发明领域本发明涉及诊断和治疗急性或慢性疾病的领域。更特别地，本发明涉及cnnm4作为所述疾病的标志物的用途，并且涉及用于治疗肝、肾和肺病的cnnm4的抑制剂。
背景技术：
：：慢性肝病包含来自不同病因的肝脏病理的组。非酒精性脂肪肝病(nafld)，在全球人口中具有20-30％的发病率，包括从脂肪变性、简单的脂质积累，至脂肪性肝炎(nash)发展的一连串肝疾患，其特征在于具有炎症的脂肪变性以及偶尔地纤维化。尽管nafld是相当良性且可逆的病理，但约20％的nash患者会发展为肝硬化。重要的是，肝硬化是不可逆的病理，其特征在于引起肝功能障碍的细胞外基质沉积。最后，大约四分之一的纤维化患者会发展为肝细胞癌(hcc)，其是肝癌最常见的形式以及世界上发病率和死亡率的第五原因。在诊断时，很少的患者有资格接受治疗性干预，并且生存率确实很差，诊断后只有6-20个月的生存。在其他方面，肝可能经受急性受损。这个器官在药物代谢和清除中起着重要作用并且，如果药物过量，可能发展为药物性肝损伤(dili)。在美国和欧洲大部分，这种病理是急性肝衰竭和移植的主要原因。每年约30000名患者发展为对乙酰氨基酚(apap)诱导的肝损伤，并且他们中的29％经受肝移植。直到现在，标准疗法仅是基于用n-乙酰半胱氨酸对他们治疗的一种疗法，但是它挽救肝的机会较低，因此需要其他疗法。考虑到广泛的肝病理及其在人群中的发病率，不仅在健康方面，而且在经济方面，都需要开发新的有效治疗。还必须提到的是，它在其先前阶段期间是相当无症状的疾病，因此除了治疗外，需要诊断工具来尽可能检测出该疾病，以阻止进展。肾脏纤维化导致在几乎每种慢性肝病中均发生细胞外基质(ecm)过度积累。与肝类似，病程是导致晚期肾脏衰竭的进展性过程，这是需要透析或肾移植的破坏性疾患。ecm发展和积累的过程可能是由两种变化引起的。在一方面，已经鉴定出几种细胞通路作为在患病条件中生成ecm产生细胞的主要途径以及，在另一方面，有缺陷的基质降解，其中ecm降解酶的确切作用和机制已经越来越复杂。尽管许多治疗干预在动物模型中似乎有效，但是将这些有希望的结果转化至人中仍然无效。肺纤维化是导致肺组织受损和瘢痕化的疾病。增厚和僵硬导致困难，随着纤维化恶化，呼吸变得更短。在大多数情况下，病理原因尚不清楚，因此通常称为特发性肺纤维化(ipf)。尽管近年来已开发出抗纤维化疗法，但仍在做出若干努力鉴定可以直接寻找更具体治疗的关键生物标志物。技术实现要素：发明人惊奇地发现，在人样本和在动物模型两者中，cnnm4在不同的病理的组中均过表达。这种病理包括慢性肝病理诸如nash、肝硬化和hcc，或急性病理诸如dili。在肾脏纤维化小鼠模型中也观察到cnnm4过表达。发明人还发现cnnm4抑制减少了对于所述疾病的动物模型中生物标志物指示剂的水平。因此，在第一方面，本发明涉及用于医学的cnnm4抑制剂。在进一步的方面，本发明涉及cnnm4抑制剂，其用于治疗受试者中的急性或慢性疾病，其中，所述疾病选自由肝病、肾病和肺病组成的组。在其他方面，本发明涉及用于诊断受试者中肝病、肾病或肺病的体外方法，所述方法包括：(a)测定来自所述受试者的样本中cnnm4的表达水平，以及(b)将所述水平与参考值比较，其中，相对于所述参考值，所述样本中cnnm4的表达水平增加表明患者患有肝病、肾病或肺病。在仍其他方面，本发明涉及特异性用于测定cnnm4表达水平的试剂在用于在体外诊断受试者中肝病、肾病或肺病的用途。在额外的方面，本发明涉及减少细胞中诱发的疾病或病症的体外方法，所述方法包括使细胞与以有效降低所述细胞内cnnm4活性、水平或功能的量的特异性cnnm4抑制剂接触。在最后方面，本发明涉及用于鉴定潜在用于减少细胞中诱发的cnnm4介导的疾病或病症的化合物的体外方法，所述方法包括使细胞与以有效降低所述细胞内cnnm4活性、水平或功能的量，或者以相对于参考值有效减少相对脂质积累或减少相对线粒体ros的量的候选化合物接触，其中，将以下的候选化合物鉴定为潜在用于治疗和/或预防cnnm4介导的肝、肾和/或肺病的化合物：该候选化合物在细胞中在诱发的cnnm4介导的疾病或病症中，抑制cnnm4活性，减少相对于参考值的相对脂质积累或减少相对于参考值的相对线粒体ros。附图说明图1.在来自dili和慢性肝病的不同病理的人样本和小鼠模型中通过ihc测定的肝中的cnnm4表达。*p<0.05vs健康的；**p<0.01vs健康的；***p<0.001vs健康的。图2.a)cnnm4表达，通过qpcr测定的与来自脂肪变性和nash患者的样本相比来自健康受试者的人肝样本的cnnm4mrna水平。b)cnnm4表达，通过qpcr测定的在体内小鼠模型中cnnm4mrna水平。c)cnnm4表达，通过qpcr测定在体外小鼠细胞模型中cnnm4mrna水平。*p<0.05vs健康的。图3.a)当用sirnacnnm4处理时，nash诱导的原代肝实质细胞中的脂质含量恢复至健康水平。b)由ros诱导的炎症在治疗的小鼠中也得到恢复以及c)当用sirna治疗处理肝实质细胞时，dili诱导的细胞死亡得到改善。*p<0.05vs健康的**p<0.01vs健康的；***p<0.001vs健康的；#p<0.05vsnash；##p<0.01vsnash；###p<0.001vsdili。图4.a)当用sirnacnnm4处理时，nash诱导的人细胞中的脂质含量恢复至健康水平。b)当用shrnacnnm4处理时，nash诱导的人细胞中的脂质含量恢复至健康水平。*p<0.05vs健康的**p<0.01vs健康的；#p<0.05vsnash对照；##p<0.01vsnash对照。图5.a)如果用sirnacnnm1、sirnacnnm2或sirnacnnm3处理nash诱导的原代肝实质细胞，它们中的脂质含量不会恢复至健康水平。b)在cnnm4过表达的情况下，补充镁不会减少原代肝实质细胞中的脂质含量。c)在原代肝实质细胞中的sirnacnnm4处理减少了由镁缺乏引起的脂质积累。***p<0.001vs健康的；##p<0.01vsnash模型/不含mg2++sirna图6.sirnacnnm4治疗后用于观察nafld进展的参数分析。a)苏丹红作为脂质含量降低的指示剂，b)血清中的gpt作为肝受损的指示剂，c)dhe作为ros炎症的指示剂以及d)αsma作为纤维化的指示剂。*p<0.05vssirna**p<0.01vssirna图7.7-氨基-2-苯基-5h-噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮对cnnm4的药理学抑制具有在nash诱导的肝实质细胞中与sirnacnnm4治疗相同的作用。a)处理的肝实质细胞示出了脂质水平减少以及b)细胞内镁水平的升高。*p<0.05vs未处理的；***p<0.001vs未处理的。图8.在肾脏纤维化动物样本中通过ihc测定cnnm4表达。***p<0.001vs健康的。图9.a)与正常组织相比，在肝的肝细胞癌(lihc)的tcga(癌症基因组图谱)原发性肿瘤样本中测定的cnnm4表达。b)与正常组织相比，在肺腺癌(luad)的tcga(癌症基因组图谱)原发性肿瘤样本中测定的cnnm4表达。具体实施方式如先前所提及的，发明人惊奇地发现，在人样本和动物模型两者中，cnnm4在不同的病理的组中均过表达。这些病理包括慢性肝病理诸如nash、肝硬化和hcc，或急性病理诸如dili。在肾脏纤维化小鼠模型中也观察到cnnm4过表达。发明人还发现cnnm4抑制减少了对于所述疾病的动物模型中生物标志物指示剂的水平。cnnm4抑制剂的医疗用途因此，在第一方面，本发明涉及用于医学的cnnm4抑制剂(即用作药剂)。在第二方面，本发明涉及cnnm4抑制剂，其用于治疗受试者中的急性或慢性疾病，其中，所述疾病选自由肝病、肾病和肺病组成的组。如本文所用，术语“cnnm4”意指“周期蛋白和cbs结构域二价金属阳离子转运介质”(也称为远古保守结构域蛋白(ancientconserveddomainprotein)，acdp，cyclinm或cnnm)。cnnm是由四个基因cnnm1、cnnm2、cnnm3和cnnm4编码的膜蛋白，这些基因在整个发育过程中以及在所有成体组织中都是进化表达的，除了cnnm1主要在大脑中表达。cnnm在镁离子(mg2+)通过在不同器官中的细胞膜的转运中起关键作用(funato等人,2014.jclininvest.124(12):5398-5410)。cnnm4对应于通过在ensembl数据库(根据2018年7月的93发布)中id号ensg00000158158鉴定的人基因。根据ensembl数据库，cnnm4编码至少4个转录物或剪接变体。因此，本公开涉及变体cnnm4-201(enst00000377075.2)并且涉及其他三种变体cnnm4-204(enst00000496186.5)、cnnm4-203(enst00000493384.1)以及cnnm4-202(enst00000482716.5)。cnnm4基因编码由uniprot数据库(根据2018年10月10日的130版)鉴定为q6p4q7的蛋白质“金属转运体cnnm4”。如本文所用，将术语“抑制剂”理解为以下的任何物质或化合物：其能够特异性沉默、减少、阻止和/或阻断基因的表达，或者通过阻止基因cnnm4的转录，因此避免形成基因的任何转录产物，或通过促进降解基因cnnm4的任何转录产物，或通过特异性地减少、阻止和/或阻断编码蛋白质的表达，以及抑制cnnm4蛋白质活性的任何化合物。在一种实施方式中，cnnm4抑制剂是以下的任何物质或化合物：其能够特异性沉默、减少、阻止和/或阻断基因的表达，或者通过阻止基因cnnm4的转录，因此避免形成基因的任何转录产物，或通过促进降解基因cnnm4的任何转录产物，或通过特异性地减少、阻止和/或阻断编码蛋白质的表达。如本文所用，术语“转录产物”或“转录物”，是指源自基因转录的rna。认为蛋白质或核酸的表达是减少的，当它的水平相对于参考值降低以下时：至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，不存在)。参考值是指对照受试者中的mrna或蛋白质的水平，该对照受试者可以是未患有特定疾病并且通常被认为是健康的受试者。替代地，参考值可以是指在给药抑制剂之前受试者中mrna或蛋白质的水平。在本发明的上下文中，参考值是指在对照受试者中或在给药抑制剂之前受试者中的cnnm4的蛋白质或mrna水平。在实施方式中，对照受试者是未患有肝、肾或肺病的受试者。认为cnnm4蛋白的活性是抑制的，当所述活性相对于参考值降低以下时：至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，不存在)。在实施方式中，参考值是指来自对照受试者的样本中cnnm4蛋白质的活性，该对照受试者可以是未患有特定疾病并且通常被认为是健康的受试者。替代地，参考值是指在给药cnnm4抑制剂之前，来自受试者的样本中cnnm4蛋白质的活性。在本发明的上下文中，参考值是指在对照受试者中或在但是于给药cnnm4抑制剂之前的受试者中的cnnm4蛋白质活性。在实施方式中，对照受试者是未患有肝、肾或肺病的受试者。如本文所用，“参考值”涉及用作从样本获得的值/数据的参考的实验室值。参考值(或参考水平)可以是绝对值、相对值、具有上限和/或下限的值、一系列的值、平均值、中位数、平均数或通过参考对照或参考值来表示的值。参考值可以基于从单个样本获得的值，诸如，例如从研究样本获得但在先前时间点获得的值。参考值可以基于大量样本，诸如，在样本种群中获得的值，或者基于包括或不包括待测试的样本的样本池。适合于测定cnnm4表达水平的方法是本领域已知的，并且包括适合于测定cnnm4基因表达和/或其蛋白质水平的任何方法。在特定的实施方式中，参考值是在不存在本发明抑制剂下，从cnnm4基因转录的mrna的水平。适合于测定cnnm4基因表达水平的方法，包括但不限于，测定mrna表达水平的标准测定诸如qpcr、rt-pcr、rna保护分析、northern印迹、rna斑点印迹、原位杂交、微阵列技术，基于标签的方法诸如基因表达序列分析(sage)包括变体诸如longsage和supersage、微阵列、荧光原位杂交(fish)，包括变体诸如flow-fish、qfish和双融合fish(d-fish)等。适合于测定cnnm4蛋白质表达水平的方法，包括但不限于，借助常规方法的定量，例如，使用能够与cnnm4蛋白质特异性结合的抗体，以及随后对所得抗体-抗原复合物定量。广泛的众所周知的测定可用于本发明，使用非标记的抗体(一级抗体)和标记的抗体(二级抗体)；这些技术包括，其中，蛋白质印迹、elisa(酶联免疫吸附测定)、ria(放射免疫测定)、竞争性eia(竞争性酶免疫测定)、das-elisa(双抗夹心elisa)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用包括特异性抗体的生物芯片或蛋白质微阵列的技术，或基于胶体沉淀的格式诸如胶体(dipstick)的测定。检测和定量目的蛋白质水平的其他方式包括亲和色谱法技术、配体结合测定等。在优选的实施方式中，cnnm4表达的抑制剂选自由以下组成的组：蛋白质、核酸、小分子或其组合。替代地，cnnm4表达的抑制剂选自由蛋白质、核酸或其组合组成的组。优选地，cnnm4表达的抑制剂选自由以下组成的组：中和抗体或其功能片段、拮抗剂、可溶性结合蛋白质、可溶性受体变体、非功能性衍生物、反义多核苷酸、rna干扰寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、mirna、sirna、甲基化的sirna、处理的sirna、shrna、反义rna、dicer-底物27-mer双链体、适配体、dna酶、核酶、三链形成寡核苷酸(tfo)、小分子及其组合。在实施方式中，cnnm4的抑制剂是中和抗体或其功能片段。如本文所用，术语“抗体”是指包括至少一种免疫球蛋白可变区的蛋白质，例如，提供免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列或免疫球蛋白可变结构域的序列。“功能片段”是能够维持其抑制cnnm4能力的抗体的任何片段。抗体可以包括，例如，可变重链(h)区(本文缩写为vh)和可变轻链(l)区(本文缩写为vl)。典型地，抗体包括两个可变重链区和两个可变轻链区。术语“抗体”涵盖抗原结合抗体片段(例如，单链抗体、纳米抗体(vhh)、fab片段、f(ab’)2片段、fd片段、fv片段和dab片段)以及完整抗体，例如，iga、igg类型(例如，igg1、igg2、igg3、igg4)、ige、igd、igm(及其亚型)的完整和/或全长免疫球蛋白。可变重和轻链区可以额外地再分为高变区，称为“互补决定区”(“cdr”)，与更保守的区混合在一起，称为“框架区”(fr)。已精确定义fr和cdr的延伸(参见kabat,e.a.,等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,theunitedstatesdepartmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242；以及chothia,c.等人(1987)j.mol.biol.196:901-917)。本文档中使用kabat定义。每个可变的重和轻链区典型地由三个cdr和四个fr构成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。抗体vh或vl链还可以包括重链或轻链恒定区的全部或部分，从而分别形成重链(hc)或轻链(lc)免疫球蛋白。免疫球蛋白轻链和重链可以通过二硫键键合。重链恒定区典型地包括三个恒定结构域，ch1、ch2和ch3。轻链恒定区典型地包括cl结构域。可变重和轻链区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区典型地介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和常规补体系统的第一组分(c1q)。术语抗体涵盖由重链和轻链形成的抗体和单链抗体两者。如本文所用，术语“重链”或“hc”涵盖全长重链及其片段两者。全长重链包括可变区结构域vh以及三个恒定区结构域ch1、ch2和ch3。vh结构域在多肽的氨基末端，以及ch3结构域在羧基末端。如本文所用，术语“轻链”涵盖全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域vl以及恒定区结构域cl。如重链，可变轻链区结构域在多肽的氨基末端。如本文所用，术语“单链抗体”是指借助基因工程修饰的分子，其包含借助合适的肽接头的可变轻链区和可变重链区，形成为基因融合的单链分子。如本文所用，术语“纳米抗体”是指单结构域抗体(sdab)，其是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。如完整抗体，它能够选择性地结合至特异性抗原。如本文所用，术语“抗体模拟物”是指如抗体可以特异性结合抗原，但不一定在结构上与抗体相关的任何化合物。化合物的“模拟物”包括化合物，在其中，对于功能活性所必需的化合物的化学结构已被模拟该化合物构象的其他化学结构所代替。模拟物的实例包括肽化合物，在其中，用以下取代肽主链：一个或多个苯二氮杂分子(参见例如，james,g.l.等人(1993)science260:1937-1942)或通过使用酰胺结合电子等排体和/或修饰天然肽主链来模拟肽二级结构的寡聚体，包括链延伸或杂原子掺入；其实例包括氮杂肽(阿扎肽)、低聚氨基甲酸酯、低聚脲、β-肽、γ-肽、低聚(亚苯基亚乙炔基)类、插烯磺化肽、聚-n-取代的甘氨酸(类肽)等。用于制备肽模拟物化合物的方法是本领域众所周知的并且是特定的，例如，在quantitativedrugdesign,c.a.ramsdengd.,chapter17.2,f.choplinpergamonpress(1992)中。如本文所用，术语抗体还指“非免疫球蛋白剂”，是除基于不同分子性质、拓扑或骨架的免疫球蛋白以外的结合剂。术语骨架意在描述蛋白质框架，其可以携带赋予蛋白质变体不同的功能的改变的氨基酸或序列插入，通常用于结合特异性靶标。此类非免疫球蛋白剂的实例是本领域众所周知的，并且包括但不限于肽适配体、核酸适配体、affibody分子、affilin、affimer、affitin、alphabody、抗运载蛋白(anticalin)、avimer、darpin、fynomer、kunitz结构域肽单体等以及在binz等人,2005(nat.biotech.23:1257-68)中综述的其他蛋白质骨架，并且通过援引包括在本文中。根据本发明，抗体可以被“人源化”以降低人个体的免疫原性。人源化抗体提高了单克隆抗体治疗的安全性和有效性。一种常见的人源化方法是在任何合适的动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)中产生单克隆抗体，并用人恒定区代替恒定区，以此方式工程化的抗体称为“嵌合”。另一种常见的方法是“cdr移植”，其用人v-fr代替非人v-fr。在cdr移植方法中，除cdr区以外的所有残基都是人来源的。在其他实施方式中，cnnm4表达的抑制剂是拮抗剂。如本文所公开的，“拮抗剂”是通过结合至受体并阻断受体而不是如激动剂那样活化受体来阻断或抑制生物学应答的受体配体或化合物的类型。替代地，能够下调cnnm4活性的其他蛋白质剂可以是其非功能性衍生物(即显性负性)。模拟这些非功能性衍生物和其他的肽可以使用本领域众所周知的并由johnmorrowstewart和janisdillahayoung[solidphasepeptidesyntheses(2nded.,piercechemicalcompany,1984)]进一步描述的固相肽合成步骤。合成肽可以通过制备型高效液相色谱法纯化，并且其组成可以通过氨基酸测序确定。根据本发明的其他类cnnm4抑制剂包括特异性可溶性结合蛋白。这些结合蛋白本身并不结合至cnnm4。然而，它们通过使cnnm4的相关结合位点复合来阻止cnnm4与效应物蛋白质相互作用。在其他实施方式中，所述cnnm4结合抑制剂是可溶性受体变体，其通过膜结合受体的蛋白水解切割或通过可变剪接受体rna的翻译来生成。这些可溶性受体中的许多缺乏通常在受体的膜结合形式中发现的跨膜和细胞质结构域。在其他特定的实施方式中，cnnm4抑制剂是核酸，其特异性结合至cnnm4基因或结合至所述基因的转录产物以阻断所述基因的表达。如本文所用，“核酸”意指核苷酸的生物聚合物，其经由磷酸二酯键(多核苷酸，多核酸)相互连接。当化学合成时，核酸的核苷酸可以额外地或可替代地经由硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键连接。取决于核苷酸(核糖或脱氧核糖)中糖的类型，区分为核糖核酸(rna)和脱氧核糖核酸(dna)的两类。如本文所用，其涉及任何天然或非天然核酸，以及“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本发明的上下文中互换使用。在本发明的上下文中，“天然核苷酸”意指可以从天然来源纯化的核苷酸。将“非天然核苷酸”定义为使用重组表达系统产生的那些，以及任选地，纯化的、化学合成的等等。当适当时，例如，在化学合成分子的情况下，核酸可以包括核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱或糖、主链修饰等等的类似物。除非另有说明，否则核酸序列以5'-3'方向表示。在实施方式中，cnnm4的抑制剂是反义多核苷酸。如本文所用，“反义多核苷酸”是指包括能够结合至靶mrna序列(正义)或dna序列(反义)的单链核酸序列(rna或dna)的反义或正义多核苷酸。在优选的实施方式中，反义多核苷酸是反义rna。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是rna干扰寡核苷酸。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是mirna。术语“微rna”或“mirna”是指能够调控基因表达的短单链rna分子，典型地为约21至23个核苷酸长。mirna可以是合成的(即，重组的)或天然的。天然mirna通过基因编码，该基因从dna转录并从初级转录物(“pri-mirna”)加工成短茎-环结构(“pre-mirna”)，并且最后到成熟mirna。成熟的mirna分子与一个或多个mrna分子部分互补，并经由类似于rna干扰的过程或通过抑制mrna的翻译来下调基因表达。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是sirna。术语“小干扰rna”(“sirna”)是指诱发rna干扰途径的小抑制rna的双链体。通过由rnase-iii类内切核糖核酸酶dicer的长dsrna的酶切割，在细胞中产生小干扰rna(sirna)。sirna在通过dicer促进的过程中与rna诱导沉默复合物(risc)联合。dicer-底物的rnai方法利用了dicer和risc负载之间的连接，其发生于当通过dicer加工rna时。传统的21-mersirna是模拟dicer产品并绕过dicer加工的需求的化学合成的rna双链体。dicer-底物rna是已针对dicer加工进行了优化的化学合成的rna双链体。这些分子的长度可以变化(通常18至30个碱基对)并且对于其反义链上的靶mrna包含不同程度的互补性。在特定的实施方式中，cnnm4的抑制剂是dicer-底物27-mer双链体。一些sirna，但不是全部，在正义链和/或反义链的5'或3'端具有未配对的突出碱基。术语“sirna”包括两条单链的双链体。如本文所用，sirna分子不限于rna分子但是进一步包括具有一个或多个化学修饰的核苷酸诸如吗啉代的核酸。在优选的实施方式中，cnnm4抑制剂是sirna。sirna是介导rna干扰(irna)的核酸。在特定的实施方式中，sirna包括具有seqidno13和seqidno14的序列。在其他特定的实施方式中，sirna包括序列seqidno:13、seqidno:14、idno:50或seqidno:51中的任何一者。在其他特定的实施方式中，sirna包括针对人cnnm4的双链体sirna，其优选靶向序列5'-gcgagagcaugaagcuguaugcacu-3'(seqidno25)(yamazakid,等人(2013),plosgenet9(12):e1003983)。在进一步特定的实施方式中，sirna包括具有表1中示出的seqidnos.的序列中的至少一个。这些序列靶向小鼠或人cnnm4，如指定的，或者在一些情况下靶向小鼠和人cnnm4两者。表1.cnnm4沉默sirna序列。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是shrna。如本文所用，术语“shrna”或“短发夹rna”是指双链rna(dsrna)，其中两条链通过在一条链的3'端和另一条链的5'端之间的不中断核苷酸的链键合，以形成双链结构。可以经由rna干扰将shrna用于沉默靶基因的表达，因为，一旦加工shrna，它就定位于rna诱导沉默复合物(risc)，将risc靶向至具有互补序列的mrna上。risc可以切割该mrna或抑制其翻译。在特定的实施方式中，shrna包含具有seqidno52的序列。在其他实施方式中，cnnm4抑制剂是sgrna。如本文所公开，术语单向导rna(“sgrna”)是指嵌合的非编码rna，其包含crispr酶和特异性识别基因区的靶向序列(crrna序列)。crrna区是20个核苷酸的序列，其与目的基因中的区同源，并将指导crispr酶活性。如本文所公开，crispr酶可以是本领域中已知的任何酶，诸如cas9和cpf1。如本文所公开，crispr是基因组编辑方法。这种技术在基因组编辑中的用途在本领域中有良好的描述，例如在us8,697,359和本文引用的参考文献中。简而言之，crispr是参与防御入侵的噬菌体和质粒的微生物核酸酶系统。微生物宿主中的crispr基因座包含crispr相关(cas)基因以及能够编程crispr介导的核酸切割(sgrna)特异性的非编码rna元件的组合。已经在广泛的细菌宿主中鉴定出三种类型(i-iii)的crispr系统。每个crispr基因座的一个关键特征是通过非重复序列的短节段(间隔物)间隔开的重复序列(直接重复)阵列的存在。非编码crispr阵列在直接重复中被转录并切割成包含单个间隔物序列的短crrna，其将cas核酸酶引导至靶位点(前间隔序列(间隔序列前体))。ii型crispr是特征更好的系统之一，在四个连续步骤中实施靶向dna双链断裂。首先，从crispr基因座转录两个非编码rna，即pre-crrna阵列和tracrrna。其次，tracrrna杂交至pre-crrna的重复区，并介导将pre-crrna加工成包含单个间隔物序列的成熟crrna。第三，经由crrna上的间隔物和靶dna上与前间隔序列邻近基序(pam)相邻前间隔序列之间的沃森-克里克碱基配对，成熟的crrna:tracrrna复合物将cas9引导至靶dna，靶识别的额外要求。最后，cas9介导靶dna的切割，以在前间隔序列内生成双链断裂。与传统的基因靶向和其他可编程内切核酸酶相比，crispr-cas9系统的一个主要优势是易于复用，其中多个基因仅仅通过使用各自靶向不同基因的多个sgrna就可以同时突变。另外，其中，当使用两个sgrna位于基因组区的侧翼时，可以缺失或颠倒居间部分。因此，cas9是ii型crispr-cas系统的标志性蛋白质，并且是大的单体dna核酸酶，通过两个非编码rna:crisprrna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)的复合物引导至与pam(前间隔序列邻近基序)序列基序相邻的dna靶序列。cas9蛋白质包含与ruvc和hnh核酸酶同源的两个核酸酶结构域。hnh核酸酶结构域切割互补的dna链，而ruvc样结构域切割非互补的链以及，结果是，将平切(bluntcut)引入至靶dna中。cas9与sgrna一起的异源表达可以将位点特异性双链断裂(dsb)引入至来自各种生物的活细胞的基因组dna中。对于真核生物中的应用，已经使用了最初来自细菌化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9密码子优化的版本，尽管也可以使用其他合适的cas9直系同源物代替，诸如金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)cas9(sacas9)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)cas9(cjcas9)。单向导rna(sgrna)是与cas9核酸酶形成复合物的crispr/cas系统的第二组分。sgrna是通过将crrna与tracrrna融合而生成的合成rna嵌合体。位于其5′端的sgrna向导序列赋予dna靶特异性。因此，通过修饰向导序列，可以生成具有不同靶特异性的sgrna。向导序列的典型长度是20bp。在植物中，已经使用植物rna聚合酶iii启动子诸如u6和u3，来表达sgrna。可以如本领域中所描述的构建用于本发明的方法的cas9表达质粒。“crrna”或crisprrna意指包含前间隔序列元件和与tracrrna互补的额外的核苷酸的rna序列。“tracrrna”(反式激活rna)意指与crrna杂交并结合crispr酶的rna序列，诸如cas9，从而激活核酸酶复合物以在α-、γ-和/或ω麦醇溶蛋白中至少一种的基因组序列内的特定位点处引入双链断裂。“前间隔序列元件”意指与基因组dna靶序列互补的crrna(或sgrna)的部分，通常约20个核苷酸的长度。这也可以称为间隔物或靶向序列。“sgrna”(单向导rna)意指tracrrna和crrna在单个rna分子中的组合，优选还包括接头环(其将tracrrna和crrna连接成单个分子)。“sgrna”也可以称为“grna”并且在本文上下文中，术语是可互换的。sgrna或grna为cas核酸酶提供靶向特异性和骨架/结合能力两者。grna可以是指包括crrna分子和tracrrna分子的双rna分子。sgrna可以作为将被转录为功能性sgrna的rna分子或dna分子提供。“crispr酶”意指可以与crispr系统相关的rna向导的dna内切核酸酶。特别地，这种酶结合至tracrrna序列。在一种实施方式中，cripsr酶是cas蛋白质(“crispr相关蛋白质”)，优选cas9或cpf1。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是适配体。如本文所用，术语“适配体”意指选择性结合靶配体但不催化随后化学反应的寡核苷酸。术语“肽适配体”是指短可变肽结构域，其在两端处均附着至蛋白质骨架，并结合至特异性的靶分子。可变的环长度典型地由十至二十个氨基酸组成，并且骨架可以是具有良好溶解性和兼容性特性的任何蛋白质。如本文所用，术语“核酸适配体”或“dna适配体”是指已经通过重复的选择轮次的工程化以结合至特异性分子靶标的dna的短链。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是dna酶。如本文所用，术语“dna酶”，是指能够进行特异性化学反应通常为催化反应的dna寡核苷酸。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是核酶。如本文所用，术语“核酶”或“rna酶”或“催化性rna”是指催化化学反应的rna分子。核酶可以用于水解在其他rna中的磷酸二酯键。具有抑制cnnm4表达能力的核酸可以在核碱基中、糖中和/或核苷酸之间的键中包含一种或多种修饰。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是三链形成寡核苷酸。如本文所用，术语“三链形成寡核苷酸(tfo)”，是能够形成三链的寡核苷酸，该三链通过形成氢键以序列特异性方式结合在双链体dna的大沟(groove)中。先前描述的所有抑制剂可以经受一种或多种修饰。对核酸主链的一种或多种残基的修饰可以包括以下中的一种或多种：糖在2’处的修饰诸如2’-o-甲基(2’-ome)、2’-o-甲氧乙基(2’-moe)、2’-o-甲氧基乙氧基、2’-氟代(2’-f)、2'-烯丙基、2’-o-[2-(甲胺基)-2-氧乙基]、2’-o-(n-氨基甲酸甲酯)；糖在4’处的修饰包括4’-硫代、4’-ch2-o-2’桥、4-(ch2)2-o-2’桥；锁核酸(lna)；肽核酸(pna)；嵌入核酸(ina)；扭转嵌入核酸(tina)；己糖醇核酸(hna)；阿糖核酸(arabinonucleicacid)(ana)；环己烯核酸(cna)；环己烯基核酸(cena)；苏糖核酸(tna)；吗啉寡核苷酸；gapmer；mixmer；掺入富含精氨酸的肽；向合成rna中添加5'-磷酸；rna适配体(que-gewirthns,genether.2007feb；14(4):283-91.)；在特异性rna适配体的受试者中的解毒剂控制的rna适配体(参考oneys,oligonucleotides.2007fall；17(3):265-74)；或其任何组合。对核酸的一个或多个核苷键的修饰可以包括以下中的一种或多种：硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)和苯胺磷酸酯，或其任何组合。锁核酸(lna)，通常称为不可及的rna，是修饰的rna核苷酸。用额外的桥连接碳2'和4'(o2’，c4’-亚甲基桥)修饰lna核苷酸的核糖基团。桥将核糖“锁定”在3'-内型结构构象中，其通常以dna或rna的a形式存在。当需要时，可以将lna核苷酸与核酸中的dna或rna碱基混合。这种低聚物是可商购的。肽核酸(pna)是人工合成的聚合物，其主链由肽键连接的n-(2-氨乙基)-甘氨酸的重复单元构成。不同的嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基-羰基键连接至主链。嵌入核酸(ina)是修饰的核酸类似物，其包括共价结合至疏水插入物的正常脱氧核糖核苷酸。己糖醇核酸(hna)是由天然核碱基和磷酸化的1,5-失水己糖醇主链形成的核苷酸。hna和rna之间的分子缔合比hna和dna之间以及天然核酸(dsdna、dsrna、dna/rna)之间的分子缔合更稳定。其他合成修饰的寡核苷酸包括ana(阿糖核酸)、cna(环己烯核酸)、cena(环己基核酸)和tna(苏糖核酸)。吗啉代(morpholino)是合成分子，其是重新设计天然核酸结构的产物。结构上，吗啉代与dna或rna之间的区别是吗啉代具有标准的核碱基，这些碱基连接至6元吗啉环，而不是连接至脱氧核糖/核糖环，以及在亚基之间的非离子二胺磷酸酯键代替了阴离子磷酸二酯键。吗啉代有时被称为pmo(二胺磷酸酯吗啉代寡核苷酸)。6元吗啉环具有化学式o(ch2ch2)2nh。gapmer或“带间隙(gap)的寡聚合物”为rna-dna-rna嵌合的寡核苷酸探针，其中dna窗口或间隙插入正常或经修饰的rna寡核苷酸(称为“翼”)中。这种修饰增加了寡核苷酸在体内的稳定性，并使探针更易于与靶标相互作用，使得可以有效地使用较短的探针。优选地，翼是保护内部阻断免于核酸酶降解的修饰的2'-o-甲基(ome)或2'-o-甲氧基乙基(moe)寡核苷酸。此外，可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键连接形成间隙或翼的核苷酸，其从而使它们抵抗rna酶降解。此外，还可以通过掺入经由3'-甲基膦酸酯键连接的碱基来修饰形成翼的核苷酸。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是小分子。如本文所用，术语“小分子”是指能够调控生物过程的低分子量(<900道尔顿)的有机化合物。小分子能够抑制蛋白质的特异性功能或破坏蛋白质–蛋白质的相互作用。在优选的实施方式中，小分子是7-氨基-2-苯基-5h-噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮(pubchemcid91383855)或罗丹明衍生物，被称为2-[5-(4-氧代-2-硫基-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]-苯甲酸，如在以下中所描述的：park,h.,等人2008.bioorgmedchemlett.18(7):2250-5(chemspiderid1014170)。在其他实施方式中，cnnm4的抑制剂是前面提及的抑制剂的任何组合。如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等包括旨在终止、预防、改善和/或减少对如本文所描述的临床病症的敏感性的任何类型的疗法。因此，如本文所用，“治疗(treatment)”，“治疗(treating)”等是指获得期望的药理和/或生理作用，覆盖对包括人在内的哺乳动物的病理病症或疾患的任何治疗。根据完全或部分预防疾患或其症状，该作用可以是预防性的，和/或根据对于疾患的部分或完全治愈和/或归因于疾患的不利影响，该作用可以是治疗性的。它覆盖了在哺乳动物中，特别在人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)增加生存时间；(b)降低由于该疾病引起的死亡风险；(c)预防该疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中；(d)抑制疾病，即，停止其发展(例如，减少疾病进展速度)；以及(e)减轻疾病，即，引起疾病消退。如本文所用，“疾病”意指活体动物的或损害正常功能的其部分之一的病症，并且典型地表现为区分体征和症状。优选的实施方式的动物是哺乳动物，优选人。如本文所用，“急性疾病”意指发病时严重和突然的病症。如本文所用，“慢性疾病”意指长期发展的病症。急性疾病可以导致慢性疾病。如本文所用，术语“受试者”、“患者”或“个体”可互换地是指动物界的任何成员，并且可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物，包括人、非人的灵长类、马、猪、兔子、狗、绵羊、山羊、牛、猫、豚鼠或啮齿动物。优选地，受试者是哺乳动物，更优选地是人。根据本发明，该疾病选自由以下组成的组：肝病、肾病和肺病。在一种实施方式中，疾病是非增殖性疾病(即，该疾病是除癌症以外的疾病)。如本文所用，“肝病”是对肝的急性或慢性受损，通常由以下引起：感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物、酒精、食物中的杂质，以及血液中正常物质的异常积累，自身免性疫过程或通过遗传缺陷(诸如血色病)。有时，可能不清楚损伤的确切原因。基于疾病的持续时间，可以将肝病分类为急性或慢性肝病。在急性肝病中，诸如急性肝炎和急性肝衰竭(alf)，病史不超过六个月。将更长持续时间的肝病分类为慢性肝病。常见肝病的非限制性实例包括肝硬化、肝纤维化、非酒精性脂肪肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝脏缺血再灌注损伤、原发性胆汁性肝硬变(pbc)和肝炎，包括病毒性和酒精性肝炎。病毒性肝炎最常见的形式是乙型和丙型肝炎(分别为hbv和hcv)。慢性肝炎可能导致肝硬化。在所有形式的肝病中，通过称为细胞凋亡的过程的肝细胞死亡是常见的。肝细胞的细胞凋亡与肝纤维化和其他肝病有关。肝病和，尤其是由药物引起的肝病(药物性肝损伤或dili)，在临床上本身表现为多种症状，这些症状本身并没有特定的信息。症状的非限制性实例包括：食欲不振、虚脱、眩晕、消瘦、恶心、呕吐、发烧、右上腹部区疼痛、关节痛、肌痛、瘙痒、疹、可能会出现排泄变色、眼睛和皮肤发黄。如本领域的专家所已知的，通常通过血液中酶水平升高的存在来检测活动性肝病的存在。特别地，alt(谷丙转氨酶)和ast(谷草转氨酶)的血液水平高于临床上可接受的正常范围被认为指示持续的肝受损。临床上使用肝病患者对于alt和ast血液水平的常规监测以测量医疗治疗期间肝病的进展。将升高的alt和ast降低至可接受的正常范围之内被认作是临床证据，反映出降低了患者持续肝受损的严重程度。在特定的实施方式中，肝病是由任何种类的肝受损引起的。如本文所用，术语“肝受损”用于表示肝脏创伤(损伤)的任何类型，包括慢性和急性创伤以及存在于肝细胞或组织中的病理变化。肝受损的临床病症可以包括，但不限于，活细胞退化、肝血管炎、存在于肝中的点状坏死或局部坏死、肝和门管区的炎症细胞浸润或成纤维细胞增殖或肝大和肝硬化、由严重的肝受损导致的肝癌等。肝病是由肝损伤导致的。对肝的损伤可能是由毒素包括酒精、一些药物、食物中的杂质、血液中正常物质的异常积累、由感染或由自身免疫性疾患引起的。在一些情况下，由肝损伤导致的肝受损包括但不限于脂肪肝、肝硬化、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎和α1-抗胰蛋白酶缺乏症。肝受损包括但不限于，肝硬化、肝纤维化、非酒精性脂肪肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝脏缺血再灌注损伤、肝炎、包括病毒性和酒精性肝炎以及原发性胆汁性肝硬变(pbc)。在优选的实施方式中，所述肝病选自肝纤维化、静脉闭塞性肝病、药物性肝损伤(dili)、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)、巴德-吉亚利综合征和肝炎或其任何组合。在更优选的实施方式中，所述肝病选自肝纤维化、静脉闭塞性肝病、药物性肝损伤(dili)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)、巴德-吉亚利综合征和肝炎或其任何组合。在更优选的实施方式中，所述肝病选自药物性肝损伤(dili)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)或其任何组合。在更优选的实施方式中，所述肝病选自药物性肝损伤(dili)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化或其任何组合。如本文所用，“纤维化”是修复或反应过程中在器官或组织中形成过量的纤维结缔组织。这可以是反应性、良性或病理性状态。对损伤的应答，这称为瘢痕化，并且如果纤维化是由单个细胞系引起的，则称为纤维瘤。生理上，纤维化的作用是沉积结缔组织，这可以干扰或完全抑制基础器官或组织的正常结构和功能。纤维化可用于描述纤维组织过度沉积的病理状态以及愈合中结缔组织沉积的过程。由细胞外基质(ecm)蛋白质的病理性积累所限定的，纤维化导致受影响组织的瘢痕化和增厚，实质上是夸大的伤口愈合应答，其干扰正常的器官功能。纤维化可能会影响任何器官。在优选的实施方式中，纤维化是肝纤维化。如本文所用，“肝纤维化”是代表肝对损伤应答的瘢痕化过程。就像皮肤和其他器官可以通过沉积胶原和其他基质成分来愈合伤口一样，因此肝可以通过沉积新的胶原来修复损伤。肝纤维化是肝瘢痕化的第一阶段。以后，如果更多的肝变得瘢痕化，则可能导致肝的肝硬化。如本文所用，“静脉闭塞性肝病”或“肝脏肝窦阻塞综合征(sos)”特征在于肝大、右上象限疼痛、黄疸和腹水，最通常发生于经历造血干细胞移植(hct)的和以下较少见的患者中：在非移植环境中使用某些化学治疗剂、摄入生物碱毒素、高剂量放射治疗后或肝移植。sos中的肝脏静脉流出阻塞是由于末梢肝脏小静脉和肝脏血窦闭塞引起的。如本文所用，“药物性肝损伤(dili)”意指使用一种或多种药物后发展的对肝的损伤。如本文所用，“脂肪变性”也称为脂肪改变，是描述脂质在细胞内异常滞留的过程。它反映了合成和消除甘油三酯脂肪的正常过程的损害。过多的脂质积聚在取代细胞质的囊泡中。当囊泡大到足以扭曲细胞核时，这种情况被称为大泡性脂肪变性；否则，这种情况被称为小泡性脂肪变性。虽然在轻度情况下对细胞没有特别不利，但大量积累会破坏细胞成分，并且在严重的情况下，细胞甚至可能破裂。与脂肪变性相关的危险因素多种多样，并且包括糖尿病、蛋白质营养不良、高血压、细胞毒素、肥胖症、缺氧和睡眠呼吸暂停。由于肝是脂质代谢的主要器官，因此其最通常与脂肪变性相关；然而，它可能发生于任何器官中，通常是肾、心脏和肌肉。在优选的实施方式中，脂肪变性在肝中引起。如本文所用，“非酒精性脂肪性肝炎(nash)”是在非酒精性患者中发展的综合征；它引起的肝受损与酒精性肝炎是组织学上无法区分的。它最通常发展于患有以下风险因素中的至少一种的患者中：肥胖症、血脂异常和葡萄糖不耐受。对病程了解甚少，但似乎与胰岛素抵抗有关(例如，在肥胖症或代谢综合征中)。大多数患者是无症状的。实验室检查包括氨基转移酶水平的升高。需要活检以确认诊断。如本文所用，“肝硬化”意指肝脏纤维化进展的晚期，其特征在于肝脏结构的扭曲和再生结节的形成。通常认为它在晚期是不可逆的，此时，唯一的治疗选择可能是肝移植。治疗潜在原因后，多种形式的肝病有可能逆转肝硬化(在其更早期中)。患有肝硬化的患者易患多种并发症，并且他们的期望寿命通常会明显较少。如本文所用“肝细胞癌(hcc)”意指侵袭性肿瘤，其通常发生于慢性肝病和肝硬化的背景下。其典型地在其过程的晚期中被诊断出来，并且诊断后的中位生存期为大约6至20个月。尽管疗法的主要支持是手术切除术，但由于肿瘤范围或潜在的肝功能障碍，大多数患者不符合条件。如本文所用，将“巴德-吉亚利综合征”(bcs)定义为肝脏静脉流出道阻塞，与阻塞的水平或机制无关，只要该阻塞不是由于心脏病、心包病或肝窦阻塞综合征(静脉-闭塞性疾病)。当由于主要静脉过程(血栓形成或静脉炎)的阻塞时，存在原发性巴德-吉亚利综合征，当肝脏静脉和/或下腔静脉通过起源于静脉外部的病变(例如，恶性)挤压或侵袭时，则存在二次巴德-吉亚利。如本文所用，“肝炎”意指肝的炎症，与原因无关。肝炎可能是由多种病症包括药物毒性、免疫疾病和病毒引起的。其特征在于是黄疸、肝肿大和发烧。如本文所用，“肾病”是对肾的急性或慢性受损。它是指由于包括外在因素、内在因素、遗传因素等的各种原因发生于肾的疾病。肾脏疾病的非限制性实例包括：肾炎、肾变病、肾脏纤维化、薄基底膜肾小球(tgbm)、微小病变肾病(mcd)、膜性肾小球肾炎(mgn)、局灶性节段性肾小球硬化症(fsgs)、dm肾病、iga肾病(igan)、肾小管间质性肾炎(tin)、过敏性紫癜(hsp)肾炎、急性肾小管损伤、bk病毒肾病、急性细胞性排斥反应、慢性抗体介导的排斥反应、慢性活性抗体介导的排斥反应、慢性钙调磷酸酶抑制剂毒性、急性肾损伤、慢性肾病、缺血性肾脏疾病、肾小球肾炎、狼疮肾炎、多囊肾病、肾盂肾炎、肾结石、肾脏结核、肾脏肿瘤、慢性肾脏衰竭、终末期肾脏衰竭、脓毒症、由肝脏损伤引起的肾脏损伤等。在优选的实施方式中，所述肾病选自急性肾损伤(aki)、慢性肾病、肾炎、肾变病以及肾脏纤维化。如本文所用，“急性肾损伤(aki)”或“急性肾脏衰竭(arf)”是在7天内发展的肾功能突然丧失。非限制性原因包括：由来自任何原因(例如，低血压)的肾血流量降低(肾缺血)引起的肾组织受损，暴露于对肾有害的物质，肾中的炎症过程或阻碍尿流动的尿路阻塞。基于特征性实验室检查诸如血尿素氮和肌酐升高，或者肾没有能力产生足够量的尿而诊断出aki。aki可能导致许多并发症，包括代谢性酸中毒、高钾水平、尿毒症、体液平衡变化以及对其他器官系统的影响，包括死亡。经历了aki的人将来可能会增加患有慢性肾病的风险。如本文所用“慢性肾病(cdk)”意指肾病的一种类型，其中，在几个月或几年的时间段内，肾功能会逐渐丧失。早期典型地没有任何症状。之后，可能发展出腿部肿胀、感到疲倦、呕吐、食欲不振或意识错乱。并发症可能包括心脏病、高血压、骨骼疾病或贫血。慢性肾病的非限制性原因包括糖尿病、高血压、肾小球肾炎和多囊肾病。风险因素包括该病症的家族史。诊断通常通过血液测试以测量肾小球滤过率，以及尿测试以测量白蛋白。可以进行进一步的测试诸如超声或肾活检，以确定潜在原因。如本文所用，“肾炎”意指肾的炎症，并且可能涉及肾小球、小管或者肾小球和小管周围的间质。非限制性原因包括：感染、毒素和自身免疫性疾患。肾炎包括肾小球肾炎(肾小球的炎症)和间质性肾炎或肾小管间质性肾炎(肾脏小管之间的空间炎症)。如本文所用，“肾变病”意指肾小管的任何退行性疾病。肾变病可以由肾病引起，或其可以是其他疾患特别是糖尿病的并发症。经由以下来进行诊断：测试尿存在的蛋白质、对于低于正常水平的蛋白质的血液测试以及观察水肿。在优选的实施方式中，纤维化是肾脏纤维化。如本文所用，“肾脏纤维化”意指影响肾的纤维化。如本文所用，“呼吸系统疾病”意指影响可能在更高等生物中进行气体交换的器官和组织的任何病理病症，以及包括以下的病症：上呼吸道、气管、支气管、细支气管、肺泡、胸膜和胸膜腔以及呼吸的神经和肌肉。如本文所用，“肺病”是影响肺的任何呼吸系统疾病。肺病可能是肺的急性或慢性受损。肺病的非限制性实例包括：哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性或急性支气管炎、囊性纤维化性肺气肿、急性呼吸窘迫综合征、细菌性肺炎、结核性肺栓塞和肺癌症。在优选的实施方式中，肺病是肺纤维化。如本文所用，“肺纤维化”意指呼吸系统疾病，其中在肺组织中形成瘢痕，从而导致呼吸问题。瘢痕形成，过度纤维结缔组织的积累(该过程称为纤维化)，导致了壁的增厚，并引起血液中的氧气供应减少。结果，患者可能会遭受气短。肺纤维化的症状包括：气短、慢性干、干咳、疲劳和虚弱、胸部不适包括胸痛、食欲不振以及快速消瘦。如本文所公开，肺纤维化可能是其他疾病的和/或包括以下的特定治疗的二次影响：治疗剂向肺的全身和局部递送的非侵入式给药，诸如鼻内给药和口服吸入给药。可能引起作为二次影响的肺纤维化的疾病和病症的非限制性实例包括：吸入环境和职业污染物，诸如在石棉沉着病、硅沉着病中以及暴露于某些空气中的金属；过敏性肺炎，最通常由吸入受细菌、真菌或动物产品污染的粉尘导致；吸烟；一些结缔组织疾病诸如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(sle)和硬皮病、结节病和肉芽肿性多血管炎；感染；某些医药，例如胺碘酮、博来霉素(平阳霉素)、白消安、甲氨蝶呤、阿朴吗啡(apomorphine)和呋喃妥因(nitrofurantoin)；胸部放射疗法。在特定的实施方式中，用于本发明的cnnm4抑制剂可以以形成药物组合物的部分给药，其中，cnnm4抑制剂是与药学上可接受的赋形剂一起给药。因此，本发明涉及药物组合物，其包括如本文所描述的cnnm4抑制剂和药学上可接受的赋形剂，用于医学(即作为治疗)。本发明进一步涉及药物组合物，其包括如本文所描述的cnnm4抑制剂和药学上可接受的赋形剂，用于治疗受试者中的急性或慢性疾病，其中，所述疾病优选选自由肝病、肾病和肺病组成的组。如本文所用，“药物组合物”涉及生理上可耐受的并且当向至人或动物给药时，典型地不产生与胃疾患、头晕以及诸如此类的过敏反应或类似的不利反应的组合物和分子实体。优选地，术语“药学上可接受的”意指它经州或联邦政府的监管机构批准，或包括在美国药典或其他公认的药典中，用于动物，并且更特定地用于人。术语“赋形剂”是指与活性成分一起给药的负载体、稀释剂或佐剂。这样的药物赋形剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油以及类似物。水或含盐的水性溶液和水性右旋糖和甘油溶液，将特别用于注射的溶液，优选用作负载体。由e.w.martin,21stedition,2005的“remington'spharmaceuticalsciences”；或“handbookofpharmaceuticalexcipients”,rowec.r.；paulj.s.；mariane.q.,sixthedition中描述了合适的药物负载体。适当量的如上文定义的抑制剂可以与药学上可接受的赋形剂和/或载体一起配制，以获得用于医学，特别是用于治疗肝病、肾病和/或肺病的药物组合物。合适的药学上可接受的负载体包括，例如，水、盐溶液、酒精、植物油、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸的单甘油酯和甘油二酯、脂肪酸酯petroetral、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。包括如上文所定义的抑制剂的药物组合物可以发生于被认为适合于所选给药途径的给药的任何药物形式，例如，通过全身的(例如静脉内的、皮下的、肌肉的注射)、口服、肠胃外或局部给药，为此药物组合物将包括配制期望给药方法所必需的药学上可接受的赋形剂。另外，还有可能鼻内或舌下给药包括如上文所定义的抑制剂的组合物，其允许通过非侵袭性模式给药进行全身给药。脑室内给药也可以是适当的。在优选的实施方式中，给药途经是静脉途经。在优选的实施方式中，给药途经是皮下途经。当必要时，用于本发明的抑制剂包括在还包括增溶剂和局部麻醉剂的组合物中以改善注射部位的任何疼痛。通常，成分以单位剂型分开或混合在一起提供，例如，作为在指示活性剂量的密封容器诸如安瓿或小袋(sachette)中的干燥的冻干粉末或无水浓缩物。当组合物通过输注给药时，可以用包含无菌药物级水或盐溶液的输注瓶分配组合物。当组合物通过注射给药时，可以提供无菌的注射用水或盐溶液的安瓿，使得在给药前混合成分。在除了静脉内给药情况下，组合物可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、聚合物或持续释放制剂。该组合物可以与本领域已知的传统粘结剂和载体一起配制。制剂可以包括标准载体，诸如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖钠、纤维素、碳酸镁等，在药物制造中具有完善功能的惰性载体。各种递送系统是已知的并且可以用于给药本发明的治疗剂包括脂质体、微粒、微胶囊等中的胶囊化。用于口服给药的固体剂型可以包括常规胶囊、持续释放胶囊、常规片剂、持续释放片剂、咀嚼片剂、舌下片剂、泡腾片剂、丸剂、悬浮液、粉末、颗粒剂和凝胶。在这些固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性赋形剂诸如蔗糖、乳糖或淀粉混合。此类剂型还可以包括，如在正常实践中，除了惰性稀释剂的额外的物质，例如润滑剂诸如硬脂酸镁。在胶囊、片剂、泡腾片剂和丸剂的情况下，剂型还可包括缓冲剂。可以用肠溶包衣制备片剂和丸剂。用于口服给药的液体剂型可以包括包含该技术中一般使用的惰性稀释剂诸如水的药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和和酏剂。这些组合物还可以包括佐剂，诸如润湿剂、乳化和悬浮剂以及甜味剂、调味和加香剂。可注射制剂，例如，水性或油性悬浮液、无菌注射剂可以根据已知技术使用合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂配制。可以使用的可接受的负载体和溶剂中为水、林格氏溶液和等张氯化钠溶液。也将无菌油常规地用作溶剂或悬浮介质。对于局部给药，本发明的化合物可以配制成乳膏、凝胶、洗剂、液体、发膏剂、喷雾溶液、分散剂、固体棒、乳剂、微乳剂以及类似物，其可以根据使用合适的赋形剂的常规方法配制，诸如，例如乳化剂、表面活性剂、增稠剂、着色剂及其两种或更多种的组合。另外，如上文所定义的抑制剂可以以经皮贴剂或离子透入装置的形式给药。合适的经皮贴剂是本领域已知的。几种药物递送系统是已知的并且可用于给药如上文所定义的抑制剂，包括，例如，脂质体、微泡、乳剂、微粒、微胶囊、阳离子脂质以及类似物中的胶囊化。阳离子脂质，也称为“bola两亲分子”或“bolas”，由疏水链与在各自端具有一个或多个带正电荷的头部基团组成。所需剂量可以作为单一单位或以持续释放形式给药。非侵入性特异性治疗的非限制性实例包括：病毒载体将气道基因递送至肺的用途，诸如慢病毒和腺病毒，以及基于聚合物的纳米技术，其也可通过吸入向肺局部地给药。给药方式可以是本领域已知的任何技术，诸如使用最常用于呼吸递送的任何装置的那些，包括雾化器、定量吸入器和干粉吸入器。可持续释放形式以及用于其制备的适当材料和方法在，例如"modified-releasedrugdeliverytechnology",rathbone,m.j.hadgraft,j.androberts,m.s.(eds.),marceldekker,inc.,newyork(2002)，"handbookofpharmaceuticalcontrolledreleasetechnology",wise,d.l.(ed.),marceldekker,inc.newyork,(2000)中描述。在本发明的一种实施方式中，根据本发明的抑制剂的口服给药形式为持续释放形式，进一步包括至少一种包衣或基质。包衣或持续释放基质包括但不限于天然聚合物，半合成或合成的水不溶性、改性的蜡、脂肪、脂肪醇、脂肪酸，天然半合成或合成的增塑剂，或它们的两种或更多种的组合。可以使用本领域专家已知的常规方法施用肠溶包衣，如在，例如johnson,j.l.,"pharmaceuticaltabletcoating",coatingstechnologyhandbook(第二版),satas,d.和tracton,a.a.(eds),marceldekker,inc.newyork,(2001)，carstensen,t.,"coatingtabletsinadvancedpharmaceuticalsolids",swarbrick,j.(ed.),marceldekker,inc.newyork(2001),455-468中描述。在实施方式中cnnm4抑制剂是sirna。sirna的体内递送方法是本领域已知的(davis,m.e.等人,nature2010april15；464(7291):1067–1070)。在实施方式中，sirna与至少一种配体缀合。配体优选特异性于在靶细胞表面上表达的受体。对于靶向肝实质细胞的sirna，至少一种配体优选为galnac或galnac衍生物。在特定的实施方式中，以0.1μg/μl至2.5μg/ml之间的浓度使用sirna。在优选的实施方式中，以以下的浓度使用sirna：至少0.1μg/μl、至少0.2μg/μl、至少0.3μg/μl、至少0.4μg/μl、至少0.5μg/μl、至少0.6μg/μl、至少0.7μg/μl、至少0.8μg/μl、至少0.9μg/μl、至少1μg/μl、至少1.1μg/μl、至少1.2μg/μl、至少1.3μg/μl、至少1.4μg/μl、至少1.5μg/μl、至少1.6μg/μl、至少1.7μg/μl、至少1.8μg/μl、至少1.9μg/μl、至少2μg/μl、至少2.1μg/μl、至少2.2μg/μl、至少2.3μg/μl、至少2.4μg/μl、至少2.5μg/μl或更多。在其他优选的实施方式中，以0.75μg/μl的浓度使用sirna。在特定的实施方式中，以患者每公斤0.1至10mg之间的剂量使用sirna。在优选的实施方式中，以至少0.1mg/kg、至少0.5mg/kg、至少1mg/kg、至少5mg/kg、至少10mg/kg的剂量使用sirna。在优选的实施方式中，cnnm4抑制剂给药一天一次、一天两次、一天三次或更多。在其他优选的实施方式中，cnnm4抑制剂给药一周一次、一周两次、一周3次、一周4次、一周5次、一周6次、一周7次或更多。在更优选的实施方式中，cnnm4抑制剂给药一周两次。替代地，本发明涉及用于治疗肝病、肾病和/或肺病的方法，包括向有此需要的受试者给药根据本发明的cnnm4抑制剂或药物组合物。先前描述的所有术语和实施方式同样适用于本发明的此方面。替代地，本发明涉及用于制备治疗肝病、肾病和/或肺病的药剂的根据本发明的cnnm4抑制剂或药物组合物。先前描述的所有术语和实施方式同样适用于本发明的此方面。用于诊断肝病、肾病或肺病的方法在其他方面，本发明涉及用于诊断受试者中肝病、肾病或肺病的体外方法，其包括：(a)测定来自所述受试者的样本中cnnm4的表达水平，以及(b)将所述水平与参考值比较，其中，相对于所述参考值，所述样本中cnnm4的表达水平增加表明患者患有肝病、肾病或肺病。先前已经在结合本发明的其他方面定义了术语“肝病”、“肾病”、“肺病”、“受试者”、“cnnm4基因”和“参考值”。关于这些术语的本发明其他方面的所有特定和优选实施方式完全适用于该方面。如本文所用，术语“诊断”既是指试图确定和/或鉴定受试者中的可能疾病的过程，即诊断程序，并且也是指通过该过程得出的意见，即诊断意见。因此，还可以将它视为尝试将个体的病症分类为单独和不同的类别，其允许做出有关治疗和预后的医疗决策。如本领域技术人员将理解的，尽管它是优选的，但这种诊断对于待诊断的受试者可能不是100％正确。然而，术语要求受试者的统计学上显著的部分可以被鉴定为患有疾病，特别是本发明上下文中的肝病、肾病或肺病，或具有其中的倾向。本领域技术人员可以使用众所周知的不同统计评估工具来确定一方是否是统计学上显著的，例如，通过确定置信区间、p-值确定、学生检验(student's-test)、mann-whitney等(参见dowdy和wearden，1983)。优选的置信区间为至少50％、至少60％、至少70％>、至少80％>、至少90％)或至少95％。p值优选为0.05、0.025、0.001或更低。如本文所公开，术语“诊断”意指确定哪种疾病或病症解释了人员的症状和体征的过程。在具体的实施方式中，本发明的用于诊断肝、肾或肺病的方法包括测定cnnm4的表达水平。测定cnnm4表达水平的方法如本文别处所公开的。在优选的实施方式中，本发明的用于诊断肝、肾或肺病的方法包括测定cnnm4蛋白质的表达水平。在更优选的实施方式中，本发明的用于诊断肝、肾或肺病的方法包括通过免疫组织化学法测定cnnm4蛋白质的表达水平。在实施方式中，当cnnm4的表达水平相对于参考值增加时，该患者患有肝病肾病和/或肺病。先前已经公开了测定cnnm4表达水平的方法。在实施方式中，当cnnm4的表达水平相对于参考值增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％或更多时，患者被诊断患有肝病、肾病和/或肺病。如本文所用，“样本”或“生物样本”是指从受试者分离的生物材料。样本包含适合于检测基因表达水平的任何材料，并且可以是包括受试者遗传材料的材料。生物样本可以包括受试者的细胞和/或非细胞材料，优选细胞材料。在特定的实施方式中，样本包括在研究下的受试者的遗传材料，例如dna、基因组dna(gdna)、互补dna(cdna)、rna、mrna等。在特定的实施方式中，遗传材料是rna。样本可以从任何生物组织或流体中分离，诸如，例如，血液，唾液，血浆，血清，尿，脑脊液(csf)，粪便，鼻、口或咽拭子，试样，自活检中获得的试样，以及包埋在石蜡中的组织肝、肺或肾组织的样本。分离样本的程序是本领域技术人员众所周知的。生物样本可以包含适合于检测cnnm4表达水平的任何生物材料并且可以包括来自受试者的细胞和/或非细胞材料。优选地，用于测定cnnm4表达水平的样本是可以使用微创手术获得的样本。在优选的实施方式中，样本是肝、肾和/或肺样本或活检。在分析样本之前，通常需要进行制备所述样本的一种或多种操作以将待测定的分子与样本中的其他分子分离。在特定的实施方式中，分子是核酸、dna和/或rna。这些样本制备操作包括操纵诸如：浓缩、悬浮、提取细胞内材料(例如，来自组织样本/全细胞等的核酸)、核酸扩增、片段化、转录、标记和/或延伸反应。这些方法是本领域技术人员众所周知的。还提供用于mrna纯化的商业试剂盒，包括但不限于来自qiagen的mirneasyminikit、mirnalifetechnologies分离试剂盒、来自sigma-aldrich的microrna分离试剂盒mirpremier和来自roche的高纯mirna分离试剂盒。在特定的实施方式中，使用agilent2100bionalizer(agilenttechnologies，帕洛阿托，加利福尼亚州，美国)中的rna6000nanochips分析rna的完整性。在实施方式中，当患者被诊断为患有肝病、肾病和/或肺病时，向所述患者给药治疗有效量的cnnm4抑制剂。如本文所用，将术语“治疗有效量”理解为能够抑制cnnm4表达的根据本发明的抑制剂的任何量。在优选的实施方式中，如果发现cnnm4的表达相对于参考值增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％时、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％时，向患者给药治疗有效量的cnnm4抑制剂。在优选的实施方式中，抑制剂选自由以下组成的组：中和抗体或其功能片段、拮抗剂、可溶性结合蛋白质、可溶性受体变体、非功能性衍生物、反义多核苷酸、rna干扰寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、mirna、sirna、shrna、sgrna、反义rna、dicer-底物27-mer双链体、适配体、dna酶、核酶、三链形成寡核苷酸(tfo)、小分子及其组合。在更优选的实施方式中cnnm4抑制剂是sirna。在甚至更优选的实施方式中，sirna包括核酸序列seqidno:13、seqidno:14、seqidno:50或seqidno:51或在表1中示出的seqidno的任何序列中的至少一种。在仍更优选的实施方式中，sirna包括如seqidno:7和seqidno:8本文所述的核酸序列。在优选的实施方式中所述肝病选自肝纤维化、静脉闭塞性肝病、药物性肝损伤(dili)、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)、巴德-吉亚利综合征和肝炎，或其任何组合。在其他优选的实施方式中，所述肾病选自急性肾损伤(aki)、慢性肾病、肾炎、肾变病以及肾脏纤维化，或其任何组合。在其他优选的实施方式中肺病是肺纤维化。先前描述的所有术语和实施方式同样适用于本发明的此方面。用于体外诊断疾病的试剂的用途在进一步的方面，本发明涉及特异性用于测定所述cnnm4表达水平的试剂在用于在体外诊断受试者中肝病、肾病或肺病的用途。特异性用于测定cnnm4表达水平的试剂可以以试剂盒形式呈现。在本发明的上下文中，将“试剂盒”或“测定装置”理解为包含实施测定cnnm4表达水平的方法所必需的不同试剂的产品或装置，将其包装以便允许它们运输和储存。适合于包装试剂盒组分的材料包括晶体、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸、包膜等等。此外，试剂盒可以包含同时、连续或单独使用试剂盒中不同组分的说明。所述说明可以是印刷材料的形式或者是能够存储说明使得它们可以被受试者阅读的电子支持物的形式，诸如电子存储介质(磁盘、磁带等)、光学介质(cd-rom、dvd)等。额外地或替代地，介质可以包含提供所述说明的因特网地址。表达“特异性用于测定cnnm4表达水平的试剂”意指化合物或化合物的组，其允许借助于测定mrna水平或借助于测定蛋白质水平两者来测定基因的表达水平。因此，第一类型的试剂包括能够与由所述基因编码的mrna特异性杂交的探针。第二类型的试剂包括与由标志物基因编码的蛋白质特异性结合的化合物并且优选包括抗体，尽管它们可以是特异性适配体。因此，在特定的实施方式中，特异性用于测定cnnm4表达水平的试剂选自由以下组成的组：与cnnm4的mrna特异性杂交的探针的组以及能够特异性扩增cnnm4的mrna的引物对的组，或者其中，特异性用于测定cnnm4表达水平的试剂是与cnnm4多肽特异性结合的抗体。在优选的实施方式中，足以测定cnnm4表达水平的试剂包括足以测定形成试剂盒的基因的表达水平的试剂总量的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。在优选的实施方式中，本发明的试剂盒的第一组分包括可以与上文提及的基因特异性杂交的探针。如本文所用，术语“特异性杂交”，是指允许两个多核苷酸在高严格条件或中等严格条件下杂交的条件。杂交反应的“严格性”由本领域普通技术人员之一容易地确定，并且通常是依赖于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般来说，较长的探针需要更高的温度用于适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于其熔融温度的环境中时，杂交通常取决于变性的dna再退火的能力。探针和可杂交序列之间所期望的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。结果是，较高的相对温度往往会使反应条件更加严格，而较低的温度则不那么严格。有关杂交反应严格性的额外的细节和解释，参见ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,wileyintersciencepublishers,(1995)。典型地如本文定义，“严格条件”或“高严格条件”：(1)采用低离子强度和高温洗涤，例如在50℃下0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间采用变性剂，诸如甲酰胺，例如在42℃下，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mm磷酸钠缓冲液ph6.5与750mm氯化钠、75mm柠檬酸钠；或(3)在42℃下，采用50％甲酰胺、5xssc(0.75mnacl、0.075m柠檬酸钠)、50mm磷酸钠(ph6.8)、0.1％焦磷酸钠、5xdenhardt溶液、超声处理的鲑鱼精子dna(50μg/ml)、0.1％sds和10％葡聚糖硫酸酯，在42℃下于0.2xssc(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中洗涤，随后是在55℃下的由包含edta的0.1xssc组成的高强度洗涤。可以将“中等严格条件”鉴定为如由sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,newyork:coldspringharborpress,1989所描述的，并且包括使用比上文描述的那些更不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％sds)。中等严格条件的实例是在37℃下在包括以下的溶液中孵育过夜：20％甲酰胺、5xssc(150mmnacl、15mm柠檬酸三钠)、50mm磷酸钠(ph7.6)、5xdenhardt's溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20mg/ml变性剪切鲑鱼精子dna，随后是在约37-50℃的1xssc中洗涤过滤器。本领域技术人员将认识到如何根据需要调节温度、离子强度等以适应因素诸如探针长度等。在通过测量由所述基因编码的多肽的水平来测定cnnm4的表达水平的情况下，根据本用途的试剂盒包括能够特异性结合至所述多肽的试剂。为此目的，抗体阵列诸如由以下描述的那些可以是有用的：dewildt等人(2000)nat.biotechnol.18:989-994；lueking等人(1999)anal.biochem.270:103-111；ge等人(2000)nucleicacidsres.28,e3,i-vii；macbeathandschreiber(2000)science289:1760-1763；wo01/40803以及wo99/51773a1。阵列的抗体包括能够以高亲和力结合至配体的任何免疫剂，包括igg、igm、iga、igd和ige，以及类似于具有抗原结合位点的抗体的分子，诸如fab'、fab、f(ab')2、单域抗体或dabs、fv、scfv等。用于制备所述抗体的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括由ausubel等人(currentprotocolsinmolecularbiology,eds.ausubel等人,johnwiley&sons(1992))描述的方法。阵列的抗体可以以高速采用，例如，使用可商购的机器人系统(例如，由geneticmicrosystems或biorobotics生产的那些)。阵列的基底可以是硝酸纤维素、塑料、晶体或可以是多孔材料，例如丙烯酰胺、琼脂糖或其他聚合物。在其他实施方式中，可以使用产生特异性抗体的细胞借助于在阵列过滤器中的培养来检测本发明的蛋白质。在诱导抗体表达后，将后者固定在过滤器中，在生产细胞所在的阵列位置中。可以将阵列的抗体与标记的靶标接触，并且可以测定靶标与固定抗体的结合水平。如果未标记靶标，则可以使用夹心类型测定，其中使用特异性用于与固定在支持物中的多肽结合的多肽的第二标记抗体。存在于阵列各自点中样本中的多肽的定量可以作为表达谱存储在数据库中。抗体阵列可以复制生产，并且可以用于比较两个不同样本的结合谱。在实施方式中，本发明涉及包括足以测定由cnnm4基因编码的多肽的平均表达水平的试剂的试剂盒或测定装置的用途，其中，该试剂是特异性结合至由所述基因编码的多肽的抗体或抗体的组，并且，其中，所述试剂包括存在于试剂盒中的试剂的至少10％。在特定的方面，本发明涉及本发明的试剂盒用于确定患有肝、肾或肺病的患者的预后的用途。在优选的实施方式中所述肝病选自肝纤维化、静脉闭塞性肝病、药物性肝损伤(dili)、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)、巴德-吉亚利综合征和肝炎，或其任何组合。在其他优选的实施方式中，所述肾病选自急性肾损伤(aki)、慢性肾病、肾炎、肾变病以及肾脏纤维化，或其任何组合。在其他优选的实施方式中肺病是肺纤维化。先前描述的所有术语和实施方式同样适用于本发明的此方面。减少诱发的疾病或病症的方法在最后的方面，本发明涉及减少细胞中诱发的疾病或病症的体外方法，所述方法包括使细胞与以有效降低所述细胞内cnnm4活性、水平或功能的量的特异性cnnm4抑制剂接触。如本文所用，术语“减少细胞中诱发的疾病或病症的方法”是指用于观察在所述疾病的细胞模型中诱发的疾病的特征性生物标志物水平的增加或降低的方法。在特定的实施方式中，细胞中诱发的疾病或病症是诱发的cnnm4介导的病症的疾病，其中，该疾病与相对于参考值增加的cnnm4表达一致。在实施方式中，诱发的cnnm4介导的病症的疾病与相对于参考值的cnnm4表达增加一致，其特征在于cnnm4的表达水平相对于参考值增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％或更多。在实施方式中，参考值对应于相同细胞系统中的cnnm4表达水平，其中，尚未诱发cnnm4介导的病症的疾病。其中，未诱发cnnm4介导的病症的疾病的相同细胞系统可用作对照。在实施方式中，细胞中诱发的疾病或病症是用于研究以下的疾病模型：dili、脂肪变性、nash、肝硬化、hcc、肝纤维化、肾纤维化或肺纤维化。在实施方式中，细胞中诱发的疾病或病症是指培养中的模型细胞系统。在实施方式中，细胞培养物是原代细胞培养物。在实施方式中，在培养细胞之前在动物模型中诱发诱发的疾病或病症。在特定的实施例中，细胞中诱发的疾病或病症是原代肝实质细胞中诱发的nash。在特定的实施方式中，动物模型是nafld动物模型，其中，通过使动物(即c57bl/6j野生型小鼠)接受甲硫氨酸(0.1％)和胆碱(0％)不足饮食4周来诱发nafld，并且随后收获肝并培养相关细胞。在特定的实施方式中，动物模型是肝硬化动物模型，其中，通过使动物(即c57bl/6j野生型小鼠)接受胆管结扎来诱发肝硬化，在1至21天后处死动物并且收获肝并培养相关细胞。在特定的实施方式中，动物模型是肝细胞癌(hcc)动物模型，其中，hcc动物模型，成年gnmt-/-小鼠自发发展hcc。将动物饲养7至9个月，处死，收获肝并培养相关细胞。在特定的实施方式中，动物模型为药物性肝损伤(dili)动物模型，其中，通过使动物(即成年c57bl/6j野生型小鼠)接受用对乙酰氨基酚(apap)，500mg/kg的处理以诱发急性肝损伤来诱发dili。在48时后处死动物，收获肝并培养相关细胞。如本文所用，术语“生物标志物”是指在特定疾病模型中监测进展所需的相关读出。在特定的实施方式中生物标志物是cnnm4的表达水平。在特定的实施方式中生物标志物是相对脂质积累。在特定的实施方式中，生物标志物是相对线粒体ros(活性氧)。在特定的实施方式中，生物标志物是tunel阳性细胞的百分比值。在特定的实施方式中，生物标志物是细胞内镁积累的水平。在其他实施方式中，本发明涉及用于鉴定潜在用于减少细胞中诱发的cnnm4介导的疾病或病症的化合物的方法，该方法包括使细胞与以有效降低细胞内cnnm4活性、水平或功能的量，或者以相对于参考值有效减少相对脂质积累或减少相对线粒体ros的量的候选化合物接触，其中，将以下的候选化合物鉴定为潜在用于治疗和/或预防cnnm4介导的肝、肾和/或肺病的化合物：所述候选化合物在细胞中在诱发的cnnm4介导的疾病或病症中，抑制cnnm4活性，减少相对于参考值的相对脂质积累或减少相对于参考值的相对线粒体ros。在实施方式中，参考值对应于在相同细胞系统中的脂质积累水平或线粒体ros水平，其中，cnnm4介导的病症的疾病已被诱发，但未被暴露于化合物。其中，未诱发cnnm4介导的病症的疾病的相同细胞系统可用作对照。认为细胞模型系统中的脂质积累或细胞系统中的线粒体ros水平是减少的，当它的水平相对于参考值降低以下时：至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在又其他实施方式中，本发明涉及用于鉴定潜在用于治疗和/或预防cnnm4介导的肝肾和/或肺病的化合物的方法，该方法包括：(a)使候选化合物与疾病的细胞模型接触；以及(b)在存在所述候选化合物下测定标志物，其中，该标志物选自由以下组成的组：在化合物存在下cnnm4的活性、相对于参考值的相对脂质积累或相对于参考值的相对线粒体ros，其中，抑制cnnm4活性、减少相对于参考值的相对脂质积累或减少相对于参考值的相对线粒体ros的化合物是潜在用于治疗和/或预防肝病、肾病和肺病的化合物。在特定的实施方式中，候选化合物选自由以下组成的组：中和抗体或其功能片段、拮抗剂、可溶性结合蛋白、可溶性受体变体、非功能性衍生物、反义多核苷酸、rna干扰寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、mirna、sirna、shrna、sgrna、反义rna、dicer-底物27-mer双链体、适配体、dna酶、核酶、三链形成寡核苷酸(tfo)、小分子及其组合。先前描述的所有术语和实施方式同样适用于本发明的此方面。本发明进一步公开了以下方面：1.一种cnnm4抑制剂，其在医学的用途。2.cnnm4抑制剂在治疗受试者中的急性或慢性疾病的用途，其中，所述疾病选自由肝病、肾病和肺病组成的组。3.根据方面2所述用途的cnnm4抑制剂，-其中，所述肝病选自肝纤维化、静脉闭塞性肝病、药物性肝损伤(dili)、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)以及巴德-吉亚利综合征、肝炎；-其中，所述肾病选自急性肾损伤(aki)、慢性肾病、肾炎、肾变病以及肾脏纤维化；-并且其中，所述肺病是肺纤维化。4.根据方面1至3中任一项所述用途的cnnm4抑制剂，其中，所述抑制剂选自由以下组成的组：中和抗体或其功能片段、拮抗剂、可溶性结合蛋白、可溶性受体变体、非功能性衍生物、反义多核苷酸、rna干扰寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、mirna、sirna、shrna、sgrna、反义rna、dicer-底物27-mer双链体、适配体、dna酶、核酶、三链形成寡核苷酸(tfo)、小分子及其组合。5.根据方面4所述用途的cnnm4抑制剂，其中，所述小分子是7-氨基-2-苯基-5h-噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮或2-[5-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-呋喃-2-基]-苯甲酸。6.一种用于诊断受试者中肝病、肾病或肺病的体外方法，其包括：(a)测定来自所述受试者的样本中cnnm4的表达水平，以及(b)将所述水平与参考值比较，其中，相对于所述参考值，所述样本中cnnm4的表达水平增加表明患者患有肝病、肾病或肺病。7.根据方面6所述的方法，其中，所述样本是肝、肾或肺活检。8.根据方面6或7中任一项所述的方法，-其中，所述肝病选自肝纤维化、静脉闭塞性肝病、药物性肝损伤(dili)、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)以及巴德-吉亚利综合征、肝炎；-其中，所述肾病选自急性肾损伤(aki)、慢性肾病、肾炎、肾变病以及肾脏纤维化；-并且其中，所述肺病是肺纤维化。9.特异性用于测定cnnm4表达水平的试剂在用于体外诊断受试者中肝病、肾病或肺病的用途。10.根据方面9所述的用途，-其中，所述肝病选自肝纤维化、静脉闭塞性肝病、药物性肝损伤(dili)、脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝硬化、肝细胞癌(hcc)以及巴德-吉亚利综合征、肝炎；-其中，所述肾病选自急性肾损伤(aki)、慢性肾病、肾炎、肾变病以及肾脏纤维化；-并且其中，所述肺病是肺纤维化。11.根据方面9或10中任一项所述的用途，其中，特异性用于测定cnnm4表达水平的所述试剂选自由以下组成的组：与cnnm4的mrna特异性杂交的探针的组以及能够特异性扩增cnnm4的mrna的引物对的组，或者其中，特异性用于测定所述cnnm4表达水平的所述试剂是与cnnm4多肽特异性结合的抗体。12.一种减少细胞中诱发的疾病或病症的体外方法，所述方法包括使细胞与以有效降低所述细胞内cnnm4活性、水平或功能的量的特异性cnnm4抑制剂接触。13.一种用于鉴定潜在用于减少细胞中诱导的cnnm4介导的疾病或病症的化合物的体外方法，所述方法包括使所述细胞与以有效降低所述细胞内cnnm4活性、水平或功能的量，或者以相对于参考值有效减少相对脂质积累或减少相对线粒体ros的量的候选化合物接触，其中，将以下的候选化合物鉴定为潜在用于治疗和/或预防cnnm4介导的肝、肾和/或肺病的化合物：所述候选化合物在细胞中在诱发的cnnm4介导的疾病或病症中，抑制cnnm4活性，减少相对于参考值的相对脂质积累或减少相对于参考值的相对线粒体ros。14.根据方面12或13中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂或所述化合物选自由以下组成的组：中和抗体或其功能片段、拮抗剂、可溶性结合蛋白、可溶性受体变体、非功能性衍生物、反义多核苷酸、rna干扰寡核苷酸、磷酸二酰胺吗啉代低聚物(pmo)、mirna、sirna、shrna、sgrna、反义rna、dicer-底物27-mer双链体、适配体、dna酶、核酶、三链形成寡核苷酸(tfo)、小分子及其组合。***本发明还将借助于以下实施例进行描述，这些实施例被认为仅是说明性的，并且不是对本发明范围的限制。实施例材料和方法人样本所有研究均在符合赫尔辛基(helsinki)宣言并根据当地国家法律下进行。每家医院的人伦理委员会(humanethicscommittee)批准了研究程序，并在纳入研究之前获得了所有患者的书面知情同意。从8个健康样本队列、31名诊断肥胖症患者和43个临床试验队列的人血清样本中量化镁。一旦抛开酒精性疾病和病毒性肝炎感染，则通过不同的标志物评估非酒精性脂肪肝(nafld)的患者。在42名患者的队列中测定了非酒精性脂肪性肝病nafld中的人cnnm4表达：10名健康患者、诊断为脂肪变性的20名患者和诊断为nafld的12名患者。在12名患者的队列中测定肝硬化患者的cnnm4水平，其中，5名被诊断为健康，以及7名被诊断为肝硬化。还测定了47名肝细胞癌(hcc)患者的cnnm4水平：6名患者是健康的，以及41名患者被诊断为hcc。在11名药物性肝损伤(dili)患者队列中测定cnnm4水平，并与3名健康患者比较。最后，分析了肾脏纤维化14个人样本以测定cnnm4表达。7个样本是健康的，以及另外7个样本被诊断为肾脏纤维化。动物实验所有动物实验均根据西班牙实验动物护理和使用指南(spanishguideforcareanduseoflaboratoryanimal)以及国际护理和使用委员会标准(internationalcareandusecommitteestandard)进行。所有程序均经cicbiogune的动物护理和使用委员会和主管当局(比斯凯亚省议会(diputacióndebizkaia))批准。在12小时光/暗周期内，将小鼠圈养在温控动物设施(aaalac认证的)中。g-他们随意饲喂标准饮食(harlantekland)与水。nafld动物模型：用于cnnm4测定的0.1％甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食(0.1％mcdd)c57bl/6j野生型小鼠用甲硫氨酸(0.1％)和胆碱(0％)缺乏饮食饲喂4周。在处理结束时处死动物并将肝分成几片用于后续分析，包括：用于组织学和免疫组织化学或代谢分析的rna或蛋白质提取、福尔马林固定。在处理期间每周收集一次用于血清分析的血液。临床前研究：用sirna疗法的nafld动物模型c57bl/6j野生型小鼠用甲硫氨酸(0.1％)和胆碱(0％)缺乏饮食饲喂4周。饮食开始后2周，将小鼠分为两组，并进行体内沉默cnnm4或无关sirna对照，按照制造商的说明使用3.0试剂(invitrogen，美国)接受200μl的0.75μg/μl溶液的或cnnm4特异性体体内sirna(customambion，美国)或对照sirna(sigma-aldrich，美国)。每周进行两次尾静脉注射直至第四周。在处理结束时处死动物并将肝分成几片用于后续分析，包括：用于组织学和免疫组织化学或代谢分析的rna或蛋白质提取、福尔马林固定。在处理期间每周收集一次用于血清分析的血液。肝硬化动物模型：胆管结扎(bdl)如先前描述(等人,2015.labinvest.95(2):223-36)，将成年c57bl/6j野生型(wilt-type)小鼠进行bdl。简而言之，用含1.5％异氟烷的o2麻醉小鼠并打开腹部。将胆管与门静脉和肝脏动脉分离，在胆管周围进行缝合并用已知的外科手术固定。最后，闭合腹部并在24h、48h、72h、3天和21天处死小鼠。将肝被分成几片用于后续分析，包括：用于组织学和免疫组织化学或代谢分析的rna或蛋白质提取、福尔马林固定。在处理期间每周收集一次用于血清分析的血液。肝细胞癌动物模型(hcc)：gnmt-/-小鼠当将小鼠描述为自发发展为hcc时，成年gnmt-/-小鼠生长7至9个月(wagner等人,2009.toxicolapplpharmacol.1；237(2):246；authorreply247)。在那时处死动物并将肝分成几片用于后续分析，包括：用于组织学和免疫组织化学或代谢分析的rna或蛋白质提取、福尔马林固定。在处理期间每周收集一次用于血清分析的血液。药物性肝损伤(dili)：对乙酰氨基酚(apap)过量用500mg/kg的对乙酰氨基酚(apap)处理成年c57bl/6j野生型小鼠以诱导急性肝损伤。在48h的处理后，处死小鼠并将肝分成几片用于后续分析，包括：用于组织学和免疫组织化学或代谢分析的rna或蛋白质提取、福尔马林固定。在处理期间每周收集一次用于血清分析的血液。原代肝实质细胞的分离、培养和处理来自3月龄的野生型(c57bl/6j)小鼠的原代肝实质细胞通过用i型胶原酶(华盛顿，美国)灌注来分离。简而言之，用异氟醚(o2中1.5％异氟醚)麻醉动物。然后，打开腹部，并将导管插入下腔静脉。用缓冲液a(1xpbs、5mmegta、37℃并且氧化的)灌注肝并切开门静脉。接下来，用缓冲液b(1xpbs、1mmcacl237℃并且氧化的)灌注肝以移除egta，并且最后用缓冲液c(1xpbs、2mmcacl2、0.65bsa、i型胶原酶、37℃并且氧化的)灌注肝。在缓冲液c灌注后，将肝与身体的其余部分分离并置于具有mem(gibco，美国)的培养皿中。小心地移除胆囊，然后用镊子机械分散肝。在mem中稀释的消化肝通过无菌纱布过滤，并将过滤的肝细胞收集和并在10％fbs(gibco)/1％psg(gibco)补充的mem中洗涤三次(在400rpm中1x4'和在500rpm中2x5')，保留所有浮在表层的库普弗(kupffer)细胞和肝星状细胞分离。在最后一次洗涤后，将包含在沉淀物中的肝实质细胞重新悬浮在10％fbs1％psgmem中，用于后续培养。将原代肝实质细胞以7600个细胞/mm2的密度接种在10％fbs/1％psg补充的mem中的先前涂有胶原的培养皿中，并置于37℃、5％co2-95％空气的培养箱中。贴壁6小时后，用新鲜的0％fbs/1％psgmem移除培养基和未贴壁的肝实质细胞，用于目标处理(表2)。表2.用于体外实验的试剂。thle2细胞thle-2细胞购自atcc(crl-2706tm)。它们被维持在补充有begmbulletkittm(龙沙(lonza))和10％fbs的支气管上皮生长培养基(begmtm,，龙沙)上。它们用0.05％胰蛋白酶-edta分开并收集在begm中。在以123g下离心5分钟后，弃去上清液并重新悬浮沉淀。质粒转染按照制造商的方案，使用(polyplus，美国)转染试剂将质粒转染到原代小鼠肝实质细胞中进行过表达。在24孔板中，将0.5μg的质粒加入缓冲液并涡旋10s，然后加入1μl的试剂。将混合物涡旋10s，向下旋转并在rt下孵育10')。转染在细胞悬浮培养基中进行，并在转染后6h将转染混合物更换为新鲜培养基，除非另有说明。通过sirna递送的基因沉默按照制造商的方案，使用dharmafect1试剂(dharmacon)以终浓度为100nm的特定sirna转染细胞。dharmafect1和sirna在rt下分别在0％fbs/1％psgmem中稀释5'。然后混合稀释液并在rt下孵育20'。然后将sirna转染混合液加入至细胞悬浮培养基中并且6h后更换为新鲜培养基。sirna转染体积，适用于6孔板)和序列总结在表3中。表3.用dharmafect1转染的sirnas适用于6孔接种细胞。通过shrna递送的基因沉默通过使用3000(赛默飞世尔(thermofisher))并根据制造商说明的方案，用特定的shrna转染细胞。7.5μl的lipofectamine和3shrna在0.2ml培养基中分别稀释，并在室温下孵育5'。在孵育后，将它们再次混合并在室温下孵育30'，然后递送至细胞。shrna转染体积适用于6孔板和序列为seqidno52:5’-ucucugccuucaaggaugcggacaaugag-3’(seqidno52)rna分离和cdna表达测定rna分离根据制造商的说明，使用trizol试剂(英杰(invitrogen))从整个肝或培养细胞中分离总rna。在细胞mrna提取的情况下，在rna沉淀步骤中使用5μg的糖原(ambion，美国)以促进rna沉淀的可见性。使用nanodropnd-100分光光度计(赛默飞世尔科技(thermofisherscientific)，美国)通过分光光度法测定rna浓度。逆转录1-2μg的分离的rna用dnasei(英杰(invitrogren))处理，并用于在随机引物和rnaseout(全部来自英杰(invitrogren))存在下通过m-mlv逆转录酶合成cdna。所得cdna在无rnase的水(sigma-aldrich)中稀释1/10(如果使用2μg，则为1/20)。实时定量pcr(rt-qpcr)使用viia7或qs6实时pcr系统和sybrselectmastermix(应用生物系统(appliedbiosystems)，美国)进行qpcr。使用1.5μl的cdna并包括特异性引物，在384孔板(应用生物系统)中总反应体积为6.5μl。所有反应一式三份进行。对引物的pcr条件进行了优化，并使用了40个循环，熔解温度为60℃，每步30s。智人和小家鼠两者的引物均使用primer3软件通过ncbi-nucleotide网页(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)设计并由sigmaaldrich合成。引物序列详见表4中和表5中。在用熔解曲线检查pcr产物的特异性后，将数据归一化为管家基因(gapdh、arp)的表达。表4.用于测定小家鼠基因mrna表达的引物列表。表5.用于测定智人基因mrna表达的引物列表。蛋白质蛋白质提取和分析如所说明的进行总蛋白质的提取。细胞用冷pbs缓冲液洗涤并重悬于200μl的ripa裂解缓冲液(1.6mmnah2po4、8.4mmna2hpo4、0.5％叠氮化物、0.1mnacl、0.1％sds、0.1％tritonx-100、5mg/ml脱氧胆酸钠)。裂解缓冲液补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(罗氏，瑞士)。将它们离心(13000rpm，在4℃下20’)并通过bradford蛋白质测定(bio-rad)对上清液(蛋白质提取物)的总蛋白质含量进行定量，并使用spectramaxm3分光光度计(美国分子仪器(moleculardevices)，美国)测定。在冷冻肝组织的情况下，使用precellys24组织均质器(precellys，法国)在500μl的缓冲液中均质化约50μg的组织。在所有情况下，将裂解物离心(13000rpm，20min，4℃)，并根据所用裂解缓冲液的类型，通过bradford蛋白质测定或bca蛋白质测定(皮尔斯，usa)对上清液(蛋白质提取物)的总蛋白质含量进行定量并使用spectramaxm3分光光度计测定。蛋白质印迹法蛋白质提取物在sds-page样本缓冲液(250mmtris-hclph6.8、500mmβ-巯基乙醇、50％甘油、10％sds和溴酚蓝)中在95℃下煮沸5min。根据蛋白质丰度和抗体灵敏度，使用mini-protean电泳系统(bio-rad)通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)在3％至15％丙烯酰胺凝胶(取决于目标蛋白质的分子量)中分离适量的蛋白质(在5至50μg之间)。使用minitrans-blot细胞(bio-rad)通过电印迹将凝胶转移至硝酸纤维素膜上。膜用在含0.1％吐温-20(sigmaaldrich)的tbsph8(tbst-0.1％)中的5％脱脂牛奶封闭，在rt下1小时，10’期间用tbst-0.1％洗涤三次，并在4℃下用商业一级抗体孵育过夜。一级抗体及其最佳孵育条件详见表6。然后在10’期间用tbst-0.1％洗涤膜三次，并在rt下在包含与辣根过氧化物酶(hrp，表6)偶联的二级抗体的封闭溶液中rt下孵育1小时。通过使用westernlightning增强化学发光试剂(ecl，珀金埃尔默(perkinelmer)，美国)检测免疫反应性蛋白质，并在curix60显影剂(agfa，比利时)中暴露于superrx-nx射线胶片(富士，日本)。表6.用于蛋白质印迹的抗体列表。染色测定用于脂质染色的苏丹红将包括o.c.t的冷冻肝样本切成10μm的切片。切片在60％异丙醇中洗涤并然后用新鲜的苏丹iii(0.5％异丙醇；sigmaaldrich)溶液染色30min。然后在60％异丙醇中再次洗涤样本，并然后用苏木精和伊红复染。然后用蒸馏水洗涤切片并在dpx样本封固剂中封固。图像是用正置光学显微镜(蔡司(zeiss))拍摄的。通过dhe的ros测定o.c.t嵌入的8μm切片在rt下与mntbap150μm一起孵育1h。然后将样本与5μm的二氢乙锭(dhe)在37℃下孵育30min，并用包含0.7mg/l的dapi的fluoromount-g(southernbiotech，usa)封固切片以复染细胞核。图像是使用axioimagerd1(蔡司(zeiss))拍摄的。用于cnnm4测定的免疫组织化学根据要使用的一级抗体揭开石蜡嵌入的切片(5μm厚)并使其经受过氧化物封闭(pbs中的3％h2o2，10'，rt)。对于小鼠组织中小鼠宿主抗体的染色，样本用山羊抗小鼠fab片段封闭(jacksonimmunoresearch，usa)(1:10，1h，rt)，并用5％山羊血清封闭(30’，rt)。然后，在潮湿室中将切片与cnnm4一级抗体(ab191207，abcam)在dako抗体稀释液(dako)中以1:100一起孵育，随后是envision抗兔(dako)hrp偶联的二级抗体孵育(30’，rt)。比色检测用vectorvip色原(vector)确认并且切片用苏木精复染。使用dpx样本封固剂封固样本。图像是用正置光学显微镜(蔡司(zeiss))拍摄的。用于αsma测定的免疫荧光对于α-sma染色，o.c.t嵌入的10μm切片与在0.01％pbs-叠氮化物中的2％bsa中以1/200稀释度的偶联至cy3(c6198,sigmaaldrich)的一级抗体一起孵育，并用含有0.7mg/l的dapi的fluoromount-g固定以复染细胞核。图像是使用axioimagerd1(蔡司(zeiss))拍摄的。bodipy用于原代肝实质细胞脂质定量将在高脂质含量培养基(oa)或甲硫氨酸/胆碱缺乏培养基(mdmc)中培养的原代肝实质细胞被固定在pbs中的4％多聚甲醛(10’，rt)中，并与1mg/ml(1h,rt)的bodipy493/503(分子探针(molecularprobes)，英杰(invitrogen))一起孵育。bodipy免疫细胞荧光图像是使用axioimagerd1(蔡司(zeiss))拍摄的。脂质体的定量使用fridasoftware进行，并表示为每细胞总数的平均面积。数据分析使用frida软件计算每个样本的强度总和平均或染色面积百分比(http://bui3.win.ad.jhu.edu/frida/,约翰霍普金斯大学(johnhopkinsuniversity))。肝脂质定量在波特匀浆器中用10倍体积的冰冷pbs匀浆30mg的冷冻肝。使用wakochemicals试剂盒(里士满，弗吉尼亚州(richmond，va))测量匀浆中的脂肪酸，并按(folch等人,1957.jbiolchem.226(1):497-509)所描述的对脂质进行定量。简而言之，从肝匀浆的1.5mg的蛋白质中提取脂质。磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、脂肪酸(fa)和胆固醇(ch)通过薄层色谱法(tlc)进行分离并按(ruizandochoa，1997)所描述的进行定量。使用a.menarinidiagnostics(意大利)试剂盒测量脂质提取物中的甘油三酯(tg)。镁测定分析细胞内镁水平在玻璃盖玻片中生长的原代肝实质细胞与2μmmag-s-tz或1μmmag-s-tz-am稀释的ref(gruskos等人,2016.j.am.chem.soc.138(44),pp14639–14649)一起加载在0％fbs/1％psg培养基中，并在37℃和5％co2下分别孵育30’或1h。去除含染料的培养基后，在0％fbs/1％psg中进行30'孵育。然后将盖玻片在20mmtris-hcl、2.4mmcacl2、10mm葡萄糖、ph7.4缓冲液中洗涤，并封固在基于eclipsete300的微型荧光分光光度计(尼康(nikon)，美国)上的恒温灌流室上，并用40x油浸荧光观察。使用grynkiewicz(grynkiewiz等人,1985.jbiolchem.260(6):3440-50)描述的方法测定细胞内mg2+水平。340/380nm激发光比率用delta系统(photontechnologiesinternational，普林斯顿(princeton))测定，并自标准方程转换为mg2+浓度：其中kd是mag-s-tz(3.2mm)和mag-s-tz-am(8.9mm)的mg2+解离常数，以及q是380nm处的最小/最大荧光强度的比率。细胞外镁水平使用quanticromtm镁测定试剂盒(bioassaysystems，美国)对细胞外镁定量。简而言之，将5μl的血清或培养基与200μl的1:1的试剂a和试剂b的混合物混合。在rt下孵育2’后，使用spectramaxm3分光光度计(美国分子仪器，美国)在500nm长度处测定od。然后，加入10μl的edta并再次测定od500。通过与标准浓度(2mg/ml)的od500进行比较，最终计算出镁浓度。体外测定法线粒体ros测定按照制造商的说明，使用mitosoxtmred试剂(lifetechnologies)测量线粒体ros。简而言之，在正常培养基中将原代肝实质细胞和肝癌细胞与mitosox试剂(2.5μm，10'，37℃在co2培养箱中)一起孵育。然后，用pbs洗涤细胞两次，并使用分光光度计在510nm激发和595nm发射下测量荧光。将最终值归一化为总蛋白质浓度。通过tunel测定细胞死亡按照上述制造商的说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒(罗氏(roche))分析细胞死亡。使细胞经受过氧化物封闭(甲醇中的3％h2o2)3分钟，然后与包含fitc偶联一级抗体(稀释度1/50)的tunel稀释缓冲液在37℃下一起孵育1小时。将切片封固在dako荧光样本封固剂(dako)中。图像是使用axioimagerd1(蔡司(zeiss))拍摄的，并通过测定tunel阳性细胞的％来计算细胞活力。结果肝病理中的cnnm4过表达慢性肝病包括一组不同的病理。已经开发了一种通过免疫组织化学(ihc)在人肝活检和小鼠动物模型肝中检测cnnm4表达的方法。本文cnnm4表达已经在dili和慢性肝病的所有阶段中表征，无论是在人活检还是动物模型中，都观察到该蛋白质在所有病理中的过表达(图1)。与来自脂肪变性和nash患者的样本相比，通过来自健康受试者的人肝样本中cnnm4mrna水平的qpcr的方法检测cnnm4表达证实了这些结果(图2a)。cnnm4表达也可以通过cnnm4mrna水平在体内nash小鼠模型(图2b)中，以及在体外nash小鼠细胞模型(图2c)中的qpcr测定。cnnm4是治疗肝病的新靶标通过ihc在cnnm4测定中观察到的过表达示出了先前提出的cnnm4是用于治疗肝病的潜在靶标，用于dili和慢性病两者。进行了体外研究，在原代肝实质细胞中诱导nash，并用sirnacnnm4疗法治疗它们。在nash模型原代肝细胞的情况下，测量了脂质含量和由活性氧(ros)引起的炎症，观察到两者在用sirna治疗的nash肝实质细胞中得到恢复(图3a和3b)。还通过对乙酰氨基酚过量进行了其他模拟dili的体外研究，观察到dili模型肝实质细胞中预期的细胞死亡，以及当用靶向sirna疗法治疗细胞时的恢复(图3c)。进一步，进行了一项体外研究，在人细胞中诱导nash，并用sirnacnnm4疗法或用shrnacnnm4疗法治疗它们，并测量脂质含量，观察到相对脂质积累在用sirna疗法治疗的nash诱导的人细胞(thle2细胞)(图4a)和在用shrna疗法治疗的nash诱导的人细胞(图4b)两者中得到恢复。靶向cnnm4的特异性和需要在观察到来自nash和dili的sirnacnnm4疗法的保护作用后，测定了靶向沉默cnnm家族的其他蛋白质(cnnm1、cnnm2和cnnm3)的效果。nash在原代肝实质细胞中被诱导，并用sirnacnnm1、cnnm2和cnnm3处理。与sirnacnnm4治疗不同，沉默cnnm家族的其他蛋白质没有效果，表明治疗的特异性仅基于cnnm4而不是基于cnnm家族的蛋白质(图5a)。此外，为了证明需要基于cnnm4的处理，已经实现了实验。在第一种情况下，通过cnnm4过表达在原代肝实质细胞中诱导脂质积累，类似于在nash患者和动物模型中观察到的，然后它们用镁补充。与sirnacnnm4处理类似，补充镁对减少脂质积累没有影响(图5b)。其次，原代肝实质细胞中的镁缺乏诱导脂质积累，是类似于cnnm4过表达的生理条件。在这种情况下，sirnacnnm4疗法减少了脂质积累(图5c)。考虑到最后两个结果，补充镁不足以治疗nash，因此需要基于cnnm4的疗法。基于sirnacnnm4的疗法的临床前研究为了解决cnnm4调节不仅在细胞中而且在动物中的有效性，开发了一项对nafld慢性肝病的第一阶段的临床前研究。在2周内给小鼠喂食0.1％甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食(0.1％mcdd)以发展nafld。当时，在2周内的0.1％mcdd之后，一组用sirnacnnm4疗法治疗，并且另一组用sictrlrna治疗。处死动物并测量不同的生物标志物以分析nafld进展。苏丹红染色测量的脂质积累(图6a)，血清中的转氨酶表明肝受损(图6b)，dhe染色量化由ros引起的炎症(图6c)，以及α-平滑肌肌动蛋白(αsma)示出纤维化的进展(图6d)。可以观察到，在用sirnacnnm4疗法治疗的动物组中nafld降低。cnnm4的药理抑制除了sirna疗法，cnnm4活性也可以药理学地调节。在原代肝实质细胞中进行了诱导nash的体外测定，以及用被称为7-氨基-2-苯基-5h-噻吩并[3,2-c]吡啶-4-酮的化合物处理它们。可以观察到，cnnm4的这种药理学抑制与在nash诱导的肝实质细胞中的sirna疗法具有相同的效果，它降低了其脂质含量(图7a)并导致它们积聚镁(图7b)。cnnm4在不同器官病理中的过度表达如图1所示出，已发现cnnm4在动物模型和人样本两者中的不同肝病理中过表达。特别地，纤维化发展不仅发生在肝中，还发生在其他器官中，诸如肾，以及考虑到纤维化在这两种组织中的发展可能有一些相似之处，cnnm4也可能在这个器官中失调(dysregulated)。已经在肾纤维化小鼠模型中观察到cnnm4过表达，表明基于cnnm4的疗法是治疗该疾病的有效的疗法之一(图8)。此外，tcga(癌症基因组图谱)数据的分析示出，与正常组织相比(图9a和9b)，cnnm4在肝细胞癌(lihc)的原发肿瘤样本中和肺腺癌(luad)的原发肿瘤样本中过表达。总之，呈现的结果证明cnnm4是预防nafld进展的合适靶标，并表明它还可以改善其他肝病理(dili、肝硬化和hcc)、肾脏纤维化和肺癌。在dili的情况下，体外研究示出了sirna疗法对apap过量的保护作用，而在其他病理中，cnnm4测定示出了它们所有都过表达。因此，通过sirna疗法或药理学上的，抑制或沉默蛋白质或其伙伴是治疗肝病、肾脏纤维化和肺癌的合适方法。序列表<110>比奥基内生物科学协会合作研究中心(asociacióncentrodeinvestigacióncooperativaenbiociencias-cicbiogune)<120>用于诊断和/或治疗急性或慢性肝、肾或肺病的方法<130>ppi21171111es<160>56<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm1正义<400>1gauccugaaugcuguaauatt21<210>2<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm1反义<400>2uauuacagcauucaggauccg21<210>3<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm1正义<400>3acgugauccaggagcuuaatt21<210>4<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm1反义<400>4uuaagcuccuggaucacgutg21<210>5<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm2正义<400>5ctcaatttgcatgaaatttaa21<210>6<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm2反义<400>6uuaaauuucaugcaaauugag21<210>7<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm2正义<400>7cggagaaagagaagaauuatt21<210>8<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm2反义<400>8uaauucuucucuuucuccgtg21<210>9<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm3正义<400>9gaugaugaauauaaaguaatt21<210>10<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm3反义<400>10uuacuuuauauucaucaucag21<210>11<211>21<212>dna/rna<213>人工序列<220><223>cnnm3正义<400>11gggcagagucgaggucgaatt21<210>12<211>21<212>dna/rna<213>人工序列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