本发明涉及一种用于检测和/或跟踪和/或表征生物膜形成的方法。本发明还涉及适用于实施上述方法的用于检测和/或表征生物膜的形成的装置。本发明特别适用于分析领域、生物学和酶学研究、制药领域和/或医学领域。在下面的描述中，方括号([])中的引用是指在文本末尾给出的参考文献列表。
背景技术：
生物膜是细菌的主要生存方式，是自然环境中90％的细菌的首选生存形式。和以浮游生活方式生活在悬液中的细菌不同，生物膜形成了一个不均一的和复杂的细菌群落，它们通过由蛋白质、糖和水组成的细胞外基质分泌物相互结合，并附着在某个表面。形成生物膜是大量细菌的共同特征。因此，微生物学界承认，生物膜生活方式是细菌生命的一个完整阶段。浮游生活方式仅是向生物膜(生活方式)的过渡。与许多现存物种一样，集体是它们生存的必要条件。这种形式的群落生活给细菌带来了显著的代谢益处。生物膜在自然或人工表面的粘附能力很高，对各种应力的抵抗能力使其难以去除。生物膜确实对化学品(例如抗生素)和机械应力(例如流体)有很好的抵抗能力。生物膜增强的抵抗力使得它们无处不在。尽管生物膜可在诸如生物修复或化合物合成等创新工艺中使用，但是已证明生物膜在细菌污染被禁止的各种场合，诸如医药环境、食品工业和某些人类环境中确实令人讨厌。在法国，生物膜导致50％至60％的医院感染(Bryers，2008)和40％的食物中毒。研究表明，到2050年，死于顽固感染的人数可能会超过死于癌症的人数(O’Neill，2014)。此外，许多行业也遭受生物膜的阻力。船体上存在的厚厚的生物膜增加了水上的摩擦力，导致35～50％的燃料过度消耗(Schultz等人，2011)。这几个数字证明，生物膜的研究具有相当大的社会经济利益。具体地，研究医院环境的生物膜是必不可少的，因为，医院环境中生物膜的去除困难是一个公共卫生问题。生物膜阻挡物(biofilmsstems)的抵抗力在很大程度上源于细胞外基质分泌物提供的机械完整性。这种材料提供了细菌之间的粘结力和对表面的附着力。生物膜中受胞外聚合物(EPS)保护的细菌即使经过净化程序仍能存活，并成为人类和动物的传染源。此外，生物膜基质的粘弹性允许生物膜适应其自然环境引起的剪切应力。基质作为一种保护细菌的手段，使它们获得对环境的强大抵抗力。此外，对生物膜的研究使我们能够确定生物膜是如何发展、变化和脱落的。因此，有必要研究它们的结构和脱离现象，以便控制它们的发展。生物膜结构的知识使得预测其对某些系统的影响成为可能。确定生物膜机械特性的好处之一是能够预测和控制传播感染的细菌的形成、积累和传播。对生物膜的第一次观察可以追溯到17世纪，但是关于生物膜的研究仍然相对较晚(35年)，其定义是由Costerton等人(1978)提出的。长期以来，细菌以其游离的、孤立的和浮游的形式被研究。然而，根据生存的原则，细菌依附在固相支撑体上，分泌粘性物质形成生物膜。生物膜由彼此粘附的细菌群落组成，并通过聚合物基质的分泌而粘附到基材上。在90年代末，有关生物膜的出版物数量出现了指数增长。生物体的生物膜行为越来越受到重视，具体是在卫生领域，生物膜在许多表面形成，如导管、瓣膜、修复体、牙齿、皮肤甚至粘膜等。生物膜的形成是一个动态的非静态过程，分几个步骤进行，详述如下：·可逆粘附：悬浮在液体中，细菌通过物理化学吸引力(如范德华力)接近表面并可逆地粘附在其上。布朗搅动、重力或液体的搅动有利于这种对表面的接近。有些微生物拥有自己的推进方式，这使它们具有运动性。这些推进方式由位于细菌外壳上的蛋白质结构(鞭毛、菌毛)组成，使细菌能够独立运动；·不可逆粘附：细菌通过细胞分裂繁殖并继续与表面粘附。此外，粘附细菌的基因表达谱的改变导致细菌表面结构的合成和细胞外多糖的分泌，这些多糖不可逆地将细菌相互粘附并粘附到该表面；·微菌落的形成：生物膜有机体的生长和新细菌粘附在生物膜上，形成微菌落；成熟：微菌落发育，生物膜根据环境条件在三个维度上构建。通道使富含营养的流体循环出现穿过微菌落；脱离：特定的游离细胞或生物膜聚集体的释放可在另一表面定植，开始新的循环(Davies和Marques，2009)。分散的细菌易于形成微菌落(Kragh等，2016)。生物膜主要由嵌入微生物分泌的(上述)EPS基质中的微生物组成。微生物占生物膜干重的10％(Flemming和Wingender，2010)。以此类推，弗莱明等人(2007)将生物膜视为生活在房屋中的微生物的城市，以细胞外基质为代表，使它们免受物理和化学环境的影响。生物膜高度水合，因为90-99％的生物膜由水组成。生物膜的其余部分由生物大分子组成。这些化合物包括多糖、蛋白质、细胞外DNA(eDNA)和RNA。基质或EPS化合物占干重的90％。基质作为细菌的粘合剂，EPS化合物在生物膜的发育和寿命中发挥重要作用(Das等，2013)。根据它们的来源菌株、营养方面的生长条件和物理和化学应力不同，细胞外基质产生的速率及其组成是不同的。因此，生物膜中包括的每种元素的比例由一定数量的因素决定，包括营养物的类型、水动力条件和温度。在显微镜下对生物膜切片的观察表明，生物膜的组成是高度非均一的的(Lawrence等，1991)。细菌菌落被通过循环流体的通道穿过，确保营养供应。生物膜的行为是由非常复杂和动态的微观结构驱动的。生物膜中的细菌发展出浮游细菌所没有的特性。群体感应允许细菌进行交流和组织协作。这种合作的另一个特点是水平基因转移(Madsen等，2012)。与浮游生物类似物相比，生物膜中的细菌对抗微生物剂的抵抗力更强。虽然在1990年代对抗生物膜剂的耐受性归因于扩散问题，但后来发现其他现象是导致对抗感染剂耐受性的原因。例如，细菌的适应和分化能力使它们能够朝着保存的方向进化。一般来说，生物膜更耐清洁，无论是化学的还是机械的。此外，频繁和反复接触抗生素可能会导致多重耐药菌的现象，这意味着抗生素治疗不再对它们产生作用。所有这些特征意味着生物膜存在于所有可耐受的环境中，并且通过细菌的释放成为传染源。在食品工业中，它们存在于生物反应器中，用于生产酒精、酸或多糖。在纺织工业中，生物膜被研究用于制造尼龙。另一方面，它们可用于替代某些牛仔服装的机械抛光(喷砂等)。此外，对生物膜的研究越来越多，而且往往处在多个学科结合处。由于其多尺度和多物理性质，从机械角度研究生物膜是复杂的。然而，它代表了一个真正的科学问题。文献中报道的生物膜机械研究结果仍然不明确。很少有协议是标准化的，研究团队开发的多种测试模型使得对照结果变得困难。因此，确实需要找到克服现有技术的这些缺陷、缺点和障碍的手段和/或方法，具体是一种允许对生物膜机械性能进行可再现和可对照研究的方法。寻找专门表征生物膜的要素也很有意义。在近期或未来的研究课题中，我们可以列举以下问题：定位生物膜内的细菌，量化流量，可视化生物膜内部，以及理解多物种生物膜内的相互作用。细菌形成生物膜的能力对于发展对抗生物膜或积极利用生物膜的策略是有意义的，例如在生物修复应用中。防止生物膜形成是健康领域的一个主要问题。目前，一旦生物膜形成，通常剂量的杀生物物质对于细菌感染通常是无效的。因此，体外检测生物膜的形成是至关重要的，特别是对于发展预防性治疗。已经提出了许多分析生物膜形成的方案(Azeredo等人，2017)。然而，它们的可变性和数量尤其导致无法对比所获得的结果和/或无法获得结果的一致性。因此，存在寻找克服这些现有技术中的不足、缺点和障碍的手段和/或方法的切实需要，尤其是快速并可靠的生物膜形成的标准方法。有一些方法可以用来尝试表征生物膜。例如，可以提及以下方法：固体培养基上的微生物计数：菌落形成单位(CFU)的计数允许对固体培养基上微生物培养物中的微生物进行计数。该做法仅限于在琼脂板上生长的细菌。这种方法也非常耗时。微量滴定板(组织培养板)：在这种方法中，没有流动循环并且在封闭培养基中生长。在染料的帮助下，孔中存在的生物数量变得可见。从孔的光密度中读取与生物膜量相关的染色程度。结果分为三类：非生物膜形成接种物、中度接种物或强生物膜形成接种物。这种方法是间接的。然而，缺乏标准化规程和缺乏可重复性是这种方法的显著缺点。MBECTM系统(Calgary设备)：MBECTM(最小生物膜根除浓度)系统是一类系统的一部分，该系统允许生产可重复的生物膜，用于几种不同浓度的杀生物剂的简单和同时评估。使用微量滴定板的方法，开发了Calgary模型以避免由于细菌沉淀引起的偏差(Ceri等人，1999；Harrison等人，2010)。Calgary设备由一个两部分的容器组成。下部由96孔微孔板组成。上部是一个由尖刺组成的盖子，尖刺与上述孔的中心重合，并和上述孔板的每个孔配合。生物膜在尖刺上形成。该装置用于表征生物膜形成并评估对抗微生物剂的敏感性(Melchior等人，2007；Arias-Moliz等人，2010)。动态底流模型是开放型培养基的方法，也就是说，有持续的营养供应。水力的流动影响生物膜的形成。流动的类型以及流动产生的剪切应力对生物膜的粘附强度有影响。因此，这些要素限制了结果的再现性，也限制了生物膜像在自然界中那样的再现性。Robbins装置：它由一系列插入细菌培养基循环室中的试样组成(Kharazmi等，1999，图1.3)。可以在不扰乱流动的情况下以无菌方式移除(和更换)试样，以进行研究(Coenye等，2008)。该模型具体用于导管材料的研究(Nickel等，1985)。然而，这个过程涉及生物膜的破坏，并且不允许对其进行机械研究。浸渍反应器：该设备模拟低剪切应力的环境。它适用用于医疗环境(导管、肺病、口腔-牙齿生物膜)中的应用。它只能在气液界面形成和研究生物膜。微发酵器：市面上有多种类型的微发酵器提供和出售：·疾病控制中心(CDC)生物膜反应器(CBR)：该反应器由一个不断补充营养的圆柱状容器组成，其中放置了塑料管。这些管具有专用于放置将被生物膜定殖的试样的位置。玻璃容器放置在磁力搅拌器上，以产生流体的循环搅拌。旋转产生的流动是可调的，因此它可以是层流或湍流。这种搅拌会产生中等至高等强度的恒定剪切应力。一旦表面被生物膜定殖，就移除试样。该反应器允许以各种菌株可重复形成生物膜样品(Goeres等，2005)；·转盘生物膜反应器：在该系统中，试样放置在圆柱状玻璃容器的底部。旋转放置试样的平台，同时细菌培养基在容器内通过循环而再生。平台旋转产生的剪应力中等偏强。但是，它仍然低于CDC；·旋转环形反应器：在这种配置中，·反应器由两个同心圆柱体组成，其中一个是旋转的。样品是附着在旋转圆柱体上的叶片。流通池：上述动态模型的主要缺点是难以实时跟踪生物膜的形成。流动室是透明腔室，细菌培养基在其中循环。用于腔室的材料适用于通过显微镜进行可视化，并允许观察生物膜的发展。然而，它的实现需要很高的技术性。流体形成的气泡的成核是一个重要的问题。此外，在流动室中不太适合高通量的观察，因为同时分析的样本相对较少。微流体平台：开发这些高度集成甚至自动化的设备，能够在受控环境中从水文和化学方面观察细菌的行为。小通道系统将生长液分配到生物膜形成区域。这类模型涉及分析数量非常有限。这些方法很少被实践，因为它们很昂贵，不能很好地重复使用并且需要很好的技术。因此，很少有出版物报告使用微流体平台，因而，也几乎没有反馈。因此，确实需要找到克服以上方法的不足、缺点和障碍的手段和/或方法。还确实需要找到克服现有技术的这些缺陷、缺点和障碍的手段和/或方法，特别是可以不考虑细菌培养条件而实施并且快速的方法。生物膜环测试(BioFilmRing简称BRT)基于微孔板设备，由BioFilmControl开发，可以高产地评估微生物形成生物膜的能力。它不需要对样品进行染色，也不需要任何洗涤，从而限制了生物膜的劣化。BRT应用见于微生物学和制药行业。该测试在对应于不同应用的几种衍生物中可用：抗菌剂和预防性、治疗性抗生素的高通量筛选，抗生物膜被膜剂的表征，酶活性对生物膜形成、降解影响的研究。BRT在筛选抗生素分子方面的应用称为抗生物膜组(Antibiofilm)。该测试可确定MICb(生物膜的最低抑制浓度)，从而可以从对浮游细菌(MIC)有效的抗生素中进行选择，这些抗生素对生物膜的形成也具有预防活性。然而，这种方法不能确定生物膜形成的动力学，例如连续地、没有时间偏差地。此外，这种方法不允许对生物膜的机械特能进行具体表征。以生物膜形式生活的细菌的代谢与由细菌群落和基质组成的材料的机械特性之间存在内在联系。控制生物膜存在的有效策略的发展，或基于生物膜使用的生物技术过程的发展，需要了解生物膜生活方式中固有的机制以及描述生物膜在其环境中的行为的机械参数的知识。在这种情况下，出现了许多测试方法来评估这些参数。它们由用于测试和识别常规工程材料或惰性流体参数的方法改良而来。然而，无论是在机械测试领域还是在识别用于表征生物材料的机械参数的方法领域，都缺乏标准化，这仍然是一个科学障碍。由于生物膜是活的结构，因此对标准化的追求是有困难的。这一特性导致了机械性能研究的复杂性。这些在空间和时间上是异质的。事实上，由于它们的组成，生物膜是复合材料。此外，细菌能够根据它们所承受的压力动态调节机械性能。目前，生物膜的机械性能尚不明确。鉴于生物膜测试的各种方式缺乏标准化，文献中报告的参数难以解释和比较。标准化协议的定义似乎对于创建跨学科社区至关重要。生物膜的时空异质性代表了一个真正的科学问题，但与此类材料的生命性质相关的问题是真正的问题。活体材料是脆弱的样品，应小心处理。活体样本的体外测试可能会导致重排，从而使结果产生偏差。另一方面，与惰性的普通工程材料相比，人们应该期待结果的更大可变性。说到生物膜，其生理条件通常需要使用非侵入性成像方法，但可能难以实现样品几何形状的精确表征。此外，现场测量表面平整度的通常要求和平面外位移的控制代表了这些材料特有的限制。因此，确实需要找到克服现有技术的这些缺陷、缺点和障碍的手段和/或方法，具体是能够获得可靠的、可再现的、可比较的结果并且还减少获得上述结果成本和时间。技术实现要素：本发明通过提供一种用于检测和/或跟踪和/或表征生物膜形成的方法，使得解决现有技术方法的问题和缺点成为可能。所述方法包括以下步骤：a)将包括至少一种微生物和多个粒子的溶液保持在允许所述至少一种微生物形成生物膜的条件下，对所述溶液进行时序的观察；b)在各种观察期间通过对研究的粒子位移的比较统计分析，检测生物膜的存在和/或表征生物膜形成动力学；发明人惊奇地证明，本发明的方法能够实时地观察生物膜的形成，而不改变生物膜，并且有利地能够以连续的而无时间偏差方式确定生物膜形成的动力学。生物膜是伴随着一种材料的发展而形成的，该材料的三维结构可能由细菌在聚合物基质中的缠结组成，聚合物基质的机械行为显示为粘弹性。有利地，本发明的方法是非破坏性方法，有利地，具体通过分析其材料特性，能够确定生物膜状态随时间的变化。有利地，本发明的方法使得研究和确定生物膜的细胞外基质的机械特性成为可能。有利地，发明人证明了本发明的方法有利地允许研究和确定生物膜的机械性能，具体是生物膜细胞外基质的机械性能，具体地通过将粒子和/或微珠加入培养基(具体是细菌培养基)中，具体第通过记录它们的位移，例如用光学装置，例如，在显微镜下观察。有利地，发明人已经证明了这种过程的结果是动态的和局部的，例如通过观察和/或拍摄的每个微珠/粒子的位移的运动学。有利地，发明人利用生物膜中微珠/粒子的位移来表征其发展。在本文中，矢量或位移分别表示为或n是指定矢量的一个示例。根据本发明，“时序的观察(temporalsuccessionofobservations)”指的是随着时间的至少两个观察。具体而言，应当理解为，当溶液保持在允许所述至少一种微生物形成生物膜的条件下时，进行至少两个观察步骤。例如，该方法可包括1至1000个观察步骤，例如1至100个观察步骤，在此期间将溶液保持在允许所述至少一种微生物形成生物膜的条件下。根据本发明，可以以规则的时间间隔执行观察步骤。例如，观察步骤可以以1至10分钟、2至8分钟、3至6分钟或等于5分钟的时间间隔进行。换句话说，可以以规则的时间间隔进行时间上的连续观察。例如，观察步骤可以以1至10分钟、2至8分钟、3至6分钟或等于5分钟的时间间隔进行。根据本发明，该观察可以以本领域技术人员已知的任何合适的方式进行。例如，可以是光学装置，例如显微镜，例如配备有40倍透镜的OlympusCKX53倒置光学显微镜、照相机、扫描仪，照相机，例如PCOEdge型或BaslerAce型照相机。根据本发明，观察可以包括至少两个溶液图像的拾取。例如，这可以是包括拍摄至少两个图像的观察。例如，这也可以是包括一系列图像拾取的观察，例如从2到100,000个图像、从2到50,000个图像、例如从2到300个图像。根据本发明，观察期间两个连续图像之间的时间间隔可以指定为Δt。目前，时间间隔Δt必须>0。根据本发明，每个观察包括，对于在所述观察期间观察到的一组粒子中的每个粒子，由所述粒子在所述观察期间做出的连续位移的轨迹的确定。换句话说，根据本发明，例如，观察值oi可以通过沿着一系列N+1副图像确定N个粒子/珠子的轨迹来获得。图像例如，N大于或等于1，例如范围从1到3000，例如范围从1000到3000。例如，N可以是1≤N，最好是1000≤N+1≤3000。根据本发明，溶液的观察可以在给定的时间内进行。例如，观察可以进行0.01毫秒至15秒的时间和/或持续时间，例如0.1毫秒至10秒。根据本发明，可以通过以本领域技术人员已知的任何合适的频率拍摄图像来进行观察。这可以包括以每秒1至1000幅图像的频率拍摄图像，例如每秒100至300幅图像，例如每秒200幅图像。根据本发明，图像可以是数字图像。在本文件中，数字图像是指本领域技术人员已知的任何数字图像。例如，它可以是由二维正交网格形成的数字图像。这个网格的最小组成实体称为像素(“像素，pictureelement”)。因此，数字图像可以是由它们的坐标和灰度级量化的像素矩阵。像素值的大小取决于图像编码的位数。如果图像被编码成N位，一个像素可以被量化成2N种不同的灰度。例如，可为16位编码图像，代表65536个不同灰度值。这种在空间和灰度深度上的信息采样定义了图像的动态。将观察到的材料的连续信号线性转换成由像素矩阵构成的采样信号可能需要一些预防措施(precautions)。优选地，为了能够应用DIC，观察表面在观察期间可以是并且保持平坦的，以便有利地不在图像中引入尺度差异。优选地，照明可以是恒定的，并且图像的动态根据需要的测量调整。DIC的目标是找到对应于初始状态(t＝0)和变形状态(t)之间的表面元素的真实位移ūt的测量位移ū。移ū的计算可以在材料表面的限定部分的每个像素中进行。这一部分通常用其首字母缩写RoI表示(称为兴趣区RegionofInterest)。选择进行计算的图像区域，一方面可以有利地避免在机械测试期间易于消失的图像边缘像素，另一方面，留出与机械信息无关区域。根据本发明，轨迹可以通过本领域技术人员已知的任何过程和/或方法来确定。例如，它可以是粒子的轨迹，例如是粒子例如在观察期间所做的所有连续位移。根据本发明，轨迹，例如珠子的轨迹，可以指的是所有被占据的连续位置，例如在一系列图像期间被珠子的中心占据的位置，可以是连续的。根据本发明，轨迹可以不是二维的，在例如时间t＝0时以珠子为中心的正交参考系中，位置可以由直角坐标系中坐标x(t)和y(t)给出。换句话说，根据本发明，轨迹，例如粒子的轨迹，可以指的是所有被占据的连续位置，例如在一系列图像期间粒子的中心占据的位置，可以是连续的。根据本发明，轨迹可以是至少二维的，例如二维或三维的。例如，当轨迹为二维时，位置可由在正交参考系中(例如以粒子为中心)的直角坐标x(t)和y(t)给出。根据本发明，通过观察，例如观察Oi，可以观察和/或表示第n个粒子的一组轨迹。例如，可以观察到例如存在于样品和/或溶液中的第n个粒子，n大于1，例如范围从1到350，例如范围从150到350。例如，n可以是1≤n，优选地150≤n≤350个粒子。换言之，每个观察可以包括一组n个粒子的n个轨迹，例如n大于1，例如其范围从1到350，例如其范围从150到350。例如，n可以是1≤n，优选地样品和/或溶液中存在150≤n≤350个粒子。根据本发明，观察Oi可以表示时间为Ti时的例如第n个粒子的一组轨迹，其中Ti对应于样本年龄(Ti≥0)，n例如大于或等于1，例如范围从1到350，例如范围从150到350。根据本发明，运动矢量意味着，例如，根据公式[(x(t+Δt)-x(t),(y(t+Δt)-y(t))]的分量矢量，0≤t≤NΔt。根据本发明，粒子的位置，例如在观察期间，可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定。例如，可以通过识别粒子上的任何点，例如通过识别所述粒子的圆周和/或外围或所述粒子的中心来确定粒子的位置。根据本发明，用于检测和/或跟踪和/或表征生物膜形成的方法可以包括，例如以下步骤：a.将至少一种微生物引入溶液中，b.将至少两个粒子引入在(a)所获得的溶液中，c.在时间(t1)时，对(b)所获得的溶液进行观察O1，d.将(c)所获得的溶液保持在允许所述至少一种微生物形成生物膜的条件下，e.在时间(t2)，对(d)所获得的溶液的进行观察O2，f.比较观察O1和O2，g.通过比较在观察O1和O2期间观察到的粒子的轨迹来确定生物膜的存在和/或表征该生物膜，根据本发明，用于检测和/或跟踪和/或表征生物膜形成的方法可以包括，例如以下步骤：a.将至少一种微生物引入溶液中，b.将至少两个粒子引入在(a)所获得的溶液中，c.在时间(T1)时，对(b)所获得的溶液进行观察O1，d.将(c)所获得的溶液保持在允许所述至少一种微生物形成生物膜的条件下，e.在时间(T2)，对(d)所获得的溶液的进行观察O2，f.通过比较观察O1和O2确定生物膜的存在和/或表征生物膜。根据本发明，粒子的检测(具体是在图像上，例如数字图像上)可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行。例如，它可以是一种用于将图像与至少一个参考图像(imagev)进行比较的方法。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定参考图像(imagev)。例如，可以是包括以下步骤的过程：-识别图像上粒子的中心，例如在某兴趣区，-选择与以所述粒子为中心的正方形相对应的粒子图像区域(imageb)，以及-根据以下公式获得参考图像(imagev)：其中imagetteb是珠子周围区域的原始图像，imagebT是imageb的转置，imagebRh是imagetteb的水平对称，imagebRv是imagetteb的垂直对称。根据本发明，imagetteb的转置可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来实施。例如，对于Mn，p的矩阵A＝(ai，j)，A的转置记为AT是具有p行和n列通项bk，l的矩阵，通项bk，l定义为：根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来实现图像的垂直对称。例如，对于Mn，p的矩阵A＝(ai，j)，A的水平对称记为ARh，ARh是具有n行p列的通项bk，l的矩阵，通项bk，l定义为：bk，l＝al，k。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来实现图像的垂直对称。例如，对于对于Mn，p的矩阵A＝(ai，j)，A的水平对称记为ARv，ARv是具有n行p列的通项bk，l的矩阵，通项bk，l定义为：bk，l＝an-k+1，l。根据本发明，粒子位移的比较统计分析可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行。根据本发明，粒子位移的比较统计分析可以具体包括一个比较观察的步骤。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的图像比较方法来实施该比较步骤。例如，它可以是一种对照图像(comparingimages)的方法，例如对于一种灰度图像，包括一个灰度等级的集合、一个灰度等级的分布，或者例如对于一种灰度图像，一种比较包括颜色等级集合的图像的方法。例如，它可以是一种图像比较(imagecomparison)方法，例如一种数字图像比较方法，例如灰度等级的数字图像。例如，图像比较步骤，具体可以是数字的(DIC)，例如，基于在连续时刻之间、相同表面的两个图像的灰度等级守恒原理的。例如，用于DIC的图像可能对应于研究对象的完整和扭曲的表面。它们可以由二维函数f和g表示。该比较可以基于参考图像和失真状态的图像之间的信号幅度的比较。函数f和g可以表示插入到像素的灰度等级，像素的位置由其坐标(x，y)标识。要转换的问题在于确定即在表面元素ROI的中心处寻找的运动场。在X变换期间，参考图像f中的点在失真图像g中的中移动。对于属于ROI、坐标为的任何点，两个时刻之间的灰度等级守恒定律可以写成：有利地，例如当在两个图像f和g之间存在灰度等级的外部干扰时，例如由光照差异或传感器噪声引起的干扰，可以引入f和g之间的距离。然后可以将该距离最小化。例如，可以比较在某区域上，这里是1D，参考图像和失真状态的图像之间信号幅度。就目前而言，确定位移是一个棘手的问题。例如，可以通过添加关于逆问题的解的先验信息对其进行正则化。例如，它可以是运动学正则化。例如，定义了位移所属的运动学基础。在实际中，可以通过一组简单的变换来处理位移。位移场可以先验分解，基于N个任意选择的形式函数，记为Φi，其中i＝1，…，N。_i是形成描述运动场的基础的形式函数其中，Φi是与形式函数Φi相关的自由度。空间正则化，通过选择区域的大小，也可以使用运动学的支持。近似变换的最佳系数的确定可能需要最小化f和g之间的距离。该距离可以以成本函数的形式形式化。可以使用各种函数，如2010年Pan等人所述。例如，这可以是其是通过最小化灰度方差来寻求灰度守恒的标准：这个函数是非线性的。假设这些是小位移，它可以通过执行一阶泰勒展开来线性化。之前的方程则变为：通过将以其线性组合形式注入近似子空间，该系统可以置于矩阵形式中[Mij]e[δi]＝[bi]其中M和b项是已知数据，它们取决于参考图像的梯度，以及初始图像和“后变形”图像之间的残差。“.”对应于两个矢量之间的欧几里得标量积。可以通过高斯-牛顿算法更新位移增量来迭代地执行正则化。位移增量可通过求解线性化系统方程获得。Δδit＝M-1b求解该系统使得能够在找到δ时找到Δδit并计算兴趣区(RoI)元素上的运动场。δit+1＝δit+Δδit+1高斯-牛顿算法可以运行直到达到停止标准(Δδit≤10-5)，例如当：有利地，图像可以被离散化并且因此对于最近的像素是已知的。实际上，计算出的位移采用N2中的值。为了实现子像素精度，可以在非整数坐标处执行灰度等级的插值，例如双三次(bi-cubic)或“样条(spline)”插值。根据本发明，该方法可以包括，当比较观察时，确定粒子的可能轨迹的统计分布和/或粒子的可能轨迹的几何形状。根据本发明，该方法可以包括，当比较观察时，通过粒子独立地确定每个粒子的可能轨迹的统计分布和现有的每个粒子的可能轨迹的几何形状。根据本发明，该方法还可以包括对每次观察期间观察到的粒子所产生的位移进行的全局统计分析和/或基于全局统计分析的结果的生物膜形成的特征时间的计算。在本文中，全局统计分析是指本领域技术人员已知的适用于位移分析的任何统计分析，例如粒子的。这可以是例如分布分析，例如基于方差，例如sobol指数，分布方差分析，对代表位移分布的统计定律类型的假设的检验。根据本发明，全局统计分析可以包括计算由所述多个粒子中的粒子分别产生的位移分布的至少一个统计参数的值和对所述至少一个由连续观察获得的统计参数的值的时间函数的变化进行分析。根据本发明，所述位移分布的至少一个统计参数可以是本领域技术人员已知的任何统计参数。例如，它可以是统计时刻对位移分布和/或轨迹的标准偏差的确定。例如，位移分布标准差的确定可以根据以下公式建立：其中P是粒子运动矢量，m＝长度(P)，在本申请中，粒子的运动矢量可以对应于连接粒子的先前位置和新位置的矢量，即最终位置矢量减去初始位置矢量。换言之，矢量在本文中也可被称为轨迹。本文中，可以在每次观察期间确定每个粒子的运动矢量和/或轨迹，例如通过测定在所述观察期间获得的每个图像上的粒子的位置。根据本发明，全局统计分析可以包括根据以下公式计算均方位移(MSD)：MSD(Δt)＝Δr2，其中Δr是粒子的径向位移，Δt是时间间隔。本文中，时间间隔Δt可以对应于两幅图像之间的时间间隔。目前，当观察包括多幅数字图像时，矢量的坐标可以用像素来表示。换言之，根据本发明，该方法可以包括确定所有粒子的统计分布。此外，根据本发明，该方法可以包括确定所有粒子的轨迹的几何形状。根据本发明，轨迹几何形状的确定可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来进行。有利地，位移和/或轨迹的标准偏差值的变化，优选地作为时间的函数，例如观察时间Тi，可使得表征随后的生物膜成为可能。有利地，发明人证实，当产生生物膜时，由粒子产生的位移分布的标准偏差值随时间变化。具体地，本发明人出乎意料地证实，当产生生物膜时，位移分布的标准偏差值随时间增加至最大值，然后降低，而在没有生物膜产生的情况下，一旦位移分布的标准偏差达到最大值，它不会随时间变化。有利地，本发明人还出乎意料地证实，可以有利地模拟在生物膜形成期间，受粒子影响位移的分布的标准偏差值随时间的变化，使得可以确定分布的标准偏差值的增长和/或下降的时间，和/或可以确定作为时间函数的位移分布的标准偏差值的变化所表示的曲线的斜率。发明人还证明了作为时间函数的位移分布的标准偏差值的变化所表示的曲线的斜率，其对应于培养基和/或溶液中的粒子“行为”的变化。根据本发明，该方法可一步包括对在每次观察中观察到的每个粒子执行的位移中观察到粒子的个体贡献的统计分析和基于该分析的结果识别至少一定百分比的执行相同类型位移的粒子。根据本发明，每个粒子的贡献和/或观察到的粒子的个体贡献的统计分析可以通过本领域技术人员已知的任何合适的统计分析方法进行。例如，它可以是一种如上所述的统计分析方法。根据本发明，该统计分析可以是对每个粒子的贡献和/或被观察粒子的个体贡献的统计分析。根据本发明，对于每个观察，对粒子的个体贡献的统计分析可以包括：-对于在所述观察期间所观察的粒子所遵循的轨迹，计算由定义相关轨迹位移的特征参数值组成的矢量；-根据所述观察期间所察粒子计算的矢量创建矩阵；-通过主分量分析分解所述矩阵；-在分解产生的主分量中确定至少一个主要主分量；-生成至少一维的、对应于在所述至少一个识别的主分量上所观察的粒子轨迹的各个矢量的投影图；根据本发明，位移的特征参数可以是选自以下组的至少一个特征参数，该组包括：包括所述轨迹的矩形对角线长度c1，其所据公式如下：其中max(A)返回矢量A的最大分量，min(A)返回矢量A的最小分量，cumsum(B)返回矢量B的累积和。-轨迹上的平均速度c2：其中mean(A)返回矢量A的分量的平均值；-每个粒子在轨迹每个点的速度分布的标准偏差c3：其中std(A)返回矢量A的分量的标准偏差；-沿横轴c4或纵轴c5的轨迹分布的标准偏差：c4＝std(X)c5＝std(Y)其中std(A)返回矢量A的分量的标准偏差；-沿横轴c6或纵轴c7的轨迹不对称分布：c6＝skw(X)c7＝skw(Y)其中skw(A)返回矢量A的分量的不对称系数；在本文中，max对应最大分量，std对应标准差，mean对应均值，skw对应不对称系数，cumsum对应累积和，min对应矢量的最小分量。根据本发明，对每个粒子的贡献和/或观察到的粒子的个体贡献的统计分析可以包括根据以下公式确定均方位移(MSD)：<Δr2(Δt)>其中Δr是粒子的径向位移，Δt是时间间隔。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法计算矢量，所述矢量由定义相关轨迹的位移的特征参数的值组成。例如，它可以是包括所有特征参数值级联的方法。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法从计算的矢量构造矩阵。例如，它可以是主分量分析。根据本发明，主分量分析可以是本领域技术人员已知的任何主分量分析。例如，它可以是允许表示最大方差值分量选择的分析。根据本发明，确定至少一个主分量，主分量可以通过本领域技术人员已知的任何方法和/或手段来进行分解以得到。根据本发明，主要的主分量可以对应于分量，优选地对应于至少40％的值组，优选地对应于60％的值组。本领域技术人员凭借其一般知识将能够选择和/或确定主分量，例如主要主分量。根据本发明，至少一维的、对应于粒子轨迹的各个矢量的投影图的生成可以通过本领域技术人员已知的任何方法来执行，其中粒子是在在所述至少一个识别的主分量上观察到的。根据本发明，该图可以是一维、二维、三维或四维图，优选为一维、二维或三维图。根据本发明，图的维数可以是所识别的主要主分量的数量的函数。例如，当确定三个主分量时，该图可以是二维图，图的每个维度独立对应一个主分量，第三个主分量被添加到图中。根据本发明，从所生成的图中，该方法可以包括识别所述图中的一组点的步骤。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法和/或分析方法来执行对所述图中的点簇的识别。例如，它可以是本领域技术人员已知的任何合适的聚类方法。例如，这可以是点分布的可视化分析、K均值(K-mean)分析、k-Medoides分析。根据本发明，该方法可以包括根据属于给定簇的点的百分比来计算粒子的百分比。根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法从属于给定簇的点的百分比计算粒子的百分比。本领域技术人员凭借其一般知识，将知道如何根据图选择方法。有利地，从属于给定簇的点的百分比计算的粒子百分比使得分类和/或表征形成的生物膜成为可能。根据本发明，该方法还可以包括对各种观察所述粒子百分比随时间的演变的分析。有利地，对各种观察的所述粒子百分比随时间的演变的分析使得可以从定量和定性的角度确定生物膜形成的动力学。根据本发明，微生物可以是本领域技术人员已知的任何微生物。例如，它可以是细菌或真菌。它们也可以是原核细胞，例如本领域技术人员已知的任何细菌，例如包括在组中的细菌，但不限于后者，组包括橙黄色醋杆菌(Acetobacteraurantius)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，亚麻根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)，棕色固氮菌(Azotobactervinelandii,)，炭疽杆菌(Bacillusanthracis,)，短杆菌(Bacillusbrevis)，蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，梭状芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，类杆菌牙龈(Bacteroidesgingivalis)，类杆菌黑色素(Bacteroidesmelaninogenicus)，汉赛巴尔通体(Bartonellahenselae)，五日热巴尔通体(Bartonellaquintana)，支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)，百日咳杆菌(Bordetellapertussis)，莱姆病螺旋体(Borreliaburgdorferi)，布兰汉卡他莫拉菌(Branhamellacatarrhalis)，流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)，羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)，猪布鲁氏菌(Brucellasuis)，鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamallei)，类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)，肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacteriumgranulomatis)，大肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)，空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)，幽门弯曲杆菌(Campylobacterpylori)，肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)，鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)，沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)，肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)，鹦鹉热衣原体(Chlamydophilapsittaci)，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)，产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)，破伤风梭菌(Clostridiumtetani)，韦尔奇梭菌(Clostridiumwelchii)，白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)，梭形棒状杆菌(Corynebacteriumfusiforme)，贝纳柯克斯体(Coxiellaburnetii)，查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)，鸟肠球菌(Enterococcusavium,Enterococcusdurans)，杜兰肠球菌(Enterococcusfaecalis)，粪肠球菌(Enterococcusfaecium)，肠粪球菌(Enterococcusgalllinarum)、恶臭肠球菌(Enterococcusmaloratus)，埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)，土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)，有核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis)，杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi,)，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)，副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)，百日咳嗜血杆菌(Haemophiluspertussis)，阴道嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)，幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，鼻硬化克雷伯菌-催产克雷伯菌(Klebseillarhinoscleromatis-klebsiellaoxytoca)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)，产甲烷杆菌(Methanobacteriumextroquens)，多形微杆菌(Microbacteriummultiforme)，藤黄微球菌(Micrococcusluteus)，鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)，牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)，白喉分枝杆菌(Mycobacteriumdiphtheriae)，胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)，麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)，麻风分枝杆菌(Mycobacteriumlepraemurium)，草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)，耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，发酵支原体(Mycoplasmafermentans)，生殖支原体(Mycoplasmagenitalium)，人支原体(Mycoplasmahominis)，肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)，淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)，小行星诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)，多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)，土拉巴氏杆菌(Pasteurellatularensis)，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)，普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)，摩氏立克次氏体(Rickettsiamooseri)，鹦鹉热立克次氏体(Rickettsiapsittaci)，五日热立克次氏体(Rickettsiaquintana)，立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)，沙眼立克次(氏)体(Rickettsiatrachomae)，亨氏罗卡利马氏体菌(Rochalimaeahenselae)伏尔希尼立克次体(Rochalimaeaquintana)，龋齿罗菌(Rothiadentocariosa)，肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)，伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，鸟链球菌(Streptococcusavium)，牛链球菌(Streptococcusbovis)，仓鼠链球菌(Streptococcuscricetus)，粪链球菌(Streptococcusfaceium)，粪链球菌(Streptococcusfaecalis)，金黄色链球菌(Streptococcusferus)，鸡链球菌(Streptococcusgallinarum)，乳酸链球菌(Streptococcuslactis)，轻型链球菌(Streptococcusmitior)，缓症链球菌(Streptococcusmitis)，变形链球菌(Streptococcusmutans)，口腔链球菌(Streptococcusoralis)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)，鼠链球菌(Streptococcusrattus)，唾液链球菌(Streptococcussalivarius)，血链球菌(Streptococcussanguis)、远缘链球菌(Streptococcussobrinus)，梅毒螺旋体(Treponemapallidum)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，逗号弧菌(Vibriocomma)，副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)，创伤弧菌(Vibriovulnificus)，嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonasmaltophilia)，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)，鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)和假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)等。例如，它可以是本领域技术人员已知的任何真菌，例如病原性或非病原性真菌，例如致病的真菌，例如对人类健康有影响或没有影响的，环境真菌，选自下组的真菌包括酵母菌，例如念珠菌和/或隐球菌，例如致病的酵母菌，例如对人类健康有影响的，例如念珠菌病和/或隐球菌病，和/或包括霉菌的组，例如曲霉属，例如致病的霉菌，例如对人类健康有影响的，例如曲霉病和/或肺真菌病。根据本发明，可以将微生物以1.106至2.108CFU/ml(CFU：菌落形成单位)，例如1.107至8.107CFU/ml的浓度引入溶液中。例如，在200μl的体积中，微生物的量可以在2.105和4.107CFU之间，例如从2.106到1.6.107CFU。根据本发明，溶液可以包括在容器中和/或存在于表面上。例如，它可以是本领域技术人员已知的任何合适的容器。例如，这可以是培养容器。根据本发明，术语“表面”是指本领域技术人员已知的任何培养表面。例如，它可以是用有机玻璃或其它合适材料制成的载玻片。这可以是，例如，可以添加一滴培养液和细菌的载玻片。根据本发明，术语“培养容器”是指本领域技术人员已知的任何培养容器。这可以是例如培养反应器、杯、管或孔，例如在微量稀释板中。根据本发明，培养容器可以是具有一个封闭端的容器、例如管式、孔等或具有两个开口的容器。它还可以是包括一个封闭端、平底型的容器，具有一个封闭端、半球形底部的容器，包括两个开口端的容器。当容器具有两个开口端时，所述容器可以构造成允许培养基以恒流或不连续流流动。例如，它可以是微量稀释板，例如由美国国家标准协会和生物分子筛选协会(“微板”)定义的带有96个孔、384个甚至1536个孔的板，或者，相反，带有48或24个孔或任何其他数量的孔的板。例如，它可以是由本领域技术人员已知的任何合适材料制成的培养容器。材料可以是例如塑料，例如聚碳酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯等、还可以是玻璃、金属。例如，这些可以是具有平底、锥形底或圆底的聚碳酸酯或聚丙烯微板。例如，它可以是聚苯乙烯容器，例如本领域技术人员已知的任何聚苯乙烯。根据本发明，溶液也可以在表面上。它可以是本领域技术人员已知的任何表面，微生物可以在其上温育和/或可以发育和/或在其上可以形成生物膜。例如，它可以是生物或非生物表面。例如，它可以是装置和/或医疗支持物的表面，例如牙科植入物、导管、假体和/或本领域技术人员已知的微生物可在其上生长的任何医疗装置。在本文件中，术语生物表面是指本领域技术人员已知的任何生物表面。在本文件中，术语非生物表面是指本领域技术人员已知的任何非生物表面。它也可以是本领域技术人员已知的细菌能够在其上形成生物膜的任何装置表面。例如，它可以是医疗器械的表面，例如导管、针头、可植入腔室导管(或Port-a-Cath)、瓣膜(例如心脏瓣膜)、假体(例如关节假体、韧带假体)、牙科植入物、泌尿道假体、腹膜、腹膜透析导管、合成血管移植物、支架、内固定装置、经皮缝合线和/或气管、通气管。根据本发明，溶液可以是本领域技术人员已知的适用于微生物培养的任何溶液和/或培养基。根据本发明，溶液可以是本领域技术人员已知的任何合适的溶液，在其中微生物可以被培养和/或可以生长和/或在其上可以形成生物膜。例如，它可以是培养基，例如本领域技术人员已知的和/或可商购的至少一种微生物能够在其中发育的任何培养基。例如，它可以是天然或合成培养基。它可以是例如用于细菌生长的培养基，例如BHI培养基(脑心浸液)、LB培养基(溶原性肉汤，也称为“LuriaBertani”)、MH培养基(Mueller-Hinton培养基)、葡萄糖肉汤、酵母培养基，例如萨布罗(Sabouraud)培养基。本领域技术人员根据其常识，会知道如何根据微生物选择合适的培养基。根据本发明，多个粒子意味着至少两个粒子。根据本发明，所述至少两个粒子可以是能够实施本发明的任何粒子。有利地，所述粒子可以是适合于实施本发明的任何形状的粒子，例如珠状、圆盘状、不对称几何形状，例如具有平面等。根据本发明，粒子的形状可以相同或不同。有利地，粒子的形状是相同的。根据本发明，粒子可以是本领域技术人员已知的任何合适的材料。例如，它可以是金属或塑料粒子。可以使用任何合适的粒度。例如，可以基于溶液和/或微生物的容器的尺寸来选择粒子尺寸。例如，粒子的尺寸可以小于容器尺寸的十分之一，优选小于容器尺寸的百分之一，甚至更优选小于容器尺寸的千分之一。例如，粒子可以具有例如10nm至100nm、0.1至100μm的尺寸。根据本发明，本发明的方法可以用至少2个粒子来实施，例如，从2到10,000,000、从1,000到1,000,000、从10,000到1,000,000、从100,000到1,000,000，从10,000到100,000个粒子。多个粒子有利地使得可以观察所述粒子的多条轨迹。根据本发明，当使用多个粒子进行该方法时，所述粒子可以具有相同的尺寸或不同的尺寸。有利地，粒子的尺寸相同。当粒子的尺寸不同时，小粒子的尺寸可以是例如10nm至1μm，例如100至500nm，而大粒子的尺寸可以是例如1μm至100μm，例如1μm至10μm，例如1μm至5μm。根据本发明，还可以使用多个相同尺寸的粒子。根据本发明，粒子可以产生可检测的信号。该信号的检测将取决于粒子的特性。例如，所述至少一个粒子可以是荧光的、磷光的、化学发光的、反射的或有色的。例如，在所述至少一个粒子具有荧光性的情况下，粒子发射的荧光可以被检测到，例如视觉检测，和/或通过本领域技术人员已知的任何光学手段。所述至少一个粒子可以例如被照亮，以便通过光源例如通过激光束跟随其位移。例如，在至少一个粒子是磷光的情况下，该粒子可以通过本领域技术人员已知的任何光学手段被可视化，例如视觉化。例如，在至少一个粒子是化学发光的情况下，粒子的检测可以通过向培养基中添加允许粒子发射光能的化学试剂来形成。有利地，所述至少一个粒子可以例如被照亮以通过光源例如通过激光束跟随其位移。本领域技术人员容易理解，为了实施本发明，所述至少两个粒子的视觉特性的选择也可以根据方案进行。根据本发明，该方法可以包括，在将(c)中获得的溶液保持在允许所述至少一种微生物形成生物膜的条件下的步骤之前和/或期间，引入至少一种选自以下的化合物：抗生素、抗真菌剂和/或它们的混合物。根据本发明，术语化合物是指本领域技术人员已知的能够改变微生物的生长/发育和/或能够杀死微生物的任何化合物，例如天然的或通过合成、化学半合成获得的或通过提取获得的。例如，它可以是抗微生物剂，例如消毒剂、防护产品、用于对抗所谓的有害物种等的产品和/或包括在第98/8/EC指令或(EU)第528/2012号法规清单中的任何抗微生物剂，一种抗生素或一种抗真菌剂。例如，它可以是选自以下组的抗生素，组包括夫西地酸(fusidicacid)、氨基糖苷类(aminoglycosides)、β-内酰胺类(beta-lactams)、青霉素(penicillins)、β-内酰胺酶抑制剂(beta-lactamaseinhibitors)、头孢菌素(cephalosporins)、碳青霉烯类(carbapenems)、单内酰胺(monobactams)、环丝氨酸(cycloserine)、达托霉素(daptomycin)、磷霉素(fosfomycin)、林可酰胺(lincosamides)、大环内酯类(macrolides)和酮内酯类(ketolides)、莫匹罗星(mupirocin)、硝基咪唑(nitro-imidazoles)、硝基呋喃(nitrofurans)、寡糖(oligosaccharides)、恶唑烷酮(oxazolidinones)、多肽(polypeptides)、杆菌肽(bacitracin)、糖肽(glycopeptides)、多粘菌素(polymyxins)和粘菌素(colistin)、喹诺酮(quinolones)、利福霉素(rifamycins)、磺胺类(sulfonamides)和二氨基吡啶(diaminopyridines)、增效剂(synergistins)、四环素(tetracyclines)、抗真菌药或它们的任何混合物。例如，它可以是选自以下组的抗真菌药物，组包括咪康唑(Miconazole)、酮康唑(Ketoconazole)、克霉唑(Clotrimazole)、益康唑(Econazole)、联苯苄唑(Bifonazole)、布康唑(Butoconazole)、芬替康唑(Fenticonazole)、异康唑(Isoconazole)、恶康唑(Oxiconazole)、舍他康唑(Sertaconazole)、磺康唑(Sulconazole)、噻菌灵(Thiabendazole)、噻康唑(Tioconazole)、氟康唑(Fluconazole)、伊曲康唑(Itraconazole)、艾沙康唑(Isavuconazole)、雷武康唑(Ravuconazole)、泊沙康唑(Posaconazole)、伏立康唑(Voriconazole)、特比萘芬(Terbinafine)、阿莫罗芬(Amorolfine)、萘替芬(Naftifine)、布替萘芬(Butenafine)、真菌病灵(Mycosubtiline)或其任何混合物。它也可以是想验证其抗生素活性和/或抗真菌活性的任何新化合物，单独的或与一种或多种其他化合物组合。根据本发明，所述抗生素和/或抗真菌剂可以是在溶液中，例如在培养基中，或以脱水或冻干形式，和/或固定在浸没在所述培养基中的表面上。可用于抗生素和/或抗真菌剂的附着方式可以是本领域技术人员已知的用于将抗生素和/或抗真菌剂附着到表面的任何方式。例如，它可以是可商购装置，例如微孔板型支持物，例如由NUNC(丹麦)、Corning(美国)和GreinerBio-One(奥地利)销售的装置。根据本发明，可将一种或多种化合物，例如一种或多种抗生素引入培养基中。有利地，当根据本发明的方法，一种称为棋盘格的常用格式使得测试不同的抗生素和/或抗真菌剂和/或寻找一种抗生素和/或抗真菌剂的组合或关联效应成为可能。使用抗生素和/或抗真菌剂的混合物(组合、联合)实施本发明的方法可以有利地使得检测任何叠加效应、协同效应和/或拮抗效应成为可能。“叠加效应”是指至少两种抗生素的作用相加，例如，可以找到与单独使用的抗生素具有相同抗生素效果但浓度较低的抗生素组合。“协同效应”是指通过添加至少第二种抗生素和/或抗真菌剂来提高抗生素和/或抗真菌剂的效果，这种抗生素和/或抗真菌剂的混合物的效果大于单独添加的每种抗生素和/或抗真菌剂的效果的和。最后，“拮抗作用”是指通过添加至少第二种抗生素和/或抗真菌剂来抑制抗生素和/或抗真菌剂对微生物的作用。例如，该实施例可以使得选择抗生素和/或抗真菌剂的相关组合或联合(“共药”)以抑制微生物的发育成为可能。根据本发明，也可以将抗生素和/或抗真菌剂连续地引入培养基中以鉴定上述的叠加效应、协同效应或拮抗效应。有利地，根据本发明的方法可以确定/检测和/或鉴定微生物对化合物的敏感性。此外，根据本发明的方法有利地使得可以鉴定新的抗微生物剂，例如新的抗生素和/或抗真菌剂。此外，根据本发明的方法可以有利地确定化合物的特异性，例如它是否是抗生素和/或抗真菌剂。本发明还涉及一种能够实施上述方法的用于检测和/或表征生物膜形成的装置。它可以是本领域技术人员已知的任何合适的装置。例如，它可以是包括检测装置例如光学检测装置例如照相机、电子显微镜，分析装置例如计算模块，图形表示装置例如视觉表示模块的设备。本领域技术人员在阅读以下示例后，也可以想到其他优点，这些示例以举例说明的方式给出，并用附图说明。附图说明图1显示了数字图像比较的示例。在图中，横坐标表示像素，纵坐标表示灰度。图2显示了通过捕获在细菌培养基中的微珠进行生物膜形成研究的实验设计。图3显示了表示铜绿假单胞菌(十字或垂直线)的、金黄色葡萄球菌的(十字或圆圈)和无细菌的(十字或三角形)相对生物膜指数(rBFI，纵坐标)的时间函数图。左图的阴影区域代表两个副本的标准偏差。图4显示了表示生物膜生长过程中遇到的四种不同类型位移的不同珠速度的图表，即被动位移(a)、喷射/疏浚位移(b)、缓慢位移(c)或连接珠子的位移(d)。图5显示了在不同孵育时间：0、45、75或105分钟内，在铜绿假单胞菌悬浮液中取出的珠子的均方位移(MSD，纵坐标)与时间(以秒为单位，横坐标)的函数关系。图6显示了在不同孵育时间：0、40、120或160分钟内，在金黄色葡萄球菌悬浮液中取出的珠子的均方位移(纵坐标)与时间(以秒为单位，横坐标)的函数关系。图7是显示了金黄色葡萄球菌或非金黄色葡萄球菌所有粒子位移的标准偏差(纵坐标)相对于孵育时间(以分钟为单位，横坐标)的函数的演变图。图8显示了两个图表，其表示作为孵育时间函数的粒子位移标准偏差的演变的两个模型。图中，α和b分别表示第一条直线部分的斜率和垂向截距，τ1为斜率的第一次中断，τ2为斜率的第二次中断。在图中，纵坐标对应于粒子位移的标准偏差，横坐标对应于孵育时间。图9为细菌培养后主分量分析的结果；图9(a)是表示粒子位移参数或轨迹主分量分析结果的柱状图；图9(b)显示了作为第一主分量(PCA1，横坐标)和第二主分量(PCA2，纵坐标)的图。图9(c)显示了作为基于图9(b)中时间的点分布的函数的粒子/珠子比例。浅灰色点对应于阻塞位移的粒子/珠子，纵坐标对应于珠子的百分比，横坐标对应于以分钟为单位的孵育时间。图10为无菌培养后主分量分析结果；图10(a)是表示粒子位移参数或轨迹主分量分析结果的柱状图；图10(b)显示了根据第一主分量和第二主分量的图；图10(c)显示了作为基于图10(b)中时间的点分布的函数的粒子/珠子比例。浅灰色点对应于阻塞位移的粒子/珠子，纵坐标对应于珠子的百分比，横坐标对应于以分钟为单位的孵育时间。图11显示了在金黄色葡萄球菌存在下、孵育后主分量分析后获得的结果；图11(a)是表示粒子位移参数或轨迹主分量分析结果的柱状图；图11(b)显示了根据第一主分量和第二主分量的图。图11(c)显示了作为基于图11(b)中时间的点分布的函数的粒子/珠子比例。浅灰色点对应于阻塞位移的粒子/珠子。图12对应于表示标准偏差(纵坐标)随铜绿假单胞菌培养时间变化的图。斜率断裂发生在34分钟。图13显示了孵育铜绿假单胞菌后，进行主分量分析后得到的结果；图13(a)是表示粒子位移参数或轨迹主分量分析结果的柱状图，纵坐标为方差百分比，横坐标为分量；图13(b)是根据第一主分量(横坐标)和第二主分量(纵坐标)的图；图13(c)显示了作为基于图13(b)中时间的点分布的函数的粒子/珠子比例。图14显示了两个图(A和B)，它们代表了所有粒子位移的标准偏差(纵坐标)随空白培养基、仅金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和万古霉素或金黄色葡萄球菌和夫西地酸的培养时间(以分钟为单位，横坐标)的演化。在图中的指示符指示相应的曲线。图15为培育金黄色葡萄球菌与万古霉素后主分量分析的结果；图15(a)是表示粒子位移参数或轨迹主分量分析结果的柱状图，纵坐标为方差百分比，横坐标为分量；图15(b)显示了根据第一(横坐标)主分量和第二主分量(纵坐标)的图；图15(c)显示了作为基于图15(b)中时间的点分布的函数的粒子/珠子比例。浅灰色点对应于阻塞位移的粒子/珠子。图16为培育金黄色葡萄球菌与万古霉素后，主分量分析的结果；图16(a)为表示粒子位移参数或轨迹主分量分析结果的柱状图，纵坐标为方差百分比，横坐标为分量；图16(b)显示了根据第一(横坐标)和第二主分量(纵坐标)的曲线图；图16(c)显示了作为基于图16(b)中时间的点分布的函数的粒子/珠子比例。浅灰色点对应于阻塞位移的粒子/珠子。图17所示曲线图表示单独的金黄色葡萄球菌、具有万古霉素的金黄色葡萄球菌、具有夫西地酸的金黄色葡萄球菌和没有细菌(空白)的相对生物膜指数(rBFI，纵坐标)随孵育时间(横坐标)变化。图18显示的图表示作为孵育时间(横坐标)函数的每孔形成的单独的金黄色葡萄球菌、有万古霉素的金黄色葡萄球菌和具有夫西地酸的金黄色葡萄球菌的菌落数(CFU/孔，纵坐标)，在图中的指示符指示相应的曲线。图19显示了作为时间(以秒为单位，横坐标)的函数均方位移(纵坐标)的图。图20显示了一个粒子的两个图像；左图对应原始图像，右图对应变换后的图像。图21显示了包括带有细菌和粒子的培养基的孔的图像。图22显示了用于跟踪和/或计算粒子位移的兴趣区(粒子)的示例，具体是通过图像相关性。图23是一个孔的灰度图像，说明了传感器的背景噪声。图24是一个散点图，它表示1000个图像上一个像素的灰度分布平均值的方差。图25表示19个珠子在68％甘油溶液中扩散的轨迹的作为时间(以秒为单位，横坐标)函数的均方位移(纵坐标)的图。右侧图形曲线的斜率大约等于1(1.5±0.1)。图26显示了在BHI溶液中扩散的39个珠子的轨迹的作为时间(以秒为单位，横坐标)函数的均方位移(纵坐标)的图。右图的曲线斜率约等于1(0.98±0.11)。图27表示在由于培养基流动而存在偏差的情况下，在液体N350中扩散的珠子轨迹的孔的照片(图27a))和存在于同一培养基中的七个珠子的轨迹的作为时间(以秒为单位，横坐标)函数的均方位移(纵坐标)的图(图27b))，二阶二次多项式的趋势表明培养基中的流动。图28显示了表示粒子的位移(纵坐标)随观察期间每秒帧频(fps，横坐标)的变化的图。图29显示了表示粒子位移(纵坐标)随每秒帧频(横坐标)变化的柱状图，即在同一次观察中的1000fps(第1行)、500fps(第2行)和200fps(第3行)。具体实施方式实施例实施例1、原位跟踪微珠以检测生物膜形成在下面的示例中，粒子独立地称为珠子、粒子或微粒。这里介绍的微珠跟踪方法应用于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜的研究。对其菌株进行生物膜生长动力学研究。在生物膜生长的连续阶段提取一系列显微图像。因此，实验重点研究了生物膜形成的早期阶段，从表征含有浮游细菌和微珠的BHI培养基，到通过微珠的位移确定生物膜形成的最初迹象。在下面的示例中，研究了微珠动力学的变化，而不是根据纯布朗位移理论计算机械参数。实际上，能够根据标准而不是比较在均质和惰性培养基中有效的MSD(均方位移)辨别珠子的不同位移是有利的。因此，目标是通过确定生物膜起源的揭示参数，从机械的角度研究生物膜的形成。通过利用对引入细菌培养基中的微珠位移的观察，确定轨迹剖面的变化，并与固着菌的活性(细胞外物质的形成或粘附)相关联。所述实验的实验室处于P2级遏制(“关注可能导致人类疾病但不太可能在环境中传播的非转基因2类微生物，它们对社区没有风险，并且有已知有效的预防或治疗方法”)。使用OlympusCX53光学参考显微镜，并在微生物安全柜下进行操作。观察细菌液体中微珠随时间的动态变化。对照由用于测试的BHI中的微珠溶液组成。在室温(20℃)和透射光下，细菌培养基中微珠的自由位移是可视化的。从记录珠子在细菌培养基中自由移动(无外部压力)观察的系列图像，分析的目的是检测珠子轨迹随时间的动态变化。为此，在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生物膜在BHI中生长期间以及在直径为1μm的微珠(优选顺磁性)存在下，以每秒200张图像的频率连续拍摄一系列图像。观察到的孔底部分在600μm2和1000μm2之间变化。图2表示所实施步骤的实验图。可以在同一系列图像中查看和跟踪几十到几百个微珠。记录一系列底孔图像，直到所有珠子都固定在生物膜或粘附细菌中。大多数珠子的封闭/固定时间取决于菌株。在相同的培养基中，对所研究的菌株平行进行BRT测试，因此，这对应于生物膜形成方面的参考。DIC提取的珠子位移的分析结果如下所示。一、材料与方法使用的材料和方法如下：a)不含抗生素的生物膜形成动力学方案如下且是基于观察的，每5或10分钟观察测试孔和对照孔的底部直到珠子固定(几个小时)。所用材料如下：1传代两次的细菌的培养皿；TON4(顺磁微珠)；BHI(脑心浸液)培养基；与读取的培育时间次数一样多的96孔微孔板。该方案包括以下步骤：1.准备2种混合物：·用于BRT测试的混合物：OD(600nm)值0.004和10μl/mlTON4的细菌溶液；·对照BRT混合物：BHI和10μl/mlTON4混合物。2.根据预先确定的板计划，在每个板中将每种混合物(200μl/孔)填充到4个孔中；3.将除一个板以外的所有板放入烘箱。4.用剩余的板，对测试孔和对照孔拍摄一系列图像；5.向孔中加入反差液并进行BRT(图像+BFI分析)测试；6.对所有培育时间重复步骤4中的方案，在所需时间从烘箱中取出板。分析：对于每个培育时间，跟踪测试孔和对照孔的一系列图像上存在的所有珠子的轨迹。探求珠子自由位移随时间的演变的趋势。以BRT获得的结果作为参考。b)在抗生素存在下生物膜形成动力学的方案如下，且是基于观察的，每5或10分钟观察测试孔和对照孔的背景直到珠子固定(几小时)。所用材料如下：1传代两次的细菌培养皿；1μm(TON4)珠子溶液；BHI培养基；溶液中的抗生素：4μg/mL的万古霉素和2μg/mL的夫西地酸(为孔中的最终浓度)；数目与读取的孵育时间次数一样多的96孔微孔板。该方案包括以下步骤：准备抗生素板：在板中，通过沉积来添加20μl抗生素。由于该沉积物通过添加细菌悬浮液(180μl/孔)进行稀释，因此沉积溶液的浓度必须是所需值的10倍，即万古霉素为40μg/mL，夫西地酸为20μg/mL。沉积溶液由根据ISO20776-1:2006制备的现有溶液制备。然后根据建立的板计划/分布以20μl/孔的比例将溶液沉积在微孔板中。注射用水(WFI)放置在对照孔中。平板接种：1.制备含有BHI和TON4(比例为10μl/mL)的“对照”混合物；2.制备BHI和TON4(比例为10μl/mL)的“菌株”混合物；3.从传代两次的菌株，用接种环收集几个菌落并将它们重悬在装有3mLBHI的管中；4.测量悬浮液在600nm处的OD600nm值，并计算添加到“菌株”混合物中的接种量，以使OD600nm＝1/225＝0.004444(孔中的OD600nm将为0.004)。接种量计算＝0.004444*菌株混合体积V/OD600nm5.用菌株接种“菌株”混合物。6.将“对照”和“菌株”混合物均质化后，按照既定的板计划，将它们以180μl/孔的比例分布在抗生素微孔板中；7.立即在37℃下孵育板。每次从烘箱中取出一块板并在显微镜下观察。记录每个测试条件的孔的一系列图像。然后在加入对照液并将板磁化1分钟后，在BRT上读取板。c)细菌菌株和生长条件分析了铜绿假单胞菌CIP104116和金黄色葡萄球菌CIP7625。在100mL无菌BHI(脑心浸液培养基)中的细菌细胞重悬至在600nm、OD600＝0.004的光密度。这对应于初始细菌悬浮液(IBS)。相同的IBS用于BioFilmRing和显微镜测试。将染色剂添加到IBS中以获得10μl/mL的终浓度。将混合物振荡，并用200μl/孔的IBS接种96孔聚苯乙烯微孔板。为每个读数培育时间准备一个板。培养物在37℃下生长，无搅拌。孔的下部直径为6毫米，没有涂层。在用于实验之前发生长过程中不接触这些板。对于金黄色葡萄球菌，研究了两种抗生素的作用以检测抗生素的能力。测试的两种抗生素是浓度分别为4μg/mL和2μg/mL的万古霉素和夫西地酸。在这些情况下，在加入20μl上述浓度的抗生素后接种孔。已知这两种抗生素具有不同的作用机制。万古霉素作用于细菌壁，而夫西地酸改变蛋白质合成。d)显微镜和图像处理每5分钟对铜绿假单胞菌分析一次粘附动力学，每10分钟对金黄色葡萄球菌分析一次粘附动力学，直到珠子固定。对于每个读数培养时间，从培养箱中取出一块板并放置在配备有40倍透镜的OlympusCKX53倒置光学显微镜上。这种放大倍数是观察和绘制的粒子数量与粒子分辨率之间的良好折衷。所使用的设备，具体是用于图像捕获的设备，是由PCO销售的PCOEdge相机或BaslerAce相机，该相机连接到显微镜的视频输出。第一个配备420万像素的CCD传感器，另一个配备130万像素的CMOS传感器。两个传感器之间的差异对研究没有影响。这一系列图像以每秒200张图像的速率捕获，每张图像的照明时间为0.5毫秒，以尊重计算机的存储容量和测量频率。在靠近孔中心的不同位置为每个孔拍摄每个系列的数千张图像。图像所拍摄的孔底面积介于600μm2和1000μm2之间，具体取决于图像的大小。通过观察孔的下部，粒子的位移被垂直限制。然而，允许粒子离开视场。立即读取第一个微孔板，无需将其置于培养箱中。根据下面描述的方法确定粒子位移的跟踪，从而可以确定两个连续图像之间的珠子中心的位移。粒子在一系列若干图像上的跟踪使得确定和获得每个图像的轨迹成为可能。跟踪和光学跟踪的分辨率为±0.045像素。e)使用生物膜环测试(BRT)验证生物膜形成在每次显微捕获后使用所谓的生物膜环测试验证生物膜形成。该方法描述于Chavant等人的“快速评估细菌生物膜形成潜力的新装置(Anewdeviceforrapidevaluationofbiofilmformationpotentialbybacteria)”，JMicrobiolMethods，2007年3月；68(3)：605-12[29]中，基于接种在细菌悬浮液(使用贴壁细胞)中的磁珠的固定。一行孔用反差液覆盖，然后将板放在由永磁铁制成、置于每个孔的中心下方的试块上放置一分钟。磁化后，将板数字化以获得板底部的图像。每个菌株的粘附能力以由生物膜元素软件计算的生物膜指数(BFI)的形式表示。f)粘附细菌的计数对粘附细菌进行计数，以将生物膜的形成与金黄色葡萄球菌菌株的微生物活性联系起来。通过生物膜生长过程中粘附的菌落数量来评估抗生素的效果。g)轨迹分析全局分析：对珠子轨迹的第一个分析是研究每个孵育时间跟踪的所有珠子的位移分布的标准偏差的演变。观察到的轨迹pi包括连续位移Nt，i，所述连续位移由粒子或珠子在与两个图像之间的时间间隔相对应的恒定时间间隔内的移动造成，如pi＝(xi，yi)，i＝1，...，Nt,i。Nt,i是轨迹i的长度。每个珠子移动的位移值连接在矢量P中，例如P＝{p1，p2，....，pNb}。Nb是给定培育时间的珠子数。P被重新整形，使其成为一维大小的矢量对于每个培育期，根据以下公式对位移分布(矢量P)的标准偏差进行评估和计算：其中m＝长度(P)，对于每个培育时间，可获得代表生物膜生长总体状态的总值。h)每个粒子/珠子的个体贡献由于每个轨迹提供有关其周围环境的信息，因此还分别评估了珠子位移。对于在观察生物膜生长的整个持续时间内观察数百个珠子/粒子，通过跟踪所有珠子/粒子的位移提供的运动矢量构成了一组数据。为了用少量值描述这些轨迹，跟踪向量被描述随运动的位移分布的特征标准所取代。每个标准结合了根据上述比较方法测量的每个粒子/珠子位移给出的信息，具体是通过比较数字图像的观察。可以使用这些不同的标准更定量地分析位移。对于每个跟踪，计算判别参数。这些参数基于位移分布的统计和整个轨迹的几何形状。从作为每个粒子/珠子的时间[X(t)，Y(t)]函数的位移来看，每个跟踪/轨迹都与n-uplet的七个参数相关联：-根据以下公式，包括所述轨迹的矩形的对角线长度c1：-沿/在轨迹上的平均速度c2：-每个粒子在轨迹每个点的速度分布的标准偏差c3：根据横向和垂直方向/轴的轨迹分布的标准偏差(每个成分一个参数)：c4＝std(X)c5＝std(Y)沿横向轴和垂直轴的位移分布的不对称性(每个成分一个参数)：c6＝skw(X)c7＝skw(Y).这7个参数用于评估珠子在细菌悬浮液内发生位移和/或轨迹的方式。它们使得证明这不是正常的位移和/或轨迹成为可能。此外，它们使之成为可能，并可用于将轨迹分类为聚类，以便清楚地辨别主动位移、随机轨迹和阻塞粒子。为了保留这些标准中最具辨别力的信息，对所有数据进行了主分量分析(PCA)。PCA是其他领域众所周知的分析方法。有利地，通过仅保留有限数量的分量，即对观察到的现象影响最大的分量，可以保留尽可能多的信息来描述轨迹。根据七个参数，构建了三个主要分量。三个主分量的选择是为了保留表达信息中最大方差的分量。换句话说，从物理标准ci定义的向量的基，将问题转化为正交向量的基PCi。后者是根据标准ci的线性组合构建的。线性分解的系数给出了标准ci对轨迹描述中的贡献的信息。然而，PCi向量的维度代表抽象信息，与分析无关。此外，向量PCi的分量的单位可能会从因分析而异。然后在三个主要分量(PC1、PC2、PC3)的坐标系中表示每个轨迹。在上述三个主分量中，基于点密度的应用空间聚类使用DBSCAN算法(基于密度的空间聚类的噪声应用(Density-BasedSpatialClusteringofApplicationswithNoise)(Ester等人，1996)用于监测来自前三个主分量图中的2个无监督的聚类。这些主要分量随后与轨迹的形状相关联，因此与珠子的行为相关。i)再现性测试金黄色葡萄球菌菌株的每个实验进行两次。在下文中，试验的两个重复被称为重复1和重复2。对于铜绿假单胞菌菌株，生长动力学仅进行一次。生物膜生长的敏感性非常依赖于环境条件。2.结果温度为37℃时，在微珠/粒子存在下，在微孔板中的BHI培养基中培养金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。观察到直接在孔底部上方移动的微珠/粒子的位移。这些惰性微珠/粒子具有球形几何形状、均一的尺寸并且构成围绕细菌的培养基行为的尺寸稳定的探针。2.1.生物膜生长动力学如图3所示，所选的两种菌株具有不同的生物膜形成能力和特异性。使用金黄色葡萄球菌的BRT推导出的生物膜生长动力学(圆点曲线)表明珠子的固定发生在120分钟。此外，阻塞发生在40分钟。对于铜绿假单胞菌菌株(垂直线点曲线)，珠子的阻塞从培育之初就开始了。斑点完全消失发生在大约80分钟，这表明珠子完全阻塞。定性地说，与金黄色葡萄球菌随着时间推移形成生物膜的相比，铜绿假单胞菌在短时间内产生非常粘的基质。与金黄色葡萄球菌不同，铜绿假单胞菌的rBFI在早期增加。2.2.珠子位移的定性分析粒子位移跟踪是在每个培育时间的短时间间隔内，在孔底部的正上方，分别对加入细菌培养基中的粒子/珠子拍摄高放大倍数的图像来进行的。在由不同菌株产生的细菌培养基中可以观察不同的珠子位移。第一种细菌悬浮液是用铜绿假单胞菌菌株制成的，而第二种是用金黄色葡萄球菌菌株制成的。实验观察表明，37℃下细菌悬浮液中的珠子位移是主动位移和热位移的组合。此外，珠子位移因生长培养基中细菌的类型而异。由包括铜绿假单胞菌的培养基产生的珠子轨迹不同于纯布朗位移。在生物膜生长过程中，对细菌悬浮液中珠子轨迹的目视观察表明，珠子倾向于向有利的方向移动。虽然对照溶液中的珠子(包括在同样营养培养基中的珠子)经历了特征性的布朗位移，但细菌溶液/培养基中的珠子在其位移中表现出扩散的增加，尤其是在培育开始时。经过很长一段时间，“增加”扩散的现象可以被消除。对于金黄色葡萄球菌，珠子/粒子似乎不太流动。他们正在经历随机位移，可能受到与其他粒子的相互作用的干扰。随着生物膜的生长，珠子减慢到完全阻塞。在生物膜生长期间观察到珠子位移的四种情况：-纯被动位移：珠子在几乎均匀的培养基中；-拖动或弹出：具有均匀或部分被推动活性的珠子；-停顿：粘性材料中的珠子；-限定被动：珠子在更粘稠的材料中，热能kBT不够。在两种应变悬浮液中以不同的方式观察到这些类型的位移。表1和图4说明了具有不同类型位移的珠子的速度。表1：观察到的两种应变的位移类型在短时间内出现由细菌引起的拖动或弹出位移。像铜绿假单胞菌这样的微生物游动并扫过表面。虽然惰性粒子在嵌入液体培养基中时会发生布朗位移，但活性细菌能够通过定向位移推动自己，从而失去平衡，并拖曳珠粒/粒子。嵌入BHI培养基和金黄色葡萄球菌的溶液中的珠子/粒子的位移对应于均匀速度的随机扩散。没有不稳定的超扩散位移。随着生物膜的生长，位移范围减小，同时保持随机特性。在没有细菌作用的情况下，被动珠子具有布朗位移。布朗位移以位置之间的时间间隔Δt成正比的均方位移(MSD)(Δr2(Δt))表征。Δr是时间间隔Δt内的径向位移。该理论预测，对于具有纯二维布朗位移的珠子，(Δr2(Δt))＝4DΔt，其中D是扩散系数。对于超扩散位移，(Δr2(Δt))＝4Dtα，α>1。在本实验中，在生物膜的生长过程中计算了细菌溶液中掺入的微珠的平方位移的平均值。对于每个轨迹，计算均方位移并绘制MSD与时间间隔的曲线。图5和图6显示了生物膜形成过程中两种菌株的均方位移与时间间隔的曲线。对于铜绿假单胞菌(图5)，一些珠子显示出超扩散位移，而对于金黄色葡萄球菌，几乎没有观察到这些行为。如上图所示，珠子位移似乎可以提供细菌微生物活性的指示。虽然金黄色葡萄球菌生物膜中的珠子位移相对简单，但铜绿假单胞菌生物膜中的珠子表现出不同的特征/行为。这与图5和图6的目视观察结果一致，图5和图6表明粒子跟踪由不同长度的直线段组成(弹道式位移)，其重要性取决于与细菌和周围环境的相互作用。由于热搅动引起的随机位移受到细菌的主动运动的影响。珠轨迹的观察是珠子位移研究的一个步骤。通过定义描述珠子的位移定量标准来进行定量分析。2.3金黄色葡萄球菌：生物膜形成的定量分析如上所述，对每个读取培育时间跟踪的所有珠子的整体位移分布进行分析。图7表示珠子位移/轨迹分布的标准偏差，它是金黄色葡萄球菌悬浮液的两次重复和对照孔的两次重复(由BHI培养基中的相同微珠组成)的培育时间的函数。如图所示，标准偏差在生物膜生长开始时增加。在对照空白中也观察到这种增加的时期。然后，在20分钟时，细菌培养基中珠子的标准偏差降低，而对照空白则稳定。大约140分钟后，位移的标准偏差下降。曲线由分段线性函数近似。双线性或三线性函数用于将曲线近似为测试条件的函数。对具有双线性函数的曲线进行第一近似。如果系数R2太低，则选择三线性函数来适应曲线。两种拟合曲线的方程为：双线性回归：三线性回归：回归使得识别分析参数和用很少的指标描述标准偏差的演变成为可能。模型及其参数在图8中进行了示意性描述。报告了多线性近似的第二部分和第三部分的斜率α1和α2，以及斜率的破坏时间τ1和τ2。α1和α2代表珠子行为的变化；τ1和τ2是这些变化的时间。两次重复中它们的数值如下表2所示。表2从图8中标准偏差曲线推导的参数通过用各种规则曲线将标准偏差的变化建模为培育时间的函数，辨别了两组条件。对珠子的个体贡献进行分析以考虑珠子行为的差异。如上所述，对于每个轨迹，测量了基于位移分布的七个标准。实施主分量分析(PCA)以减少数据集的大小。第一主分量(PC1)约占总信息的60％，而PC2和PC3各占总信息的14％(图9)。所有培育时间跟踪的所有轨迹都在由(PC1，PC2，PC3)组成的新坐标系中表示。可以将所有轨迹分为两组，如图9所示。在生物膜的生长过程中，所有的珠子都以相同的方式表现。计算并绘制了作为培育时间函数的每个聚类中珠子的比例(下面的图9(c))。每个聚类中珠子比例的变化非常平滑，可以分为三个步骤。这些变化的时间如下表3所示。对于对照孔，仅辨别了一组，如图10所示。第二次重复的分析(图11)显示了类似的结果。表3：从比例曲线推导出的参数重复菌株τ1(min)τ2(min)1金黄色葡萄球菌70.9142.72金黄色葡萄球菌97.21602.4.铜绿假单胞菌：生物膜形成的定量分析对每个铜绿假单胞菌的培育时间跟踪的悬浮液中的所有珠子的大量位移分布进行分析。图12表示作为培育时间函数的珠子位移分布的标准偏差。对于金黄色葡萄球菌的悬浮液，标准偏差的变化通过线性函数建模。在34分钟时检测到双线性函数模型趋势变化，此时标准偏差停止增加。34分钟后，标准偏差的值似乎整体下降，最后一次培育时间的这些值变化很大。这种可变性可能是由于铜绿假单胞菌生物膜形成的异质性。进一步对单个珠子的位移进行了分析。为每个粒子计算了先前定义的七个参数。在对每个轨迹的七个参数的所有数据进行PCA后，生物膜形成过程中报告的所有轨迹都在根据三个主要成分(PC1、PC2、PC3)构建的新的最终坐标系中。和以前一样，制作聚类以将对应于相同位移特性的珠子聚集在一起。计算作为培育时间函数的每个聚类中的轨迹数。就像对金黄色葡萄球菌所做的那样，下面的图13(b)显示了点组(聚类)的分布。下面的图13(c)显示了在铜绿假单胞菌生物膜生长过程中属于一个组的珠子数量的演变。随着生物膜的增长，总体趋势显示被阻塞的珠子数量增加。然而，下降并不规律。阻塞珠的比例随生长时间的变化表明阻塞珠的数量可能会明显变化。铜绿假单胞菌的结果可以解释生物膜的形成更加异质。我们发现，对珠子个体行为的分析表明，在开始时，观察到细菌悬浮液中的特定活性，并在生长的第一分钟后出现。2.5.金黄色葡萄球菌：抗生素对生物膜形成的影响抗生素作用的表征是制药领域的一个重要问题。我们在这里测试了两种抗生素延迟或阻止生物膜形成的能力。对实验数据进行同样的处理。下图显示了作为时间函数的包括抗生素的金黄色葡萄球菌悬浮液的标准偏差的变化。在万古霉素或夫西地酸的存在下，随着生物膜生长，在生物膜生长的早期，标准偏差增加，然后减少，比没有抗生素的情况下减少得更慢。双线性函数拟合含抗生素的细菌悬浮液的标准偏差方程的曲线。报告了含有抗生素的细菌悬浮液的双线性近似的参数α1和τ1，并在下表4中与对照(空白)和不含抗生素的金黄色葡萄球菌悬浮液进行了比较。位移分布标准偏差的变化使得辨别悬浮液/细菌培养基中抗生素的存在成为可能。在抗生素存在的情况下，标准偏差曲线类似于空白对照的曲线。表4：从标准偏差曲线推导出的参数在对上述7个参数(PC1、PC2、PC3)进行主分量分析后，对单个珠子的位移进行的分析表明，DBSCAN算法可以检测一个主聚类和一个较小的聚类(图15)。点的散点图(图15(b))在第一主分量的方向上比得到的对照散点图(仅BHI+珠子)的偏移更大。正如所证明的，这两种抗生素阻止了珠子的固定，这在所获得的图中得到了清楚的说明和证明，具体是在分析了主要成分之后。为了将BRT的结果与作为培育时间函数的IAB的演变进行比较，进行了BRT。对于在抗生素存在下金黄色葡萄球菌的悬浮液，作为培育时间的函数的rBFI的曲线(图17)表明抗生素限制了珠子的粘附。有或没有抗生素的金黄色葡萄球菌孔中(图18)粘附细菌的计数证明了两种抗生素均对细菌粘附活性的有作用。3.讨论在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生物膜生长过程中对珠子位移的定性观察揭示了不同类型的珠子位移。对于这两种菌株，生物膜的形成会导致珠子被捕获。对于金黄色葡萄球菌菌株，珠子位移范围随着生物膜的生长而减小，同时保留随机特性，而加入铜绿假单胞菌悬浮液中的珠子经常经历不稳定的弹射。本发明的方法有利地使得可以在微观尺度上检测可能与细菌粘附或生物膜生长相关的生物事件。为此，使用例如耦合到数字图像相关算法的光学装置监测加入金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌的细菌悬浮液中的微珠的位移。由于轨迹测量产生的大量数据，这些数据有利地由特定特征/参数表征。一方面，对于每个读数培育时间，所有跟踪轨迹的基本时间间隔内的所有位移都是混合的。另一方面，单独考虑珠子并且确定的参数/标准使得描述珠子的行为成为可能。由于这种跟踪和分析方法，确定了生物膜生长期间的定量特征时间。为了分析全局位移以及珠子的单个位移，我们在培育金黄色葡萄球菌约140分钟时检测到生物事件。此外，在精心选择的框架中将珠子分为两组，可以精确检测珠子阻塞的开始。对于金黄色葡萄球菌，根据所涉及的重复，阻塞的开始发生在大约71分钟到97分钟之间。第二个事件发生在大约143到160分钟之间。这些趋势与BRT的结果一致。在第一阶段没有发生粘附(rBFI＝0)，然后珠子的阻塞逐渐出现(rBFI增加)，直到很大部分珠子被阻塞(rBFI最大)。对两种抗生素对金黄色葡萄球菌生物膜作用的研究表明，与不含抗生素的细菌悬浮液相比，对惰性珠子的微观位移分析可以辨别出抗生素的有效性。实际上，在存在抗生素(不管是哪种抗生素)的情况下，作为培育时间函数的位移标准偏差的变化与对照遵循相同的趋势。如上所述，获得的结果与BRT和对琼脂平板上粘附细菌的计数一致。此外，显然，与已知方法不同，由于其非破坏性性质，本发明的方法有利地使得随时间连续获得结果成为可能。具体地，本发明的方法能够在细菌培养期间无需任何行动和/或添加化合物(例如造影剂)即可获得结果。此外，本发明的方法可以在不与培养物直接接触的情况下进行，因此该方法有利地是一种非侵入性和非破坏性测试，同时允许获得许多参数，这些参数对于实时地表征生物膜是有用的。此外，本发明的方法有利地使得可以在培养物的培育时间结束时获得结果，取消产品/耗材的使用，这有利地使得可以缩短分析时间和降低耗材和劳动力两方面成本。有利地，本发明的方法可以通过跟踪植入生物膜内的粒子的位移，将时间维度添加到测量中。有利地，本发明的方法允许对生物膜的形成进行非破坏性检测。此外，本发明的方法有利地使得可以通过惰性珠的微观轨迹的特征来检测在生物膜形成期间发生的生物事件和/或辨别现象。本发明的方法有利地允许对生物膜形成的动力学进行时序上几乎连续的跟踪。有利地，本发明的方法使得控制生物膜生长的动力学成为可能，它是非侵入性和非破坏性的。本发明的方法有利地允许在其培育期间多次观察细菌培养物，例如，与已知方法不同，它有利地使得可以所需的尽可能接近的培育时间进行多次观察。此外，根据本发明的方法有利地使得获得可靠且可比较的结果成为可能。有利地，本发明的方法通过使用在细菌培养基内的惰性微珠和观察所述在细菌培养基内的惰性珠的被动位移，使辨别细菌生物膜(例如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)生长动力学过程中的现象和特征时间成为可能。下面的表5到13总结了实验的参数和相应的一系列图像。表5：铜绿假单胞菌测试参考表6：金黄色葡萄球菌测试，测试参考：重复1、空白表7：测试参考：重复1，金黄色葡萄球菌表8：测试参考：重复1，金黄色葡萄球菌-万古霉素表9：测试参考：重复1，金黄色葡萄球菌-夫西地酸表10：金黄色葡萄球菌测试，测试参考：重复2，空白表11：金黄色葡萄球菌测试，测试参考：重复2-菌株表12：金黄色葡萄球菌测试，测试参考：重复2，金黄色葡萄球菌-万古霉素表13：金黄色葡萄球菌测试，测试参考：重复2，金黄色葡萄球菌-夫西地酸实施例2、粒子跟踪方法实施例DIC需要使用数字图像，这些图像可以转换在被研究材料表面上的材料点的位置信息。该信息可以通过灰度标记来具体化。对于许多工程材料和坚硬的骨状活体材料，需要在待测样品表面预先涂抹散斑。活体材料有时因其质地而具有自然纹理，这使得数字图像相关性的使用是合适的。例如，通过显微镜(Mathias和Stoodley，2009)拍摄生物膜或腿部软组织(Bouten，2009)图像就是这种情况。然而，使用活体材料的自然纹理来获得其机械行为的定量信息可能存在偏差。由于其活的特性，这种类型的材料能够对测试过程中诱导引起的机械应力做出积极的反应。在本文件中，被动微珠在材料内随机排列。DIC可以有利地用于跟踪并入在异质和动态培养基中的粒子的目的。将被研究培养基置于小容量容器中，以便在倒置光学显微镜下无压力地进行观察。观察直接位于容器底部的珠子的自由位移。通过倒置显微镜的视频输出记录一系列图像。布朗位移包括永久位移(由于摩擦现象没有阻尼)，也没有流体中微米粒子的优先取向。正是粒子与流体分子的不断碰撞，才导致胶体粒子发生位移。在这种情况下，驱动力是带有kBT级的能量的热力，kB是玻尔兹曼常数，T是温度，以开尔文表示(Wirtz，2009)。布朗位移与溶剂分子碰撞的概率有关。平均而言，粒子保持静止是因为它在一个方向上的位移和在另一个方向上的位移一样频繁。对于纯布朗位移，位移的算术平均值为零(Qian等，1991)。布朗位移以均方位移(MSD)表征。文献中已经证明，这个量级取决于包括微珠的培养基的特性。对于纯布朗扩散，半径粒子的均方位移作为位移的测量时间间隔Δt的函数呈线性变化。线性系数取决于粒子在其中扩散的流体的机械参数。二维轨迹r(t)＝(x(t)，y(t))的MSD和时间间隔Δt之间的关系由下式给出：D是爱因斯坦的扩散系数。它与溶剂的动态粘度η有关。这些方程用于无偏布朗位移。此外，作为位移时间间隔的函数的粒子的MSD曲线的形状可以是微珠浸入其中的培养基的特有的。对于符合亚扩散条件的位移，MSD与对于所谓的超扩散位移，MSD与Δtα成正比，其中对于所谓的超扩散位移，MSD与Δtα成正比，其中α＞1。时间间隔越大，误差线可能越大。实际上，两个位置之间的时间间隔越大，可用于计算平均值的项就越少。图19表示作为时间和位移(布朗、超扩散或亚扩散)函数的MSD变化的三个图。实施例3：用于跟踪材料示例中的粒子、定位兴趣区、缩小兴趣区并验证粒子跟踪计量的方法实施例1.粒子追踪使用40倍透镜在光学显微镜(放大倍数400)下观察珠/粒子。这些是与实施例1中使用的珠子/粒子相同的珠子/粒子。400倍的放大倍数使得可以在珠子上的信息分辨率(然后珠子被在10个像素(px)的直径的区域上编码)和图像中可见的珠子数量实现良好的折衷成为可能。记录了几千张图像的系列。使用数字图像比较(DIC)算法单独跟踪珠子。使用了本地版本中DIC的公式：焦点位于图像的一部分，即围绕珠子缩小为51×51平方像素的正方形，并整体计算该区域。位移的运动学保持简单，并限定在图像的这一部分进行。它由垂直位移分量和水平位移分量组成。对于每个珠子，图像相关算法以顺序方式测量基线图像和系列中的后续图像之间的像素位移。该计算是沿着一系列图像进行的，以重建珠的轨迹。该DIC图允许进行快速、适当和已知的错误跟踪。如果算法显示收敛困难，则可能有不同的解释：·珠子已脱离图像框；·珠子超出景深，失真图像与初始图像差异太大；·珠子在初始图像和失真图像之间移动得太远，·算法接下来需要一个非零初始化。对于第一种情况，珠子的坐标使得考虑轨迹超出图像成为可能。对于其他两种情况，计算是用系列中的前一张图像初始化，然后在这个新的初始图像和它后面的图像之间继续计算。2.定位兴趣区如上所述，还对每个粒子单独进行珠子/粒子跟踪。这部分的目的是检测图像中珠子的存在，以限制珠子周围的兴趣区。在每个系列的图像中，观察到的珠子数目从几十个到几百个不等。因而能够系统地检测珠子。为此，实施了基于图像处理技术的自动处理。对于每个图像序列，第一个图像是打开的。图像中珠子的中心由用户手动选择。创建了这个珠子和其周围区域的20×20平方像素(px2)imagetteb图像。为了消除由于选择特定珠子而产生的内在特异性，从所选图像创建了一个新的Imagetev图像。这个新的虚拟图像由基本图像的简单变换的线性组合组成。因此，根据以下组合创建新的虚拟映像：其中Imagetteb是珠子周围区域的原始缩略图，ImagetteTb是原始缩略图的转置，ImagetteRhb是原始缩略图的水平对称，ImagetteRvb是原始缩略图的垂直对称。这些转换对珠子编码图案的对称性进行了修正。图20显示了一个粒子的两个图像，左图对应原始图像，右图对应变换后的图像。兴趣区定位算法基于OpenCV库，搜索整个图像与Imagettev图像之间的相关最大值，代表一个独立的珠子。相关最大值可能出现在珠子周围的几个像素上。通过平移缩略图的一半宽度和高度，选择由围绕珠子的一组相关最大值形成的每个簇的重心以指定珠子的中心。这个过程使得检测图像中珠子的中心成为可能。图21对应于检测到粒子(黑色圆圈)的图像。3.缩减兴趣区孔底部的图像代表3维珠子的2D视图。考虑到珠子的球形度，它们没有在均匀灰度等级上进行编码。事实上，珠子的中心被编码为较亮的像素，因此珠子的图像是暗电晕(darkcorona)。为了去除中心最亮的像素，图像相关算法中考虑的兴趣区被缩减为由珠子边缘周围的暗像素形成的电晕。珠子被编码为直径为10像素(px)。在51×51平方像素的兴趣区上，珠子中心周围3像素半径内的光像素被屏蔽。同样，编码孔底部且超过珠子中心13像素的像素被屏蔽。图22是用于跟踪粒子位移的兴趣区(粒子)的表示，具体是通过图像关联。珠子中心的光像素被屏蔽，因为它们不提供DIC计算的相关信息。同样，在计算中不考虑孔底部超出珠子周围小外围的像素。4.验证粒子追踪计量如果传感器是完美的(并且光源是恒定的)，则静止场景的图像是相同的。实际上，光学测量系统拍摄的图像可能会被图像拍摄电子操作中固有的传感器噪声改变。传感器产生的噪声可能会在DIC计算的位移测量中传播，并直接影响测量分辨率。为了计算传感器噪声，获取了在培养皿上干燥的珠子样品的1000张图像。干珠聚合体的焦点在深度上略有移动，以故意创建模糊图像，从而平滑图像上的灰度梯度。对于位置(xi,yi)的每个像素pi，计算1000张图像的灰度平均值lmi以及方差lvi。对于一系列尺寸为300×200平方像素的图像，计算了60,000对(lmi、lvi)。它们作为所讨论像素的灰度平均值的函数被绘制在方差图上。帧(lm，lv)中测量点的分散表明，正如预期的那样，最亮的像素显示出最大的可变性。该曲线轮廓(lm，lv)是场测量中使用的相机所要求的。点云形成沿仿射线定向的束。另一方面，光束中心的凸起是由于刚性实体(Grediac和Sur)的位移。为保守起见，图像上灰度的标准偏差被任意选择作为本实施例中观察到的最大方差。因此，以下公式适用：图像以16位编码。然后，位移测量分辨率由以下方程确定(Réthoré等人，2008；Blaysat等人，2016)：实际上，相关矩阵Mij的值指的是平均值，DIC计算的位移的两个分量的测量分辨率为：σx＝0.0462px(对于位移的水平分量)σx＝0.0464px(对于位移的垂直分量)图23对应于说明传感器背景噪声的图像。如图所示，焦点已被有意偏移以平滑图像中的灰度梯度，并去除/减少背景噪声。图24是一个散点图，表示是超过1000个“相同”图像上像素的灰度分布平均值的函数的方差。如所证明的，在本实施例中，DIC用于珠子/粒子的适当跟踪，对于这些珠子/粒子，在位移测量方面控制了例如与背景噪声相关的变化和/或误差和/或不准确度。此外，通过跟踪分散在培养基中的若干微珠，确保了对材料异质性的考虑。5.在不同类型的环境中验证验证测试是用标准液体进行的，以模拟生物膜材料。对在已知粘度的均质培养基中移动的珠粒的自由位移计算进行了几项初步测试。在本实施例中，研究了1μm微珠在已知粘度的标准液体中的位移。研究了含68％(质量百分比)甘油的第一溶液。对于该溶液，粘度值被制成表格(Takamura等，2012)。在20℃和25℃之间，这种溶液的粘度约为16.4mPa.s±4.8mPa.s。这种培养基的粘度实验值是通过预先计算扩散系数D来计算的，并由曲线MSD＝f(Δt)得出。这些曲线是为在甘油溶液中扩散的19个珠子绘制的。在log-log刻度上，曲线的斜率大约等于1(1.05±0.1)。因此，MSD值与Δt成正比，珠子很好地遵从随机趋势进行扩散，没有流动或限制。根据这些曲线，这19个珠粒计算的粘度值平均为16.6mPa.s±5mPa.s。进行相同的步骤以找出用于初始细菌悬浮液的BHI(脑心输液)培养基的粘度。尽管BHI溶液的理论值未知，但该值的数量级为10-3Pa.s。由于BHI是将粉末(37g/L)溶解在大量的水中制成的，因此所得液体的质地接近水的质地。以类似于为甘油溶液实施的方法的方式，为在BHI溶液中扩散的39个珠子绘制了作为Δt函数的MSD曲线。该溶液中这些珠子的位移属于布朗位移类型。作为时间间隔函数的MSD曲线确认了轨迹的定性观察(见图24和25)。实际上，MSD取决于Δt。本试验测得的实验粘度为3.2mPa.s±1.3mPa.s。对于低粘度的惰性材料，这些初次测试使得在实验条件下确认机械参数的测量成为可能。测量是在更高粘度的培养基中进行的，并且使用了另外两种粘度高一百倍的标准液体。这两个样品的粘度范围为大约500到700mPa.s。所用液体D500和N350(Sigma-Aldrich)的粘度分别为498.4mPa.s和712.9mPa.s(25℃时的值)。从一系列图像中提取珠子轨迹。干燥珠子以便不改变珠子溶液的液体粘度，进而避免珠子和液体之间的额外物理化学相互作用。对在液体N350中扩散的珠子的观察显示珠子轨迹似乎是由流体的非自主流动驱动的(图26)。MSD曲线作为所考虑的时间间隔的函数，与该培养基中六个珠子的轨迹相关，具有存在流动的粘性培养基的典型特征(图27)。另一方面，对于这些粘度的液体，1μm珠子的平均位移小于之前研究的液体。D500液体中的珠轨迹是有非常小的振幅的位移。因此，增加了图像采集频率，以便以更精细的方式捕捉珠子方向的变化(图29)。图28显示了捕获在D500液体中的珠子在不同采集频率下的位移分量。当图像采集频率较高时，珠子位移的水平分量增加。参考文献：1.Bryers,J.(2008).Medicalbiofilms.Biotechnologyandbioengineering,100(1)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