物)中的每种肽免疫原构建体的免疫原性进行仔细校正，以确保最终th肽选择和最终疫苗制剂开发的成功。
d.达到cmax的速率
针对共价连接至不同th表位的α-突触核蛋白肽免疫原构建体的免疫原性数据做进一步分析显示，以不同的速率达到特定的cmax取决于所使用的th表位。图4b包含图4a中所报导免疫原性数据的子集。具体而言，利用第13和21号制剂免疫豚鼠，制剂含有共价连接至α-突触核蛋白肽(seqidno：61)的th表位kkkmvf3th(seqidno：13)和ebvebna-1th(seqidno：42)，其可在8wpi达到相同的cmax，但是是以不同的速率达到。特别地，含有kkkmvf3th(seqidno：13)的α-突触核蛋白肽免疫原构建体比含有ebvebna-1th(seqidno：42)的α-突触核蛋白肽免疫原构建体更快地达到其cmax。类似地，含有
e.总结
此实验的结果表明，利用肽免疫原构建体所引起的免疫反应(包括抗体效价、cmax、抗体产生的开始、反应的持续时间等)可以通过选择与b细胞表位缀合的th表位来加以调节。因此，可以通过改变在肽免疫原构建体中与b细胞表位缀合的th表位来设计针对目标抗原位点的特异性免疫反应，其有助于定制针对任何患者或受试者的个体特征的个人化医疗。
实施例3
肽免疫原性构建体的免疫原性可取决于b细胞表位序列的长度而异
以下详细描述三种二肽重复(dpr)肽免疫原构建体的免疫和评估。
a.免疫接种和血清收集
制造三种dpr肽免疫原构建体，如表9所示其氨基酸序列为seqidno：236、237和238。将每种肽免疫原配制于montanidetmisa51和cpg中以在初次免疫时利用400μg/ml剂量对豚鼠进行免疫，并在注射后(wpi)第3、6、9和12周时以100μg/ml剂量进行加强免疫，每个组别为3只豚鼠。
b.抗体效价的评估
进行elisa试验以评估专门设计的dpr肽免疫原构建体的免疫原性。利用dprb细胞表位肽或肽免疫原构建体包被板孔，其作为标靶肽。利用10倍连续稀释将豚鼠免疫血清从1∶100稀释至1∶100,000。利用a450临界值设为0.5的a450的线性回归分析计算测试血清的效价，以log10表示。所有肽免疫原均引发针对包被于板孔中的b细胞表位肽的强免疫原性效价。
c.供抗体特异性分析的基于肽的elisa试验
如以下所述开发用以评估免疫血清样品的elisa试验。
将用于免疫动物的相同dpr肽免疫原构建体(即seqidno：236、237或238)以2μg/ml的浓度配制于ph9.5的10mm碳酸氢钠缓冲液中，把此dpr肽免疫原构建体于37℃下作用1小时以分别地包被96孔板的孔。
d.利用elisa试验评估鲑对dpr的抗体反应性
将肽包被的孔与250μl配制于pbs中浓度为3重量百分比的明胶于37℃下反应1小时，以阻断非特异性蛋白质结合位点，接着利用含有0.05体积百分比
e.免疫原性评估
依照实验免疫接种程序收集来自动物的免疫前和免疫血清样品，并在56℃下加热30分钟以使血清补体因子失活。在施用含有dpr肽免疫原构建体的药物组合物后，根据程序获得血液样品，并评估其针对特定靶点的免疫原性。测试了连续稀释的血清，并将稀释倍数的倒数取对数(log10)以表示阳性效价。通过其能力(引发针对目标抗原内期望表位特异性的高效价b细胞抗体反应，且同时将针对用以提供期望b细胞反应增强的th表位的抗体反应性维持在低至可忽略)，而评估特定药物组合物的免疫原性。
f.小鼠免疫血清中dpr水垩的免疫分析
使用抗dpr抗体作为捕获抗体，而生物素标记的抗dpr抗体作为检测抗体，通过夹心elisa(cloud-clon，seb222mu)测定接受dpr衍生肽免疫原接种的小鼠的血清dpr水平。简而言之，将抗体以100ng/孔的量配制于包被缓冲液(15mm碳酸钠，35mm碳酸氢钠，ph9.6)中以固定在96孔板上，并在4℃下隔夜反应。利用200μl/孔的测定稀释液(含0.5％牛血清白蛋白、0.05％
g.抗dpr抗体的纯化
利用亲和柱(thermoscientific，rockford)从由注射后(wpi)第3至15周的豚鼠或小鼠收集的血清中纯化抗dpr抗体，所述豚鼠或小鼠是利用含有不同序列的肽的dpr肽免疫原构建体(seqidno：236、237或238)进行免疫接种的。简而言之，在缓冲液(0.1m磷酸盐和0.15m氯化钠，ph7.2)平衡后，将400μl血清加入nabproteingspincolumn中，然后翻滚式混合(end-over-ehdmixing)10分钟并以5,800xg离心1分钟。利用结合缓冲液(400μl)洗涤柱三次。随后，将洗脱缓冲液(400μl，0.1m甘氨酸，ph2.0)加入spincolumn中再以5,800xg离心1分钟后洗脱抗体。将洗脱的抗体与中和缓冲液(400μl，0.1mtris，ph8.0)混合，并通过使用nano-drop于od280测定以测量这些纯化抗体的浓度，以bsa(牛血清白蛋白)作为标准品。
h.结果
利用elisa评估来自接受免疫接种的豚鼠血清的针对dpr肽或肽免疫原的免疫原性效价。
图7显示在利用3种不同dpr肽免疫原构建体免疫的豚鼠中在15周期间内的抗血清特性。利用10倍连续稀释方式稀释来自0、3、6、9、12和15wpi的豚鼠抗血清。利用dpr肽或肽免疫原包被elisa板。利用a450临界值设为0.5的a450的线性回归分析计算测试血清的效价，以log10表示。
然后将含有poly-ga肽的dpr肽免疫原构建体(seqidno：236、237和238)的elisa数据绘制为如图7所示的图，其中将用于免疫动物的相同肽免疫原结合到elisa板上用于分析。所有dpr免疫原构建体均表现出针对相对应dpr肽或肽免疫原的高免疫原性。elisa结果显示，在免疫之前于第0周，各组别均未观察到可检测的抗体效价。数据显示dpr肽免疫原构建体中二肽重复的长度对抗体效价产生中度影响。具体而言，poly-ga10、15和25个重复的构建体(分别为seqidno：236、237和238)彼此具有不同的免疫原性，如图7所示。
有趣的是，b细胞表位肽的长度可影响肽免疫原构建体的免疫原性谱。图7(左图)显示ga10肽免疫原构建体(seqidno：236)的免疫原性以规律增加的方式随着时间稳定地增加，而图7(中图)显示了ga15肽免疫原构建体(seqidno：237)的免疫原性在下降之前约在9wpi达到峰值，且图7(右图)显示ga25肽免疫原构建体(seqidno：238)的免疫原性以规律增加的方式随着时间稳定地增加。
图7的结果表明，免疫反应可以受到影响，这取决于肽免疫原构建体中所使用b细胞表位的长度。
i.总结
此实验的结果表明，利用肽免疫原构建体所引起的免疫反应(包括抗体效价、cmax、抗体产生的开始、反应的持续时间等)可以通过肽免疫原构建体中所使用的b细胞表位的长度来加以调节。因此，可以通过改变在肽免疫原构建体中的b细胞表位的长度来设计针对目标抗原位点的特异性免疫反应，其有助于定制针对任何患者或受试者的个体特征的个人化医疗。
实施例4
肽免疫原构建体的免疫原性可取决于施用肽的量和给药方案而异
肽免疫原构建体的各种剂量和给药方案的免疫和评估在下文详细描述。
a.ub-311疫苗(aβ肽免疫原)
aβ疫苗(ub-311)包含2种肽免疫原，每种都具有氨基端aβ1-14肽，其通过氨基酸间隔子合成地连接至衍生自2种病原体蛋白质(b型肝炎表面抗原及麻疹病毒融合蛋白)的不同th细胞表位肽(
ub-311配制于含有明矾的th2偏向递送系统中，并含有等摩尔比值的aβ1-14-εk-hbsag3和aβ1-14-εk-kkk-mvf5th肽。将2种aβ免疫原与聚阴离子cpg寡脱氧核苷酸(odn)混合以形成微米级颗粒的稳定免疫刺激复合物。将铝矿物盐(
b.在豚鼠中所使用不同剂量的ub-311
将aβ疫苗(ub-311)以含有0μg、1μg、3μg、10μg、30μg、100μg、300μg、600μg和1,000μg的总肽免疫构建体的剂量在0、3和6wpi施用于豚鼠。在0、3、5、7和9wpi时采集血清样品以评估抗体效价。
图8是显示针对每个免疫剂量所获得的抗体效价结果的图。结果显示，免疫接种中所使用的肽量可以对抗体效价产生明显的影响；但是，应针对每种剂量评估最佳技术效果。具体地，图8显示，将施用肽的剂量从0μg增加至600μg直接地对应于免疫原性的增加。然而，当施用1,000μg肽免疫原时，与较低剂量的肽免疫原构建体相比(将300μg和600μg与1,000μg相比)，免疫原性实际上是降低的。因此，由肽免疫原构建体所获得的最佳免疫原性不是线性的，且应针对每种肽免疫原构建体进行仔细评估。
c.在豚鼠中ub-311的不同给药方案可影响免疫原性
评估aβ疫苗(ub-311)的给药方案，以确定作为初始剂量和加强剂量施用的肽免疫原构建体的量是否可以影响组合物的整体免疫原性。
利用不同的初始剂量和加强剂量进行施用，将ub-311疫苗在0、3和6wpi施用于豚鼠。具体而言，一组动物在周数0wpi施用剂量为100μg的ub-311进行初次免疫，然后利用2个剂量的400μg的ub-311进行加强免疫；而第二组动物在周数0wpi施用剂量为400μg的ub-311进行初次免疫，然后利用2个剂量的100μg的ub-311进行加强免疫。此实验的结果如图9所示。
图9显示给药方案可对ub-311组合物的免疫原性(cmax和持续时间)产生影响。具体而言，与使用高剂量(400μg的ub-311)进行初始免疫并使用较低剂量(100μg的ub-311)进行加强免疫的动物相比，使用低剂量(100μg的ub-311)进行初始免疫并使用高剂量(400μg的ub-311)进行加强免疫的动物获得较高且较长的cmax。
这项研究的结果表明，给药方案可以影响肽免疫原构建体的免疫原性。
图10提供给药方案可以影响肽免疫原构建体的免疫原性的另一个实例。具体而言，图10显示利用aβ疫苗(ub-311)进行关于3个月的加强免疫方案(上图)或6个月的加强免疫方案(下图)在利用300μg的aβ疫苗(ub-311)免疫人类受试者后通过elisa获得的抗aβ1-28抗体效价。每个图中的方框部分突出显示研究中所有人类受试者的平均效价。
图10的结果表明，可以实现不同的免疫原性谱，其取决于提供给受试者的给药方案。
d.在大鼠中所使用的lhrh肽免疫原构建体的不同给药方案
评估包含不同量的lhrh肽免疫原构建体的制剂的给药方案，以确定肽免疫原构建体的总量是否可影响制剂的免疫原性。
具体而言，利用含有如表10所示的3种肽的lhrh组合物免疫三只大鼠。一组大鼠是利用100μg的3种lhrh肽免疫原进行免疫；而第二组大鼠则利用300μg的3种lhrh肽免疫原进行免疫。评估免疫原性和睾酮浓度，并在图11a和11b中报导。
图11a显示利用100μg的lhrh制剂免疫大鼠后所获得的抗体效价和睾酮浓度。图11b显示利用300μg的lhrh制剂免疫大鼠后所获得的抗体效价和睾酮浓度。图11a和11b表明，对于lhrh肽免疫原构建体而言，与较低剂量的lhrh肽免疫原构建体相比，300μg的较高剂量导致较高的抗lhrh效价和较高的睾酮浓度降低。
因此，图11a和11b的结果表明，肽免疫原构建体的剂量水平与所达成的技术效果之间具有直接的相关性。
e.总结
此实验的结果表明，利用肽免疫原构建体所引起的免疫反应(包括抗体效价、cmax、抗体产生的开始、反应的持续时间等)可以通过使用不同的给药方案来加以调节。因此，可以通过改变于患者或受试者的给药方案来设计针对目标抗原位点的特异性免疫反应，其有助于定制针对任何患者或受试者的个体特征的个人化医疗。
实施例5
肽免疫原构建体的免疫原性可取决于所使用的佐剂而异
如下所述，针对配制在不同佐剂中的il-6、igeempd和lhrh肽免疫原构建体进行免疫和评估。
a.il-6肽免疫原构建体
评估使用不同佐剂的包含il-6肽免疫原构建体的制剂的免疫原性。在cia大鼠中进行的poc研究表明，设计的肽免疫原构建体具有高免疫原性和针对il-6诱发的发病机理的治疗功效，这暗示了其在类风湿关节炎和其他自身免疫疾病中的潜在免疫治疗应用。以下研究集中在肽免疫原构建体的优化、佐剂的选择和在cialewis大鼠中的剂量的确定。
在大鼠cia免疫研究中，将作为不同佐剂的montanideisa51和adju-phos与相同的肽免疫原(seqidno：243)和cpg一同配制以分别地进行评估。分为5组的每组五只大鼠接受两种佐剂制剂中的一种，对于这两种不同的佐剂而言总共有10组。利用配制于0.5ml体积中为5、15、45、150μg的不同剂量通过i.m.途径在第-7、7、14、21和28天进行初次免疫和加强免疫以注射治疗组中的所有动物，并进行临床观察直至第35天。在两个不同的无肽免疫原的佐剂安慰剂组中仅接受制剂中的佐剂媒介物的注射。
利用针对包被在板上的大鼠il-6重组蛋白的elisa测定抗il-6效价。结果显示，通过elisa分析，利用两种不同佐剂媒介物注射的两个安慰剂组均未发现可检测到的抗il-6抗体效价，而使用两种佐剂制剂利用il-6免疫原构建体(seqidno：243)免疫的所有治疗组均产生针对大鼠il-6的抗体。一般而言，结果显示观察到剂量依赖性方式，特别是对于使用isa51制剂的组(图12)。与用adjuphos佐剂制备的制剂的低于4(log10)的免疫原性相比，isa51制剂在接受免疫接种的大鼠中诱导的免疫反应高于adjuphos制剂，isa51制剂的免疫原性分别地在所有剂量下均具有超过4的log10数值。
图12显示使用isa51/cpg或adju-phos/cpg配制的不同剂量的seqidno：243免疫的大鼠在43天期间内的抗体反应动力学。利用重组大鼠il-6包被elisa板。利用4倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶4.19x108。利用非线性回归通过将0.45的临界值合并到每个血清样本的4-参数逻辑曲线中来计算待测血清的效价，表示为log10。
此实验的结果表明，佐剂的选择可对肽免疫原构建体的免疫原性具有显著的技术效果。
b.igeempd肽免疫原构建体
评估使用不同佐剂的包含igeempd肽免疫原构建体的制剂的免疫原性。在猕猴中进行的poc研究表明，设计的肽免疫原构建体具有高免疫原性和针对igeempd诱发的发病机理的治疗功效，这暗示了潜在的免疫治疗应用。以下研究集中在肽免疫原构建体的优化和使用igeempd肽免疫原构建体的佐剂的选择。
在猕猴免疫研究中，将作为不同佐剂的adju-phos和montanideisa51与相同的igeempd肽免疫原(seqidno：244)和cpg一同配制以进行评估。
图13a和13b显示说明使用配制在不同佐剂中各种量的seqidno：244的ige-empd肽免疫原构建体免疫猕猴后所获得的抗ige-empd抗体效价的图。图13a显示使用adjuphos作为佐剂使用cpg3配制成稳定化的免疫刺激复合物所获得的抗体效价；而图13b显示使用montanideisa51作为佐剂使用cpg3配制成稳定化的免疫刺激复合物所获得的抗体效价。
此实验的结果表明，与含有adjuphos的制剂相比，当与montantideisa51一起使用时，配制在不同佐剂中的igeempd肽免疫原构建体具有更高的免疫原性(图13a和13b)。因此，使用不同的佐剂可对肽免疫原构建体产生不同的技术效果(免疫原性)。
c.lhrh肽免疫原构建体
评估使用不同佐剂的包含lhrh肽免疫原构建体的制剂的免疫原性。在猪中进行的poc研究表明，设计的肽免疫原构建体具有高免疫原性和针对lhrh诱发的发病机理的治疗功效，这暗示了潜在的免疫治疗应用。以下研究集中在肽免疫原构建体的优化和使用lhrh肽免疫原构建体的佐剂的选择。
在猪免疫研究中，将作为不同佐剂的emulsigend和montanideisa50v与相同浓度的相同的lhrh肽免疫原(seqidno：239-241)一同配制以进行评估。
图14a和14b显示说明使用配制在不同佐剂中各种量的seqidno：239-241的lhrh肽免疫原构建体免疫猪后所获得的抗lhrh抗体效价的图。图14a显示使用emulsigend作为佐剂所获得的抗体效价；而图14b显示使用montanideisa50v作为佐剂所获得的抗体效价。
此实验的结果表明，与含有emulsigend的制剂相比，当与montantideisa50v一起配制时，配制在不同佐剂中的lhrh肽免疫原构建体具有不同的技术效果(睾酮浓度下降)(图14a和14b)。因此，使用不同的佐剂可对肽免疫原构建体产生不同的技术效果(作用持续时间，即，在此案例为免疫去势)。
d.总结
此实验的结果表明，利用肽免疫原构建体所引起的免疫反应(包括抗体效价、cmax、抗体产生的开始、反应的持续时间等)可以通过选择制剂(此制剂含有相同浓度的肽免疫原构建体)中所使用的佐剂来加以调节。因此，可以通过改变缀合至b细胞表位的th表位或制剂中所使用的佐剂来设计针对目标抗原位点的特异性免疫反应，其有助于定制针对任何患者或受试者的个体特征的个人化医疗。
实施例6
在豚鼠体内靶向abeta肽而非th表位的肽免疫原构建体的独特免疫原性
利用以等摩尔比值配制在一起的肽免疫原构建体aβ1-14-εk-kkk-mvf5th(seqidno：67)和aβ1-14-εk-hbsag3th(seqidno：68)在第0周和第4周免疫接种六只豚鼠。在第8周，将动物放血并收集血清样品，以利用elisa试验测定抗aβ肽和抗th表位抗体效价(log10)。所有6只豚鼠的抗体反应特异性地靶向aβ1-42肽而非两种人工th表位(mvf5th和hbsag3th)，如表11所示。
实施例7
来自利用ub-311疫苗免疫接种的动物的狒狒和食蟹猕猴外周血单个核细胞(pbmc)培养物的细胞免疫反应
利用ficoll-hypaque梯度离心分离来自利用ub-311免疫接种的狒狒和食蟹猕猴的外周血单个核细胞(pbmc)。针对肽诱导的增殖和细胞因子产生，将细胞(每个孔含有2×105个细胞)单独培养，或将细胞与添加的个别肽结构域(包括aβ1-14、aβ1-42、
来自食蟹猕猴pmbc培养物的细胞因子分析(il-2、il-6、il-10、il-13、tnfα、ifnγ)是在仅有培养基或在肽结构域或促分裂原存在下的等分试样上进行。根据试剂盒说明将猴特异性细胞因子夹心elisa试剂盒(u-cytechbiosciences，utrecht，thenetherlands)用于测定个别细胞因子的浓度。
在免疫动物的第15、21和25.5周从由猕猴收集的全血中分离pmbc。在各种aβ肽(aβ1-14和aβ1-42)存在下培养分离的pbmc。
当在培养基中加入aβ1-14肽时，未观察到淋巴细胞的增殖反应。然而，当将aβ1-42肽加入pbmc培养物时，发现了阳性增殖反应。
还在aβ肽或pha促分裂原存在下针对细胞因子分泌测试在第15、21和25.5周收集的pbmc样品。如表12所示，三种细胞因子(il-2、il-6、tnfα)显示出对于全长aβ1-42肽而非aβ1-14肽反应的可检测的分泌；与安慰剂疫苗样品相比，在
利用仅具有具有外源t辅助细胞表位的氨基端aβ1-14肽免疫原的ub-311疫苗免疫食蟹猕猴，其没有aβ17-42肽结构域，表明在aβ1-42肽存在下于pbmc培养物中所注意到的阳性增殖结果与ub-311疫苗反应无关，而是对天然全长aβ的背景反应。
这些结果支持仅具有aβ1-14和外源t辅助细胞表位的ub-311疫苗的安全性，表明它不会对正常食蟹猕猴中的天然全长aβ肽产生潜在的炎症性抗自身细胞介导的免疫反应。相反，在an-1792疫苗临床试验研究中与脑炎相关的不良事件部分归因于在此疫苗的单体或纤维/聚集的aβ1-42免疫原中包含t细胞表位。
实施例8
来自利用ub311疫苗免疫的阿尔兹海默症患者的pbmc的淋巴细胞增殖分析及细胞因子分析
利用ficoll-hypaque梯度离心分离来自患有阿尔兹海默症的患者的外周血单个核细胞(pbmc)。针对肽诱导的增殖和细胞因子产生，以三重复的方式，将细胞(每个孔含有2.5×105个细胞)单独培养，或将细胞与添加的个别肽结构域(终浓度为10μg/ml)一起培养，肽结构域包括aβ1-14(seqidno：56)、aβ1-16(seqidno：57)、aβ1-28(seqidno：59)、aβ17-42(seqidno：58)、aβ1-42(seqidno：60)和不相关的38-mer肽(p1412)。将培养物于具有5％二氧化碳的环境在37℃下培养72小时，然后从每个孔中取出100μl上清液并在-70℃冷冻以用于细胞因子分析。在每个孔中加入10μl含有0.5μci的3h-胸腺嘧啶核苷(3h-tdr，amersham，catno.trk637)的培养基，并培养18小时，然后利用液体闪烁计数器检测放射性同位素掺入。促分裂原植物凝集素(pha)作为淋巴细胞增殖的阳性对照。没有aβ肽或含有pha促分裂原的单独培养的细胞作为阴性和阳性对照。刺激指数(s.i.)计算为具有aβ肽的三重复实验培养物的每分钟计数(cpm)平均值除以三重复阴性对照培养物的平均cpm；si＞3.0被认为是显著的增殖反应。
a.增殖分析
由从接种ub-311疫苗的患有阿尔兹海默症的患者在第0周(基线)和第16周(接种第三剂后4周)收集的全血中分离出外周血单个核细胞样品，然后在缺乏或存在各种aβ肽的情况下进行培养。如表13所示，当在培养基中加入aβ1-14、其他aβ肽或p1412(不相关的对照肽)时，未观察到淋巴细胞的显著增殖反应。如所预期的，当将pha促分裂原加入培养基时，可注意到阳性增殖反应。在ub-311免疫接种之前和之后观察到对pha的类似反应(p＝0.87)表明研究受试者的免疫功能没有显著改变(表13)。
统计分析。通过配对t检验检查第0周和第16周之间淋巴细胞增殖的差异。通过双尾检验测定统计显著性水平(p＜0.05)。r版本2.14.1用于所有统计分析。
b.细胞因子分析
来自pbmc培养物的细胞因子分析(il-2、il-6、il-10、tnf-α、ifn-γ)是在仅具有细胞或在aβ肽结构域或pha存在下的培养基等分试样上进行的。根据制造商的说明书将人类特异性细胞因子夹心elisa试剂盒(u-cytechbiosciences，utrecht，thenetherlands)用于测定个别细胞因子的浓度(pg/ml)(clindiaglabimmunol.5(1)：78-81(1998))。
将在第0周和第16周从接种ub-311疫苗的阿尔兹海默症患者收集的pbmc样品也用于测试细胞因子分泌，其在仅有细胞(阴性对照)或存在aβ肽、p1412(不相关的肽)或pha促分裂原(阳性对照)的情况下培养3天后进行测试。试剂盒的可定量范围介于5和320pg/ml之间。低于5pg/ml或高于320pg/ml的任何测量浓度分别表示为低于定量限(bql)或高于定量限(aql)。但是，出于统计考虑，bql或aql分别用较低(5pg/ml)或较高(320pg/ml)的可量化限值替换。在第0周和第16周的每种细胞因子的平均浓度显示于表14中。如所预期的，除了il-2的外，在pha存在下(阳性对照)细胞因子产生显著增加。在基线(第0周)和第16周可观察到对利用aβ1-14或其他aβ肽刺激反应的细胞因子的产生，但是出现的大多数值与相对应的阴性对照(仅有细胞)相似。
为了评估免疫接种后细胞介导的免疫反应的变化，将从基线到第16周平均细胞因子浓度的变化与阴性对照进行比较，并通过配对wilcoxon符号秩检验(pairedwilcoxonsigned-ranktest)进行检查。在对全长aβ1-42肽反应中显示出四种细胞因子(ifn-γ、il-6、il-10、tnf-α)的分泌显著增加；此观察结果可能是由于aβ1-42聚集体的构象表位。在aβ1-14或其他aβ肽中未检测到细胞因子分泌的上调。
c.摘要
ub-311疫苗含有两种肽免疫原，每种都具有分别与mvf5th和hbsag3th表位合成连接的氨基端aβ1-14肽。体外淋巴细胞增殖和细胞因子分析用于评估ub-311疫苗免疫接种对细胞免疫反应的影响。当将aβ1-14肽或任何其他aβ肽加到培养基中时，没有观察到淋巴细胞的增殖反应，如表13所示。除了aβ1-42以外，在利用aβ1-14和其他aβ肽处理后未检测到ub-311疫苗接种患者淋巴细胞的细胞因子分泌的上调，当与处理前第0周的水平相比时，aβ1-42在ub-311免疫接种后于第16周引起4种细胞因子(ifn-γ、il-6、il-10、tnf-α)明显增加(表14)。通过th2型t细胞反应的细胞因子释放的增加更可能与ub-311疫苗反应无关，因为单独使用aβ1-14没有检测到上调。怀疑对aβ1-42的反应是对天然aβ的背景反应，其可能与aβ1-42上鉴定的天然t辅助细胞表位有关。观察到在对pha的反应中缺乏il-2产生，这与利用正常人pbmc在相似的实验条件下于clindiagnlabimmunol1998；5：78-81中由katialrk等人报导的结果一致。总之，这些结果表明，ub-311疫苗在参与第i期临床试验的轻度至中度阿尔兹海默症患者中未产生潜在的炎症性抗自身、细胞介导的免疫反应，从而进一步证明ub-311疫苗的安全性。
实施例9
相较于阴性对照在具有中度免疫炎症反应的正常血液供体中的初始外周血单个核细胞(pbmc)内可以检测到混杂人工th反应细胞
elispot试验用于检测在正常血液供体中的初始外周血单个核细胞内的混杂人工th反应细胞，以评估当与强效促分裂原植物凝集素(pha)和阴性对照相比时其引发炎症反应的效力。
elispot试验采用夹心酶联免疫吸附分析法(elisa)技术。为检测t细胞活化，检测ifn-γ或相关细胞因子作为分析物。将对所选分析物具有特异性的单克隆或多克隆抗体预先包被在以pvdf(聚偏二氟乙烯)膜为底的微孔板上。将适当刺激的细胞移液到孔中，并将微孔板置于加湿的37℃co2培养箱中一段特定的时间。在培养期间，紧邻分泌细胞的固定化抗体与分泌的分析物结合。在洗去任何细胞和未结合的物质后，将对所选分析物具有特异性的生物素化多克隆抗体加入孔中。在洗涤以移除任何未结合的生物素化抗体后，加入与链霉抗生物素蛋白缀合的碱性磷酸酶。随后通过洗涤移除未结合的酶，并加入底物溶液(bcip/nbt)。形成蓝黑色沉淀并在细胞因子定位的位点处出现斑点，每个个别的斑点代表个别分析物分泌细胞。利用自动elispot图像分析仪系统或利用立体显微镜手动计数计算斑点的数目。
在进行的体外研究中，将pha浓度为10μg/ml的培养物作为阳性对照。针对存在于定期正常血液供体中外周血单个核细胞内的反应细胞数目，测试
如图15所示，针对其对混杂人工
总而言之，在初始供体pbmc中可以容易地检测到混杂人工th反应细胞，所述初始供体pbmc准备好通过分泌特征性细胞因子来产生免疫反应以帮助b细胞抗体产生和相对应的效应t细胞反应。在此使用ifn-γ作为实例说明这些th表位肽的这种刺激性质。然而，这种刺激性炎症反应足够适度的去产生合适的效应细胞反应(用于抗体产生的b细胞，用于杀死目标抗原细胞的细胞毒性t细胞)，以便在疫苗接种过程中不引起不利的炎症病理生理反应。
实施例10
用于个人化癌症免疫疗法的基于新表位(neo-epitope)的肽免疫原构建体及其制剂
我们正处于癌症治疗的t细胞革命之中。在过去几年中，诸如免疫检查点抑制剂(ici)和过继细胞疗法(如嵌合抗原受体t细胞(car-t))等新疗法为数百万罹患癌症的人们提供了新的希望。ici药物有助于克服癌症所构建的天然屏障，此屏障是用以防止我们自己的免疫系统(且特别是我们的t细胞)抵抗癌症。例如，car-t疗法设计患者的t细胞以产生针对某些肿瘤细胞的免疫反应。这些新疗法带来了未来的疗法，旨在“教育”t细胞以更高的准确度攻击肿瘤。
个人化或新抗原的癌症疫苗越来越令人兴奋，其为数百万罹患癌症的人们提供了新的希望。新抗原是个人化的肿瘤突变，其被大多数人的免疫系统视为外来的。因此，个人化疫苗针对这些新抗原，其教育免疫系统发现并杀死肿瘤。
生物信息学、蛋白质体学、基于细胞的分析和非标准方法已被广泛应用于有效鉴定真正的新抗原。在微卫星和外显子的剪接错误(mis-splicing)中由indel(即短的插入和缺失)形成的rna移码(rnaframeshift(fs))变体是高免疫原性新抗原的丰富来源。
含有所有可能的(例如400k)fs(移码)肿瘤衍生肽的阵列可用于检测来自一滴患者血液的抗体反应性，从而为癌症诊断和新抗原ctl表位的鉴定提供了杰出的工具。
可以使用rnaseq进行mhc分型(mhctyping)，而netmhc和netmhcpan可以用于预测新抗原结合亲和力。
在体外hla不可知试验(agnosticassay)中，代表来自患者肿瘤的每个鉴定的突变的多肽被分别地递送到它们自己的抗原呈递细胞(apc)中，然后将其加工并在细胞表面上呈递肽，在此它们被各种效应t细胞所识别。如果t细胞识别并结合肽，将引发细胞因子反应。测量真实抗原并裁定其为“好”(即刺激性)或“坏”(即抑制性)。可以鉴定出患者的t细胞-cd4+(辅助t细胞)和cd8+(杀伤t细胞)二者反应的实际抗原，并选择其作为新表位以用于设计新表位肽免疫原构建体。
通过包括患者对此其具有已经存在的反应的凭经验证实的新抗原，因此开发了针对已经引发患者免疫系统的个人化癌症疫苗。
简而言之，使用本公开所描述的设计原理，使得衍生自特定经验证实的新抗原(新抗原包含b或ctl新表位)的新表位肽可具有高免疫原性。具有共价连接至选择的新表位的混杂人工th表位的参与，此类新表位肽免疫原构建体可以促进针对新抗原的抗体的诱导和维持，和诱导效应ctl功能，以及产生b和ctl记忆细胞，导致持续的b细胞和ctl反应与强大的抗肿瘤免疫力。
代表性公共新抗原，其具有用于黑色素瘤新抗原的选定目标表位序列、用于神经胶质瘤的组蛋白3变体h3.3k27m和用于结肠直肠癌的kras(具有g变成d的突变体)，分别在表3a中显示为seqidno：73、74和75。
本公开设计的新表位肽免疫原构建体及其制剂可以在临床试验中进一步评估安全性、免疫原性和功效，其由三部分组成：
1)在没有疾病迹象但具有很高的复发风险的癌症患者中作为单一疗法的安全性和免疫原性的研究。
2)在具有晚期或转移性实体瘤患者中将新表位疫苗与fda批准的免疫检查点抑制剂合并使用的安全性、免疫原性和功效的研究。
3)在使用免疫检查点抑制剂治疗后未能反应或癌症已经进展的具有复发或难治性实体瘤的患者中，将新表位疫苗作为单一疗法的安全性、免疫原性和功效的研究。
符合条件的患者(其针对皮肤黑色素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、头颈部鳞状细胞癌(scchn)或尿路上皮癌已完成治疗(例如手术切除、术前辅助性和/或辅助性化疗，和/或放射治疗)，且ct或mri无疾病证据)可参与这些癌症免疫治疗。
实施例11
用于癌症免疫治疗的肿瘤相关糖类抗原(taca)-b细胞表位免疫原构建体及其制剂
肿瘤细胞的特征在于异常的糖基化模式，其导致表面寡糖的异质性、截断和过表达。三种主要类别的糖类结构已被确认为潜在的肿瘤相关糖类抗原(taca)，显示为gd3、gd2、globo-h、gm2、fucosylgm1、psa、ley、lex、slex、slea和stn，如图16所示。
(1)黏蛋白(mucin)相关的o-聚糖：tn、tf和stn
(2)鞘糖脂(glyco-sphingolipids)：包括神经节苷脂(ganglioside)gm3、gm2、gd2、gd3、岩藻糖基gm1(fucosylgm1)和中性红细胞糖苷脂(globoside)globoh
(3)血型抗原：slex、leylex、slea和ley
globolh在乳腺癌细胞表面表达为糖脂并且是有吸引力的肿瘤标志物。使用烯糖组装方法合成globolh六糖以进行寡糖合成。globah作为b-半抗原并且可以在还原末端配备官能基团以允许与表2中所示的th辅助细胞肽共价固定以形成免疫原性肽构建体。如danishefsky和livingston先前所述(网站：glycopedia.eu/hetero-taca-vaccines-based-on-protein-carriers)，比起使用klh或别的常规载体蛋白的其他方法，在这类应用中使用所公开的th表位更加通用。
每个多肽的氨基端或在蛋白质的赖氨酸(k)残基侧链中的伯胺在ph7-9下可用以作为n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)类型的交联接头试剂的目标，以形成稳定的酰胺键，以及释放n-羟基琥珀酰亚胺离去基团。此外，m-顺丁烯二酰亚胺苄酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimideester)(mbs)(h.lchiang，etal.vaccine.201230(52)，7573-7581)、对硝基苯酯(pnp)(s.j.danishefsky，etal.acc.chem.res.2015，48(3)，643-652)以及不同链长的接头也可以作为对于表2所示th辅助细胞肽而言重要的taca缀合接头。
本公开人工th表位可用于癌症疫苗组合物，其包含：(a)免疫原性组合物，其包含基本上为globolh或其免疫原性片段的聚糖；(b)与表2所示的混杂人工t辅助细胞表位肽共价连接的免疫原性片段。从羧基端到氨基端利用去保护/偶联通过固相肽合成(spps)和fmoc化学逐步分别制备表2所示的th表位肽(例如，
利用通过kaiser试验监测的偶联反应，通过在固相树脂上直接形成酰胺键，使聚糖可以利用或不利用间隔子而与人工th表位肽连接。两种策略可以用于这种偶联：(1)制备具有活化离去基团的聚糖衍生物，然后与结合连接th肽的间隔子的树脂进行偶联，其中氨基端具有游离胺或(2)将树脂结合的氨基端胺基转化成为活化酯，然后与聚糖进行偶联反应。聚糖与树脂结合和间隔子-th肽的直接偶联将允许与在树脂结合的游离胺基上的活化基团进行更有效的偶联反应，然后通过标准树脂释放切割反应从树脂释放偶联聚糖肽。两个游离大分子(例如多糖和长链肽)之间的空间位阻将使聚糖-肽偶联反应更困难，因此效率更低且产率低。
在一些方面，b-半抗原连接的t辅助载体是表2描述的间隔子连接的th-肽。
在一些实施方案中，接头是对硝基苯基接头、n-羟基琥珀酰亚胺接头、对硝基苯酯(pnp酯)或n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs酯)。nhs酯可以在ph7-9下与伯胺反应以形成稳定的酰胺键，同时释放n-羟基琥珀酰亚胺离去基团。
在此实施例中使用以下缩写：pnp：对硝基苯酯；npc：n-硝基苯基氯甲酸酯；dss(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)；和nhs：n-羟基琥珀酰亚胺；mbs：m-顺丁烯二酰亚胺苄酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯。
包括以下化学反应和制备步骤(图17至21)以说明各种实施方案。
1.利用对硝基苯基(pnp)基团制备活化的
可以通过自动化固相合成和fmoc化学合成人工th表位(例如，
2.利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)基团制备活化的
可以利用自动化固相合成和fmoc化学合成
3.globolh缀合
具有末端胺基的globolh六糖类似物(2)的制备可以通过遵循一锅合成策略来实现(c.y.huang，etal.，proc.natlacadsciusa2006，103，15-20)。简而言之，可以将globolh溶液引入活化的
4.globolh活化酯的制备
可将globolh己胺(2)溶解在无水dmf溶液中。然后加入对硝基苯己二酸二酯并在室温下搅拌2-4小时。可以利用tlc和kaiser试验监测反应，以检查游离胺基的消失。可在减压而不加热状况下移除dmf溶剂，然后可将所得残余物利用二氯甲烷和含0.5％乙酸的水进行萃取三次。可以将得到的水溶液浓缩并通过反相柱(rp-c18)层析法进行纯化(利用meoh/含有1％乙酸的h2o进行等度洗脱)。
5.gm3活化酯的制备
先前已经描述了gm3神经节苷脂类似物的合成和纯化(jacquess，etal.，j.am.chem.soc.，2012134(10)：4521-4)。可将gm3类似物胺x(4.5mg；5.2μmol)溶解在二甲基甲酰胺(1.5ml)中并加入三乙胺(3.0eq.)。然后可加入对硝基苯己二酸二酯(10.0eq.)。通过tlc(ch2cl2-meoh-h2o-acoh；4∶5∶1∶0.5)监测，反应可被完成。利用乙酸将反应的ph调整至5.0，然后与甲苯(3×)共蒸发。可浓缩残余物，并且利用meoh-含有1％乙酸的h2o的梯度通过hplc(beckmanc18-硅胶半制备柱)纯化获得的残余物。可以在cd3od中获得1hnmr谱。
6.tn活化酯的制备
可以基于先前的报导(t.toyokuni，etal.，bioorgmedchem.1994，11，1119-32；ands.d.scott，etal.，j.am.chem.soc.，1998，120(48)，12474-85)合成糖类tn。将配制于无水ch2cl2(25ml)中的tn类似物(6mmol)、nhs(160mg，1.39mmol)和edc(268mg，1.40mmol)在室温下搅拌1小时。将混合物利用预冷的h2o(3x30ml)洗涤、干燥(na2so4)并浓缩，以得到琥珀酰亚胺酯衍生物(7)，其为无色浆状物。
7.唾液酸化的路易斯寡糖-x抗原(slex)活性酯(9)的制备
可利用公开的合成策略(g.kuznik，bioorganic&medicinalchemistryletters，7(5)：577-580，1997)达成slex四糖衍生物(8)的制备。将化合物(8)加入到加热至室温配制于dmf/dcm内的npc(2eq.)溶液中，并再搅拌30分钟。可利用dcm和水溶液洗涤浓缩的粗混合物。可在减压状况下处理所得水溶液并利用rpc18柱纯化。
8.产生糖缀合物的一般程序
各个聚糖与各个树脂结合间隔子合并的th肽的标准偶联反应是遵循标准肽键形成偶联程序，其通过碳二亚胺偶联反应利用常规固相肽合成仪而进行。
根据标准肽合成方法可将树脂结合的聚糖-肽由树脂移除，且回收、沉淀并冻干。
可以利用自动化固相合成和fmoc化学合成t细胞肽表位(例如
总之，在此实施例中，详细描述各个聚糖与表2所示的各个th辅助细胞表位肽的有效缀合，以允许此类糖类-肽免疫原构建体被有效地制备以用于后续的疫苗制剂。使用人工th表位的这些糖类疫苗制剂可提供针对目标糖类抗原(此目标糖类抗原通常存在于癌细胞上)的聚焦抗体反应，以允许在临床试验中对癌症患者进行免疫疗法。
实施例12
通过将混杂人工t辅助细胞表位连接至效应细胞表位(例如ctl表位)增强效应t细胞功能以及其用以开发针对病毒感染的通用t细胞疫苗的制剂
导言
t辅助细胞携带表面标志物cd4并表达称为t细胞受体的表面受体，其由多肽异二聚体(称为例如α/β)组成。t辅助细胞识别与ii类mhc蛋白质结合的病毒肽，ii类mhc蛋白质通常在抗原呈递细胞(apc)的表面。这些相互作用导致t辅助细胞活化、增殖和分化，从而提供足够高的结合亲和力。
t辅助细胞(cd4+t细胞)为先天性和适应性免疫系统的细胞提供可溶性介质和受体-配体相互作用，触发和调节它们的效应功能。这些细胞是异源群体，迄今为止，已经描绘了几个亚群的特性，包括：th1、th2、th17和t滤泡辅助(tfh)细胞。还有调节性cd4+t细胞(treg)，其抑制t辅助细胞和细胞毒性亚群的生长和功能。
每种类型的效应t细胞是由关键转录调节因子所控制，表达不同的细胞表面分子阵列，并分泌“签名”细胞因子，其共同促进t细胞亚群在免疫系统内的特定作用。
tfh细胞与其他辅助细胞亚群的区别在于它们具有归巢到b细胞滤泡的独特能力，并可为抗原特异性b细胞(抗原特异性b细胞正在经历其igv区基因的体细胞超突变(shm)和改变其对抗原的亲和力)提供帮助。tfh细胞分泌细胞因子il-21，其是b细胞分化和针对病毒的高亲和力、类别转换的抗体反应发展所必需的。tfh介导的信号可确保选择对免疫抗原具有更高亲和力的b细胞，然后其可分化成为长寿浆细胞或记忆b细胞。由于通过shm过程可能出现自身反应性b细胞克隆以及所选择克隆的长寿，因此存在严格的耐受性机制以控制从tfh细胞向b细胞递送正选择信号是至关重要的。
th1细胞主要参与增强细胞毒性反应。这些细胞通过刺激细胞毒性t细胞前体的成熟，部分通过分泌细胞因子il-2和ifn-γ，以促进针对病毒感染的细胞介导的反应。th1细胞还分泌肿瘤坏死因子(tnf)、介导延迟型过敏反应，并促进igg2a抗体的产生。th1细胞通过活化位于病毒感染部位的巨噬细胞和其他t细胞而大大增强免疫反应。这种反应是延迟型过敏反应的基础，延迟型过敏反应是许多病毒感染发病机理的公认部分。
其他th细胞，包括th2和th17细胞，也通过促进炎症或产生特异性抗体同型而有助于针对病毒感染的免疫反应。
一些t细胞可下调其他t细胞和/或b细胞反应。cd4+t细胞的不同亚群称为调节性t细胞(t-reg)。有两种基本类型的t-reg：(1)在负选择期间于胸腺中产生的ttreg，并且被认为主要涉及控制自身免疫疾病；和(2)在免疫反应期间诱导的itreg，且其参与终止免疫反应并使免疫系统恢复至内稳态。t-reg细胞还可以帮助维持保护和免疫介导的病理之间的平衡。
辅助t细胞在肽疫苗接种中的影响是巨大的。cd4+t辅助细胞在活化后可通过同源t辅助细胞表位的包含物提供强烈的可持续cd8+t细胞反应。鉴于cd4t细胞的局部免疫调节功能，优选活化衍生自靶向病毒或肿瘤的抗原在目标组织中的同源帮助(cognatehelp)。外来抗原以及甚至肿瘤相关蛋白质通常含有免疫原性片段(th表位)，其作为免疫系统的热点。如同在本发明中设计和描述的肽免疫原构建体，其通过将选择的混杂人工th表位共价连接至目标b或效应t细胞(例如ctl)表位，可以促进apc、cd4和cd8t细胞的紧密相互作用，以诱导最佳和保护性cd8t细胞反应。
用于掺入病毒特异性通用t细胞疫苗中的作为目标抗原位点的ctl表位肽的实例
1.hivctl疫苗成分
尽管有抗逆转录病毒疗法(art)，人类免疫缺陷病毒(hiv)-1仍然存在于稳定的潜伏病毒库中，主要存在于静息记忆cd4+t细胞中。此病毒库是治愈hiv-1感染的主要障碍。为了清除病毒库，已经在体外和体内测试潜伏hiv-1的药理学再活化。一个关键剩余的问题是病毒特异性免疫机制(包括细胞毒性t淋巴细胞(ctl))是否可以在潜伏逆转后在art治疗患者中清除感染细胞。在广泛的数据挖掘之后，鉴定出在测试的每个慢性感染患者中可识别来自未突变潜伏hiv-1的表位的ctl，其利用被并入通用hivt细胞疫苗设计中的如表3b(seqidno：76-82)所示的此类ctl表位的特定肽代表。慢性感染的患者保留广谱病毒特异性ctl反应。预期通过这种hiv通用t细胞疫苗(此疫苗将这些具有与本发明混杂人工th表位(seqidno：1-52)分别共价连接的ctl表位肽掺入)适当加强这种反应，而导致潜伏病毒库的消除。
2.hsvctl疫苗成分
单纯疱疹病毒感染高百分比的世界人口并建立潜伏感染，其中病毒基因组保留在感觉神经元中，但不产生病毒粒子。病毒从这种潜伏状态的周期性再活化会导致病变，其可以影响口腔和嘴唇、生殖道和眼角膜的粘膜表面，并且不太频繁地影响皮肤和脑。hsv-2对从产道中获取hsv-2的新生儿可能是致命的；角膜hsv-1感染是导致失明的主要传染因素；并且脑部hsv-1感染占病毒性脑炎病例的大约四分之一，其可能致命。已经进入临床试验的hsv-1疫苗主要设计用于抗体生产，并且效果不大。有证据表明cd8+t细胞在控制小鼠和人类的hsv感染中具有重要作用。
1型hsv(hsv-1)顺序表达其基因为立即早期(α)、早期(β)、渗漏晚期(γ1)和真正晚期(γ2)，其中病毒dna合成仅对γ2基因表达而言是绝对先决条件。γ1蛋白质糖蛋白b(gb)含有强免疫显性cd8+t细胞表位(gb498-505)，其被50％位于急性感染三叉神经节(tg)的cd8+效应t细胞和位于潜伏感染tg的cd8+记忆t细胞所识别。
通过广泛的数据挖掘和全面的数据分析，将c57bl/6小鼠中的整个hsv特异性cd8+t细胞库纳入以用于hsvctl疫苗设计考虑。此外，发现不同组的hsv-1gb表位被来自有症状的和无症状的个体的cd4+t细胞所识别。其中，gb166-180、gb661-675和gb666-680被cd4+ctl靶向，其裂解自体hsv-1-和牛痘病毒(表达gb[vvgb])-感染的lcl。gb166-180和gb666-680似乎优先被来自hsv-1-血清反应阳性健康“无症状”个体的cd4+t细胞识别，而gb661-675似乎优先被来自严重“有症状”个体的cd4+t细胞识别。一种有效的免疫治疗性疱疹疫苗将排除潜在“有症状的”gb661-675表位。此外，还鉴定了三个在无症状个体中被高度识别的vp11/12cd8+表位，发现它们在眼部疱疹的“人源化”hla-a*02：01转基因小鼠模型中引发强烈的保护性免疫。
具有如表3b(seqidno：83-106)所示的此类ctl表位的特定肽代表的一系列hsvctl表位被鉴定出来，其被并入本发明的设计中以用于开发基于通用多表位的hsvt细胞疫苗。
3.养猪产业中的fmdv、prrsv和csfv通用t细胞疫苗
口蹄疫病毒(fmdv)、猪生殖和呼吸道综合征病毒(prrsv)和猪瘟病毒(csfv)是养猪产业中导致生物体衰弱的病原体。开发针对这些病原体的有效疫苗在养猪产业中具有实际意义。
尽管接种疫苗后诱导的中和抗体在控制疾病和病毒传播方面非常有效，但它们不会赋予跨亚型保护，并且可能由于抗原变化而变得无效。细胞免疫反应，尤其是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的产生，由于它们在开发针对各种病毒的有效和交叉保护性肽疫苗的潜力而受到很多关注。例如，ctl表位肽可用于开发交叉保护性人类流行性感冒疫苗(包括重组病毒载体和肽疫苗)；鉴定出针对fmdv的o血清型的ctl表位肽与其他fmdv血清型交叉反应。然而，大多数分析仅限于特定的病毒蛋白，并且仅能识别少数ctl表位。
在广泛的数据挖掘、设计、合成、劳动密集和耗时的免疫原性和功能测定程序之后，对大量精心设计ctl肽的评估允许验证衍生自各种fmdv、prrsv和csfv病毒蛋白质的选定病毒特异性ctl表位。代表这些表位的选定的ctl肽显示在表3b中，具有seqidno：107-145。
在我们的选择和鉴定的过程中，整合了生物信息管道分析猪病毒序列以解决若干挑战：(1)遗传变异，(2)特定表面蛋白质的不完全筛选，以及(3)基于非猪白细胞抗原的不适当预测。将ctl表位肽与混杂人工th表位肽的适当连接所产生的本发明肽免疫原构建体并入，其导致具有持续记忆和长持续时间ctl反应的t细胞疫苗的开发。这种针对fmdv、prrsv、csfv和其他经常破坏养猪产业的病毒感染的基于高精确性有效肽的猪疫苗的商业开发对畜牧业至关重要。
表1
用于肽免疫原构建体设计中的包括理想化人工th表位的病原体蛋白衍生的th表位的氨基酸序列
表2
任选的异源性间隔子和cpg寡核苷酸的例子
表3a
目标抗原位点(b细胞表位)的例子
＊利用半胱氨酸取代的氨基酸用下划线表示。
表3b
目标抗原位点(ctl表位)的例子
表4
例示性肽免疫原构建体
表11
在豚鼠中靶向aβ肽而非th表位的aβ1-14免疫原的独特免疫原性
表12
在15、21和25.5wpi收集的接受ub311接种或正常食蟹猕猴外周血单个核细胞(pbmc)中在利用aβ1-14、aβ1-42肽或pha(植物凝集素)促分裂原刺激后的细胞因子浓度的测定
a结果显示为平均值±标准偏差
bbdl，低于检测水平
表13
评估来自19名阿尔兹海默症患者pbmc的刺激指数
表14
评估来自19名患者的外周血单个核细胞(pbmc)在利用aβ肽或pha促分裂原刺激后的细胞因子浓度1
1测定的可定量范围为5至320pg/ml
2＞90％受试者的浓度高于定量限上限(aql＞320pg/ml)
31名患者有aql值46名患者有aql值
58名患者有aql值64名患者有aql值
7在对pha促分裂原反应中观察到缺乏il-2产生与在类似实验条件下报导的数据一致
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