包含痘苗病毒和羟基脲作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物的制作方法

1.本发明涉及一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含痘苗病毒和羟基脲作为活性成分。


背景技术：

2.溶瘤病毒具有优异的肿瘤特异性靶向能力、在癌细胞中的增殖能力和癌细胞杀伤能力。最近，已经进行了基于溶瘤病毒的各种临床研究。2015年，美国和欧洲开启了溶瘤病毒领域的时代，基于单纯疱疹病毒的溶瘤病毒talimogene laherparepvec(t-vec)作为晚期黑色素瘤的治疗药物被成功商业化。
3.最近，溶瘤病毒的有用性超过了它们自身的功效，并且病毒活化了肿瘤免疫，从而显示出它们作为与另一种免疫治疗剂联合使用的治疗剂的潜力。直到2000年，那是溶瘤病毒发展的早期阶段，由病毒的癌细胞特异性增殖引起的病毒的直接杀伤作用相对更为重要。然而，随后的临床研究发现，肿瘤免疫的活化是一种关键机制，而不是直接的癌细胞杀伤作用。基于这一发现，最近正在开发包括两者联合施用的溶瘤病毒和免疫治疗剂如免疫检查点抑制剂的治疗剂。这是因为已知溶瘤病毒将抑制免疫的肿瘤微环境转变为适于免疫治疗的肿瘤微环境。
4.在基于痘苗病毒的溶瘤病毒的多项临床研究中，溶瘤病毒治疗可能导致急性肿瘤坏死、持久反应或完全反应，但在某些情况下，可能导致难以预测的结果(药效学变异性)，例如进行性疾病或过早死亡。例如，对于基于痘苗病毒的pexa-vec，在1期临床试验中，一些患者在溶瘤病毒治疗后一个月内过早死亡，这与持续的全身炎症反应和主要器官功能障碍有关。此外，溶瘤病毒治疗后观察到的短暂流感症状(高烧)和低血压是溶瘤病毒治疗后最常见的不良事件。
5.因此，为了增强溶瘤病毒的治疗效果，有必要了解癌细胞、患者的免疫状态和溶瘤病毒之间的相互作用；并且基于这种理解，需要研究能够提高溶瘤病毒临床疗效的技术。


技术实现要素：

6.技术问题
7.因此，进行了增强用作溶瘤病毒的痘苗病毒的抗癌作用的研究，结果，本发明人发现，与仅施用痘苗病毒的常规情况相比，在将痘苗病毒和羟基脲共同施用于患有癌症的个体的情况下，全身炎症反应显著降低，以确保安全使用。此外，本发明人发现，在全身施用痘苗病毒时，在共同施用羟基脲的情况下，可获得优异的癌细胞特异性选择性和增殖能力。
8.解决方案
9.为了实现上述目的，在本发明的一个方面，提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，该药物组合物包含痘苗病毒和羟基脲作为活性成分。
10.在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，该方法包括向患有癌
症的个体施用痘苗病毒和羟基脲。
11.在本发明的又一方面，提供了包含痘苗病毒和羟基脲的组合物用于预防或治疗癌症的用途。
12.在本发明的再一方面，提供了包含痘苗病毒和羟基脲的组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
13.在本发明的再一方面，提供了一种抗癌佐剂，该抗癌佐剂包含羟基脲作为活性成分。
14.有益效果
15.与仅施用痘苗病毒的常规情况相比，本发明的包含痘苗病毒和羟基脲作为活性成分的用于治疗癌症的药物组合物具有优异的抗癌作用和安全性。因此，本发明的包含痘苗病毒和羟基脲作为活性成分的药物组合物可以有效地用于治疗癌症。
附图说明
16.图1示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用野生型痘苗病毒(western reserve株痘苗病毒，wr)和羟基脲(hydroxyurea，hu)，然后在第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积而获得的结果；
17.图2示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用野生型痘苗病毒(wr)和hu，然后在第0、3、7、10和14天测量体重而获得的结果；
18.图3示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和hu(60mg/kg)，然后在第0、3、7、10、14、17和21天测量肿瘤体积而获得的结果，该重组痘苗病毒(wr vv
tk-)通过缺失wr中的tk基因而获得；
19.图4示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和hu(30mg/kg)，然后在第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积而获得的结果；
20.图5示出了通过在向小鼠黑色素瘤移植小鼠(b16f10)施用重组痘苗病毒(vv_dd)和hu的前1天和施用后的第4天和第7天测量肿瘤体积而获得的结果，该重组痘苗病毒(vv_dd)通过同时缺失wr中的tk基因和痘苗病毒生长因子(virus growth factor，vgf)基因而获得；
21.图6示出了通过向人结直肠癌细胞(ct-26)移植小鼠施用重组痘苗病毒(wots-418)和hu，然后在第0、5、10、12和15天测量肿瘤体积而获得的结果；
22.图7示出了通过向人肺癌细胞(nci-h460)移植小鼠施用重组痘苗病毒(wots-418)和hu，然后测量存活率而获得的结果；
23.图8示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用重组痘苗病毒(vv
tk-)和人粒细胞集落刺激因子(rhg-csf)或hu，然后测量小鼠肿瘤体积而获得的结果；
24.图9示出了通过从已施用重组痘苗病毒(vv
tk-)和人粒细胞集落刺激因子(rhg-csf)或hu的小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)分离脾脏中的淋巴细胞，将淋巴细胞施用于新小鼠，然后测量新小鼠的肿瘤体积而获得的结果；
25.图10示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用重组痘苗病毒(ots-412)和hu，然后测量小鼠肿瘤体积而获得的结果；
26.图11示出了通过从已施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-)和hu的小鼠肾癌细胞移植
小鼠(renca)分离t淋巴细胞，将t淋巴细胞施用于新小鼠，然后测量新小鼠的肿瘤体积而获得的结果；
27.图12示出了通过从已施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-)和hu的小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)分离脾细胞，将脾细胞施用于新小鼠，然后测量新小鼠的肿瘤体积而获得的结果；
28.图13示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用重组痘苗病毒(ots-412)和hu，然后在第22天测量肿瘤体积而获得的结果；
29.图14示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用重组痘苗病毒(ots-412)和hu，然后观察脾组织中cd4+t细胞或cd8+t细胞的增殖而获得的结果；
30.图15示出了通过向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4t1)施用重组痘苗病毒(ots-412)和hu，然后观察血液和脾组织中cd4+t细胞或cd8+t细胞的增殖而获得的结果；
31.图16示出了通过向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4t1)中的左侧肿瘤施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和hu，然后测量左侧肿瘤体积而获得的结果；
32.图17示出了通过向小鼠乳腺癌细胞移植小鼠(4t1)中的左侧肿瘤施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和hu，然后测量右侧肿瘤体积而获得的结果；
33.图18示出了通过向小鼠肾癌细胞移植小鼠(renca)施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和hu，然后在第22天进行染色以确定重组痘苗病毒在小鼠肿瘤组织中的分布而获得的结果；
34.图19示出了通过向正常小鼠施用野生型痘苗病毒(wr)、或野生型痘苗病毒(wr)和hu，然后鉴定野生型痘苗病毒在肝组织和肾组织中的分布而获得的结果。
35.最佳实施方式
36.下面将具体描述本发明。
37.在本发明的一个方面，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含痘苗病毒和羟基脲作为活性成分。
38.药物组合物中所含的痘苗病毒和羟基脲可以同时、依次或以相反的顺序联合施用。具体而言，痘苗病毒和羟基脲可以同时施用。此外，可以先施用羟基脲，然后施用痘苗病毒。此外，可以先施用痘苗病毒，然后施用羟基脲。另外，可以先施用羟基脲，然后施用痘苗病毒，然后再次施用羟基脲。
39.痘苗病毒可以属于但不限于：western reserve(wr)、纽约痘苗病毒(new york vaccinia virus，nyvac)、wyeth(纽约市卫生局(the new york city board of health，nycboh))、lc16m8、lister、copenhagen、天坛(tian tan)、ussr、tashkent、evans、international health division-j(ihd-j)或international health division-white(ihd-w)痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，使用了western reserve株痘苗病毒和wyeth株痘苗病毒。
40.痘苗病毒可以是野生型痘苗病毒或重组痘苗病毒。具体而言，重组痘苗病毒可以通过在野生型痘苗病毒中缺失基因或向其中插入外源基因而获得。本文中，在野生型痘苗病毒的基因中，可以缺失编码选自由以下组成的组中的任一种病毒毒力相关基因：胸苷激酶(thymidine kinase，tk)、痘苗生长因子(vgf)、wr53.5、f13.5l、f14.5、a56r、b18r或其组合。
41.此外，插入的外源基因可以是促进免疫和编码选自由以下组成的组中的任一种的基因：单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，hsv-tk)、突变的hsv-tk、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，g-csf)、胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，cd)、1型羧酸酯酶、2型羧酸酯酶、干扰素β(interferon beta，inf-β)、生长抑素受体2及其组合。
42.具体而言，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因而获得：western reserve(wr)、纽约痘苗病毒(nyvac)、wyeth(纽约市卫生局(nycboh))、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、international health division-j(ihd-j)或international health division-white(ihd-w)痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，使用通过在western reserve株痘苗病毒中缺失tk基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“wr vv
tk
‑”。另外，在本发明的一个实施方式中，使用通过在wyeth株痘苗病毒中缺失tk基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“wyeth vv
tk
‑”。
43.此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因和vgf基因而获得：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，使用通过在western reserve株痘苗病毒中缺失tk基因和vgf基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“vv_dd”。
44.此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因并将hsv-tk基因插入该痘苗病毒中而获得：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
45.此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因并将突变的hsv-tk基因插入该痘苗病毒中而获得：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。在本发明的一个实施方式中，重组痘苗病毒是通过在wyeth株痘苗病毒中缺失tk基因并在缺失位置插入编码seq id no：1的hsv-tk片段(1-330aa)的基因而获得的，该病毒被命名为“ots-412”。此外，在本发明的一个实施方式中，使用通过从western reserve株痘苗病毒中缺失tk基因并在缺失位置插入编码hsv-tk基因的seq id no：2的hsv-tk变体的基因而获得的重组痘苗病毒，并且将该病毒命名为“wots-418”。
46.此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因并将gm-csf基因插入该痘苗病毒中而获得：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
47.此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因并将c-csf基因插入该痘苗病毒中而获得：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
48.此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因并将胞嘧啶脱氨酶(cd)基因插入该痘苗病毒中而获得：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
49.此外，重组痘苗病毒可以通过在属于以下的痘苗病毒中缺失tk基因并将生长抑素
受体2基因插入该痘苗病毒中而获得：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
50.此外，重组痘苗病毒可以通过在痘苗病毒中缺失tk基因并将选自由各自编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、突变的hsv-tk、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、胞嘧啶脱氨酶(cd)或生长抑素受体2的基因组成的组中的任何两种或更多种基因插入该痘苗病毒中来获得，所述痘苗病毒属于：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
51.此外，重组痘苗病毒可以通过在痘苗病毒中缺失tk基因和vgf基因并将选自由各自编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、突变的hsv-tk、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、胞嘧啶脱氨酶(cd)或生长抑素受体2的基因及其组合组成的组中的任一种基因插入该痘苗病毒中来获得，所述痘苗病毒属于：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
52.如本文所用，术语“基因缺失”是指由于基因的部分或完全缺失或外源基因插入其中而导致的基因不表达。在基因中发生部分缺失的情况下，该基因表达的多肽的n末端或c末端的一些氨基酸可能会缺失。
53.如本文所用，术语“胸苷激酶(tk)”是指称为胸苷激酶并参与核苷酸生物合成的酶。tk是一种用于细胞和病毒中的核苷酸生物合成的酶。这里，对于细胞而言，正常细胞不再分裂，因此其中不存在tk；即使对于快速分裂的细胞，如毛囊细胞，tk的存在量也不足以让病毒利用。从这些观点来看，病毒通过缺失其中的tk基因而只在存在tk的癌细胞的情况下能够增殖，从而可以选择性地杀死癌细胞。
54.如本文所用，术语“痘苗生长因子(vgf)”是指与表皮生长因子具有序列同源性并刺激感染细胞周围的细胞增殖的多肽。痘苗病毒在增殖细胞中复制得更好，因此可以有利地用于体内病毒复制。为了使溶瘤病毒仅在癌细胞中更特异性地增殖，除了tk基因缺失之外，该病毒还可以另外进行vgf基因缺失。
55.如本文所用，术语“gm-csf”被称为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，是指由巨噬细胞、t细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的蛋白质。gm-csf刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)和单核细胞。此外，gm-csf迅速增加巨噬细胞的数量，从而诱导免疫反应。gm-csf可以是人类来源的并且可以是具有genbank：aaa52578.1的序列的蛋白质。
56.如本文所用，术语“cd”被称为胞嘧啶脱氨酶，是指催化胞嘧啶水解脱氨为尿嘧啶和氨的酶。
57.如本文所用，术语“g-csf”被称为粒细胞集落刺激因子，是指由巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等在受到炎症或内毒素刺激时产生的细胞因子。g-csf促进嗜中性粒细胞的产生。g-csf可以是人类来源的(rhgcsf)并且可以是具有genbank：aaa03056.1的序列的蛋白质。
58.如本文所用，术语“生长抑素受体2”是指由人类中的sstr2基因编码的蛋白质。生长抑素受体2主要在肿瘤中表达，并且过度表达生长抑素受体2的神经内分泌肿瘤患者显示
出预后改善。生长抑素受体2具有刺激许多细胞(包括癌细胞)凋亡的能力。
59.如本文所用，术语“羟基脲”是指具有下式的化合物。
60.[式1]
[0061][0062]
羟基脲被认为是抑制dna合成的抗癌剂。然而，其确切的作用机制尚未阐明。此外，羟基脲可以含有羟基脲的商品化药物的形式包含在药物组合物中。含有羟基脲的商品化药物的例子可以包括但不限于droxia
tm
、mylocel
tm
、和胶囊。羟基脲可以口服，也可以肠胃外施用。
[0063]
痘苗病毒的剂量根据个体的病症和体重、疾病严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。剂量可以使得患者接受1
×
105至1
×
10
18
的病毒颗粒、传染性病毒单位(tcid
50
)、或噬菌斑形成单位(pfu)的痘苗病毒。具体地，剂量可以使得患者接受1
×
105、2
×
105、5
×
105、1
×
106、2
×
106、5
×
106、1
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108、5
×
108、1
×
109、2
××
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
、5
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
、1
×
10
15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
或更高的病毒颗粒、传染性病毒单位、或噬斑形成单位的痘苗病毒，并且其中还可以包括上述数值之间的各个数值和范围。优选地，痘苗病毒可以1
×
105pfu至1
×
10
10
pfu的剂量施用。更优选地，痘苗病毒可以等于或大于1
×
105pfu且低于1
×
109pfu的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，痘苗病毒以1
×
105pfu或1
×
107pfu施用。
[0064]
此外，羟基脲可以1mg/kg/天至100mg/kg/天或10mg/kg/天至90mg/kg/天的剂量施用。具体地，羟基脲可以10mg/kg/天至90mg/kg/天、15mg/kg/天至80mg/kg/天、20mg/kg/天至70mg/kg/天、25mg/kg/天至65mg/kg/天、或30mg/kg/天至60mg/kg/天的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，羟基脲以30mg/kg/天或60mg/kg/天施用。取决于剂量，羟基脲可以每天数次分剂量施用。具体地，羟基脲可以每天施用1至4次或每天1至2次。
[0065]
癌症可以是实体癌或血癌。具体地，血癌可以是选自由淋巴瘤、急性白血病和多发性骨髓瘤组成的组中的任一种。实体癌可以是选自由以下组成的组中的任一种：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。
[0066]
此外，本发明的药物组合物还可以包含生理上可接受的运载体。此外，本发明的药物组合物还可以包含合适的赋形剂和通常用于制备药物组合物的稀释剂。此外，药物组合物可以按照常规方法以注射剂形式配制。
[0067]
在配制成肠胃外施用的制剂的情况下，药物组合物可以配制成无菌水溶液、非水溶液、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。作为非水溶液或悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、注射用酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用witepsol
tm
、聚乙二醇、tween
tm 61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
[0068]
关于施用途径、剂量和施用频率，药物组合物可以根据患者的状况和有无副作用
以多种方式和量施用于对象；并且本领域技术人员可以在合适的范围内选择最佳的施用途径、剂量和施用频率。此外，该药物组合物可以与对于待治疗疾病的治疗效果已知的另一种药物或生理活性物质联合施用，或者可以以与其他药物的组合制剂的形式配制。
[0069]
药物组合物可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过任何合适的方法进行，例如瘤内、腹膜内、皮下、皮内、结内、静脉内或动脉内施用。其中，可以优选瘤内、腹膜内或静脉内施用。另一方面，药物组合物的剂量可以根据施用方案、总剂量和患者的健康状况来确定。
[0070]
用于治疗癌症的药物组合物的特征可以在于痘苗病毒的癌症选择性增加。
[0071]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，其包含含有痘苗病毒作为活性成分的第一组合物和含有羟基脲作为活性成分的第二组合物。
[0072]
痘苗病毒如上针对药物组合物所述。
[0073]
包含羟基脲作为活性成分的第二组合物可以是商品化药物。含有羟基脲的商品化药物的例子可以包括droxia
tm
、mylocel
tm
、和胶囊。第二组合物可以口服，也可以肠胃外施用。
[0074]
痘苗病毒的剂量根据个体的病症和体重、疾病严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。剂量可以使得患者接受1
×
105至1
×
10
18
的病毒颗粒、传染性病毒单位(tcid
50
)、或噬菌斑形成单位(pfu)的痘苗病毒。具体地，剂量可以使得患者接受1
×
105、2
×
105、5
×
105、1
×
106、2
×
106、5
×
106、1
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108、5
×
108、1
×
109、2
××
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
、5
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
、1
×
10
15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
或更高的病毒颗粒、传染性病毒单位、或噬斑形成单位的痘苗病毒，并且其中还可以包括上述数值之间的各个数值和范围。优选地，痘苗病毒可以1
×
105pfu至1
×
10
10
pfu的剂量施用。更优选地，痘苗病毒可以等于或大于1
×
105pfu且低于1
×
109pfu的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，痘苗病毒以1
×
105pfu或1
×
107pfu施用。
[0075]
此外，第二组合物可以1mg/kg/天至100mg/kg/天或10mg/kg/天至90mg/kg/天的剂量施用。具体地，第二组合物可以10mg/kg/天至90mg/kg/天、15mg/kg/天至80mg/kg/天、20mg/kg/天至70mg/kg/天、25mg/kg/天至65mg/kg/天、或30mg/kg/天至60mg/kg/天的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，第二组合物以30mg/kg/天或60mg/kg/天施用。取决于剂量，第二组合物可以每天数次分剂量施用。具体地，第二组合物可以每天施用1至4次或每天1至2次。
[0076]
癌症可以是实体癌或血癌。具体地，血癌可以是选自由淋巴瘤、急性白血病和多发性骨髓瘤组成的组中的任一种。实体癌可以是选自由以下组成的组中的任一种：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。
[0077]
第一组合物和第二组合物还可以包含生理上可接受的运载体。此外，本发明的试剂盒中包含的组合物还可以包含合适的赋形剂和通常用于制备药物组合物的稀释剂。此外，组合物可以按照常规方法以注射剂形式配制。
[0078]
在配制成肠胃外施用的制剂的情况下，第一组合物和第二组合物可以配制成无菌水溶液、非水溶液、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。作为非水溶液或悬浮剂，可以使用丙二
醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、注射用酯如油酸乙酯等。作为栓剂的基质，可以使用witepsol
tm
、聚乙二醇、tween
tm 61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
[0079]
关于施用途径、剂量和施用频率，第一组合物和第二组合物可以根据患者的状况和有无副作用以多种方式和量施用于对象；并且本领域技术人员可以在合适的范围内选择最佳的施用途径、剂量和施用频率。此外，该药物组合物可以与对于待治疗疾病的治疗效果已知的另一种药物或生理活性物质联合施用，或者可以以与其他药物的组合制剂的形式配制。
[0080]
第二组合物可以口服或肠胃外施用。具体地，第二组合物可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过腹膜内、动脉内或静脉内施用来进行。
[0081]
第一组合物可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过任何合适的方法进行，例如瘤内、腹膜内、皮下、皮内、结内、动脉内或静脉内施用。其中，可以优选瘤内、腹膜内或静脉内施用。另一方面，第一组合物的剂量和第二组合物的剂量可以根据施用方案、总剂量和患者的健康状况来确定。
[0082]
此外，第一组合物可以施用1至10次或2至5次，并且可以7至30天的间隔将其施用于个体。具体地，可以7天、14天、21天或30天的间隔施用第一组合物。
[0083]
第二组合物可以在施用第一组合物之前或之后施用。具体而言，第二组合物可以从第一组合物施用前3至5天开始每天一次连续施用，并且可以从第一组合物施用24小时以内或24小时后开始每天一次连续施用9至28天。在本发明的一个实施方式中，第二组合物可以从第一组合物施用前1至3天开始每天一次连续施用，并且可以在第一组合物施用后每天一次连续施用13天、17天、18天或28天。
[0084]
在本发明的又一个方面，提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向患有癌症的个体施用痘苗病毒和羟基脲。
[0085]
痘苗病毒可以属于但不限于：western reserve、nyvac、wyeth、lc16m8、lister、copenhagen、天坛、ussr、tashkent、evans、ihd-j或ihd-w痘苗病毒株。
[0086]
痘苗病毒和羟基脲可以同时、依次或以相反的顺序联合施用。具体而言，痘苗病毒和羟基脲可以同时施用。此外，可以先施用羟基脲，然后施用痘苗病毒。此外，可以先施用痘苗病毒，然后施用羟基脲。另外，可以先施用羟基脲，然后施用痘苗病毒，然后再次施用羟基脲。
[0087]
痘苗病毒的剂量根据个体的病症和体重、疾病严重程度、药物类型、施用途径和时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。剂量可以使得患者接受1
×
105至1
×
10
18
的病毒颗粒、传染性病毒单位(tcid
50
)、或噬菌斑形成单位(pfu)的痘苗病毒。具体地，剂量可以使得患者接受1
×
105、2
×
105、5
×
105、1
×
106、2
×
106、5
×
106、1
×
107、2
×
107、5
×
107、1
×
108、2
×
108、5
×
108、1
×
109、2
××
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
、5
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
、1
×
10
15
、1
×
10
16
、1
×
10
17
或更高的病毒颗粒、传染性病毒单位、或噬斑形成单位的痘苗病毒，并且其中还可以包括上述数值之间的各种数值和范围。优选地，痘苗病毒可以1
×
105pfu至1
×
10
10
pfu的剂量施用。更优选地，痘苗病毒可以等于或大于1
×
105pfu且低于1
×
109pfu的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，痘苗病毒以1
×
105pfu或1
×
107pfu施用。
[0088]
此外，羟基脲可以1mg/kg/天至100mg/kg/天或10mg/kg/天至90mg/kg/天的剂量施
用。具体地，羟基脲可以10mg/kg/天至90mg/kg/天、15mg/kg/天至80mg/kg/天、20mg/kg/天至70mg/kg/天、25mg/kg/天至65mg/kg/天、或30mg/kg/天至60mg/kg/天的剂量施用。在本发明的一个实施方式中，羟基脲以30mg/kg/天或60mg/kg/天施用。取决于剂量，羟基脲可以每天数次分剂量施用。具体地，羟基脲可以每天施用1至4次或每天1至2次。
[0089]
此外，痘苗病毒可以施用1至10次或2至5次，并且可以7至30天的间隔将其施用于个体。具体地，可以7天、14天、21天或30天的间隔施用痘苗病毒。
[0090]
羟基脲可以在施用痘苗病毒之前、期间或之后施用。具体地，羟基脲可以在施用痘苗病毒之前或之后施用。羟基脲可以从痘苗病毒施用前3至5天开始每天一次连续施用，并且可以从痘苗病毒施用24小时后开始每天一次连续施用9至28天。在本发明的一个实施方式中，羟基脲可以从痘苗病毒施用前1至3天开始每天一次连续施用，并且可以在痘苗病毒施用后每天一次连续施用13天、17天、18天或28天。
[0091]
癌症可以是实体癌或血癌。具体地，血癌可以是选自由淋巴瘤、急性白血病和多发性骨髓瘤组成的组中的任一种。实体癌可以是选自由以下组成的组中的任一种：肺癌、结直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、胸腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、直肠癌、胆囊癌、胆道癌、胰腺癌及其组合。
[0092]
羟基脲可以口服或肠胃外施用。具体地，羟基脲可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过腹膜内、动脉内或静脉内施用来进行。
[0093]
痘苗病毒和羟基脲可以肠胃外施用，并且这种施用可以通过任何合适的方法进行，例如瘤内、腹膜内、皮下、皮内、结内、静脉内或动脉内施用。其中，可以优选瘤内、腹膜内或静脉内施用。另一方面，痘苗病毒和羟基脲的剂量可以根据施用方案、总剂量和患者的健康状况来确定。
[0094]
如本文所用，术语“个体”是指患有或正在遭受可通过施用本发明的药物组合物而缓解、抑制或治疗的疾病的人。
[0095]
如本文所用，术语“施用”是指通过适当的方法将有效量的物质引入个体，痘苗病毒和羟基脲的施用可以通过使物质到达目标组织的一般途径进行。
[0096]
此外，痘苗病毒和羟基脲可以与对于待治疗疾病的治疗效果已知的另一种药物或生理活性物质联合施用，或者可以以与其他药物的组合制剂的形式配制。
[0097]
在本发明的再一方面，提供了包含痘苗病毒和羟基脲的组合物用于预防或治疗癌症的用途。
[0098]
在本发明的再一方面，提供了包含痘苗病毒和羟基脲的组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
[0099]
在本发明的再一方面，提供了一种抗癌佐剂，该抗癌佐剂包含羟基脲作为活性成分。这里，羟基脲如上针对药物组合物所述。此外，抗癌佐剂的特征可以在于其用作包含痘苗病毒作为活性成分的抗癌剂的抗癌佐剂。抗癌佐剂的特征可以在于其改善、增强或增加痘苗病毒的抗癌活性。抗癌佐剂的特征可以在于其增加痘苗病毒的癌症选择性。
具体实施方式
[0100]
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不限于此。
[0101]
制备例1.生产重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-、wr vv
tk-)
[0102]
制备例1.1.穿梭质粒载体的构建
[0103]
为了生产缺失胸苷激酶(tk)基因的重组痘苗病毒，野生型痘苗病毒，即wyeth株(nyc卫生局)和western reserve株购自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)。对于重组，使用含有萤火虫荧光素酶报告物(p7.5启动子)基因或gfp基因的穿梭质粒载体对野生型痘苗病毒中的tk区域进行置换。
[0104]
制备例1.2.生产重组痘苗病毒
[0105]
为了获得重组病毒，将hela细胞(atcc)以每孔4
×
105个细胞接种在6孔板中，然后在含有10％胎牛血清的emem培养基中进行培养。随后，以0.05moi进行野生型痘苗病毒处理。2小时后，将培养基更换为含有2％胎牛血清的emem培养基，然后使用xfect
tm
聚合物(clonetech 631317，usa)用4μg制备例1.1中构建并线性化的穿梭质粒载体转染细胞。培养4小时。随后，将培养基更换为含有2％胎牛血清的emem培养基，再培养72小时。最后收集感染细胞，然后重复冻融3次。随后，通过超声裂解细胞，采用蔗糖垫层法获得游离的重组痘苗病毒，命名为wyeth vv
tk-或wr vv tk-。
[0106]
制备例2.生产重组痘苗病毒(ots-412)
[0107]
为了生产缺失胸苷激酶(tk)基因并表达突变的单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因的重组痘苗病毒，使用其中重组有合成的seq id no：1的突变1型hsv-tk基因(pse/l启动子)和萤火虫萤光素酶报告物(p7.5启动子)基因的puc57amp+质粒(genewiz，usa)作为穿梭载体，对wyeth株野生型痘苗病毒中的tk区域进行置换。使用如上构建的穿梭载体以与制备例1.2中相同的方式获得重组痘苗病毒，并将该病毒命名为ots-412。
[0108]
制备例3.生产重组痘苗病毒(wots-418)
[0109]
为了生产缺失胸苷激酶(tk)基因并表达突变的单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因的重组痘苗病毒，使用其中重组有合成的seq id no：2的突变1型hsv-tk基因(pse/l启动子)和萤火虫萤光素酶报告物(p7.5启动子)基因的puc57amp+质粒(genewiz，usa)作为穿梭载体，对western reserve株野生型痘苗病毒中的tk区域进行置换。使用如上构建的穿梭载体以与制备例1.2中相同的方式获得重组痘苗病毒，并将该病毒命名为wots-418。
[0110]
制备例4.生产重组痘苗病毒(wr vv_dd)
[0111]
为了生产缺失胸苷激酶(tk)基因和痘苗生长因子(vgf)基因的重组痘苗病毒，使用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，egfp)基因的穿梭质粒对western reserve株野生型痘苗病毒中的tk区域进行置换，并且使用含有lacz基因的穿梭质粒对同一病毒中的vgf基因区域进行置换。使用含有egfp基因的穿梭质粒和含有lacz基因的穿梭质粒，以与制备例1.2中相同的方式获得重组痘苗病毒，并将该病毒命名为vv_dd。
[0112]
实验例1.野生型痘苗病毒(wr)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症治疗效果的确认：renca(i)
[0113]
实验例1.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
[0114]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，10周龄)经历2天的驯化期，然后以5
×
106个细胞皮下移植renca癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至80mm3，然后开始施用野生型痘苗病毒。另一方面，western reserve株野生型
痘苗病毒(wr)在同种异体移植模型中具有比wyeth株野生型痘苗病毒更强的增殖能力。
[0115]
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了腹膜内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用野生型痘苗病毒(wr，1
×
105pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了共同施用野生型痘苗病毒(wr，1
×
105pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。野生型痘苗病毒瘤内施用一次；并且从施用野生型痘苗病毒前1天开始至施用后第14天，除野生型痘苗病毒施用日外，每周5次腹膜内施用羟基脲。
[0116]
实验例1.2.检查肿瘤体积的变化
[0117]
在实验例1.1中各组小鼠药物施用后第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积。结果确认了，与阴性对照组相比，阳性对照组小鼠的肿瘤体积被抑制，而实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图1)。
[0118]
实验例1.3.检查体重的变化
[0119]
对实验例1.1中的阴性对照组、阳性对照组和实验组的小鼠每次药物施用后在第3、7、10、14天测量体重。结果，所有三组都没有显著的体重减轻(图2)。
[0120]
实验例2.重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症治疗效果的确认：renca(ii)
[0121]
实验例2.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
[0122]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5
×
106个细胞同种异体移植renca癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，western reserve株衍生的重组痘苗病毒(wr vv
tk-)在同种异体移植模型中具有比wyeth株衍生的重组痘苗病毒更强的增殖能力。
[0123]
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝8)。将接受了腹膜内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-，1
×
107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(60mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒瘤内施用两次；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第21天，除重组痘苗病毒施用日外，每周6次腹膜内施用羟基脲。
[0124]
实验例2.2.检查肿瘤体积的变化
[0125]
在实验例2.1中各组小鼠药物施用后第0、3、7、10、14、17和21天测量肿瘤体积。结果确认了，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图3)。
[0126]
实验例3.重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症治疗效果的确认：renca(iii)
[0127]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，10周龄)经历2天的驯化期，然后以5
×
106个细胞在左大腿处皮下移植renca癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。
[0128]
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了腹膜内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-，1
×
105pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒瘤内施用一次；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第14天，除重组痘苗病毒施用日外，每周6次腹膜内施用羟基脲。
[0129]
各组小鼠药物施用后第0、3、7、10和14天测量肿瘤体积。结果确定了，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积的生长被抑制了约25％(图4)。
[0130]
实验例4.重组痘苗病毒(wr vv_dd)和羟基脲对小鼠黑色素瘤移植小鼠的癌症治疗效果的确认：b16f10
[0131]
使购自koatech(韩国)的c57bl/6小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以5
×
105个细胞皮下移植小鼠黑色素瘤癌细胞系(atcc，b16f10)。观察肿瘤体积直至达到50mm3至100mm3，然后开始施用重组痘苗病毒(wr vv_dd)。重组痘苗病毒(wr vv_dd)是通过对western reserve株痘苗病毒中的胸苷激酶(tk)和痘苗生长因子(vgf)区域进行双重缺失获得的，并且在同种异体移植模型中具有有限的增殖能力。
[0132]
将产生的小鼠黑色素瘤移植小鼠分为4组(n＝6)。将接受了腹膜内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了单独施用羟基脲(30mg/kg)或重组痘苗病毒(vv_dd，1
×
106pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。在第0天和第5天腹膜内施用重组痘苗病毒；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第15天，除重组痘苗病毒施用日外，每周6次腹膜内施用羟基脲。
[0133]
在对各组小鼠药物施用前1天和施用后第4天和第7天测量肿瘤体积。结果确认了，与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被显著抑制(图5)。从这些结果确认了，在重组痘苗病毒(vv_dd)和羟基脲共同施用的情况下观察到协同效应。
[0134]
实验例5.重组痘苗病毒(wots-418)和羟基脲对人肺癌细胞系移植小鼠的癌症治疗效果的确认：nci-h460
[0135]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c nu/nu小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以5
×
106个细胞皮下异种移植nci-h460人肺癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒(wots-418)。另一方面，western reserve株衍生的重组痘苗病毒(wots-418)在人肺癌细胞系(nci-h460)异种移植小鼠中具有增殖能力。
[0136]
将产生的人肺癌细胞系移植小鼠分为2组(n＝4)。将接受了腹膜内施用生理盐水的组设置为对照组，将接受了共同施用重组痘苗病毒(wots-418，1
×
107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒腹膜内施用一次；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第15天，除重组痘苗病毒施用日外，每周6次腹膜内施用羟基脲。
[0137]
在各组小鼠药物施用后第0、5、10、12和15天测量肿瘤体积。结果确认了，与对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被抑制了约40％(图6)。
[0138]
实验例6.重组痘苗病毒(wots-418)和羟基脲在小鼠结直肠癌细胞移植小鼠中的存活率分析：ct-26
[0139]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以1
×
106个细胞皮下移植小鼠结直肠癌细胞系(ct-26，korea cell line bank)。7天后，开始施用重组痘苗病毒(wots-418)和羟基脲。另一方面，western reserve株衍生的重组痘苗病毒(wots-418)在同种异体移植模型中具有比wyeth株衍生的重组痘苗病毒更强的增殖能力。
[0140]
将产生的小鼠结直肠癌细胞系移植小鼠分为2组(n＝12)，即接受了腹膜内施用重组痘苗病毒(wots-418，1
×
107pfu)的组和接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(30mg/
kg)的组。重组痘苗病毒腹膜内施用一次；羟基脲从重组痘苗病毒施用后1天开始连续腹膜内施用5次。
[0141]
分析各组小鼠的存活曲线。结果，对于仅接受了重组痘苗病毒施用的组，所有小鼠在施用后25天死亡；然而，30％或更高的接受了羟基脲和重组痘苗病毒共同施用的小鼠存活了55天或更长(图7)。从这些结果可以确认，在共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的情况下，与仅施用重组痘苗病毒的情况相比，安全性提高。
[0142]
实验例7.重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症治疗效果的确认：renca(iv)
[0143]
实验例7.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
[0144]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后以5
×
106个细胞同种异体移植renca癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。
[0145]
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为4组(n＝4)。将接受了瘤内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-，1
×
107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-，1
×
107pfu)和重组人粒细胞集落刺激因子(rhg-csf，75μg/kg)的组、以及接受了重组病毒(vv
tk-，1
×
107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。瘤内施用重组痘苗病毒，从施用重组痘苗病毒前3天开始，每周5次腹膜内施用rhg-csf或羟基脲，直至处死。
[0146]
实验例7.2.检查肿瘤体积的变化
[0147]
施用后第16天处死实验例7.1的各组小鼠，并测量肿瘤体积。结果，与初始肿瘤体积相比，阳性对照组的小鼠和接受了共同施用重组痘苗病毒和rhg-csf的实验组的小鼠显示出近10倍的增加。与初始肿瘤体积相比，接受重组痘苗病毒和羟基脲共同施用的实验组小鼠显示出近8倍的增加，这是观察到的最受抑制的肿瘤体积(图8)。
[0148]
实验例7.3.确认抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic t lymphocyte，ctl)活化
[0149]
为确认共同施用重组痘苗病毒与羟基脲的情况下是否获得肿瘤特异性抗癌作用，在第16天处死实验例7.1中的各组小鼠，然后从各组中分离出脾脏中的淋巴细胞。然后，将分离出的淋巴细胞分别注射到新的正常小鼠体内。进行了癌移植并观察了肿瘤体积。具体地，一周后，将小鼠以5
×
106个细胞同种异体移植renca癌细胞系(korea cell line bank)，并在第19天测量肿瘤体积。
[0150]
结果，在注射了从接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组的小鼠中收集的脾细胞的小鼠中，肿瘤生长被显著抑制。另一方面，在注射了从其余组的小鼠中收集的脾细胞的每只小鼠中，肿瘤生长没有被显著抑制(图9)。从这些结果确认了，接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组不仅产生了免疫细胞例如细胞毒性t细胞，而且活化了适应性免疫。
[0151]
实验例8.重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症治疗效果的确认：renca(v)
[0152]
实验例8.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
[0153]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历一周的驯化期，然后以5
×
106个细胞同种异体移植renca癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体
积直至达到50mm3至100mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，wyeth株衍生的重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-)在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中几乎不增殖。
[0154]
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为4组(n＝4)。将接受了瘤内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了单独施用羟基脲的组和接受了单独施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-，1
×
107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-，1
×
107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。瘤内施用重组痘苗病毒，从施用重组痘苗病毒前3天开始，每周5次腹膜内施用羟基脲，直至处死。
[0155]
实验例8.2.检查肿瘤体积的变化
[0156]
在实验例8.1中各组小鼠药物施用后第0、4、10、15和22天测量肿瘤体积。结果，与初始肿瘤体积相比，阳性对照组小鼠的肿瘤体积增加了约11至13倍。另一方面，与初始肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积增加了约4倍(图10)。
[0157]
实验例8.3.确认肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)活化
[0158]
为确认重组痘苗病毒与羟基脲共同施用的情况下是否获得肿瘤特异性抗癌作用，在第16天处死实验例8.1中的各组小鼠，然后从各组中分离出脾细胞和细胞毒性t淋巴细胞(cd8+t细胞)。然后，将分离出的脾细胞和细胞毒性t淋巴细胞分别注射到新的正常小鼠体内。进行了癌移植并观察了肿瘤体积。具体地，一周后，将小鼠以5
×
106个细胞同种异体移植renca癌细胞系(korea cell line bank)，并在第7、10、14、18和21天测量肿瘤体积。
[0159]
结果，在注射了从实验组小鼠收集的脾细胞或t淋巴细胞的小鼠中，肿瘤生长被显著抑制。另一方面，在注射了从其余组的小鼠中收集的脾细胞或t淋巴细胞的小鼠中，肿瘤生长没有被显著抑制(图11)。从这些结果确认了，接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组中，不仅是由于t淋巴细胞，而且由于脾中形成的其他免疫细胞，具有抗癌功效的适应性免疫被活化(图11和图12)。
[0160]
实验例9.重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-)和羟基脲对小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症治疗效果的确认：renca(vi)
[0161]
实验例9.1.小鼠肾癌细胞移植小鼠的产生及药物施用
[0162]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5
×
106个细胞同种异体移植renca癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，wyeth株衍生的重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-)在小鼠肾癌细胞移植小鼠模型中几乎不增殖。
[0163]
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了瘤内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-，1
×
107pfu)的组作为阳性对照组。另外，将接受了施用重组痘苗病毒(wyeth vv
tk-，1
×
107pfu)和羟基脲(30mg/kg)的组设置为实验组。瘤内施用重组痘苗病毒，从施用重组痘苗病毒前1天开始，每周6次腹膜内施用羟基脲，直至处死。
[0164]
实验例9.2.检查肿瘤体积的变化
[0165]
施用后第22天处死实验例9.1的各组小鼠，并测量肿瘤体积。结果，与阴性对照组小鼠的肿瘤体积相比，阳性对照组小鼠的肿瘤体积被抑制了约25％。特别地，与阴性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被抑制了约37.5％，并且与阳性对照组小鼠的肿瘤体积相比，实验组小鼠的肿瘤体积被抑制了约15％(图13)。
[0166]
实验例9.3.脾脏组织微环境的确认
[0167]
当共同施用重组痘苗病毒和羟基脲时，对免疫细胞在肿瘤微环境中的分布进行了分析。为了分析，使用二氨基联苯胺(dab)进行免疫组织化学染色。具体地，从各组的小鼠中收集脾脏。将脾组织切成0.4μm并干燥。随后，用pbs洗涤组织，然后用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)处理。用按1:50的比例稀释的一抗(抗cd3抗体(abcam)、抗cd4抗体(bd biosciences)、抗cd8抗体(bd biosciences))对组织进行处理，使反应在4℃过夜进行。第二天，用pbs洗涤组织，然后在室温下与二抗(dako)反应30分钟。再次用pbs洗涤组织，使用abc试剂盒(dako)进行反应，然后通过添加h2o2使其显色。然后，对组织进行脱水，然后封装。
[0168]
结果确认了，cd4+t细胞和cd8+t细胞更丰富地分布在实验组小鼠的肿瘤组织中(图14)。从这些结果确认了，在共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的情况下，与仅施用重组痘苗病毒的情况相比，脾组织中的cd4+t细胞和cd8+t细胞更加分化和活化。也就是说，确认了在共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的情况下，与仅施用重组痘苗病毒的情况相比，适应性免疫被更好地活化。
[0169]
实验例10.小鼠乳腺癌细胞移植小鼠中由重组痘苗病毒(ots-412)和羟基脲引起的抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)活化的确认：4t1(i)
[0170]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，7周龄)经历一周的驯化期，然后以1
×
106个细胞同种异体移植4t1癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，wyeth株衍生的重组痘苗病毒(ots-412)在小鼠乳腺癌细胞移植小鼠模型中几乎不增殖。另外，乳腺癌细胞系移植小鼠是在包括肺组织在内的全身进行转移的动物模型，转移一般通过肿瘤表面的结节数来评估。
[0171]
将产生的小鼠乳腺癌细胞移植小鼠分为4组(n＝5)。将接受了瘤内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了共同施用重组痘苗病毒(ots-412，1
×
107pfu)或羟基脲(30mg/kg)的组设置为阳性对照组。将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲的组设置为实验组。重组痘苗病毒先瘤内施用，然后第一次施用后第7天再次施用。从施用重组痘苗病毒前3天开始到处死前3天，除重组痘苗病毒施用日外，每天一次腹膜内施用羟基脲。
[0172]
药物施用后第18天处死各组小鼠，从小鼠中收集血液和脾脏。通过流式细胞术分析免疫细胞在血液和脾细胞中的分布。结果确认了，诱导肿瘤免疫反应的cd4+t细胞和cd8+t细胞在血液和脾脏中的分布在实验组小鼠中最高。此外发现，与阴性对照组和阳性对照组的小鼠相比，实验组小鼠中具有免疫抑制功能的髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，mdsc)的数量显著减少(图15)。
[0173]
实验例11.重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和羟基脲对小鼠乳腺癌细胞移植小鼠的适应性免疫增强作用的确认：4t1(ii)
[0174]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，10周龄)经历2天的驯化期，然后以1
×
106个细胞在左大腿处皮下移植4t1癌细胞系(korea cell line bank)。两天后，将相同数量的4t1癌细胞系皮下移植到小鼠的右大腿。观察左大腿上皮下移植的肿瘤直至其体积达到50mm3至200mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。
[0175]
将产生的小鼠乳腺癌细胞移植小鼠分为3组(n＝6)。将接受了瘤内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-，1
×
105pfu)的组设置为阳
性对照组。另外，将共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(90mg/kg)的组设置为实验组。将重组痘苗病毒施用到左侧肿瘤中一次，并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第14天，除重组痘苗病毒施用日外，每周6次腹膜内施用羟基脲。
[0176]
在各组小鼠药物施用后第0、3、7、10和14天测量两个大腿皮下移植的肿瘤体积。结果确认了，与阳性对照组小鼠的左侧肿瘤体积相比，实验组小鼠的左侧肿瘤体积的生长被抑制了约35％(图16)。此外，与阳性对照组小鼠的右侧肿瘤体积相比，实验组小鼠的右侧肿瘤体积的生长中被抑制了约45％(图17)。根据这些结果，确认了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲对周围肿瘤的影响。
[0177]
也就是说确认了，在通过痘苗病毒和羟基脲共同施用对肿瘤进行局部处理的情况下，即使在未施用病毒的肿瘤中也观察到抗癌作用。
[0178]
实验例12.共同施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-)和羟基脲后小鼠肾癌细胞移植小鼠的癌症选择性增加的确认(i)
[0179]
使购自orient bio(釜山，韩国)的balb/c小鼠(雌性，8周龄)经历一周的驯化期，然后以5
×
106个细胞同种异体移植renca癌细胞系(korea cell line bank)。观察肿瘤体积直至达到100mm3至150mm3，然后开始施用重组痘苗病毒。另一方面，western reserve株衍生的重组痘苗病毒(wr vv
tk-)在同种异体移植模型中具有比wyeth株衍生的重组痘苗病毒更强的增殖能力。
[0180]
将产生的小鼠肾癌细胞移植小鼠分为3组(n＝8)。将接受了腹膜内施用生理盐水的组设置为阴性对照组，将接受了施用重组痘苗病毒(wr vv
tk-，1
×
107pfu)的组设置为阳性对照组。另外，将接受了共同施用重组痘苗病毒和羟基脲(60mg/kg)的组设置为实验组。重组痘苗病毒瘤内施用两次；并且从施用重组痘苗病毒前1天开始至施用后第21天，除重组痘苗病毒施用日外，每周6次腹膜内施用羟基脲。
[0181]
第22天处死各组小鼠，并从小鼠中分离出肿瘤。通过使用二氨基联苯胺(dab)进行免疫组织化学染色比较病毒增殖。具体地，从各组的小鼠中收集肿瘤组织。将肿瘤组织切成0.4μm并干燥。随后，用pbs洗涤组织，然后用牛血清白蛋白(bsa)处理。用以1:50的比例稀释的一抗(货号abin1606294，antibodies-online)对组织进行处理，使反应在4℃过夜进行。第二天，用pbs洗涤组织，然后在室温下与二抗(alexa 594，货号a21205，invitrogen)反应30分钟。再次用pbs洗涤组织，使用abc试剂盒(dako)进行反应，然后通过添加h2o2使其显色。然后，对组织进行脱水，然后封装。
[0182]
结果确认了，重组痘苗病毒更丰富地分布在实验组小鼠的肿瘤组织中(图18)。从这些结果确认了，在全身施用重组痘苗病毒时共同施用羟基脲的情况下，观察到重组痘苗病毒的更有效的肿瘤特异性增殖。
[0183]
实验例13.在正常小鼠(ii)中共同施用野生型痘苗病毒(wr)和羟基脲后存活率和癌症选择性增加的确认
[0184]
使购自orientbio(釜山，韩国)的balb/c nu/nu小鼠(雌性，7周龄)经历2天的驯化期，然后开始施用野生型western reserve株痘苗病毒(wr)。另一方面，野生型western reserve株痘苗病毒在同基因小鼠中的增殖能力有限。
[0185]
将小鼠分为两组(n＝12)。将接受了施用野生型western reserve株痘苗病毒(1
×
107pfu)的组设置为对照组，将接受了共同施用野生型western reserve株痘苗病毒与羟基
脲(50mg/kg)的组设置为实验组。野生型痘苗病毒鼻内施用一次；并且从施用野生型痘苗病毒前1天开始，除野生型痘苗病毒施用日外，每周5次腹膜内施用羟基脲。
[0186]
第8天，处死对照组和实验组小鼠，并从小鼠中分离出肾组织和肝组织。进行免疫组织化学染色。制造石蜡块，并使用二甲苯和乙醇对每个块进行脱蜡。使用去掩蔽室(decloaking chamber)对所得的块进行抗原修复。然后，将一抗(货号abin1606294，antibodies-online)连接到该块上，并将fitc标记的二抗(alexa594，货号a21205，invitrogen)连接到其上。然后，使用荧光显微镜进行观察。
[0187]
结果确认了，与对照组小鼠的肝组织和肾组织相比，病毒在实验组小鼠的肝组织和肾组织中分布和增殖较少(图19)。