用于癌症免疫疗法的方法和组合物与流程

用于癌症免疫疗法的方法和组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2018年11月15日提交的美国临时申请号62/767,515、2019年3月28日提交的美国临时申请号62/825,496和2019年11月4日提交的美国临时申请号62/930,399的优先权和权益，其公开内容各自通过引用全文纳入本文。
技术领域
3.本文所公开的方法和组合物涉及肿瘤免疫疗法，特别是用于免疫细胞疗法的抗原特异性t淋巴细胞的制备和使用。


背景技术：

4.免疫细胞疗法，例如过继细胞疗法(act)，包括从对象收集免疫细胞，扩增细胞，以及将细胞重新引入同一对象或不同对象的步骤。例如，供体衍生，离体扩增的人抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的act已经成为了治疗癌症的有希望的途径。其他act包括培养的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，分离并扩增的t细胞克隆以及表达常规t细胞受体或嵌合抗原受体的基因工程改造的淋巴细胞(例如t细胞)。该基因工程改造的淋巴细胞被设计为消除表达特定抗原的癌细胞，然后被扩增并输送给患者。act可以提供导致患者体内肿瘤细胞减少的肿瘤特异性淋巴细胞(例如t细胞)。
5.然而，该t细胞疗法的抗肿瘤活性已经受到t细胞扩增不足和检查点免疫抑制的限制。因此，本领域中需要能够克服这些限制的改进组合物和方法。


技术实现要素：

6.本文公开了用于t细胞疗法的改进的方法和组合物。更具体地，本文公开了t细胞表面修饰以携带工程化的背包，与检查点抑制剂的抑制剂(例如，抗
‑
pd
‑
l1抗体)组合。在一些实施方式中，该背包可以包含通过可生物降解接头可逆交联的多种治疗性蛋白单体(例如，细胞因子如il
‑
15)。在其他实施方式中，该背包可以是设计成系连到免疫细胞表面的融合蛋白。
7.一方面，本文公开了一种治疗(例如癌症免疫疗法)组合物，其包含：
8.装载有多个蛋白簇和/或免疫刺激融合分子(ifm)的有核细胞；以及
9.检查点抑制剂的抑制剂。
10.在一些实施方式中，所述蛋白簇可各自包括通过多个可生物降解交联剂彼此可逆地交联的多个治疗性蛋白单体，其中所述蛋白簇的直径通过动态光散射测量为30nm至1000nm，其中所述交联剂在给予有需要的对象后在生理条件下降解，以从蛋白簇中释放所述治疗性蛋白单体，可选地，其中所述蛋白簇进一步地包括表面修饰，例如聚阳离子，从而允许蛋白簇与有核细胞相结合。
11.在一些实施方式中，所述治疗性蛋白单体可包含一种或多种细胞因子分子，可选地，以及一种或多种共刺激分子，其中：
12.(i)一种或多种细胞因子分子选自il
‑
15，il
‑
2，il
‑
7，il
‑
10，il
‑
12，il
‑
18，il
‑
21，il
‑
23，il
‑
4，il1α，il1β，il
‑
5，ifnγ，tnfa，ifnα，ifnβ，gm
‑
csf或gcsf；以及
13.(ii)一种或多种共刺激分子选自cd137，ox40，cd28，gitr，vista，抗
‑
cd40抗体或cd3。
14.在一些实施方式中，该交联剂可以是可降解或可水解的接头。在一些实施方式中，可降解的接头是氧化还原响应性接头。示例性接头以及制备和使用各种接头(例如，制备纳米凝胶或背包)的方法在pct申请号pct/us2018/049594，美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944和美国公开号2014/0081012中公开，其各自通过引用全文纳入本文。
15.在某些实施方式中，每个ifm可经工程改造以包含免疫刺激细胞因子分子和对有核细胞表面抗原有亲和力的靶向部分(例如抗体或其抗原结合片段)，其中免疫刺激细胞因子分子可操作地连接到靶向部分。示例性ifm(也称作“系连融合体”或tf)公开在pct国际公开号wo 2019/010219和wo 2019/010222中，各自通过引用全文纳入本文。
16.在一些实施方式中，免疫刺激细胞因子分子选自il
‑
15，il
‑
2，il
‑
6，il
‑
7，il
‑
12，il
‑
18，il
‑
21，il
‑
23或il
‑
27或其变体形式中的一种或多种。所述抗原可选自cd45，cd4，cd8，cd3，cd11a，cd11b，cd11c，cd18，cd25，cd127，cd19，cd20，cd22，hla
‑
dr，cd197，cd38，cd27，cd196，cxcr3，cxcr4，cxcr5，cd84，cd229，ccr1，ccr5，ccr4，ccr6，ccr8，ccr10，cd16，cd56，cd137，ox40或gitr中的一种或多种。
17.在一个实施方式中，所述ifm包含il
‑
12，例如与人源化的抗
‑
cd45fab融合的单链il
‑
12p70。所述单链il
‑
12p70可包含由柔性接头连接的il
‑
12b和il
‑
12a。
18.在各种实施方式中，所述有核细胞和所述检查点抑制剂的抑制剂可分别向需要(例如癌症免疫疗法)的患者提供和给予(例如依次地)。在一些实施方式中，所述有核细胞可来自己被富集或训练以具有针对一种或多种肿瘤相关抗原(taa)的特异性的t细胞群。
19.在某些实施方式中，检查点抑制剂可以是pd
‑
1，pd
‑
l1，lag
‑
3，tim
‑
3或ctla
‑
4中的一种或多种。检查点抑制剂的抑制剂可以是结合并中和或抑制检查点抑制剂的抗体或其抗原结合片段。
20.本文还提供了一种用于提供癌症免疫疗法的方法，其包括：
21.向有需要的患者给予装载了多种蛋白簇和/或ifm的多种有核细胞；以及
22.给予所述患者检查点抑制剂的抑制剂。
23.附图简要说明
24.图1.示出了示例性deep
tm
il
‑
15制剂。
25.图.2：il
‑
15增加了pmel t细胞上pd
‑
1的表达。
26.图3：deep
tm
il
‑
15引发的pmel和抗
‑
pd
‑
l1组合研究1的实验概述。
27.图.4：研究1显示在淋巴清除(cpx)的情况下αpd
‑
l1促进了deep
tm
‑
15引发的pmel t细胞抗肿瘤活性。
28.图.5：研究1显示deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞和αpd
‑
l1组合增加了抗肿瘤活性，增加了无肿瘤生存者(tfs)，结果在il15
‑
fc的暴露下没有变化，并且耐受性良好，体重没有变化。
29.图6：deep
tm
il
‑
15引发的pmel和抗
‑
pd
‑
l1组合研究2的实验概述。
30.图7：与pmel+apd
‑
l1相比，dp
‑
15 pmel+a
‑
pd
‑
l1显示出改善的抗肿瘤活性和生存。
31.图8：研究2显示deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞和αpd
‑
l1组合增加了抗肿瘤活性，增加了无肿瘤生存者(tfs)，在il15
‑
fc的暴露下结果没有变化，并且耐受性良好，体重没有变化。
32.图9：deep
tm
il
‑
15引发的pmel和抗
‑
pd
‑
l1组合研究3的实验概述。
33.图10：与αpd
‑
l1组合增加了肿瘤中pmel t细胞的激活(ifn
‑
γ分泌)。
34.图11：接受系连il
‑
12 tf的肿瘤特异性t细胞组合或不组合pd
‑
l1阻断治疗的荷瘤小鼠的生存分析。箭头指示肿瘤特异性细胞疗法过继转移的天数。
35.图12：肿瘤中的ifng和pd
‑
l1浓度。
具体实施方式
36.癌症免疫疗法，包括过继t细胞疗法，是治疗癌症的一种有前途的策略，因为它利用对象自身的免疫系统攻击癌细胞。但是，这种方法的主要局限性在于所移植的t淋巴细胞的活力和功能迅速下降。为了在肿瘤中维持大量活的肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞，免疫刺激剂与转移细胞的共同给药是必要的。当以高剂量全身给药时，这些试剂可以增强转移的(即供体)细胞的体内活力，改善转移的细胞的治疗功能，从而导致总体上提高的抗癌功效；但是，高剂量的此类试剂也可能导致危及生命的副作用。例如，将白介素2(il
‑
2)用作佐剂极大地支持了黑色素瘤的过继t细胞疗法，其中il
‑
2为转移的t细胞提供关键的佐剂信号，但也引起严重的剂量限制性炎性毒性并扩增了调节性t细胞(treg)。将佐剂活性集中在转移的细胞上的一种方法是对转移的细胞进行基因工程改造以分泌其自身的支持因子。迄今为止，大规模生产基因工程改造的t淋巴细胞的技术难度和挑战以及高成本已大大限制了该方法在临床应用中的潜力。
37.在一些方面，本文公开的是检查点抑制剂的抑制剂和装载有治疗性蛋白簇或系连融合体的免疫细胞的组合疗法。这允许简单、安全且高效地将生物活性剂如药物、蛋白质(例如佐剂如il
‑
2)或颗粒递送到靶免疫细胞的质膜上，同时克服通常与这种细胞疗法相关的检查点免疫抑制。在某些实施方式中，这种治疗性蛋白簇或系连融合体组合物被称为“纳米凝胶”，“纳米颗粒”或“背包”，这些术语在本文中可互换使用。为了清楚起见，“背包”可指交联在一起的单体簇(例如il15
‑
fc异二聚体)，或系连融合体(tf)分子(例如，il
‑
12
‑
tf如il
‑
12和抗
‑
cd45抗体融合体)。可以将组合物装载、锚定、系连或背负(可互换使用)到细胞上，例如有核细胞。装载过程也被称为“引发”，所产生的细胞可被称为“引发的”细胞。背包的或装载的或引发的细胞可以有许多治疗应用。例如，装载的t细胞可以用于包括act(过继细胞疗法)在内的t细胞疗法中。其他重要的免疫细胞类型也可以被装载，包括例如b细胞，肿瘤浸润淋巴细胞，nk细胞，抗原特异性cd8+t细胞，经遗传工程改造以表达嵌合抗原受体(car)的t细胞或car
‑
t细胞，经遗传工程改造以表达对肿瘤抗原具有特异性的t细胞受体的t细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(til)，和/或经过抗原训练的t细胞(例如，已经被展示感兴趣的抗原(例如肿瘤相关抗原(taa))的抗原呈递细胞(apc)“训练”的t细胞)。
38.出乎意料地发现，在存在淋巴清除的情况下，抗
‑
pd
‑
l1以协同方式进一步提高了deep
tm
il
‑
15(化学交联的il
‑
15/il
‑
15rα/fc异二聚体(il15
‑
fc)的多聚体)或deep
tm
il
‑
12(融合人源化抗
‑
cd45 fab的单链il
‑
12p70)引发细胞的抗肿瘤活性。即，抗
‑
pd
‑
l1和deep
tm
il
‑
15或deep
tm
il
‑
12组合的效力与将其效力纯粹相加的预期相比有统计学上的显著
性差异(增加)。
39.除了前述内容之外，本发明还考虑了其他纳米结构，其包括除对过继转移的细胞产生佐剂作用以外的目的的其他蛋白质治疗剂。如本文所提供的，本领域技术人员将容易认识到，本公开具有更广泛的应用。
40.本公开的各个方面可以单独使用、组合使用、或者以前面描述的实施例中未具体讨论的各种配置使用，因此在其应用上不限于在前面的描述中阐述的或者在附图中示出的部件的细节和布置。例如，一个实施方式中描述的方面可以以任何方式与其它实施方式中描述的方面组合。
41.定义
42.方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求中使用的特定术语汇集在此。除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所属领域普通技术人员通常所理解的含义。
43.本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。术语“一种”或“一个”当与“包含”在本文中联用时，可表示“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。
44.如本文所用，“约”和“近似”通常表示在考虑测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差度在给定数值范围的20％以内，通常在10％以内，更通常在5％以内。术语“基本(上)”表示超过50％，更优选超过80％并且最优选超过90％或95％。
45.如本文所用，术语“包含”或“包括”是针对存在于给定实施方式中的组合物、方法及其各自的组分来使用的，为开放式，可包含未指定要素。
46.如本文所用，术语“基本上由
……
组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本公开的该实施方式的基本和新颖的或功能的特征的附加要素。
47.术语“由
……
组成”指本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其排除了在该实施方式的描述中未列举的任何要素。
48.本文所用“多个/多种”表示超过1个/种，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个/种，例如25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多个/种，或其间任何整数。
49.本文使用的术语“治疗物”，“治疗剂”，“活性物”，“活性剂”，“活性药物剂”，“活性药物”或“药物”是指任何活性药物成分(“api”)，包括其药学上可接受的盐(例如盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐和糖精盐)，以及无水，水合和溶剂化形式，前药形式，以及api各自的光学活性对映体以及api的多晶型物。治疗剂包括药学，化学或生物剂。另外，药学，化学或生物试剂可包括具有期望性质或影响其是否为治疗剂的任何试剂。例如，试剂还包括诊断剂，杀生物剂等。
50.术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性或支化聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，并且可间插有非氨基酸。该术语也包括修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分偶联。多肽可从天然来源分离，可采用重组技术由原核或真核宿主产生，或者可为合成方法的产品。应当理解，术语“蛋白质”包括融合蛋白或嵌合蛋白，以及细胞因子，抗体及其抗原结合片段。
51.如本文所用的“抗体”或“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。在一个实施方式中，抗体分子包含全长抗体或全长免疫球蛋白链的抗原结合或功能片段。例如，全长抗体是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(ig)分子(例如，igg)。在实施方式中，抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分，例如抗体片段。抗体片段(例如功能片段)是抗体的一部分，例如fab，fab’，f(ab’)2，f(ab)2，可变片段(fv)，域抗体(dab)或单链可变片段(scfv)。功能性抗体片段结合与完整(例如，全长)抗体识别的抗原相同的抗原。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离的片段，例如由重链和轻链的可变区或其中轻链和重链可变区通过肽接头(“scfv蛋白”)连接的重组单链多肽分子组成的“fv”片段。在一些实施方式中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如fc片段或单氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如，dab(域抗体)，单链，fab，fab’和f(ab’)2片段以及单链可变片段(scfv)。术语“fab”和“fab片段”可互换使用，并且是指包括来自抗体的每个重链和轻链的一个恒定域和一个可变域的区域，即v
l
，c
l
，v
h
，和c
h
1。
52.在实施方式中，抗体分子是单特异性的，例如，其包含对单个表位的结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是多特异性的，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是双特异性抗体分子。如本文所用，“双特异性抗体分子”是指对一种以上(例如，两，三，四或更多种)表位和/或抗原具有特异性的抗体分子。
53.如本文所用，“抗原”(ag)是指大分子，包括所有蛋白质或肽。在一些实施方式中，抗原是可以引起免疫应答的分子，例如涉及某些免疫细胞的激活和/或抗体产生。抗原不仅参与抗体产生。t细胞受体还识别抗原(尽管其肽或肽片段与mhc分子复合的抗原)。任何大分子，包括几乎所有蛋白质或肽，都可以是抗原。抗原也可以源自基因组重组体或dna。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna都编码“抗原”。在实施方式中，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也不需要完全由基因编码。在实施方式中，抗原可以合成或可以衍生自生物学样品，例如组织样品，肿瘤样品，细胞或具有其他生物学组分的流体。如本文所用，“肿瘤抗原”或可互换使用的“癌症抗原”包括存在于癌症，例如，癌症细胞或肿瘤微环境上或与之相关的可以激发免疫应答的任何分子。如本文所用，“免疫细胞抗原”包括存在于免疫细胞上或与之相关的可引起免疫应答的任何分子。
54.抗体分子的“抗原结合位点”或“抗原结合片段”或“抗原结合部分”(在本文中可互换使用)是指抗体分子，例如免疫球蛋白(ig)分子，例如igg参与抗原结合的一部分。在一些实施方式中，抗原结合位点由重(h)链和轻(l)链的可变(v)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的可变区域内的三个高度发散的延伸(称为高变区域)位于称为“框架区”(fr)的更为保守的侧翼延伸之间。fr是天然在免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在实施方式中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面，其与结合的抗原的三维表面互补。重链和轻链三个高变区中的每一个被称为“互补决定区”或“cdr。”框架区和cdr已经在例如kabat，e.a.等，(1991)
《热门免疫学蛋白质序列》，第五版，美国卫生和人服务部，nih出版号91
‑
3242，和chothia，c.等，(1987)j.mol.biol.196：901
‑
917中被定义和描述。每条可变链(例如，可变重链和可变轻链)通常由三个cdr和四个fr组成，按照下述氨基酸顺序从氨基端到羧基端排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3和fr4。可变轻链(vl)cdr通常定义为包括位置27
‑
32(cdr1)，50
‑
56(cdr2)和91
‑
97(cdr3)上的残基。可变重链(vh)cdr通常定义为包括位置27
‑
33(cdr1)，52
‑
56(cdr2)和95
‑
102(cdr3)上的残基。本领域普通技术人员将理解，环在抗体之间可以具有不同的长度，并且以诸如kabat或chotia的编号系统为准，从而框架在抗体之间具有一致的编号。
55.在一些实施方式中，抗体的抗原结合片段(例如，当作为融合分子的一部分包括时)可以缺乏或没有完整的fc结构域。在某些实施方式中，抗体结合片段不包含完整的igg或完整的fc，但是可以包含来自轻链和/或重链的一个或多个恒定区(或其片段)。在一些实施方式中，抗原结合片段可以完全不含任何fc结构域。在一些实施方式中，抗原结合片段可以基本上没有完整的fc结构域。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括完整fc结构域的一部分(例如，ch2或ch3结构域或其部分)。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括完整的fc结构域。在一些实施方式中，fc结构域是igg结构域，例如igg1，igg2，igg3或igg4 fc结构域。在一些实施方式中，fc结构域包含ch2结构域和ch3结构域。
56.如本文所用，“细胞因子”或“细胞因子分子”是指天然存在的野生型细胞因子的全长，片段或变体(包括其具有天然存在的细胞因子分子的至少10％活性的片段和功能变体)。在一些实施方式中，细胞因子分子至少有天然存在的分子的30％、50％或80％的活性，例如免疫调节活性。在某些实施方式中，细胞因子包含白介素(例如：il
‑
2，il
‑
7，il
‑
15，il
‑
10，il
‑
18，il
‑
21，il
‑
23，il
‑
12，ifn
‑
γ，ifn
‑
α，gm
‑
csf，flt3
‑
配体，或这些细胞因子例如il
‑
15sa的超激动剂/突变体形式)。在实施方式中，细胞因子分子还包含任选地与免疫球蛋白fc区偶联的受体结构域，例如细胞因子受体结构域。在其他实施方式中，细胞因子分子与免疫球蛋白fc区偶联。在其他实施方式中，细胞因子分子与抗体分子(例如，免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单域抗体，双特异性或多特异性抗体)，或非抗体支架和抗体模拟物(例如载脂蛋白(例如抗运载蛋白(anticalin))，亲和体，纤连蛋白(例如单抗体(monobody)或阿迪连接素(adnectin))，结蛋白，锚蛋白重复序列(例如darpins)和a域(例如avimer)))偶联。
57.如本文使用，“免疫刺激融合分子”(ifm；可与“系连融合体”互换使用)是指包含免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分的嵌合分子。免疫细胞靶向部分可包含对靶免疫细胞表面上的抗原具有亲和力的抗体或其抗原结合片段。免疫刺激细胞因子分子可操作地与抗体或其抗原结合片段连接，例如通过接头。示例性系连融合蛋白(例如，il
‑
15系连融合体和il
‑
12系连融合体)例如在pct国际公开号pct/us2018/040777、pct/us2018/040783和pct/us2018/040786中公开的那些，均通过引用纳入本文。
58.如本文所用“给药”和类似术语是指将组合物递送给正在治疗的个体。优选地，本发明的组合物通过例如肠胃外给药，包括皮下，肌内或优选静脉内途径给药。
59.本文所用术语“癌症”和“癌的”是指或描述典型特征为细胞生长失控的哺乳动物生理病症。癌症的例子包括但不限于：黑色素瘤，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。癌症的更具体的例子包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，肺癌，包括
小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌和肺鳞状癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，包括胃肠道癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头颈癌。
[0060]“有核细胞”是含有核的细胞。在一些实施方式中，有核细胞可以是免疫细胞例如免疫效应细胞。
[0061]
如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫系统中起作用，例如保护免受感染和异物侵害的各种细胞中的任何一种。在实施方式中，该术语包括白细胞，例如嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞。术语“免疫细胞”包括本文所述的免疫效应细胞。“免疫细胞”还指参与免疫应答的细胞的修饰形式，例如，修饰的nk细胞，包括nk细胞系nk
‑
92(atcc目录号crl
‑
2407)，hank(表达高亲和力fc受体fcγriiia(158v)的nk
‑
92变体)和tank(靶向的nk
‑
92细胞，其用表达给定肿瘤抗原的car的基因转染)，例如，如上文klingemann等所述。
[0062]
如本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答的细胞，例如促进免疫效应应答。免疫效应细胞的示例包括但不限于t细胞，例如cd4+t细胞，cd8+t细胞，αt细胞，βt细胞，γt细胞和δt细胞；b细胞；自然杀伤(nk)细胞；自然杀伤t(nkt)细胞；树突状细胞；和肥大细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)，其包含，例如，表达嵌合抗原受体(car)，例如结合癌抗原的car。在其他实施方式中，免疫细胞表达外源高亲和力fc受体。在一些实施方式中，免疫细胞包含，例如表达工程改造的t细胞受体。在一些实施方式中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，免疫细胞包含免疫细胞群，并且包含已经针对肿瘤相关抗原(taa)的特异性富集的t细胞，例如，通过分选针对展示感兴趣的taa(例如mart
‑
1)的mhc具有特异性的t细胞来富集。在一些实施方式中，免疫细胞包括免疫细胞群，并且包括已经被展示感兴趣的taa肽的抗原呈递细胞(apc)，例如，树突状细胞“训练”以具有针对taa的特异性的t细胞，。在一些实施方式中，针对选自mart
‑
1，mage
‑
a4，ny
‑
eso
‑
1，ssx2，生存素或其他中的一种或多种的taa训练t细胞。在一些实施方式中，免疫细胞包含t细胞群，其已被展示了多个感兴趣的taa肽的apc，例如，树突状细胞“训练”以对多种taa具有特异性。这类t细胞也在本文中被称作多靶t细胞(“mtc”)。在一些实施方式中，免疫细胞是细胞毒性t细胞(例如，cd8+t细胞)。在一些实施方式中，免疫细胞是辅助t细胞，例如cd4+t细胞。
[0063]“肿瘤相关抗原”(taa)是肿瘤细胞产生的抗原物质，其引发宿主的免疫应答。肿瘤抗原在用诊断测试鉴定肿瘤细胞中是有用的肿瘤标志物，在肿瘤治疗中是潜在使用候选物。在一些实施方式中，所述taa可来自癌症，其包括但不限于原发或转移性黑素瘤，胸腺瘤，淋巴瘤，肉瘤，肺癌，肝癌，非霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，白血病，子宫癌，宫颈癌，膀胱癌，肾癌和腺癌例如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，胰腺癌等。taa可以是患者特异性的。在一些实施方式中，taa可能是p53，ras，β
‑
连环蛋白，cdk4，α
‑
辅肌动蛋白
‑
4，酪氨酸酶，trpl/gp75，trp2，gploo，melan
‑
a/mart 1，神经节苷脂，psma，her2，wt1，epha3，egfr，cd20，mage，bage，gage，ny
‑
eso
‑
1，端粒酶，生存素，或其任意组合。示例性的taa包括优先表达的黑素瘤抗原(prame)，滑膜肉瘤x(ssx)断裂点2(ssx2)，ny
‑
eso
‑
1，生存素和wilms
′
肿瘤基因1(wt
‑
1)。
[0064]
如本文所用的细胞毒性“t淋巴细胞”(ctl)是指具有杀死靶细胞能力的t细胞。当发生以下两个步骤时可以发生ctl活化：1)靶细胞上的抗原结合的mhc分子和ctl上的t细胞受体之间产生相互作用；2)通过t细胞上共刺激分子和靶细胞的接合而产生共刺激信号。然后，ctl识别靶细胞上的特异性抗原并诱导这些靶细胞的破坏，例如通过细胞裂解。在一些实施方式中，ctl表达car。在一些实施方式中，ctl表达工程改造的t细胞受体。
[0065]
如本文所用，“有效量”是指足以以合理的风险/收益比提供期望的局部或全身作用的生物活性剂或诊断剂的量，如将参加任何医学治疗或诊断测试的生物活性剂或诊断剂的量。这将根据患者，疾病，所进行的治疗以及药物的性质而有所不同。
[0066]
如本文所用，“药学上可接受的”应指可用于制备基本安全无毒的药物组合物，所述药物组合物既非生物学不利也无其他不利情况，并包括可用于兽医用途以及人类药物用途。“药学上可接受的液体运载体”的实例包括水和有机溶剂。优选的药学上可接受的水性液体包括pbs，盐水和右旋糖溶液等。
[0067]
术语“治疗”或“处理”表示为了包括如下的目的施用药物：(i)预防疾病或病症，即，导致疾病或病症的临床症状不发展；(ii)抑制疾病或病症，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)减轻疾病或病症，即导致临床症状消退。
[0068]
术语“对象”包括可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物，人)。在一个实施方式中，对象是患者，例如需要免疫细胞疗法的患者。在另一个实施方式中，对象是供体，例如，免疫细胞的同种异体供体，例如，用于同种异体移植。
[0069]
术语“自体的”指衍生自后来将其重新引入的同一个体的任何物质。
[0070]
术语“基本上纯化的细胞”是指基本上不含其他细胞类型和/或相对于起始群体中的其他细胞类型已经富集的细胞。基本上纯化的细胞也指已经从其他细胞类型中分离出来的细胞，在其天然产生的状态下通常与之相关联。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指的是同质性的细胞群。在其它情况下，该术语简单地指示已经从其天然状态下天然相关的细胞中分离出来的细胞。在一些实施方式中，所述细胞在体外培养。在其它方面中，所述细胞不在体外培养。
[0071]
下面进一步详细描述本公开的各个方面。在整个说明书中提供了其他定义。
[0072]
单体
[0073]
根据本公开使用的蛋白单体的实例包括但不限于抗体(例如，igg，fab，混合的fc和fab)，单链抗体，抗体片段，工程化的蛋白质，例如fc融合体，酶，辅因子，受体，配体，转录因子和其他调节因子，细胞因子，趋化因子，人血清白蛋白等。这些蛋白质可能是天然的也可能不是天然的。考虑并且可以根据本公开使用其他蛋白质。如在例如美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944，美国公开号2014/0081012和2017年6月13日提交的pct申请号pct/us17/37249中所公开的，可以通过交联可逆地修饰任何蛋白质以形成簇或纳米凝胶结构，其全部通过引用并入本文。
[0074]
在各种实施方式中，可以使用本文公开的一种或多种交联剂使治疗性蛋白单体交联。治疗性蛋白单体可包含一种或多种细胞因子分子和可选的一种或多种共刺激分子。细胞因子分子可以选自il
‑
15，il
‑
2，il
‑
7，il
‑
10，il
‑
12，il
‑
18，il
‑
21，il
‑
23，il
‑
4，il1α，il1β，il
‑
5，ifnγ，tnfa，ifnα，ifnβ，gm
‑
csf或gcsf。共刺激分子选自cd137，ox40，cd28，gitr，vista，抗cd40抗体或cd3。
[0075]
在一些实施方式中，本公开的蛋白单体是免疫刺激蛋白。如本文所用，免疫刺激蛋白是在其被给予的对象中刺激免疫应答(包括增强预先存在的免疫应答)的蛋白质，无论是单独还是与另一种蛋白质或试剂组合。可以根据本公开使用的免疫刺激蛋白的实例包括但不限于抗原，佐剂(例如鞭毛蛋白，胞壁酰二肽)，包括白介素(例如il
‑
2，il
‑
7，il
‑
15，il
‑
10，il
‑
18，il
‑
21，il
‑
23(或这些细胞因子的超激动剂/突变形式，例如il
‑
15sa)，il
‑
12，ifn
‑
γ，ifn
‑
α，gm
‑
csf，flt3
‑
配体)的细胞因子，和免疫刺激抗体(例如，抗ctla
‑
4，抗cd28，抗cd3或这些分子的单链/抗体片段)。考虑并且可以根据本公开使用其他免疫刺激蛋白。在一些实施方式中，免疫刺激蛋白可以是结合免疫抑制剂的抑制剂，例如检查点抑制剂的抑制剂，例如pd
‑
1，pd
‑
l1，lag
‑
3，tim
‑
3，ctla
‑
4，抑制性kir，cd276，vtcn1，btla/hvem，havcr2和adora2a的抗体或其抗原结合片段，例如，us2016/0184399中所述的那些，其通过引用并入本文。
[0076]
在一些实施方式中，本公开的蛋白单体是抗原。可以根据本公开使用的抗原的实例包括但不限于癌症抗原，自身抗原，微生物抗原，变应原和环境抗原。考虑并且可以根据本公开使用其他抗原蛋白。
[0077]
在一些实施方式中，本公开的蛋白质是癌症抗原。癌症抗原是优先由癌细胞表达的抗原(即，其在癌细胞中表达的水平高于在非癌细胞上的表达)，并且在某些情况下，它仅由癌细胞表达。癌症抗原可以在癌细胞内或在癌细胞表面上表达。可以根据本公开使用的癌症抗原包括但不限于mart
‑
1/melan
‑
a，gp100，腺苷脱氨酶结合蛋白(adabp)，fap，亲环蛋白b，结直肠相关抗原(crc)
‑
0017
‑
1a/ga733，癌胚抗原(cea)，cap
‑
1，cap
‑
2，etv6，aml1，前列腺特异性抗原(psa)，psa
‑
1，psa
‑
2，psa
‑
3，前列腺特异性膜抗原(psma)，t细胞受体/cd3
‑
ζ链和cd20。癌症抗原可以选自下组：mage
‑
a1，mage
‑
a2，mage
‑
a3，mage
‑
a4，mage
‑
a5，mage
‑
a6，mage
‑
a7，mage
‑
a8，mage
‑
a9，mage
‑
a10，mage
‑
a11，mage
‑
a12，mage
‑
xp2(mage
‑
b2)，mage
‑
xp3(mage
‑
b3)，mage
‑
xp4(mage
‑
b4)，mage
‑
c1，mage
‑
c2，mage
‑
c3，mage
‑
c4和mage
‑
c5。所述癌症抗原可以选自下组：gage
‑
1，gage
‑
2，gage
‑
3，gage
‑
4，gage
‑
5，gage
‑
6，gage
‑
7，gage
‑
8和gage
‑
9。癌症抗原可以选自下组：bage，rage，lage
‑
1，nag，gnt
‑
v，mum
‑
1，cdk4，酪氨酸酶，p53，muc家族，her2/neu，p21ras，rcas1，α
‑
甲胎蛋白，e
‑
钙粘附蛋白，α
‑
连环蛋白，β
‑
连环蛋白，γ
‑
连环蛋白，p120ctn，gp100pmel117，prame，ny
‑
eso
‑
1，cdc27，腺瘤性息肉病大肠杆菌蛋白(apc)，铁蛋白，连接蛋白37，ig独特型，p15，gp75，gm2神经节苷脂，gd2神经节苷脂，人乳头瘤病毒蛋白，smad肿瘤抗原家族，imp
‑
1，p1a，ebv编码的核抗原(ebna)
‑
1，脑糖原磷酸化酶，ssx
‑
1，ssx
‑
2(hom
‑
mel
‑
40)，ssx
‑
1，ssx
‑
4，ssx
‑
5，scp
‑
1和ct
‑
7，cd20和c
‑
erbb
‑
2。考虑并且可以根据本公开使用其他癌症抗原。
[0078]
在一些实施方式中，本公开内容的蛋白质是抗体或抗体片段，包括但不限于贝伐单抗曲妥珠单抗阿仑单抗(适用于b细胞慢性淋巴细胞性白血病)，吉妥单抗(hp67.6，抗cd33，适用于白血病，例如急性髓细胞白血病)，利妥昔单抗托西单抗(抗cd20，适用于b细胞恶性肿瘤)，mdx
‑
210(同时结合her
‑
2/neu癌基因蛋白产物和免疫球蛋白g(igg)(fcγri)的i型fc受体的双特异性抗体)，奥戈伏单抗(适用于卵巢癌)，依决洛单抗达利珠单抗帕利珠单抗(
适用于呼吸道疾病，例如rsv感染)，替伊莫单抗(适用于非霍奇金淋巴瘤)，西妥昔单抗mdx
‑
447，mdx
‑
22，mdx
‑
220(抗tag
‑
72)，ior
‑
05，ior
‑
t6(抗cd1)，ior egf/r3，西洛伐单抗依帕妥珠单抗喷突莫单抗和gliomab
‑
h(适用于脑癌，黑色素瘤)。考虑并且可以根据本公开使用其他抗体和抗体片段。
[0079]
蛋白质可通过任何末端或内部亲核基团例如
‑
nh2官能团(例如赖氨酸的侧链)连接(例如，共价连接)至可降解的接头。例如，蛋白质可以在允许蛋白质通过可降解的接头彼此可逆的共价交联的条件下与可降解的接头接触。在一些实施方式中，蛋白质可以被交联以形成多个蛋白质纳米凝胶。在一些实施方式中，条件包括使蛋白质与可降解的接头在水性缓冲液中在4℃至25℃的温度下接触。在一些实施方式中，接触步骤可以在水性缓冲液中进行30分钟至一小时。在一些实施方式中，水性缓冲液包含磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在一些实施方式中，水性缓冲液中蛋白质的浓度为10mg/ml至50mg/ml(例如10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml)。
[0080]
细胞因子
[0081]
本文所述的方法和组合物，例如接头化合物，可用于交联一种或多种细胞因子分子。在实施方式中，细胞因子分子是细胞因子的全长，片段或变体，例如，包含一个或多个突变的细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子分子包含选自以下的细胞因子：白细胞介素
‑
1α(il
‑
1α)，白细胞介素
‑
1β(il
‑
1β)，白细胞介素
‑
2(il
‑
2)，白细胞介素
‑
4(il
‑
4)，白细胞介素
‑
5(il
‑
5)，白细胞介素
‑
6(il
‑
6)，白细胞介素
‑
7(il
‑
7)，白细胞介素
‑
12(il
‑
12)，白细胞介素
‑
15(il
‑
15)，白细胞介素
‑
17(il
‑
17)，白细胞介素
‑
18(il
‑
18)，白细胞介素
‑
21(il
‑
21)，白细胞介素
‑
23(il
‑
23)，干扰素(ifn)α，ifnβ，ifnγ，肿瘤坏死因子α，gm
‑
csf，gcsf或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。在其他实施方式中，细胞因子分子选自白细胞介素
‑
2(il
‑
2)，白细胞介素
‑
7(il
‑
7)，白细胞介素
‑
12(il
‑
12)，白细胞介素
‑
15(il
‑
15)，白细胞介素
‑
18(il
‑
18)，白细胞介素
‑
21(il
‑
21)，白细胞介素
‑
23(il
‑
23)或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。
[0082]
在实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域。在一个实施方式中，细胞因子分子包含如本文所述的il
‑
15受体或其片段(例如，il
‑
15受体α的胞外il
‑
15结合结构域)。在一些实施方式中，细胞因子分子是il
‑
15分子，例如本文所述的il
‑
15或il
‑
15超激动剂。如本文所用，与天然存在的细胞因子相比，细胞因子分子的“超激动剂”形式显示增加，例如至少10％，20％，30％的活性。示例性的超激动剂是il
‑
15sa。在一些实施方式中，il
‑
15sa包含il
‑
15和il
‑
15受体的il
‑
15结合片段，例如il
‑
15受体α或其il
‑
15结合片段的复合物，例如，如本文所述。
[0083]
在其他实施方式中，细胞因子分子进一步包含抗体分子，例如，免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段或亲和体片段或衍生物，例如，sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，例如，fc区，单结构域抗体，双特异性抗体或多特异性抗体。在一个实施方式中，细胞因子分子还包含免疫球蛋白fc或fab。
[0084]
在一些实施方式中，细胞因子分子是il
‑
2分子，例如il
‑
2或il
‑2‑
fc。在其他实施方式中，细胞因子激动剂可用于本文公开的方法和组合物中。在实施方式中，细胞因子激动
剂是细胞因子受体的激动剂，例如针对细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引起天然存在的细胞因子的至少一种活性。在实施方式中，细胞因子激动剂是细胞因子受体的激动剂，例如针对选自il
‑
15ra或il
‑
21r的细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)。
[0085]
在一些实施方式中，细胞因子分子是il
‑
15分子，例如il
‑
15，例如人il
‑
15的全长，片段或变体。在实施方式中，il
‑
15分子是野生型人il
‑
15。在其他实施方式中，il
‑
15分子是人il
‑
5的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方式中，il
‑
15分子包含突变，例如n72d点突变。
[0086]
在其他实施方式中，细胞因子分子还包含任选地与免疫球蛋白fc或抗体分子偶联的受体结构域，例如il
‑
15rα的胞外结构域。在实施方式中，细胞因子分子是如wo 2010/059253中所述的il
‑
15超激动剂(il
‑
15sa)。在一些实施方式中，细胞因子分子包含il
‑
15和与fc融合的可溶性il
‑
15受体α结构域(例如，sil
‑
15ra
‑
fc融合蛋白)，如rubinstein等，pnas 103：24p.9166
‑
9171(2006)中所述。
[0087]
il
‑
15分子可进一步包含多肽，例如细胞因子受体，例如细胞因子受体结构域，和第二异源结构域。在一个实施方式中，异源结构域是免疫球蛋白fc区。在其他实施方式中，异源结构域是抗体分子，例如，fab片段，fab2片段，scfv片段或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的n
‑
末端，并且在其他实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的c
‑
末端。
[0088]
某些细胞因子和抗体公开于例如美国公开号2017/0080104，美国专利号9,603,944，美国公开号2014/0081012和pct申请号pct/us2017/037249中(各自通过引用全文纳入本文)。
[0089]
背包
[0090]
在一些实施方式中，通过使用本文公开的一种或多种交联剂使多种治疗性蛋白单体交联以制备背包或纳米颗粒。尽管该图显示了含二硫化物的接头，但是也可以使用本文公开的其他可生物降解的接头。
[0091]
在某些实施方式中，背包可以通过使多种治疗性蛋白单体与多种交联剂反应以形成直径为例如约30nm至1000nm的蛋白簇而制备。在一些实施方式中，反应可以在约5℃至约40℃的温度下进行。该反应可以进行约1分钟至约8小时。
[0092]
提供的蛋白质簇可以进行表面修饰，例如聚阳离子。在美国公开号2017/0080104和美国专利号9,603,944中公开了某些表面修饰，两者均通过引用全文纳入本文。实例包括聚赖氨酸(聚k)，peg
‑
聚k和聚精氨酸。
[0093]
在一些实施方式中，交联反应可以在一种或多种拥挤剂例如聚乙二醇(peg)和甘油三酯的存在下进行。示例性的peg包括peg400，peg1000，peg1500，peg2000，peg3000和peg4000。
[0094]
某些蛋白质溶解性助剂，例如甘油，乙二醇和丙二醇，山梨糖醇和甘露醇也可以提高背包形成的产率。
[0095]
在某些实施方式中，由于背包中阳离子赖氨酸残基的反应，本发明的某些交联剂将导致背包具有净负电荷，其将抑制细胞附着。这样，首先通过静电相互作用用聚阳离子络
合背包驱动细胞附着可能是有用的。例如，背包可以用聚阳离子如聚赖氨酸(聚
‑
l
‑
赖氨酸)，聚乙烯亚胺，聚精氨酸，聚组氨酸，聚凝胶和/或deae
‑
右旋糖酐涂覆或表面修饰。聚阳离子可以帮助背包非特异性地结合或吸附在带负电荷的细胞膜上。在一些实施方式中，待包含在混合溶液中的聚阳离子可以是具有阳离子基团或可以变成阳离子基团的基团的聚合化合物，并且游离聚阳离子的水溶液显示碱性。可以变成阳离子基团的基团的实例包括氨基，亚氨基等。聚阳离子的实例包括：聚氨基酸，例如聚赖氨酸，聚鸟氨酸，聚组氨酸，聚精氨酸，聚色氨酸，聚2，4
‑
二氨基丁酸，聚
‑
2，3
‑
二氨基丙酸，鱼精蛋白和多肽链中的具有至少一种或多种选自下组的氨基酸残基的多肽：赖氨酸，组氨酸，精氨酸，色氨酸，鸟氨酸，2，4
‑
二氨基丁酸和2，3
‑
二氨基丙酸；聚胺，例如聚烯丙胺，聚乙烯胺，烯丙胺和二烯丙胺的共聚物，以及聚二烯丙胺；和聚亚胺，例如聚乙烯亚胺。
[0096]
在一些实施方式中，用于促进背包粘附至细胞的聚阳离子涂层或表面修饰剂是peg
‑
聚赖氨酸的阳离子嵌段共聚物，例如[甲氧基
‑
聚(乙二醇)n
‑
嵌段
‑
聚(l
‑
赖氨酸盐酸盐)，peg
‑
聚赖氨酸](pk30)。该嵌段共聚物可包含约114个peg单元(mw约5000da)和30个赖氨酸单元(mw约4900da)。线性peg聚合物具有甲氧基端基，聚赖氨酸为盐酸盐形式。pk30是线性两亲嵌段共聚物，其具有聚(l
‑
赖氨酸盐酸盐)嵌段和非反应性peg嵌段。聚
‑
l
‑
赖氨酸嵌段在生理ph下提供净阳离子电荷，并在缔合后使背包具有净正电荷。pk30结构[甲氧基
‑
聚(乙二醇)n
‑
嵌段
‑
聚(l
‑
赖氨酸盐酸盐)]如下。
[0097][0098]
在一些实施方式中，背包可以用与免疫细胞表面上的受体结合的抗体或其抗原结合片段包被，从而将背包特异性地靶向免疫细胞。示例性抗体包括本文公开的那些或包含该抗体的融合蛋白。
[0099]
在一个实例中，“il15
‑
fc”(具有两个缔合的il
‑
15蛋白的il15ra
‑
sushi
‑
结构域
‑
fc融合同二聚体蛋白)单体可以被交联并用聚阳离子进行表面修饰以形成il
‑
15背包。然后可以将il
‑
15背包装载到免疫细胞(例如t细胞)上以形成引发的t细胞。
[0100]
ifm
[0101]
在一些实施方式中，细胞因子或其他免疫调节剂可以通过ifm的方式靶向受体(例如，在免疫细胞上)，例如在pct申请号pct/us2018/040777，pct/us18/40783和pct/us18/40786(各自通过引用全文纳入本文)。
[0102]
在某些实施方式中，ifm可以在n至c末端的方向上用下式表示：r1
‑
(任选地l1)
‑
r2或r2
‑
(任选地l1)
‑
r1；其中r1包含免疫细胞靶向部分，l1包含接头(例如本文所述的肽接头)，并且r2包含免疫刺激部分，例如细胞因子分子。
[0103]
在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，连接至，例如共价连接至
免疫细胞靶向部分。在一些实施方式中，免疫刺激部分，例如细胞因子分子，与免疫细胞靶向部分功能性连接，例如共价连接(例如，通过化学偶联，融合，非共价缔合或其他方式)。例如，免疫刺激部分可以例如通过接头与免疫细胞靶向部分间接地共价偶联。
[0104]
在实施方式中，接头选自：可裂解的接头，不可裂解的接头，肽接头，柔性接头，刚性接头，螺旋接头或非螺旋接头。在一些实施方式中，接头是肽接头。肽接头的长度可以是5
‑
20、8
‑
18、10
‑
15或约8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在一些实施方式中，肽接头包含gly和ser，例如，包含氨基酸序列(gly4‑
ser)
n
的接头，其中n表示基序的重复数，例如，n＝1、2、3、4或5(例如(gly4ser)2或(gly4ser)3接头)。
[0105]
在其他实施方式中，接头是非肽化学接头。例如，免疫刺激部分通过交联共价偶联至免疫细胞靶向部分。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间
‑
马来酰亚胺苯甲酰基
‑
n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。
[0106]
在一些实施方式中，接头可以是可生物降解或可裂解的接头。可裂解的接头允许ifm裂解，从而可以从免疫靶向部分释放免疫刺激部分，例如细胞因子分子。接头的裂解可以由相关组织内的生物激活引起，或者由外部刺激例如电磁辐射例如uv辐射引起。
[0107]
在一个实施方式中，可裂解的接头被配置用于在细胞外部裂解，例如在与细胞或组织损伤或疾病相关的条件下裂解。这样的条件包括例如酸中毒；细胞内酶(通常局限于细胞内)的存在，包括坏死条件(例如被钙蛋白酶或其他从坏死细胞中溢出的蛋白酶裂解)；低氧条件，例如还原性环境；血栓形成(例如，接头可能被凝血酶或与凝血级联反应相关的另一种酶裂解)；免疫系统激活(例如，接头可通过激活的补体蛋白的作用裂解)；或与疾病或伤害相关的其他条件。
[0108]
在一个实施方式中，可裂解的接头可包括s
‑
s连接(二硫键)，或可包括当金属被还原时会分解的过渡金属络合物。s
‑
s接头的一个实施方式可以具有以下结构(如美国专利号9,603,944中公开的内容，该专利通过引用整体并入本文)。
[0109]
另一个示例性的ph敏感接头，其在ph变化时例如在低ph下被裂解，其将促进酸(或碱)不稳定部分，例如酸不稳定酯基团等的水解。这些条件可以在细胞外环境中发现，例如酸性条件，其可能存在于癌细胞和组织附近，或还原性环境中，如可能存在于缺氧或缺血性细胞和组织附近；通过蛋白酶或在其他酶，其存在于待治疗疾病的细胞，例如患病，凋亡或坏死的细胞和组织表面上或在其附近释放；或通过其他条件或因素。酸不稳定的接头可以是例如顺式
‑
乌头酸接头。ph敏感连接的其他示例包括乙缩醛，缩酮，活化的酰胺(例如2，3二甲基马来酰胺的酰胺)，乙烯基醚，其他活化的醚和酯(例如烯醇或甲硅烷基醚或酯)，亚胺，亚铵，原酸酯，烯胺，氨基甲酸酯，腙，和本领域已知的其他连接(参见，例如，pct公开号wo 2012/155920和franco等，aims materials science，3(1)：289
‑
323，通过引用并入本文)。也可以使用wo 2019/050977中公开的接头，在此通过引用纳入。表述“ph敏感”是指所讨论的可裂解的接头在酸性ph(例如，低于6.0的ph，例如在4.0
‑
6.0的范围内)基本上裂解的事实。
[0110]
在其他实施方式中，将免疫刺激部分直接共价偶联至免疫细胞靶向部分，而无需接头。
[0111]
在其他实施方式中，ifm的免疫刺激部分和免疫细胞靶向部分不是共价连接的，例
如是非共价缔合的。
[0112]
细胞因子分子与抗体分子，例如免疫球蛋白部分(ig)(例如抗体(igg)或抗体片段(fab，scfv等))融合的示例性格式可包括与抗体分子的氨基末端(n末端)或羧基末端(c末端)，通常是抗体分子的c末端的融合。在一个实施方式中，包含结合至ig多肽的细胞因子多肽，细胞因子
‑
受体复合物或细胞因子
‑
受体fc复合物，细胞因子多肽链和ig多肽链之间的合适连接的细胞因子
‑
ig部分融合分子包括直接多肽键，在两个链之间具有多肽接头的连接；以及链之间的化学键。
[0113]
在一个示例中，ifm包含白介素
‑
12(il
‑
12)。一般来说，il
‑
12是由p35和p40亚基组成的异二聚体细胞因子，分别由2个独立的基因il
‑
12a和il
‑
12b编码。il
‑
12参与将幼稚t细胞分化为th1细胞。它被称为t细胞刺激因子，其可以刺激t细胞的生长和功能。它刺激t细胞和自然杀伤(nk)细胞产生干扰素
‑
γ(ifn
‑
γ)和肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)，并减少il
‑
4介导的ifn
‑
γ抑制。产生il
‑
12的t细胞具有一个共受体cd30，该受体与il
‑
12活性有关。
[0114]
il
‑
12在nk细胞和t淋巴细胞的活性中起重要作用。il
‑
12介导nk细胞和cd8细胞毒性t淋巴细胞的细胞毒性活性增强。nk细胞中il
‑
2和il
‑
12的信号转导之间似乎也存在联系。il
‑
2刺激两种il
‑
12受体il
‑
12r
‑
β1和il
‑
12r
‑
β2的表达，从而维持nk细胞中与il
‑
12信号转导有关的关键蛋白的表达。ifn
‑
γ的产生和靶细胞的杀伤证明了增强的功能反应。
[0115]
il
‑
12也具有抗血管生成活性，这意味着它可以阻断新血管的形成。它通过增加干扰素γ的产生来做到这一点，这又增加了一种被称为诱导蛋白
‑
10(ip
‑
10或cxcl10)的趋化因子的产生。ip
‑
10然后介导这种抗血管生成作用。由于其诱导免疫应答的能力及其抗血管生成活性，人们一直在测试il
‑
12作为一种可能的抗癌药物。il
‑
12与银屑病和炎症性肠病之间可能存在可用于治疗的联系。
[0116]
il
‑
12与il
‑
12受体结合，后者是由il
‑
12r
‑
β1和il
‑
12r
‑
β2形成的异二聚体受体。il
‑
12r
‑
β2被认为在il
‑
12功能中起关键作用，因为它被发现在活化的t细胞上，并受到促进th1细胞发育的细胞因子的刺激和被促进th2细胞发育的细胞因子的抑制。结合后，il
‑
12r
‑
β2被酪氨酸磷酸化，并提供激酶tyk2和jak2的结合位点。这些对于激活关键的转录因子蛋白(例如stat4)很重要，该蛋白与t细胞和nk细胞的il
‑
12信号转导有关。
[0117]
il
‑
12是一种有效的细胞因子，具有重塑实体瘤中抗炎环境的潜力。然而，其临床应用受到可溶给药或工程改造分泌il
‑
12的过继转移t细胞产生的严重毒性的限制。本文公开的系连融合体(tf)能够改善对细胞因子剂量和生物分布的控制。在体外模型系统中，il
‑
12
‑
tf细胞因子在t细胞表面提供持久的il
‑
12装载，并在il
‑
12受体下游提供持续的t细胞活化和信号转导。反过来，这可以激活先天免疫和适应性免疫。
[0118]
系连融合体中的il
‑
12可以是包含il
‑
12a和il
‑
12b亚基的单链形式。在一些实施方式中，il
‑
12可作为非单链存在(即，作为il
‑
12的天然形式的il
‑
12a和il
‑
12b的异二聚体)。例如，tf可以通过三个蛋白亚基(fab重链，fab轻链w/il
‑
12a(或il
‑
12b)和il
‑
12b(或il
‑
12a))的共表达制备。
[0119]
在一些实施方式中，tf可以是il
‑
12
‑
tf(例如il
‑
12和抗
‑
cd45抗体融合)，例如在pct国际公开号wo 2019/010219中公开的，其通过引用全文纳入本文。在一个示例中，“deep
tm
il
‑
12”(融合到人源化抗
‑
cd45 fab的单链il
‑
12p70)tf可以重组表达，纯化，然后系连到表达cd45的免疫细胞如t细胞上以形成引发的t细胞。
[0120]
组合物和细胞疗法
[0121]
在一些实施方式中，一旦制备和纯化，背包可以任选地冷冻直到用于细胞疗法。细胞疗法可选自，例如过继细胞疗法，car
‑
t细胞疗法，工程改造的tcr t细胞疗法，肿瘤浸润淋巴细胞疗法，抗原训练的t细胞疗法，或富集的抗原特异性t细胞疗法。
[0122]
在各种实施方式中，可通过提供本文公开的蛋白簇或背包或系连融合体组合物，并将蛋白簇或背包或系连融合体组合物与有核细胞如免疫细胞一起孵育，优选持续约30
‑
60分钟来制备细胞疗法组合物。可以将细胞与背包冷冻保存，直到通过例如输注给予患者。
[0123]
本文还公开了一种细胞治疗组合物，其包含与有核细胞例如t和nk细胞缔合的本文公开的蛋白簇或背包或系连融合体组合物。可以将这种细胞治疗组合物给予需要其的对象。给药后，背包内的交联剂可在生理条件下降解，从而从蛋白簇中释放治疗性蛋白单体。
[0124]
本文提供了包含背包或系连融合体的组合物，包括药物组合物。组合物可以以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物配制。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分(例如，纳米颗粒的生物活性蛋白)的生物活性的有效性的无毒材料。在一些实施方式中，此类组合物可包含盐，缓冲剂，防腐剂和任选地其他治疗剂。在一些实施方式中，药物组合物还可包含合适的防腐剂。在一些实施方式中，药物组合物可以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。在一些实施方式中，适合于肠胃外给药的药物组合物包含纳米颗粒的无菌水性或非水性制剂，在一些实施方式中，其与受体对象的血液等渗。该制剂可以根据已知方法配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。
[0125]
本文公开的组合物具有多种治疗用途，包括例如癌症、自身免疫疾病和传染病的治疗。本文所述的方法包括通过使用本文所述的背包或背负的细胞治疗对象的癌症。还提供了用于减少或改善对象的癌症症状的方法，以及用于抑制癌症的生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在实施方式中，本文描述的方法在给予了本文描述的或本文描述的药物组合物的对象中减小了肿瘤的大小和/或减少了癌细胞的数量。
[0126]
在实施方式中，癌症是血液癌症。在实施方式中，血液癌症是白血病或淋巴瘤。如本文所用，“血液癌症”是指造血或淋巴组织的肿瘤，例如，影响血液，骨髓或淋巴结的肿瘤。示例性的血液癌症包括，但不限于：白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(all)，急性髓细胞白血病(aml)，慢性淋巴细胞白血病(cll)，慢性骨髓性白血病(cml)，毛细胞白血病，急性单核细胞白血病(amol)，慢性髓单核细胞白血病(cmml)，青少年髓单核细胞白血病(jmml)或大颗粒性淋巴细胞性白血病)，淋巴瘤(例如与aids相关的淋巴瘤，皮肤t细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(例如经典霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主导的霍奇金淋巴瘤)，真菌病(mycosis fungoides)，非霍奇金淋巴瘤(例如b细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤，小淋巴细胞淋巴瘤(cll/sll)，弥漫性大b细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，免疫母细胞大细胞淋巴瘤，前体b淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或t细胞非霍奇金淋巴瘤(真菌病，间变性大细胞淋巴瘤或前体t淋巴母细胞淋巴瘤))，原发性中枢神经系统淋巴瘤，s
é
zary综合征，巨球蛋白血症)，慢性骨髓增殖性疾病，朗格汉斯细胞组织细胞增生症，多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，骨髓增生异常综合征，或骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤。
[0127]
在实施方式中，癌症是实体癌。示例性的实体瘤癌包括，但不限于：卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域癌，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺非小细胞癌，小
肠癌，食道癌，黑色素瘤，卡波济肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，子宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊髓轴肿瘤，中枢神经系统(cns)肿瘤，原发性cns淋巴瘤，肿瘤血管生成，所述癌症的转移性病变或其组合。
[0128]
在实施方式中，以适合于待治疗或预防的疾病的方式给予背包或背负的细胞。通过诸如患者状态这样的因素以及患者疾病的类型和严重程度确定给药的数量和频率。适当的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医师可以考虑对象的肿瘤大小，感染或转移程度，年龄，体重和状况的个体差异来确定要给予的药物组合物(或背包)的精确量。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以104至109个细胞/kg体重，例如105至106个细胞/kg体重的剂量给予，包括那些范围内的所有整数值。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以这些剂量多次给予。在实施方式中，本文描述的药物组合物可以使用免疫疗法中描述的输注技术给予(参见，例如，rosenberg等，new eng.j.med.319：1676，1988)。
[0129]
在实施方式中，将背包或背负的细胞肠胃外给予对象。在实施方式中，将细胞静脉内，皮下，肿瘤内，结节内，肌内，皮内或腹膜内给予给对象。在实施方式中，将细胞直接给予(例如注射)到肿瘤或淋巴结中。在实施方式中，以输注(例如，如rosenberg等，new eng.j.of med.319：1676，1988中所述)或静脉内推注方式给予细胞。在实施方式中，细胞以可注射的储库制剂形式给予。
[0130]
在实施方式中，对象是哺乳动物。在实施方式中，对象是人，猴，猪，狗，猫，牛，绵羊，山羊，兔，大鼠或小鼠。在实施方式中，对象是人。在实施方式中，所述对象是儿科对象，例如小于18岁，例如小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或以下。在实施方式中，对象是成年人，例如，至少18岁，例如，至少19、20、21、22、23、24、25、25
‑
30、30
‑
35、35
‑
40、40
‑
50、50
‑
60、60
‑
70、70
‑
80或80
‑
90岁。
[0131]
检查点抑制剂及其抑制剂
[0132]
t细胞介导针对抗原的免疫应答的能力需要两个不同的信号转导相互作用(viglietta，v.等.(2007)neurotherapeutics 4：666
‑
675；korman，a.j.等.(2007)adv.immunol.90：297
‑
339)。首先，阵列于抗原呈递细胞(apc)的表面的抗原被呈递给抗原特异性幼稚cd4
+
t细胞。这样的呈递通过t细胞受体(tcr)递送信号，该信号引导t细胞启动所呈递抗原特异性的免疫响应。第二步，通过apc和不同t细胞表面分子之间的相互作用介导的多种共刺激和抑制信号触发t细胞的活化和增殖，并最终抑制它们。
[0133]
免疫系统是由共刺激和共抑制配体和受体网络严格控制的。这些分子提供了t细胞活化的次级信号，并提供了正向和负向信号的平衡网络，以最大化抗感染的免疫应答，同时将免疫限制在自身(wang，l.等.(epub，2011年3月7日)j.exp.med.208(3)：577
‑
92；lepenies，b.等.(2008)endocrine，metabolic&immune disorders
‑
drug targets 8：279
‑
288)。共刺激信号的示例包括apc的配体b7.1(cd80)和b7.2(cd86)与cd4 t淋巴细胞的cd28和ctla
‑
4受体结合(sharpe，a.h.等.(2002)nature rev.immunol.2：116
‑
126；lindley，p.s.等.(2009)immunol.rev.229：307
‑
321)。b7.1或b7.2与cd28的结合刺激t细胞活化，而b7.1或b7.2与ctla
‑
4的结合抑制该活化(dong，c.等.(2003)immunolog.res.28(l)：39
‑
48；
greenwald，r.j.等.(2005)ann.rev.immunol.23：515
‑
548)。cd28在t细胞表面上组成型表达(gross，j.，等.(1992)j.immunol.149：380
‑
388)，而ctla
‑
4表达在t细胞活化后迅速上调(linsley，p.等.(1996)immunity 4：535
‑
543)。
[0134]
cd28受体的其它配体包含一组b7相关的分子，也称为“b7超家族”(coyle，a.j.等.(2001)nature immunol.2(3)：203
‑
209；sharpe，a.h.等.(2002)nature rev.immunol.2：116
‑
126；collins，m.等.(2005)genome biol.6：223.1
‑
223.7；korman，a.j.等.(2007)adv.immunol.90：297
‑
339)。b7超家族的一些成员是已知的，包括b7.1(cd80)，b7.2(cd86)，可诱导的共刺激配体(icos
‑
l)，程序性死亡
‑
1配体(pd
‑
l1；b7
‑
h1)，程序性死亡
‑
2配体(pd
‑
l2；b7
‑
dc)，b7
‑
h3，b7
‑
h4和b7
‑
h6(collins，m.等.(2005)genome biol.6：223.1
‑
223.7)。
[0135]
程序性死亡1(pd
‑
1)蛋白是t细胞调节剂的扩展cd28/ctla
‑
4家族的抑制性成员(okazaki等.(2002)curr opin immunol 14：391779
‑
82；bennett等.(2003)j.immunol.170：711
‑
8)。cd28家族的其他成员包含cd28，ctla
‑
4，icos和btla。已鉴定了pd
‑
1的两种细胞表面糖蛋白配体，程序性死亡配体1(pd
‑
l1)和程序性死亡配体2(pd
‑
l2)。已显示pd
‑
l1和pd
‑
l2结合pd
‑
1时能下调t细胞活化和细胞因子分泌(freeman等，(2000)j exp med 192：1027
‑
34；latchman等，(2001)nat immunol 2：261
‑
8；carter等，(2002)eur j immunol32：634
‑
43；ohigashi等，(2005)clin cancer res 11：2947
‑
53)。
[0136]
pd
‑
l1(或称为分化簇274(cd274)或b7同源物1(b7
‑
h1))是40kda的1类跨膜蛋白。pd
‑
l1与其在活化t细胞，b细胞和血液细胞上发现的受体pd
‑
1结合以调控激活或抑制。pd
‑
l1和pd
‑
l2都是b7同源物，其与pd
‑
1结合，但不与cd28或ctla
‑
4结合(blank等.(2005)cancer immunol immunother.54：307
‑
14)。pd
‑
l1与其t细胞上的受体pd
‑
1的结合递送信号，其抑制tcr介导的il
‑
2产生活化和t细胞增殖。所述机制涉及zap70磷酸化的抑制及其与cd3c的关联(sheppard等.(2004)feb s lett.574：37
‑
41)。pd
‑
1信号转导减弱了由tcr信号转导引起的pkc
‑
θ环磷酸化激活，这是转录因子nf
‑
κb和ap
‑
1的激活及il
‑
2的产生所必需的。pd
‑
l1还与共刺激分子cd80(b7
‑
1)结合，但不与cd86(b7
‑
2)结合(butte等.(2008)mol immunol.45：3567
‑
72)。
[0137]
细胞表面上pd
‑
l1的表达已显示被ifn
‑
γ刺激上调。已在多种癌症，包括人肺癌、卵巢和结肠癌以及各种骨髓瘤中发现pd
‑
l1表达，且常与预后不良相关(iwai等.(2002)pnas 99：12293
‑
7；ohigashi等.(2005)clin cancer res11：2947
‑
53；okazaki等.(2007)intern.immun.19：813
‑
24；thompson等.(2006)cancer res.66：3381
‑
5)。pd
‑
l1被认为在肿瘤免疫中通过增加抗原特异性t细胞克隆的凋亡起作用(dong等.(2002)nat med 8：793
‑
800)。pd
‑
l1还被认为可能参与肠粘膜炎症，且抑制pd
‑
l1抑制与结肠炎相关的消耗性疾病(kanai等.(2003)j immunol 171：4156
‑
63)。
[0138]
在一些实施方式中，本文公开的肿瘤免疫疗法的组合物包含抗
‑
pd
‑
l1抗体或其抗原结合片段。例如，阿特朱单抗(atezolizumab)和其他抗
‑
pd
‑
l1抗体已在us 8,217,149中公开，其通过引用全文纳入本文。阿维鲁单抗(avelumab)和其他抗
‑
pd
‑
l1抗体在wo 2013/079174中公开，其通过引用全文纳入本文。德瓦鲁单抗(durvalumab)和其他抗
‑
pd
‑
l1抗体已在us 8,779,108中公开，其通过引用全文纳入本文。bms
‑
936559和其他抗
‑
pd
‑
l1抗体在us 7,943,743和wo 2015/081158中公开，其通过引用全文纳入。其他抗
‑
pd
‑
l1抗体包括例如在wo 2015/181342，wo 2014/100079，wo 2016/000619，wo 2014/022758，wo 2014/
055897，wo 2015/061668，wo 2013/079174，wo 2012/145493，wo 2015/112805，wo 2015/109124，wo 2015/195163，us 8,168,179，us 8,552,154，us 8,460,927和us 9,175,082中所述的那些，其通过引用全文纳入。
[0139]
实施例
[0140]
实施例1：免疫细胞的背负
[0141]
目的：可以用hbss中5种浓度的il
‑
15背包以50m/ml的细胞浓度标记人类细胞(例如t细胞，car
‑
t，nk细胞，其他免疫细胞)。标记后，可以测试细胞：
[0142]
a.通过经由facs测量的7
‑
aad染色测定活力
[0143]
b.通过经由facs测量的计数珠测定在培养物中的扩增
[0144]
c.通过抗il
‑
15抗体和人抗igg进行背包表面标记
[0145]
注意，虽然本实施例关注il
‑
15，但普通技术人员将理解，相同的实验方法适用于其他细胞因子和/或ifm。
[0146]
il
‑
15背包的解冻
[0147]
使用前，应将背包保存于
‑
80℃。解冻后的背包可以重新冷冻，最多可以重复使用3次或更多次的冷冻/解冻周期。
[0148]
从冰柜中取出背包等份试样，然后在冰上解冻。
[0149]
1.将bp溶液解冻后，在进行细胞标记实验前15分钟将其温热至室温。
[0150]
2.用hbss调整bp储液至3mg/ml的最终工作溶液
[0151][0152]
背包稀释和细胞标记：
[0153]
总共7个反应：1个仅pbs的对照，1个可溶性il
‑
15恒定对照(接种后添加到细胞中)，和5个背包样品(一式三份)(总共21个样品)。背包样品为：
[0154]
a.bp
‑
剂量1：3mg/ml
[0155]
b.bp
‑
剂量2：1.5mg/ml
[0156]
c.bp
‑
剂量3：0.75mg/ml
[0157]
d.bp
‑
剂量4：0.375mg/ml
[0158]
e.bp
‑
剂量5：0.1875mg/ml
[0159]
1.用圆底96孔板对背包进行系列稀释：
[0160][0161]
2.将来自上述每孔的10ul稀释背包分配到圆底96孔板中的三个孔中(一式三份背负)，总共21孔。
[0162]
细胞洗涤和背负：
[0163]
以下步骤中使用的缓冲液，pbs和培养基应预热至37℃。
[0164]
1.从培养物中收集30x106个细胞，并以500g沉淀它们5分钟。
[0165]
2.抽吸除去细胞上清液。
[0166]
3.通过将沉淀物重悬于10ml预热(37℃)hbss缓冲液中洗涤细胞，然后用cellometer(含aopi染料)或台盼蓝计数。
[0167]
4.以500g离心5分钟。
[0168]
5.吸出上清液并将细胞沉淀物悬浮在预热的(37℃)hbss中，使其浓度为100x106个细胞/ml(约300ul缓冲液)。
[0169]
6.吸取10ul细胞到含背包或hbss每个孔中，并通过吹打轻轻混合它们。
[0170][0171]
7.用微膜覆盖板以防止蒸发，然后在细胞培养箱中孵育(通常在37℃与5％co2条件下或最适合培养的条件下)。
[0172]
8.在37℃下孵育细胞一小时。
[0173]
9.向每个孔中添加180ul预热的完全细胞培养基(含血清)。
[0174]
10.以500g沉淀细胞5分钟，并用多孔歧管抽吸培养基。
[0175]
11.按照步骤9和步骤10用200ul完全培养基再洗涤细胞两次，沉淀细胞和吸出上清液。
[0176]
12.第三次洗涤后，将每个样品中的细胞重悬于200ul完全培养基中。细胞的密度应约为5x106个细胞/ml，在铺板过程中需要进一步以1∶10稀释。
[0177]
13.通过将20ul细胞悬液从96孔u底转移到96孔平底组织培养板中然后添加180ul细胞培养基(不添加细胞因子)以1∶10的比例稀释细胞，以达到5x105个细胞/ml的最终铺板密度。
[0178]
14.在三个单独的96孔平底板中，将步骤13再重复3次(总共4个板：第0天，第1天，第3天，第x天，以拆分为将来的时间点)。
[0179]
15.将可溶性il
‑
15单体添加到每个板的可溶性il
‑
15恒定对照孔中。
[0180]
细胞计数和活力测试：
[0181]
在流式细胞仪上使用7
‑
aad和countbright计数珠对细胞进行计数。
[0182]
1.在每个时间点，从培养箱中取出一个96孔平底板，通过上下吹打将细胞重悬于培养基中。
[0183]
2.将20ul细胞溶液转移到96孔v型底平板上。
[0184]
3.向每个孔中添加20ul的“countbright珠溶液。”[0185]
countbright珠溶液包含(下面列出了标记1孔的体积)：
[0186]
a.19.6ul countbright珠储液
[0187]
b.0.4ul的100x7aad(7
‑
aad，生命技术公司(lifetech)，a1310，10ug/ml是100x)
[0188]
4.在培养后第1、3和x天重复这些步骤以评估活力和扩增。
[0189]
通过表面染色的bp装载效率测试：
[0190]
在第0天和第1天使用抗
‑
il
‑
15和抗
‑
人igg抗体通过流式细胞术分析il
‑
15背包的表面水平。
[0191]
1.从培养箱中取出96孔平底板，通过上下吹打将细胞重悬于培养基中。
[0192]
2.将100ul细胞溶液转移到新的v型底96孔板中(应包含约50000个细胞)。
[0193]
3.沉淀细胞(500g，5分钟)并吸出上清液。
[0194]
4.将细胞重悬于40ul“抗体细胞表面染色液”中。
[0195]
抗体染色溶液(下面列出了用于标记1个孔的体积)：
[0196]
a.0.4ul的小鼠抗
‑
人igg bv421
‑
biolegend目录号409318，1∶100稀释
[0197]
b.0.4ul的抗
‑
il
‑
15 pe：r&d systems目录号ic2471ip，1∶100稀释
[0198]
c.0.4ul的100x7aad(7
‑
aad，生命技术公司(lifetech)，a1310，10ug/ml是100x)
[0199]
d.38.8ul的macs缓冲液
[0200]
5.在室温下孵育细胞10分钟。
[0201]
6.向每个孔中加入160ul冷macs缓冲液，以500g沉淀细胞5分钟，吸出。
[0202]
7.再用200ul冷macs缓冲液洗涤细胞一次。
[0203]
8.重悬于30μl/孔的macs缓冲液中，并在流式细胞仪上分析(hts模式)。
[0204]
使用的试剂：
[0205]
汉克斯平衡盐溶液(hbss，吉布可公司(gibco)，含钙和镁，目录号14025
‑
092)
[0206]
磷酸盐缓冲盐水(pbs，吉布可公司，无钙，无镁，目录号10010
‑
023)
[0207]
圆底96孔平板(granier
‑
bio，透明，无菌，聚丙烯平板，目录号650261)
[0208]
v型底96孔平板(任选但推荐)：costar 3894
[0209]
平底96孔平板(fishersci，目录号353072)
[0210]
计数珠(生命技术公司，countbright绝对计数珠，目录号c36950)
[0211]7‑
氨基放线菌素
‑
d(7
‑
aad，生命技术公司，目录号a1310)
[0212]
人il
‑
15 pe
‑
偶联的抗体(r&d系统公司，目录号ic2471p)
[0213]
小鼠抗
‑
人igg，bv421(白乐津公司，目录号409318)
[0214]
替代性抗体：小鼠抗
‑
人igg，apc(白乐津公司，目录号409306)
[0215]
替代性抗体：驴抗
‑
人igg(h+l)，dylight 650(赛默飞世尔(thermofisher)，目录号sa5
‑
10129)
[0216]
macs缓冲液(任选的)：
[0217]
edta：生命技术公司，15575
‑
038
[0218]
磷酸盐缓冲盐水，ph 7.4(与上述相同)
[0219]
牛血清白蛋白(bsa)：美国生物公司(americanbio，inc.)，目录号ab01243
‑
00050
[0220]
实施例2：deep
tm
il
‑
15引发的t细胞协同pd
‑
l1阻断以克服检查点免疫疗法抗性
[0221]
引言：白介素
‑
15(il
‑
15)激活并扩增cd8
+
t细胞和nk细胞，而不是免疫抑制性t
reg
细胞。因此，il
‑
15对肿瘤免疫疗法是一种有吸引力的资源，但其全身给药受到免疫激活和毒性的限制。为了限制il
‑
15的全身暴露，我们开发了deep
tm
il
‑
15，一种化学交联的il
‑
15/il
‑
15rα/fc异二聚体(il15
‑
fc)多聚体。在过继细胞转移(act)之前，deep
tm
il
‑
15被装载到肿瘤反应性t细胞上。这种新的治疗方法使得deep
tm
il
‑
15以全身性il15
‑
fc无法达到的浓度装载到细胞中，引起自身分泌t细胞活化和扩增，同时限制全身暴露和相关毒性。该t细胞疗
法的抗肿瘤活性已经受到t细胞扩增不足和检查点免疫抑制的限制。此处，我们组合了deep
tm
il
‑
15引发的t细胞和pd
‑
l1阻断以克服这些限制。
[0222]
具体地，如图1中所示，deep
tm
il
‑
15(或dp
‑
15)是指以下的多聚体：人il
‑
15受体α
‑
sushi
‑
结构域
‑
fc融合同源二聚体与两个缔合的il
‑
15分子(il15
‑
fc)，通过可裂解的交联剂(参见，例如，pct申请号pct/us2018/049594，以参考的方式纳入本文)连接，且非共价包被有聚乙二醇(peg)
‑
聚赖氨酸
30
嵌段共聚物(pk30)。更具体地，deep
tm
il
‑
15是指以下的多聚体：人类il15
‑
fc单体，通过可水解的交联剂(cl17)连接，并非共价包被有聚乙二醇(peg)
‑
聚赖氨酸
30
嵌段共聚物(pk30)。il15
‑
fc单体由两个亚基组成，每个亚基由与非共价结合至il
‑
15分子的il
‑
15受体α
‑
sushi
‑
结构域融合的效应子减毒igg2 fc变体组成。deep
tm
il
‑
15引发的t细胞是通过装载过程生成的，在该过程中，靶细胞与高浓度的deep
tm
il
‑
15共孵育。通过此过程，deep
tm
il
‑
15通过静电相互作用与细胞缔合，并被内化以产生deep
tm
il
‑
15的细胞内储库。从这些储库中，deep
tm
il
‑
15通过交联剂的水解缓慢释放生物活性il15
‑
fc。il15
‑
fc的这种延长释放促进了deep
tm
il
‑
15引发的t细胞的增殖和存活，从而提供了靶向的，可控制的和时间依赖性的免疫刺激。
[0223]
本研究的目的是评估deep
tm
il
‑
15引发的pmel细胞和抗pd
‑
l1组合的抗肿瘤活性，以及评估环磷酰胺(cpx)对于deep
tm
il
‑
15引发的pmel细胞单独或组合抗pd
‑
l1的抗肿瘤活性的贡献。
[0224]
材料和方法
[0225]
deep
tm
il
‑
15合成
[0226]
deep
tm
il
‑
15通过用交联试剂孵育il15
‑
fc来合成。从b6.cg
‑
thy1
a
/cy tg(tcratcrb)8rest/j小鼠中分离出pmel cd8
+
t细胞(pmel)，活化、扩增并装载deep
tm
il
‑
15以产生deep
tm
il
‑
15引发的pmel(deep
tm
‑
15 pmel)。
[0227]
研究动物
[0228]
b6d2f1雌性小鼠(约7周龄)购自查尔斯河实验室(charles river laboratories)威明顿，马萨诸塞州(wilmington，ma)。研究开始时，体重范围在15.5至21.3g之间。实验动物的护理和治疗符合机构动物护理和使用委员会(iacuc)的指导原则。
[0229]
b16
‑
f10肿瘤建立和肿瘤及体重测量
[0230]
在研究的第5天将b16
‑
f10黑素瘤细胞(1
×
106个)皮下注射到雌性b6d2f1小鼠剃毛的右肋腹。每周用卡尺测量肿瘤尺寸(在缩写列表中定义的长度[l]和宽度[w])3次。使用以下公式计算肿瘤体积：(w2×
l)/2。为了入组，按照肿瘤体积(平均33.6mm3；范围18
‑
63mm3)将小鼠随机分组。单独监视动物的肿瘤生长直到第76天，每只动物的肿瘤体积达到或超过1500mm3时被安乐死。
[0231]
治疗可能导致动物的肿瘤部分缓解(pr)或完全缓解(cr)。在pr响应中，在研究过程中连续三次测量，肿瘤体积≤其第1天体积的50％，且在这三次中的一次或多次测量中，肿瘤体积≥13.5mm3。在cr响应中，在研究过程中连续三次测量肿瘤体积≤13.5mm3。在研究期间动物只对pr或cr事件进行一次评分，如果pr和cr标准均满足，则只对cr进行评分。在研究的最后一天，所有cr响应的动物都按照无肿瘤生存者(tfs)另外分类。
[0232]
在第1
‑
5天，动物每天称重，然后每周称重两次，直到研究完成。经常观察小鼠的任何不良的、治疗相关(tr)副作用的明显迹象，并在观察时记录临床症状。按照方案监测个体
体重(bw)，一次测量体重减轻超过30％或连续三次测量体重减轻超过25％的动物作为tr死亡被安乐死。根据查尔斯河发现服务公司(charles river discovery services)的方案，组平均bw减轻也被监测。可接受的毒性定义为研究期间组平均bw减轻少于20％且tr死亡不超过10％。
[0233]
淋巴清除
[0234]
所有小鼠在第1天以每只4mg注射cpx以清除内源性免疫细胞。
[0235]
peml细胞的分离和扩增
[0236]
从30只雌性pmel小鼠(杰克逊实验室，缅因州巴港)的脾脏和淋巴结(腹膜，腋窝和宫颈)中分离出pmel细胞。用gentlemacs octo dissociator(美天旎生物技术公司(miltenyi biotech)，加利福尼亚州奥本)处理脾脏和淋巴结，并通过40μm过滤器。离心洗涤细胞，并使用imacs幼稚cd8a+分离试剂盒(美天旎生物技术公司)和multimacs细胞24块(美天旎生物技术公司)和分离器(美天旎生物技术公司)按照制造商的操作规程纯化cd8a+细胞。通过流式细胞术确认了cd8a
+
细胞的纯度。
[0237]
共分离出533
×
106个pmel t细胞，并以10
×
106个/ml/小瓶的密度在培养基(干细胞科技公司(stemcell technologies))中冷冻。大约200
×
106个细胞(20瓶)运送到查尔斯河发现服务公司(charles river discovery services)，北卡罗来纳州莫里斯维尔27560，gateway centre大道3300号，用于此处所述的实验。作为研究invitro
‑
e480的一部分，在查尔斯河发现服务公司进行了体外扩增和pmel t细胞的deep
tm
il
‑
15装载。冷冻的cd8
+
t细胞解冻(d0)，以1.0
×
106/ml重悬在含有10％胎牛血清(fcs)，青霉素/链霉素(pen/strep)(1％)，l
‑
谷氨酰胺(1％)，胰岛素/转铁蛋白/硒(its，1％)和β
‑
巯基乙醇(bme，50μm)的洛斯维公园纪念研究所1640培养基(rpmi
‑
1640)中，并接种到包被αcd3和αcd28抗体的6孔组织培养板中(5
×
106个细胞/孔)。细胞在37℃和5％co2下孵育24小时。接种后24小时(d1)加入小鼠il
‑
2(20ng/ml)和小鼠il
‑
7(0.5ng/ml)。在d2和d3上，对细胞计数并用含有小鼠il
‑
21(25ng/ml)的新鲜培养基稀释至0.2
×
106个细胞/ml的浓度。在d4收集细胞并以100
×
106个pmel t细胞/ml重悬在载剂缓冲液中。
[0238]
deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞的制备
[0239]
pmel t细胞(100
×
106个细胞/ml)与等体积deep
tm
il
‑
15(1.5mg/ml)混合并在37℃旋转孵育1小时以产生deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞。通过离心(500g)洗涤deep
tm
il
‑
15引发的pmel细胞(3x，首先用培养基，然后用hbss洗涤两次)并计数。然后将所述细胞以25
×
106个细胞/ml重悬，将200μl细胞悬液(5
×
106个细胞)通过尾静脉注射到第5组和第7组的小鼠中。
[0240]
αpd
‑
l1抗体
[0241]
抗
‑
pd
‑
l1抗体购自bioxcell公司(克隆10f.9g2)，使用前避光储存在4℃。
[0242]
血液收集
[0243]
在实验的d3、d6和d20(分别于act后1、4和18天)，以下颌下出血的方式收集全部组别全部小鼠的活体血样(约0.1ml)。取自小鼠1
‑
5的样品进行无抗凝血剂的血清制备处理并冷冻。取自小鼠6
‑
10的样品收集在涂有edta的试管中并处理用于流式细胞术分析(仅d3和d6的样品，未显示)。
[0244]
deep
tm
il
‑
15引发的pmel细胞和抗
‑
pd
‑
l1组合在b16
‑
f10黑素瘤荷瘤小鼠中的评估
[0245]
设计实验以评估装载了deep
tm
il
‑
15的pmel细胞和检查点阻断(抗
‑
pd
‑
l1)组合的抗肿瘤活性。实验时间表显示在图3、图6和图9中，分别对应研究1、研究2和研究3。本文提供了研究2的详细方法，其与研究1和研究3的方法相似(除非在图3和图9中另有说明)。具体地，对于研究1，注射的细胞是10x106个而非5x106个(研究2)，且无单独pd
‑
l1，其对照组为生理盐水(该组不接受cpx)。在研究2中所有组都接受了cpx。在研究3中，使用的肿瘤(约200
‑
300mm3)大于研究1和研究2(接近30
‑
50mm3)。
[0246]
fc
‑
il
‑
15 elisa
[0247]
fc
‑
il
‑
15酶联免疫吸附试验(elisa)用于测定在d3、d6和d18收集的血清样品中il15
‑
fc的浓度。elisa板用山羊抗
‑
人igg fc捕获抗体(南方生物技术公司(southern biotech)；0.5μg/ml于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中)在4℃下包被过夜。然后用试剂稀释剂(1％牛血清白蛋白(bsa)于pbs中)洗涤板并在30℃封闭至少2小时。洗涤板，向孔中加入样品(在试剂稀释剂中1∶20稀释)和il15
‑
fc标准品(一式两份，在试剂稀释剂中31
‑
2000pg/ml)，并将板在37℃下孵育1小时。下一步洗涤板，然后加入生物素
‑
抗
‑
il
‑
15检测抗体(r&d系统公司(r&d systems)；0.125μg/ml于试剂稀释剂中)并在37℃孵育1小时。再洗涤板，用链霉亲和素
‑
hrp(南方生物技术公司；1/6000稀释于试剂稀释剂)在37℃孵育20分钟，再洗一次，然后添加3，3’，5，5
’‑
四甲基联苯胺(tmb)底物溶液(surmodics)，并在室温黑暗条件下孵育20分钟直到用1n hcl(j.t.baker)中止反应。然后在酶标仪(450nm)上读板。
[0248]
1∶20稀释中血液的定量下限(lloq)为0.31ng/ml。
[0249]
流式细胞术
[0250]
act后第7天，小鼠被安乐死处理，并通过流式细胞术检测瘤内pmel t细胞概况。肿瘤被解离成单细胞悬液，并用染色缓冲液(0.5％bsa，2mm edta于pbs中)洗涤。细胞沉淀重悬在包含下列染色抗体(1∶100稀释在染色缓冲液中)和计数珠(赛默飞世尔(thermo fisher)，沃尔瑟姆，马塞柱塞州)的主混合物中，并在室温下避光孵育30分钟。为了进行细胞内染色，细胞在染色缓冲液中洗涤3次，重悬在固定/透化溶液(赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific)，沃尔瑟姆，马塞柱塞州)中，并孵育过夜(4℃)。次日，离心样品，在透化缓冲液中洗涤3次，在针对胞内ki67标志物的抗体中室温下避光孵育30分钟，用透化缓冲液洗涤一次，然后在染色缓冲液中洗涤一次。然后细胞重悬在染色缓冲液中进行facs分析。
[0251]
在facscelesta(bd公司(becton
‑
dickinson)，新泽西州富兰克林湖市)上收集流式细胞术的数据并在flowjo v10中分析。
[0252][0253][0254]
结果
[0255]
如图2所示，il
‑
15增加了pmel t细胞上pd
‑
1的表达。然后设计并进行三个
t细胞亚群中检测到更高比例的ifn
‑
γpos pmel t细胞，这与活化表型一致。
[0265]
讨论
[0266]
在本研究中，我们评估了单剂量5
×
106个deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞单独或与pd
‑
l1阻断组合在b16
‑
f10荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性。对照组包括载剂和αpd
‑
l1单药治疗小鼠。αpd
‑
l1单独治疗与载剂相比没有延缓肿瘤生长。与载剂或αpd
‑
l1对照相比，采用deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞的过继细胞转移(act)产生了具有统计学显著性的肿瘤生长抑制和生存延长。与单独用药相比，deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞和αpd
‑
l1组合的抗肿瘤活性有统计学显著改善且增加了存活。重要的是，deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞act组合或不组合pd
‑
l1阻断均耐受良好，只与治疗开始前初始体重相比有轻微、短暂且毒理学上不相关的体重下降。与载剂或αpd
‑
l1治疗的小鼠相比，减少增重可能归因于降低的肿瘤生长。最后，向deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞添加αpd
‑
l1阻断抗体不增加全身il15
‑
fc水平。总之，这些发现表明deep
tm
il
‑
15引发的t细胞act和pd
‑
l1阻断的组合增强了小鼠中的抗肿瘤效力，而没有引起主要毒性。
[0267]
总之，组合deep
tm
il
‑
15引发的t细胞act和pd
‑
l1阻断增强了小鼠中的抗肿瘤效力且未引发主要毒性。相比于载剂对照或单药αpd
‑
l1，利用deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞治疗导致统计学显著的肿瘤生长抑制且改善存活，包括3/10 cr但无tfs。相比于载剂对照或单药，deep
tm
il
‑
15引发的t细胞act和pd
‑
l1阻断的组合引起了统计学显著的肿瘤生长抑制改进。与两种单药相比，deep
tm
il
‑
15引发的t细胞act和pd
‑
l1阻断的组合改善了中位生存期，在研究终止时(d76)导致10/10 cr和6/10tfs。所有治疗组都耐受良好。deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞act组合或不组合pd
‑
l1阻断均只伴随有与治疗开始前初始体重相比微小、短暂且毒理学上不相关的体重下降。与载剂或αpd
‑
l1治疗小鼠相比，deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞act单独或组合αpd
‑
l1导致增重减少。该观测可能归因于肿瘤生长降低。向deep
tm
il
‑
15引发的pmel t细胞疗法中添加αpd
‑
l1不影响il15
‑
fc的全身暴露。
[0268]
实施例3：deep
tm
il
‑
12组合检查点抑制剂增强抗肿瘤耐久性
[0269]
评估表面系连的il
‑
12增强免疫检查点抑制的抗肿瘤响应的能力。根据pct国际公开号wo 2019/010219和wo 2019/010222，均通过引用全文纳入本文，构建il
‑
12系连融合体(il
‑
12 tf；chm1fab
‑
il
‑
12)使得il
‑
12能够系连到pmel t细胞上。
[0270]
为了评估组合增强抗肿瘤效力的能力，所述组合包含系连了il
‑
12 tf的肿瘤特异性细胞疗法和检查点抑制剂，使用pmel/b16
‑
f10 t细胞治疗癌症模型评估肿瘤生长抑制和肿瘤微环境效应。简而言之，用400,000个b16
‑
f10黑色素瘤细胞皮内接种c57bl/6j小鼠。从pmel
‑
1小鼠中分离出cd8 t细胞，其在b16
‑
f10黑色素瘤细胞中表达对小鼠gp100抗原具有特异性的t细胞受体。使用针对小鼠cd3和cd28受体的抗体活化小鼠cd8t细胞两天，然后在存在il
‑
21条件下扩增两天。简而言之，将分离的cd8t细胞在先前已包被抗小鼠cd3和cd28受体抗体的nunc highbind板中的完全培养基(含rpmi 1640、10％fbs、胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒、青霉素/链霉素和50umβ
‑
巯基乙醇)中孵育；并且cd3和cd28抗体的包被浓度分别为0.5ug/ml和5ug/ml。在抗体包被的板上孵育约24小时后，分别添加il
‑
2和il
‑
7至终浓度为20ng/ml和0.5ng/ml。孵育第二天后，从抗体包被的板中回收细胞，并在含有终浓度为20ng/ml的il
‑
21的培养基中稀释至约200,000个细胞/ml的密度。在il
‑
21中扩增一天后，将细胞在含有终浓度为20ng/ml的il
‑
21的培养基中再次稀释至约20000个细胞/ml的密度。然后回
收细胞，洗涤，并与浓度为125nm的il
‑
12 tf(chm1fab
‑
scil
‑
12p70)在37c孵育30分钟，然后再洗涤3次以去除未结合的il
‑
12 tf。细胞在hbss中重悬并通过尾静脉注射过继转移(5x106个细胞/每只小鼠)到b16
‑
f10荷瘤小鼠中。作为对照，还单独用hbss或pmel t细胞治疗小鼠。在过继细胞转移的前一天，用4mg环磷酰胺治疗荷瘤小鼠。抗
‑
pd
‑
l1抗体(克隆10f.9g2)以每剂200ug的剂量每周两次腹膜内给予，持续六周。在第一剂细胞之后的14和28天，给予第二和第三剂系连了il
‑
12 tf的pmel t细胞。这些第二和第三剂是在没有环磷酰胺治疗的情况下给予的(即，环磷酰胺仅在第一剂细胞之前被包括在内)。pct国际公开号wo 2019/010219证明，与单剂t细胞相比，多剂量的装载有il
‑
12 tf的肿瘤特异性t细胞改善了抗肿瘤生存，但多剂量的单独肿瘤特异性t细胞却没有。因此，本研究仅对装载il
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12 tf的t细胞进行了多剂量评估。
[0271]
图11中的生存分析证明，与单独pmel t细胞相比，il
‑
12 tf增强了抗肿瘤活性，多剂量的系连il
‑
12 tf的pmel t细胞进一步改善了抗肿瘤效力。在每种情况下
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与单剂量或多剂量的系连il
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12 tf的pmel t细胞组合
‑
与抗
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pd
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l1检查点抑制剂组合进一步改善了抗肿瘤效力。其特征为中位生存期的改善和持久长期存活者的增加。
[0272]
为了评估所述组合免疫疗法在肿瘤微环境中的效果，进行了单独的研究以评估在组合免疫治疗后肿瘤内的炎症生物标志物。ifng是il
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12产生的关键细胞因子，介导il
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12的许多促炎效果。小鼠接受上述系连il
‑
12tf(chm1fab
‑
scil
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12)的pmel t细胞和pmel t细胞的治疗，然后在治疗后的第七天处死并用elisa或luminex分析肿瘤内ifng和pd
‑
l1的表达。采用单向方差分析和后续的tukey事后检验评估统计学显著性，将所有样品相互比较。与单独pmel t细胞相比，系连il
‑
12 tf的pmel t细胞增强了ifng产生，并通过将il
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12 tf和抗
‑
pd
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l1组合进一步增强了ifng产生(图12)。当仅与peml t细胞组合时，抗
‑
pd
‑
l1治疗并没有增强ifng产生(图12)。不希望囿于理论，据信所述组合至少部分地通过增强肿瘤中il
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12 tf的促炎效果出乎意料地增强了抗肿瘤效力。这些效果伴有肿瘤中pd
‑
l1表观浓度的减少。不希望囿于理论，进一步据信所述抗
‑
pd
‑
l1抗体可以与elisa试验中的抗体结合到pd
‑
l1蛋白上的相同表位。我们将其解释为认为抗
‑
pd
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l1抗体正在降低肿瘤中pd
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l1的生物可利用浓度。
[0273]
修改
[0274]
对本公开所述方法和组合物的改进和变动对本领域技术人员是显而易见的，而不偏离本公开的范围和精神。虽然已结合具体的优选实施方案对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方案。实际上，本公开所属领域的相关领域的技术人员意图和理解对所描述的用于实施本公开的方式的各种修改，这些修改落入由所附权利要求所表示的本公开的范围内。
[0275]
通过引用纳入
[0276]
本说明书中提到的所有专利和公开通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的专利或公开专门和单独地通过引用纳入本文那样。