本发明涉及肺癌治疗
技术领域：
：，尤其是一种药物组合物及其在制备治疗肺癌的药物中的应用，本发明还涉及该药物组合物在增加癌症患者体重中的应用。
背景技术：
：：原发性肺癌是目前世界上发病率和死亡率均占第一位的恶性肿瘤；我国更是肺癌大国，肺癌年发病人数和年死亡人数几乎占全球年发病人数的一半[1][2]。而肺癌的转移是影响患者生存的主要原因，80-90％患者的死亡是由复发转移引起的。因此，肺癌转移的防治是目前全球关注的重点课题。转移机制复杂，涉及上皮间质转化、血管新生、免疫逃逸、肿瘤微环境、细胞粘附分子、获得失巢凋亡抗性等多个环节[3]，特别是癌相关成纤维细胞的激活在转移中发挥极其重要的作用。对靶向治疗不敏感的转移性(中晚期)非小细胞肺癌，目前化疗仍然是主要的治疗手段。约75％的肺癌经过常规4-6个疗程一线双药联合方案化疗后会获得瘤体稳定或缩小后，按照nccn指南推荐可选择维持化疗治疗方案如培美曲塞、吉西他滨、多西他赛等。尽管培美曲塞等药物可以延长无疾病进展生存期，但最终并不能带来总生存期的获益，另外，维持化疗导致的血液学毒性、疲乏等使得大多数患者会选择停药。另外还有针对血管新生的药物如贝伐珠单抗等可延长生存期；但缺乏针对肿瘤微环境的治疗性药物。技术实现要素：基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能延长肺癌患者总生存期的药物，该药物能抑制癌相关成纤维细胞激活和癌细胞转移，且副作用低。为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，本发明提供了一种中药组合物，所述组合物含有法半夏，僵蚕，灵芝，龙葵，猫爪草，山慈菇，西洋参，浙贝母和肿节风。需要说明的是，该中药组合物即益气除痰方，本发明在此基础上提供了益气除痰方的新的用途，例如，延长肺癌患者的总生存期，以及增加肺癌患者的体重、抑制癌相关成纤维细胞激活等。优选地，所述组合物还含有半枝莲和红豆杉。本申请的发明人经多次实验发现，本发明的中药组合物能增加荷瘤小鼠的体重；更优选地，本发明的中药组合物在低剂量时，用于治疗肿瘤和延长肿瘤患者的生存期的疗效更佳；更优选地，含有法半夏、僵蚕、灵芝、龙葵、猫爪草、山慈菇、西洋参、浙贝母和肿节风的中药组合物在低剂量时，以及含有法半夏、僵蚕、灵芝、龙葵、猫爪草、山慈菇、西洋参、浙贝母、肿节风、半枝莲和红豆杉的中药组合物在高剂量时，用于减少肿瘤转移灶数目，效果更佳。优选地，所述组合物中含有以下重量份的组分：法半夏9份，僵蚕10份，灵芝12份，龙葵12份，猫爪草30份，山慈菇9份，西洋参6份，浙贝母10份，肿节风30份。优选地，所述组合物中还含有半枝莲30份和红豆杉7份。优选地，所述中药组合物还包括以下重量份的组分：①白术15份、茯苓25份、甘草6份、黄芪30份；②麦冬15份、玄参15份、女贞子20份、旱莲草20份；③桃仁15份、莪术15份、田七10份、延胡索15份；④苇根15份、桃仁15份、鱼腥草30份、冬瓜仁15份；⑤陈皮15份、茯苓25份、白术15份、浙贝母15份。需要说明的是，在益气除痰方的基础上添加了白术15份、茯苓25份、甘草6份、黄芪30份后，得到的配方在治疗气虚证时具有良好的效果；在益气除痰方的基础上添加了麦冬15份、玄参15份、女贞子20份、旱莲草20份后，得到的配方在治疗阴虚证时具有良好的效果；在益气除痰方的基础上添加了桃仁15份、莪术15份、田七10份、延胡索15份后，得到的配方在治疗血瘀证时具有良好的效果；在益气除痰方的基础上添加了苇根15份、桃仁15份、鱼腥草30份、冬瓜仁15份后，得到的配方在治疗痰热证时具有良好的效果；在益气除痰方的基础上添加了陈皮15份、茯苓25份、白术15份、浙贝母15份后，得到的配方在治疗痰湿证时具有良好的效果。在第二个方面，本发明还提供了上述的中药组合物在制备治疗肺癌的药物中的应用。优选地，所述肺癌为中晚期非小细胞肺癌。需要说明的是，采用本发明的中药组合物治疗晚期非小细胞肺癌的疗效特点是长期获益，既可以延长无进展生存期，又可以延长总生存期，特别是上述中药组合物治疗有类似于免疫治疗疗效特点的生存拖尾效应，有部分患者的无疾病进展生存期非常长。在第三个方面，本发明还提供了一种用于增加癌症患者体重的药物，所述药物包括上述的中药组合物。优选地，所述癌症为肺癌，更优选为中晚期非小细胞肺癌。在第四个方面，本发明还提供了一种抑制癌相关成纤维细胞激活、抑制肺癌转移的药物，所述药物包括上述的中药组合物。优选地，所述肺癌为中晚期非小细胞肺癌。更优选地，所述肺癌为iiib-iv期非小细胞肺癌。在第五个方面，本发明还提供了上述的中药组合物在制备用于增加lewis静脉移植模型小鼠体重的药物中的应用。综上所述，本发明的有益效果为：本发明采用传统的益气除痰方治疗肺癌患者，发现采用本发明的中药组合物治疗晚期非小细胞肺癌的疗效特点是长期获益，既可以延长无进展生存期，又可以延长总生存期，特别是上述中药组合物治疗有类似于免疫治疗疗效特点的生存拖尾效应，有部分患者的无疾病进展生存期非常长；另一方面，本发明的中药组合物可以有效增加肺癌患者的体重以及lewis静脉移植模型小鼠体重。附图说明图1为三组患者的生存曲线图，其中图1(a)为无进展生存曲线图，经log-rank分析，中西医维持组与中医维持组比较p＝0.36，中医维持组与西医维持组比较p＝0.28，中西医维持组与西医维持组p＝0.027；图1(b)为总生存曲线图，经log-rank分析，中西医维持组与中医维持组比较p＝0.88，中医维持组与西医维持组比较p＝0.03，中西医维持组与西医维持组p＝0.024；图2为三组患者的生存曲线图(删除单纯或联合抗血管维持治疗者)，其中图2(a)为无进展生存曲线图，经log-rank分析，中医+化疗维持组与中医维持组比较p＝0.59，中医维持组与化疗维持组比较p＝0.031，中医+化疗维持组与化疗维持组p＝0.005；图2(b)为总生存曲线图，经log-rank分析，中医+化疗维持组与中医维持组比较p＝0.53，中医维持组与化疗维持组比较p＝0.012，中医+化疗维持组与化疗维持组p＝0.019；图3为肺腺癌三组患者的生存曲线图，其中图3(a)为无进展生存曲线图，经log-rank分析，中西医维持组与中医维持组比较p＝0.31，中医维持组与西医维持组比较p＝0.94，中西医维持组与西医维持组p＝0.15；图3(b)为总生存曲线图，经log-rank分析，中西医维持组与中医维持组比较p＝0.76，中医维持组与西医维持组比较p＝0.033，中西医维持组与西医维持组p＝0.048；图4为肺腺癌化疗维持与中医+化疗维持患者的生存曲线图，其中经log-rank检验，p＝0.036；图5为小鼠体重曲线图(a.总图；b.前39天)；图6为小鼠生存曲线图(a.总图；b.删除非肿瘤死亡)；图7为肺部转移灶数目统计结果图；图8为各组的脏器重量及脏器指数柱状图(a、脾脏；b、肝脏；c、心脏；d、肾脏；1、脏器重量；2、脏器指数)；图9为转移瘤组织内上皮间质转化标志物的表达检测结果图(40×，sp染色法，a1，模型组肿瘤组织vimentin表达，a2，治疗组肿瘤组织vimentin表达，b1，模型组肿瘤组织e-cadherin表达，b2，治疗组肿瘤组织e-cadherin表达)；图10为转移瘤组织内a-sma、tgf-β1的表达检测结果图(40×，sp染色法，a1，模型组肿瘤组织a-sma表达，a2，治疗组肿瘤组织a-sma表达，b1，模型组肿瘤组织tgf-β1表达，b2，治疗组肿瘤组织tgf-β1表达)；图11为a549细胞24h后不同组别的迁移情况检测结果图，其中，#，与空白对照组比较，p<0.05；*,与tgf-β模型组比较，p<0.05；图12为a549细胞不同组别的上皮间质转化标志物表达情况检测结果图，其中，#，与空白对照组比较，p<0.05；*,与tgf-β模型组比较，p<0.05；图13为h1650细胞不同组别的上皮间质转化标志物表达情况检测结果图，其中，#，与空白对照组比较，p<0.05；*,与tgf-β模型组比较，p<0.05；图14为h1299细胞不同组别的上皮间质转化标志物表达情况检测结果图，其中，#，与空白对照组比较，p<0.05；*,与tgf-β模型组比较，p<0.05；图15为h1650细胞不同组别的内质网应激标志物表达及src激活情况检测结果图，其中，#，与空白对照组比较，p<0.05；*,与tgf-β模型组比较，p<0.05；图16为h1299细胞不同组别的内质网应激标志物表达及src激活情况检测结果图，其中，#，与空白对照组比较，p<0.05；*,与tgf-β模型组比较，p<0.05；图17为a549细胞不同组别中(a)xbp1mrna，(b)snailmrna，(c)sox4mrna的表达情况结果统计图，其中，#，与空白对照组比较，p<0.05；*,与tgf-β48h模型组比较，p<0.05。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本发明中的试剂、材料和实验动物均可从市场上或其它公开渠道获得。实施例1益气除痰法维持治疗中晚期非小细胞肺癌的临床疗效本实施例采用观察性研究设计分析真实世界中中医药维持治疗中晚期nsclc的疗效，为益气除痰法中医药治疗在中晚期nsclc维持治疗中的应用提供真实世界的循证证据。1、试验方法1.1研究设计观察性队列研究，按strobe标准[4]进行研究、分析和报告。1.2研究对象纳排标准纳入标准：(1)2012年02月01日至2019年1月31日于广州中医药大学第一附属医院住院或门诊治疗。(2)根据最新的nsclc临床分期uicc2017第8版评估为术后复发，iiib，iv期。经病理诊断(组织学或细胞学)确诊为nsclc。(3)患者年龄在18周岁以上，80周岁以下，男女均可。(4)既往接受规范的一线含铂双药治疗化疗方案，包括或不包括抗血管生成药物，且根据recist疗效评价标准进行影像学疗效评价，为稳定以上。一线治疗方案参照nccn指南(吉西他滨联合铂类、紫杉醇类药物联合铂类、或培美曲塞联合铂类)。(5)维持阶段接受中医药和/或化疗、抗血管治疗。(6)维持阶段开始时，根据ecogps评分标准，ps评分为0～2分(为了避免中药组和化疗组之间的组间偏倚，ps3分患者不纳入)，或kps评分≥60分。(7)中医辨证证候要素中含有脾虚、痰湿证的患者。排除标准：(1)一线/维持治疗期间接受了靶向药物、针对靶病灶的放疗、免疫治疗等其他抗肿瘤治疗。使用针对骨转移瘤、脑转移瘤等非靶病灶的姑息性放疗纳入。(2)进入维持治疗后随访次数少于1次；(3)合并有严重的其他系统疾病,包括不能控制的高危性心律失常、心瓣膜疾病、心肌梗塞的患者等，以排除患者因严重系统疾病导致的非肿瘤性死亡，减少失访偏倚。(4)重复癌的患者。(5)妊娠或哺乳期的患者。(6)重要信息如分期，病理类型，化疗方案等不能补全。(7)严重违背随访计划(维持治疗复诊时间>2月)的患者；所有符合以上纳入标准，不符合以上排除标准的患者均纳入分析，这决定了本实施例的研究样本量。1.3干预措施根据病历系统中记录的治疗方式将入组的患者分为三组：中医维持组(单纯中医维持治疗)，西医维持组(包括维持化疗，抗血管维持治疗，维持化疗联合抗血管治疗)；中西医维持组组(包括中医联合维持化疗，中医联合抗血管维持治疗，中医联合维持化疗及抗血管维持治疗)。记录患者应用中药的时间，维持治疗包括化疗、抗血管生成治疗的方案，化疗的疗程数，是否规律化疗直到进展等信息。本发明治疗肺癌的常规中成药为清金得生片(口服，每次三片，每日三次)联合中药汤剂(益气除痰方为基础方进行加减)进行治疗，中药汤剂具体如下：益气除痰方：法半夏9g，僵蚕10g，灵芝12g，龙葵12g，猫爪草30g，山慈菇9g，西洋参6g，浙贝母10g，肿节风30g。根据证候在益气除痰方基础上进行加减：气虚证：白术15g、茯苓25g、甘草6g、黄芪30g；阴虚证：麦冬15g、玄参15g、女贞子20g、旱莲草20g；血瘀证：桃仁15g、莪术15g、田七10g、延胡索15g；痰热证：苇根15g、桃仁15g、鱼腥草30g、冬瓜仁15g；痰湿证：陈皮15g、茯苓25g、白术15g、浙贝母15g；服用方法：水煎煮至250ml，一日2次，饭后服用。1.4协变量从患者的病历系统中，收集以下基线信息作为协变量：(1)社会人口学数据，包括年龄，性别，吸烟史。(2)肺癌疾病诊断资料：病理学资料(鳞癌，腺癌)、靶病灶大小、转移部位、分期、基因状态(突变型，野生型/基因状态不明)；(3)合并疾病情况：有，无；(3)一线治疗数据：治疗方案；是否联合抗血管治疗；疗程数；(4)疾病缓解状态：完全缓解(completeresponse，cr)/部分缓解(partialresponse，pr)；稳定(stabledisease，sd)；(5)维持治疗开始时kps评分。1.5随访维持治疗期间：每1.5-2个月进行一次影像学复查，按recist1.1标准对靶病灶进行疗效评估。疾病进展后：每个月电话随访一次，了解患者后续治疗情况及生存情况。如果患者失访，则以失访前的最后一次来计算总生存时间，生存状态记为生存；如果不能明确患者的具体死亡日期，则以死亡当月的第一天算为死亡时间。所有患者随访至2019年8月7日。1.6结局指标(1)无进展生存期(progress-freesurvival，pfs)：自维持治疗开始时至疾病进展/死亡(如果死亡先出现)的时间。无进展生存期按月计算。(2)总生存期(overallsurvival，os)：自维持治疗开始时至因任何原因死亡/末次随访的时间。总生存期按月计算。1.7统计方法(1)基线资料对比包括：性别(男，女)、吸烟(有，无)，分期(术后复发，iiib、iv期)、是否有转移灶(骨、肝、肺、脑、其它)、合并疾病情况(有，无)，肿瘤原发灶大小(＞5cm，≤5cm)；基因状态(未知/阴性，阳性)，一线化疗方案(培美曲塞含铂方案，吉西他滨含铂方案，紫杉醇类含铂方案)，一线抗血管生成治疗(无，有)，一线采用靶病灶的局部治疗(有，无)，一线化疗疗程数目(4，6)，一线治疗疗效(cr/pr，sd)；维持治疗开始时的kps体力评分(60，70,80,90)为分类资料。年龄作为定量资料。定量资料用均数±标准差(x±s)表示，分类变量用计数(百分数)表示。分类资料采用选用卡方检验，定量资料(年龄)采用kruskal-wallis检验(非正态分布)。(2)描述性分析患者接受维持治疗的情况。分析患者接受维持化疗、接受抗血管维持治疗、接受中医药维持治疗的比例、时间或疗程数及是否维持到疾病进展；卡方检验分析西医治疗组和中西医治疗组中维持化疗，抗血管生成治疗及是否维持到疾病进展的情况；(3)描述性分析患者接受二线治疗的情况。分析未治疗、接受化疗、接受中医药治疗、接受靶向药物治疗、接受抗血管生成治疗的比例；(4)随访时间用反向乘积极限法kaplan-meier方法进行计算[5]。(5)生存时间分析：采用kaplan-meier方法进行生存分析得到三组间的无疾病进展生存曲线图和总生存曲线图，计算得出中位pfs和中位os；使用log-rank检验评估组间生存差异(分别对比中医维持组与西医维持组，西医维持组与中西医维持组、中医维持组与中西医维持组的生存差异)。按上述方法分析单纯化疗维持与中药联合化疗维持的pfs和os情况，分析单纯化疗维持与中药维持的pfs和os情况。(6)疾病进展风险及死亡风险分析：依次采用cox单因素和多因素比例风险模型计算不同组别(中西医维持治疗相对于西医维持治疗，中西医维持治疗相对于中医维持治疗，中医维持治疗相对于西医维持治疗)的疾病进展风险hazardratio，hr和死亡风险hr及相对于的95％置信区间(confidenceintervals，cis)。首先对年龄、性别、病理类型、疾病分期等预后因素进行单因素cox回归分析；筛选出对无疾病进展生存期、总生存期影响较大的预后因素(设定放入多因素cox比例风险模型中使hr值变动超过10％及文献中报道明确与生存有关的预后因素)。将筛选出的预后因素作为协变量，采用多因素cox比例风险模型分析调整了以上预后因素后，分析治疗因素对无疾病进展风险及死亡风险的影响。有缺失数据的病例在多因素分析中予以排除。因本研究中缺失数据较少，不会对结局指标产生明显影响，本研究不进行关于缺失数据的敏感性分析。(7)亚组分析：维持治疗主要人群为腺癌亚组患者，采用kaplan-meier法绘制腺癌组的生存曲线图，采用cox比例风险模型分析腺癌亚组的疾病进展风险和死亡风险。(8)统计分析采用empower(r)(www.empowerstats.com,x&ysolutions,inc,boston,ma)进行检验，p<0.05视为有统计学意义。2、试验结果2.1入组情况本实施例共收集符合纳入标准的病历184例，排除21例，因患者接受了靶向维持治疗排除13例，维持治疗期间口服替吉奥等非肺癌批准药物3例，维持治疗期间接受了免疫治疗(入组临床试验)2例，随访间隔时间大于2月排除1例，随访＜1次排除1例，患者只接受了观察排除1例，最后纳入分析的病历共163例。2.2患者特征本实施例按中医，西医，中西医组进行三组分类，其中西医维持组中有37人；单纯中医维持组61人，中西医维持组中有65人，因此本研究纳入分析的人数为163人。其中，男性115(70.55％)人，女性48(29.45％)人，平均年龄59.59±9.70岁，吸烟患者51(31.29％)例，不吸烟患者111(68.10％)例，腺癌患者130(79.75％)人，鳞癌患者33(20.25％)，7(4.29％)例术后复发患者，27(16.56％)例iiib期患者，129(79.14％)例iv期患者，一线治疗后疗效评价为sd的有125(76.69％)，pr以上的有38(23.31％)，其中只有2例cr患者。将患者按照中医维持，西医维持，中西医维持进行三组分类后的基线情况如表1所示，在年龄、性别、合并基础病情况、肿瘤分期、转移情况、egfr基因状态、一线化疗方案、疗程数等因素进行基线水平均衡性比较，结果显示均无统计学差异(p＞0.05)。病理类型方面，西医维持组的鳞癌类型最多，而中西医维持组以腺癌类型最多，有差异性趋势，p值较小。在肺转移方面，以中西医维持组有肺转移的最多，有差异性趋势，p值较小。kps方面，西医维持组kps评分为80-90的患者比例最高，占78.38％，而中西医维持组的kps评分60-70分的患者比例最高，占43.08％，三组体力情况有差异趋势。吸烟情况方面，西医维持组的最高，占59.46％，与鳞癌类型占比高可能相关。一线抗血管治疗应用方面，西医维持组最高，占45.95％，而中医维持组最低，占3.28％，有统计学差异。一线治疗后疗效评价为pr以上的西医维持组最高，占比37.84％，而中西医维持组最低，占15.38％，三组有统计学差异。表1基线情况注：gp，吉西他滨铂类方案；ap，培美曲塞铂类方案；dp，紫杉醇类铂类方案；sd，稳定；pr，部分缓解；cr，完全缓解。2.3维持治疗情况结果参见表2，163例患者中，19人接受了维持化疗，11人接受了抗血管维持治疗，7人接受了抗血管联合化疗维持治疗，61人接受了单纯中药维持治疗，51人接受了中药维持化疗，14人接受了中药+化疗+抗血管维持治疗。西医维持组及中西医维持组接受化疗维持的方案无明显差异，均以培美曲塞为主。在西医维持组中，有18人(48.65％)接受抗血管维持治疗，中西医维持组中14人(21.54％)接受抗血管维持治疗，两组有明显差异。在西医维持组中，有21人(56.76％)接受维持治疗直到病情进展，中西医维持组中只有17人(26.98％)接受西医维持治疗直到病情进展，两组有明显差异。表2维持治疗情况2.4二线治疗情况结果参见表3，143例进展的患者中共随访到139例患者的后续抗肿瘤治疗情况，有44(31.65％)人接受了中医药或者最佳支持治疗，51(36.69％)人接受了抗肿瘤化疗，30(21.58％)人接受了靶向治疗，12(8.63％)人接受了局部治疗，2(1.44％)人入组了免疫临床试验。经卡方检验，三组的二线维持治疗手段比例无明显差异。表3后续治疗情况2.5随访及生存情况随访至2019年8月7日，采用反向kaplan-meier方法计算中位随访时间为25.07(18.73,34.00)月；其中，西医维持组，中医维持组，中西医维持组的中位随访时间依次为19.60，29.00月，21.90月，经log-rank检验分析，三组随访时间无明显统计学差异(p＝0.25)。163例患者中，有143人出现进展，截尾数据20例，截尾数据按照末次随访时间计算pfs。中位pfs为5.63(5.00,7.27)月。有93患者死亡，截尾数据70例，中位os为17.07(15.00,21.90)月，三组的随访时间均超过了中位生存期。2.6无进展生存期和总生存期情况对比分析中医维持与中西医维持两组的pfs和os，结果显示中医维持组和中西医维持组的中位pfs分别为6.27月vs6.70月(p＝0.36)；os分别为21.83月vs20.33月(p＝0.88)，均无统计学差异。从图1可以看出，pfs方面中西医维持组有部分患者稍微延长的趋势，但在总生存方面两条生存曲线基本完全重合，表明在中医维持的基础上加上西医维持延长无疾病进展生存期和总生存期的可能性很小。参见表4和5，对比分析西医维持与中医维持两组的pfs和os，结果显示西医维持组和中医维持组的中位pfs分别为3.83月vs6.27月(p＝0.28)；os分别为13.40月vs21.83月(p＝0.03)。从生存曲线可以看出，pfs方面中医维持组有部分患者有延长的趋势，os方面中药维持组优于西医维持组，中位os可延长8.43月。参见表4和5，对比分析西医维持与中西医维持两组的pfs和os，结果显示西医维持组和中西医维持组的中位pfs分别为3.83月vs6.70月(p＝0.027)；os分别为13.40月vs20.33月(p＝0.024)。从生存曲线可以看出，在pfs和os方面中西医维持组均优于西医维持组，中位pfs延长2.87月，中位os延长6.93月。表4各组的无疾病进展生存情况表5各组的总生存情况为了分析在单纯化疗维持基础上加上中医维持有无获益，进一步对比分析了化疗维持与中医联合化疗维持两组的pfs和os，结果显示化疗维持组和中医+化疗维持组的中位pfs分别为3.57月vs6.90月(p＝0.005)；os分别为11.57月vs16.97月(p＝0.019)。从图2的生存曲线可以看出，在pfs和os方面在化疗维持基础上加上中医维持，均优于单纯化疗维持，中位pfs延长3.33月，os延长5.4月。为了分析单纯中医维持与单纯化疗维持之间的获益差异，对比化疗维持与中医维持两组的pfs和os，结果显示化疗维持组和中医维持组的中位pfs分别为3.57月vs6.27月(p＝0.031)；os分别为11.57月vs21.83月(p＝0.012)，提示中医维持在pfs、os方面优于维持化疗。2.7腺癌亚组无进展生存期和总生存期比较对比分析中医维持组与中西医维持两组的pfs和os，结果显示中医维持组和中西医维持组的中位pfs分别为5.63月vs6.90月(p＝0.31)；os分别为21.83月vs17.73月(p＝0.76)，均无统计学差异。从图3可以看出，pfs方面中西医维持组较中医维持组有延长的趋势，但在总生存方面两条生存曲线基本重合，表明在中医维持的基础上加上西医维持可能具有延长无进展生存期的作用，但无总生存的获益。参见表6和7，对比分析西医维持组与中医维持两组的pfs和os，结果显示西医维持组和中医维持组的中位pfs分别为4.9vs5.63个月(p＝0.94)；os分别为16.03月vs21.83月(p＝0.033)。从图3可以看出，pfs方面两组无明显差异，在总生存方面中药维持组优于西医维持组，总生存期延长5.8月。参见表6和7，对比分析西医维持组与中西医维持两组的pfs和os，结果显示西医维持组和中医维持组的中位pfs分别为4.90月vs6.90月(p＝0.15)；os分别为16.03月vs17.73月(p＝0.048)。进一步对比分析了腺癌亚组中，化疗维持组与中医联合化疗维持两组的pfs，结果显示中医加化疗维持组优于单纯化疗维持组(p＝0.036，图4)。表6各组的无疾病进展生存情况(腺癌患者)表7各组的总生存情况(腺癌患者)2.8疾病进展风险和死亡风险的单因素分析单因素回归分析结果显示，与西医维持治疗比较，中医维持组的疾病进展风险有下降趋势(hr，95％ci:0.75，0.48-1.17)，但无统计学意义，死亡风险下降45％(hr，95％ci:0.55，0.32-0.94)；在西医维持治疗的基础上加入中医药维持可以明显下降37％的疾病进展风险(hr，95％ci:0.63，0.41-0.99)，降低43％的死亡风险(hr，95％ci:0.57，0.34-0.97)，见表8。在腺癌亚组中，与西医维持治疗比较，中医维持组的疾病进展风险与之相似(hr，95％ci:0.91，0.54-1.53)，但死亡风险下降49％(hr，95％ci:0.51，0.28-0.94)；在西医维持治疗的基础上加入中医药维持有降低疾病进展风险的趋势(hr，95％ci:0.74，0.45-1.22)，降低43％的死亡风险(hr，95％ci:0.57，0.32-1.01)，见表8。表8疾病进展风险和死亡风险的单因素cox回归分析2.9疾病进展风险和死亡风险的多因素分析采用2种方式选择cox多因素模型的协变量，第一种方式是按在基本模型中引进协变量或在完整模型中剔除协变量对治疗手段的回归系数的影响>10％的标准筛选影响疾病进展风险的协变量，采用cox模型进行协变量筛选，筛选出影响疾病进展风险的协变量包括：性别、年龄、基因状态、吸烟情况、一线化疗方案、一线抗血管治疗情况、疗程数。因一线疗效情况与一线治疗方案、基因状态相关，未放入筛选。各转移灶与分期相关，未将各转移灶放入筛选。cox多因素模型记为模型一。第二种方式选择对疾病进展风险和死亡风险有影响的，且在组间不平衡的变量作为混杂因素，来进行调整，包括：kps评分；吸烟状态；抗血管治疗；一线疗效。cox多因素模型记为模型二。分别用两种模型进行回归分析，选择更有支持西医维持治疗获益的结果作为最终结果，以避免中药作用的假阳性，在这种情况下，如果仍支持中药维持获益，则中药维持获益的结果可信度较高。结果显示：参见表9，疾病进展风险方面，与西医维持治疗比较，中医药维持降低疾病进展风险的获益更高(hr，95％ci：0.53，0.31-0.91)，两种模型结果差异<10％,基本一致。与西医维持治疗比较，西医维持基础上加上中医药维持可以降低疾病进展风险(hr，95％ci：0.46，0.27-0.78)。与中医维持治疗比较，中西医维持具有降低疾病进展风险的趋势，但无统计学意义(hr，95％ci：0.79，0.50-1.23)。在腺癌亚组中，与西医维持治疗比较，中医药维持有降低疾病进展风险的趋势。与西医维持治疗比较，西医维持基础上加上中医药维持可降低疾病进展风险(hr，95％ci：0.56，0.31-1.02)。与中医维持治疗比较，中西医维持可降低疾病进展风险(hr，95％ci：0.60，0.36-0.98)。表9疾病进展风险的多因素cox回归分析模型一：调整了：性别、年龄、心血管病史、病理类型、基因状态、分期、吸烟情况、一线化疗方案、一线抗血管治疗情况、疗程数(4，>4)。模型二：调整了:kps评分；吸烟状态；抗血管治疗；一线疗效。按在基本模型中引进协变量或在完整模型中剔除协变量对治疗手段的回归系数的影响>10％的标准筛选影响死亡风险的协变量，采用cox模型进行协变量筛选，筛选出影响死亡风险的协变量包括：性别、年龄、心血管病史、糖尿病病史、病理类型、kps评分、吸烟情况、一线化疗方案、一线抗血管治疗情况、疗程数、二线治疗情况。cox多因素模型记为模型一。模型二调整kps评分，吸烟状态，一线抗血管治疗，一线疗效。结果显示，参见表10，在死亡风险方面，两个模型结果基本一致，与西医维持治疗比较，单纯中医维持、西药维持基础上加上中医药维持，均可降低大约50％的死亡风险。与中医维持治疗比较，中西医维持不能降低死亡风险。在腺癌亚组中，结果基本一致。表10死亡风险的多因素cox回归分析模型一：调整了：性别、年龄、心血管病史、糖尿病病史、病理类型、kps评分、吸烟情况、基因情况、一线化疗方案、一线抗血管治疗情况、疗程数(≤4，>4)、二线治疗情况。模型二：调整了:kps评分；吸烟状态；抗血管治疗；一线疗效。3.1小结通过对163例维持治疗的患者进行分析，我们得到以下结果：①与单纯西医维持治疗比较，中西医结合治疗可以延长中晚期nsclc的无疾病进展生存期和总生存期。②与单纯西医维持治疗比较，中医治疗延长中晚期nsclc的总生存期，并有延长无进展生存期的趋势。③与单纯中医维持治疗比较，中西医维持治疗有延长中晚期nsclc的无进展生存期的趋势，但无延长总生存期的趋势。④腺癌亚组中，在无进展生存期方面中西医维持治疗疗效最佳，总生存期方面中医维持治疗、中西医维持治疗无明显差异，均优于西医维持组。⑤对比西医维持和中医维持的无进展生存期和总生存期的获益情况，推断西医维持治疗的疗效特点是短期获益，可以延长无进展生存期，但总生存期无获益；而中医治疗的疗效特点是长期获益，既可以延长无进展生存期，又可以延长总生存期。特别是中药治疗有类似于免疫治疗疗效特点的生存拖尾效应，有部分患者的无疾病进展生存期非常长，即使中西医维持组中患者的西医维持治疗早已中止。3.2本实施例的优势和创新点本实施例有以下研究优势：第一，本实施例是近年来为数不多较大样本量的真实世界研究。我们严格按照strobe标准进行了研究分析和报道。以往中医药维持治疗中晚期nsclc的研究多为随机对照研究，但样本量低，方法学不够严谨，结果的偏倚风险较高，同时不能反映真实世界的中医药治疗情况。前期进行的少量队列研究报告不够规范。第二，在设计和统计分析过程中采用了几种方法降低了偏倚风险：①在纳入人群的特征上，我们将研究中的患者局限于那些病情严重程度和身体状况相似的中晚期nsclc患者；排除了一线治疗不规范或接受局部治疗的患者，这些患者所占比例较少，但是重要的混杂因素；排除了维持治疗中接受了靶向治疗或非常规化疗方案的患者(如口服替吉奥、希罗达等)，均是重要混杂因素但占比较少，减轻了混杂因素带来的偏性。②在纳入人群中排除了随访时间间期超过2个月，随访次数少于1次的患者，降低了观察偏性。且因为此条件排除的患者较少，对选择偏性影响不大。③全面收集了潜在的预后因素，如性别、年龄、吸烟状况、ps、分期、病理学、肿瘤转移情况，合并症，一线治疗方式和疗程数，一线疗效评估等可能影响预后的因素，并且缺失数据很少。④采用多元回归模型和分层控制了混杂。通过上述努力，我们尽可能地降低了选择偏性、观察偏性和混杂偏性，因此本实施例产生假阳性结果的可能性很低。3.3试验结果的可靠性及与既往研究的对比分析本实施例中的西医维持组患者主要来源于外院经过维持治疗进展后再来我院就诊的患者。因此，在基线中可以看到中医维持组和中西医维持组的抗血管药物所占比例和肺鳞癌类型所占比例，比西医维持组低；西医维持组中鳞癌患者接受了更高比例的抗血管治疗(特别是鳞癌患者中重组人血管内皮生长抑制因子的应用占比较高)，部分缓解以上的患者占比更高，这可能是由于以下几方面原因：①首次发病即来到中医院的患者经济情况相对较差，经济上不能承受抗血管药物，抗血管生成治疗的应用少可能导致了较低的疾病缓解率。②我院既往开展局部冷冻治疗技术较多，在鳞癌维持治疗阶段疗效不明确的情况下，更多鳞癌患者接受了局部治疗，鳞癌患者较少使用重组人血管内皮生长抑制因子抗血管生成治疗，导致了以上差异。再者，西医维持组中接受维持治疗直到进展的患者占比更高，而中西医维持组接受西医维持治疗直到病情进展的比例较低，可能是由于中医院的患者有更多的维持治疗选择，以及中医院医生对中药维持疗效的认可，导致了维持化疗的中止。的确，多个患者在停止维持化疗后继续采用中药维持，仍然有很长的无进展生存期。本实施例结果显示，中医药+化疗维持对比单纯化疗维持的pfs结果与许玲等所报道的结果(西医维持组3.73月，中西医维持组6.43月)基本一致[6]。单纯中医药维持的pfs(3.70月)稍长于李和根等所报道的结果(3.30月)[7]。本研究结果中的单纯中医维组持的os(21.8月)与李和根等报道的os基本一致(21.5月)[7]，稍长于刘苓霜等报道的os(18.8月)[8]。而西医维持组比既往报道的生存期略短，可能与入组患者的体力评分(0-2分)差于既往研究的患者体力情况(ps0-1分)有关。从生存结局来看，本研究的选择偏倚应较小。在西医维持治疗的作用方面，我们对比了中医维持及中西医维持治疗的差异，通过多因素回归分析，选取了更有利于支持西医维持治疗的结果，目前的结果支持西医维持治疗在无进展生存期方面的疗效，但总生存期无获益，与既往研究的结果基本一致。本实施例亦通过对比西医维持及中西医维持治疗的差异分析中医维持治疗的作用。从研究结果中可以看出，在西医维持组中抗血管维持治疗的比例更高，西医维持治疗直到进展的比例更高，两组的维持治疗疗程数无明显差异。推理来说，中医的结果更容易偏向假阴性，在此情况下，获得重要获益的阳性结果，则更加支持中药获益的可靠性。3.4本实施例的临床意义及推广性这个研究的临床意义在于为中医药维持治疗在中晚期nsclc中的应用提供了循证证据。除非有显著证据证明纳入到本研究的患者与其他中晚期nsclc患者有显著差异，我们认为这种综合治疗模式可以推广到中国所有的中国晚期nsclc患者。实施例2益气除痰方抑制肺癌进展的分子机制本实施例主要进行以下两方面研究，第一，采用静脉移植模型进一步确认益气除痰方抑制转移的作用，分析益气除痰方对癌相关成纤维细胞的作用；第二，采用多个细胞株明确中药复方通过调控内质网应激抑制上皮间质转化的作用机制。1材料1.1实验动物小鼠：c57bl/6j，雌性，来源北京维通利华实验小鼠技术有限公司，4-6周龄，16-18g。1.2细胞株llc-hmuc1-gfpc9，由中科蓝华生物科技公司赠予。a549细胞株、人源egfr突变的非小细胞肺癌耐药细胞株h1975和h1650购买于美国典型培养物保藏中心。1.3试剂如下表11所示。表11试剂1.4仪器如下表12所示。表121.5药物益气除痰方(yqct)，由西洋参、法半夏等药物组成，方中所用中药材均购自广州中医药大学第一附属医院中药房。2方法2.1llc-hmuc1-gfp细胞复苏、培养与传代液氮管里取出llc-hmuc1-gfp冻存管，迅速放置37℃水浴锅中解冻，将细胞悬液加入预先准备的pbs中，离心(250×g，4min)；弃上清液，用dmem完全培养基(含10％fbs)重悬细胞，放置培养皿中，在5％co2、37℃恒温培养箱中静置培养。2-3天传代，按照1：3稀释方式传，当细胞长满培养皿底部的80％时，经0.25％胰酶-edta消化液消化后传代。2.2益气除痰方及益气除痰方加减方浸膏的制备益气除痰方，以下称为处方1，组成：法半夏9g，僵蚕10g，灵芝12g，龙葵12g，猫爪草30g，山慈菇9g，西洋参6g，浙贝10g，肿节风30g，共计128g。制法：按处方剂量，称取处方原料，其中法半夏(主要抗肿瘤活性物质为生物碱)、僵蚕(水提醇沉无具有抗凝作用)、龙葵(主要活性物质为生物碱类、多糖类)、猫爪草(主要活性物质为多糖类)、山慈菇(主要活性物质为生物碱类)、浙贝(主要活性物质为生物碱类、皂苷类)，以上药味混匀，加8倍量水提取1.5小时，提取液用3000r/min离心10分钟后再以滤纸抽滤，取滤液，药渣再加6倍量水提取1小时，提取液同法离心、抽滤，取滤液，合并滤液，得滤液a。灵芝(主要活性物质为灵芝多糖、灵芝酸)、西洋参(主要抗癌活性物质为皂苷类)、肿节风(主要活性物质为反丁烯二酸、异嗪皮啶、黄酮类化合物)，以上药味混匀，加8倍量70％乙醇提取1.5小时，提取液同法离心、抽滤，取滤液，药渣再加6倍量70％乙醇提取1小时，提取液同法离心、抽滤，取滤液，合并滤液，得滤液b。滤液a于60℃减压浓缩至适宜体积，滤液b于45℃减压浓缩至适宜体积，合并a与b，再于60℃减压浓缩至1ml浓缩液约含1g生药量的体积，得到处方1浸膏，将浸膏置于-20℃冷冻过夜，迅速取出，置于冷冻干燥机中干燥(-45℃)至浸膏成干粉，取出，粉碎混匀，即可。益气除痰方加减方，以下简称处方2，组成：法半夏9g，僵蚕10g，灵芝12g，龙葵12g，猫爪草30g，山慈菇9g，西洋参6g，浙贝10g，肿节风30g，半枝莲30g，红豆杉7g，共计165g。制法：按处方剂量，称取处方原料，其中法半夏、僵蚕、龙葵、猫爪草、山慈菇、浙贝，以上药味混匀，加8倍量水提取1.5小时，提取液用3000r/min离心10分钟后再以滤纸抽滤，取滤液，药渣再加6倍量水提取1小时，提取液同法离心、抽滤，取滤液，合并滤液，得滤液a。灵芝、西洋参、肿节风、半枝莲(主要物质为黄酮类化合物)、红豆杉(主要为紫杉烷二萜类、黄酮类)，以上药味混匀，加8倍量70％乙醇提取1.5小时，提取液同法离心、抽滤，取滤液，药渣再加6倍量70％乙醇提取1小时，提取液同法离心、抽滤，取滤液，合并滤液，得滤液b。滤液a于60℃减压浓缩至适宜体积，滤液b于45℃减压浓缩至适宜体积，合并a与b，再于60℃减压浓缩至1ml浓缩液约含1g生药量的体积，得到处方2浸膏，将浸膏置于-20℃冷冻过夜，迅速取出，置于冷冻干燥机中干燥(-45℃)至浸膏成干粉，取出，粉碎混匀，即可。2.3llc-hmuc1-gfp细胞尾静脉接种造模本实施例采用llc静脉移植模型。对数生长期的llc-hmuc1-gfp细胞，弃培养基，用pbs洗一次，用0.25％胰酶-edta消化液消化1-2min，吸去胰酶，用完全培养基中和，吹打均匀成细胞悬液，离心(250g，4min)，弃上清液，用pbs洗涤3次，最后用pbs震荡重悬细胞。用台盼蓝排除法计数活细胞数，用pbs制备成2.5×106/ml单细胞悬液。将2.5×106/mlllc-hmuc1-gfp单细胞悬液尾静脉注射接种到c57bl/6小鼠上，每只注射200μl，制备小鼠尾静脉模型。2.4实验分组及干预措施本实施例为进一步优化处方，增加疗效，设置了益气除痰方加减组，以观察加入红豆杉是否可以增加其抗转移和延长生存期的疗效。接种第二天称重，将小鼠随机分成5组：模型组(生理盐水组)，处方1(益气除痰方原方)低剂量组、处方1高剂量组、处方2(益气除痰方+红豆杉)低剂量组，处方2高剂量组，每组各18只。处方1：128g生药/处方，1g生药相当于0.18g浸膏粉，浸膏得率约为：17.9％，临床用量：128*0.18＝23.04g/d，小鼠用量：23.04/60*10＝3.84g/kg，低剂量：3.84*2＝7.68g/kg，换算小鼠量：0.1536g/20g，高剂量：3.84*4＝15.36g/kg，换算小鼠量：0.3072g/20g。小鼠灌胃体积为20μl/g，低剂量灌胃浓度：0.384g/ml，高剂量灌胃浓度：0.768g/ml。处方2：165g生药/处方，1g生药相当于0.14g浸膏粉，浸膏得率约为：13.7％(增加了红豆杉)，临床用量：165*0.14＝23.04g/d，小鼠用量：23.1/60*10＝3.85g/kg，低剂量：3.85*2＝7.7g/kg，换算小鼠量：0.154g/20g，高剂量：3.85*4＝15.4g/kg，换算小鼠量：0.308g/20g，小鼠灌胃体积为20μl/g，低剂量灌胃浓度：0.385g/ml，高剂量灌胃浓度：0.77g/ml。灌胃药物准备：称量相应的药物溶解到50ml灭菌蒸馏水，分装到5ml离心管中，-20℃保存，灌胃前，将其放入50-60℃水浴中加热，灌胃药物为常温或略高于常温。2.5常规检测指标每3天称一次体重，绘制小鼠的体重曲线。每天监测小鼠死亡情况，绘制生存率曲线。观察不良反应(精神差、活动迟缓、弓背、进食少)。动物接种天数为88天，给药87天，给药28天停药，3天后再给药。给药40天各组随机挑选5只解剖观察肺部病灶，称量各脏器重量，将各脏器一部分中性福尔马林固定，一部分放-80℃存储。2.6免疫组化检测肺部病灶的转移相关指标表达(1)石蜡切片：玻片置60℃烤箱烘烤3h，然后可以保存在4℃冰箱。实验前，先将玻片置60℃烤箱中烘烤30min。脱水包埋切片后获得4um厚的组织切片，捞在防脱的硅化玻片上。(2)石蜡切片脱蜡：趁热放在二甲苯脱蜡3×5min。(二甲苯可以放在水浴里加热，需要在通风橱做)。二甲苯与无水乙醇1:1混匀：5min；无水乙醇2×3min，95％酒精2×3min，85％酒精1×3min，75％酒精1×3min，蒸馏水流洗。(抗原修复前确保切片一直浸没在水中，切勿变干，变干后会导致非特异性抗体结合产生高背景)(3)将玻片置于0.01mph6.0的柠檬酸盐溶液中，在95℃水浴锅中加热。玻片自然冷却至室温。pbs洗三次，每次3min。滴加山羊血清或小牛血清封闭1h。甩去山羊血清或小牛血清，滴加一抗4℃孵育过夜。常温复温45min。pbs洗三次，每次3min。滴加二抗孵育30min。pbs洗三次，各3min。新鲜配置的dab显色1～5min，或者密切注视显色程度而随时终止反应。蒸馏水洗10min，以终止显色。苏木素染色2min，自来水冲洗15min，95％、100％酒精两缸各两次，二甲苯洗两次各5min，封片。隔天显微镜观察并拍照，根据染色强度及染色面积进行结果判读。2.7益气除痰方(益肺散结丸)的预处理因既往细胞实验中益气除痰方原药干预浓度较高，且该方(益肺散结丸院内制剂)难以直接溶于水中，为了增加药物的溶解度，降低细胞试验中益气除痰方的浓度，我们进行以下处理：称取益气除痰方(益肺散结丸)20g，充分研碎后倒入500ml的锥形瓶，在500ml的锥形瓶中加入200ml的超纯水，用玻璃棒充分搅匀，使研碎后的中药粉末尽量溶于200ml的水中，在50度的水浴锅中煮1个小时，增加药物的溶解度(因丸剂已经进行了有效成分的提取，温度太高会破坏有效成分，经摸索50度为适宜温度)；过滤抽提不溶的药物，旋转蒸发仪上把过滤好的水提取物旋转剩下20ml，在冻干机上冻干48h，称量冻干粉的质量是2g。2.8迁移实验为了进一步验证益气除痰方精制后对肺癌细胞迁移侵袭能力的影响，采用划痕实验进行验证。分组如下：control组：不干预；tgf-β组：tgf-β5ng/ml孵育24h；tgf-β+yqct组：tgf-β5ng/ml+益气除痰方yqct0.5mg/ml孵育24h。在6孔板中中加入约5×105个细胞，培养24h后，用枪头划痕，枪头要垂直，不能倾斜，用pbs洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5％co2培养箱，加入各组培养液。按0，24小时取样，拍照。计算迁移率。2.9westernblot检测细胞中的蛋白表达水平(1)细胞分组：为了进一步验证益气除痰方对肺癌细胞上皮间质转化的影响，增加了h1650、h1299细胞进行进一步验证。分组如下：control组：不干预tgf-β48h组：tgf-β5ng/ml孵育48htgf-β+益气除痰方(yqct)48h组：tgf-β5ng/ml+yqct0.5mg/ml孵育48h(2)总蛋白抽提。按1ml裂解液加10μlpmsf(100mm)和10μlcocktail，摇匀置于冰上(pmsf要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。每管细胞加100μl含pmsf和的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解要经常来回摇动裂解完后于4℃下14000rpm离心5min。(提前开离心机预冷)。将离心后的上清分装转移倒干净的离心管中放于-80℃保存。将提取好样品的蛋白溶液和5×上样缓冲液按4：1混合，煮沸10min，缓慢恢复室温后，稍离心，放于-20℃保存。(3)蛋白样品初步定量。参照南京凯基生物发展有限公司提供的试剂盒说明书操作说明，货号为：kgpbca，按下表13稀释标准样品制作标准曲线：稀释实验样品：每个样品取2μl，加38μlh2o稀释20倍。按顺序排列好。配制bca试剂浓度测定工作液：取50体积a液，加入1体积b液，充分混匀，现配现用。准备96孔板，各取20μl稀释好的标准样品和实验样品于96孔板中。每孔加入200μl工作液，37℃避光孵育30min。于酶标仪中读取吸光值即od值，波长为560nm。表13标准样品(4)sds-page电泳。凝胶电泳前，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端。根据样品的上样顺序和上样体积依次上样。电泳：80v恒压电泳至溴酚蓝至分离胶后，120v恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。(5)转膜。pvdf膜甲醇预处理3～5秒，放至转膜缓冲液浸润半小时。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层，滤纸，凝胶，pvdf膜，滤纸，凝胶转印堆积层这样的“三明治”结构。按正负极方向放置转印夹。低温条件下，100v恒压根据蛋白分子量每1kda转膜1分钟来进行转膜。(6)免疫印记。取出杂交膜，tbst漂洗5min，1次。5％脱脂奶粉溶液室温封闭1小时。tbst洗膜10min，1次。合适的一抗稀释浓度4℃过夜。tbst洗膜10min，4次。相应二抗稀释液37℃孵育1h。tbst洗膜10min，4次。将杂交膜置于一透明塑料板上，注意不要让膜干燥。用一干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用试剂盒提供的滤纸吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒。(7)显影。配制ecl化学发光液，将杂交膜浸泡于ecl化学发光液5min，移至自动显影仪显影，拍照并分析。以gapdh为内参计算相对各目的蛋白相对表达量。2.10定量pcr检测细胞中的mrna表达水平(1)细胞分组及干预方式。为了进一步验证益气除痰方对肺癌细胞上皮间质转化的影响并同时分析内质网应激反应是否参与了tgf-β诱导的上皮间质转化，选用4-pba(内质网应激抑制剂)进行验证。分组如下：control组：不干预tgf-β12h组：tgf-β5ng/ml孵育12htgf-β24h组：tgf-β5ng/ml孵育24htgf-β48h组：tgf-β5ng/ml孵育48htgf-β+4-pba48h组：tgf-β5ng/ml+4-pba10mmol/l孵育48htgf-β+yqct48h组：tgf-β5ng/ml+yqct0.5mg/ml孵育48h(2)rna提取及pcr方法同第三部分。设计的引物如下表14所示：表14引物序列2.11统计分析使用ibmspssstatistics24.0及graphpadprism检测进行统计分析，数据测量值表示为平均值(mean)±标准偏差(sd)，体重变化曲线采用prism的2-wayanova分析和spss的混合效应模型分析，生存时间比较采用log-rank(mantel-cox)test进行分析。转移灶及脏器指数的变化，用spss软件的shapiro-wilk进行正态性检验，p＜0.05，表示数据不服从正态分布，p＞0.05，表示数据服从正态分布，若不符合正态分布则用levene’s方差齐性检验来检验方差齐性，p＜0.05，表示数据方差不齐，p＞0.05，表示数据符合等方差性，结果显示等方差，等方差者采用单因素方差分析进行总体比较，用多重比较法的lsd法和bonferroni法进行多个均数间的多重比较；方差不齐时，总体比较用kruskal-wallish检验，多重比较采用nemenyi。细胞实验多组间比较采用prism的onewayanova分析，两组间比较采用t检验。设检验水准α＝0.05，当p<0.05时认为存在统计学意义。3结果3.1益气除痰方对lewis静脉移植模型小鼠体重的影响从小鼠体重曲线总图5观察，给药组与模型组体重增长趋势一致，但是后期死亡动物影响体重，所以体重曲线呈现不规律。将肿瘤接种39天前小鼠体重数据用graphpadprism的2-wayanova分析和spss的混合效应模型分析，处方1低剂量体重曲线与模型组有统计学差异，处方1低剂量体重曲线与处方2低剂量组有统计学差异，处方2低剂量与模型组没有统计学差异，提示益气除痰方原方可以增加荷瘤小鼠的体重。3.2益气除痰方对lewis静脉移植模型小鼠生存期的影响生存曲线结果(参见图6)分析，模型组中位生存期为51.5天，处方1低剂量中位生存期为56天，处方1高剂量中位生存期为50天，处方2低剂量中位生存期为42天，处方2高剂量中位生存期为44天，利用graphpadprism统计分析，log-rank(mantel-cox)test结果显示模型组与其他各组没有统计学差异，处方1低剂量组与处方2高剂量组有统计学差异。利用spss的logrank检测结果与graphpadprism的log-rank(mantel-cox)test一致。截至肿瘤接种87天，模型组还剩1只，处方1高剂量组还剩1只动物。处方2高剂量有3只动物在灌胃第8天死亡，处方1低剂量和处方2低剂量各有一只动物在灌胃第32天出现步伐不稳情况，然后进行解剖观察，将这5只特殊情况数据删除后生存曲线如图6b。利用graphpadprism统计分析(参见表15和16)，log-rank(mantel-cox)test结果显示模型组与其他各组没有统计学差异，处方1低剂量组与处方2高剂量组有统计学差异。尽管处方1与模型组无明显差异，但生存期仍有延长趋势。根据此结果，我们认为，益气除痰方的低剂量组疗效最佳。表15各组的中位生存期(graphpadprism软件分析)表16各组的中位生存期(删除非肿瘤死亡)3.3益气除痰方对lewis静脉移植模型小鼠转移灶的影响肿瘤接种40天后，每组随机选取5只小鼠解剖取肺脏，在解剖显微镜下观察肺病灶。从柱状图7看出，处方1低剂量和处方2高剂量肺部转移灶平均值比模型组少，处方1高剂量和处方2低剂量比模型组多，其中处方1低剂量组与模型组比较减少41.18％。将各组数据用spss软件的shapiro-wilk进行正态性检验，结果显示模型组和处方1高剂量组不符合正态性分布，因此用levene’s方差齐性检验来检验方差齐性，结果显示等方差，方差分析结果显示不同处理组对小鼠肺部转移灶数量没有影响，用多重比较法的lsd法和bonferroni法进行多个均数间的多重比较，结果显示各组两两对比没有统计学差异。3.4益气除痰方对lewis静脉移植模型小鼠各脏器的影响肿瘤接种40天后，每组随机选取5只小鼠解剖取各脏器，称量重量。脏器指数计算公式为(脏器重量/体重)×100，利用graphpadprism绘图，spss的单因素方差分析对数据进行分析。将各组数据用spss软件的shapiro-wilk进行正态性检验，结果显示非正态性分布，因此用levene’s方差齐性检验来检验方差齐性，p＜0.05，表示数据方差不齐，p＞0.05，表示数据符合等方差。根据统计结果归纳不同脏器重量和脏器指数的检验方式和多重比较方法(参见表17)。表17不同脏器重量和脏器指数的检验方式和多重比较方法3.4.1脾脏重量和脏器指数分析脾脏重量柱状图和脏器比柱状图8a显示除处方2低剂量外，其他组均比模型组低，处方1低剂量组脾脏重量最低，提示处方1低剂量可能干预脾脏重量。spsskruskal-wallish检验显示不同组的脾脏重量没有差异，脏器指数没有差异。nemenyi法多重比较检验结果显示各组两两对比没有差异，脾脏脏器指数两两比较结果同样没有差异。3.4.2肝脏重量和脏器指数分析肝脏重量柱状图和脏器指数柱状图8b结果显示各给药组均比模型组高，肝脏重量用spsskruskal-wallish检验显示不同组的肝脏重量没有差异，nemenyi法多重比较检验结果显示模型组与处方2高剂量比较有统计学差异。肝脏脏器指数用spss的单因素方差分析结果显示不同组对小鼠肝脏重量没有差异，用lsd法和bonferroni法进行多个均数间的多重比较，lds检验显示模型组与处方2高剂量比较有统计学差异，但bonferroni检验，各组间两两对比没有差异。3.4.3心脏重量和脏器指数分析心脏体重柱状图和脏器指数柱状图8c显示，处方2低剂量比其他组低，用spss的单因素方差分析结果显示不同组的小鼠心脏重量没有差异，脏器指数也没有差异，用lsd法和bonferroni法进行多个均数间的多重比较，心脏重量的lds检验显示处方2低剂量与处方1低剂量和处方2高剂量有统计学差异，心脏脏器指数的lds检验显示模型组与处方2低剂量比较有差异，处方1高剂量与处方2低剂量比较有差异，但bonferroni检验，心脏重量和心脏脏器指数各组间两两对比没有差异。3.4.4肾脏重量和脏器指数分析肾脏体重柱状图和脏器指数柱状图8d显示除了处方2低剂量，其余组均比模型组高，用spss的单因素方差分析结果显示不同组的小鼠肾脏重量没有差异，lds检验显示，处方1低剂量与处方2低剂量比较具有差异，bonferroni检验没有差异。肾脏脏器指数用spsskruskal-wallish检验显示不同组的心脏脏器指数没有差异，nemenyi法多重比较检验结果显示各组两两间对比没有差异。3.5益气除痰方对lewis静脉移植模型小鼠肿瘤转移灶上皮间质转化标志物表达的影响。经免疫组化染色后各目的蛋白表达阳性的细胞呈棕黄色，蛋白表达越强，染色越深。本实施例免疫组化结果显示，中药组瘤体组织内细胞的emt相关标记物e-cadherin蛋白较对照组升高，而vimentin蛋白下降，提示益气除痰方可在体内抑制emt的发生，从而降低肿瘤细胞的侵袭转移能力(参见图9)。3.6益气除痰方对lewis静脉移植模型小鼠肿瘤转移灶癌相关成纤维细胞的影响免疫组化结果(参见图10)显示，模型组瘤体组织内细胞的a-sma蛋白染色呈棕黄色，阳性染色细胞数多，而处方1低剂量治疗组a-sma蛋白染色呈淡黄色，且阳性染色细胞数少，治疗组的a-sma表达下降；模型组组中tgf-β1呈弥漫性强阳性表达，处方1低剂量治疗组染色强度降低，tgf-β1表达降低，说明益气除痰方可以抑制肿瘤组织内癌相关成纤维细胞的激活，减少tgf-β的表达或分泌。3.7益气除痰方对肺癌细胞迁移能力的影响采用tgf-β进行建模，益气除痰方进行干预，采用划痕实验测定细胞迁移能力，结果表明在划痕24h后空白对照组细胞划痕的缺口已逐渐缩小，而tgf组在已逐渐缩小至接近愈合的状态，益气除痰方和tgf-β组比对照组细胞缺口较大，缺口愈合情况差。与空白对照组比较，0.5mg/ml益气除痰方的迁移率明显下降，差异有统计学意义，与tgf-β组相比，益气除痰方中药组的细胞缺口较大，这表明益气除痰方可以显著抑制a549细胞的迁移能力(图11)。3.8益气除痰方抑制a549、h1650、h1299肺癌细胞上皮间质转化的能力采用tgf-β进行建模，益气除痰方进行干预，westernblot检测上皮间质转化的分子标志物，分析益气除痰方对上皮间质转化能力的抑制作用。在模型组a549细胞emt相关标志物出现了特征性的变化，代表上皮表型的zo-1蛋白表达下降(与对照组比较，p＜0.05)，e-cadherin蛋白有下降趋势，但无统计学意义，而代表间质表型的vimentin和n-cadherin蛋白表达明显升高(与对照组比较，p＜0.05)，提示a549细胞发生了上皮间质转化。而加入益气除痰方干预后，与模型组比较，zo-1蛋白表达明显升高(与tgf-β模型组比较，p＜0.05)、vimentin和n-cadherin表达均出现明显下降(与模型组比较，p＜0.05)，提示益气除痰方可以明显抑制a549细胞emt的发生(图12)。在模型组h1650细胞emt相关标志物出现了特征性的变化，代表上皮表型的e-cadherin蛋白表达下降(与空白对照组比较，p＜0.05)，而代表间质表型的vimentin和n-cadherin蛋白表达明显升高(与空白对照组比较，p＜0.05)，上皮间质转化转录因子snail表达上调(与空白对照组比较，p＜0.05)，提示h1650细胞发生了上皮间质转化。而加入益气除痰方干预后，与模型组比较，vimentin、n-cadherin、snail表达均出现明显下降(与模型组比较，p＜0.05)，但e-cadherin无明显变化，提示益气除痰方可以明显抑制h1650细胞emt的发生(图13)。在tgf-β诱导下，模型组h1299细胞emt相关标志物出现了特征性的变化，代表上皮表型的e-cadherin蛋白表达下降(与对照组比较，p＜0.05)，zo-1下调不明显，代表间质表型的vimentin蛋白表达明显升高(与对照组比较，p＜0.05)，上皮间质转化转录因子snail表达上调(与对照组比较，p＜0.05)，提示h1299细胞发生了上皮间质转化。而加入益气除痰方干预后，与模型组比较，vimentin、snail表达均出现明显下降(与模型组比较，p＜0.05)，zo-1表达上调，但e-cadherin无明显变化，提示益气除痰方可以明显抑制h1299细胞emt的发生(图14)。3.9益气除痰方对内质网应激相关通路的影响。采用tgf-β进行建模，益气除痰方进行干预，westernblot检测内质网应激相关通路蛋白的表达。根据图15显示，在h1650细胞中，模型组tgf-β培养48h后，grp94表达稍提高，atf4表达有下降趋势，p-src表达明显升高，提示tgf-β48h促进内质网应激蛋白grp94的表达、激活src通路促进上皮间质转化，但对atf4蛋白的表达影响不明显。与tgf-β模型组比较，加入益气除痰方干预后，grp94和atf4表达明显下调(与模型组对比，p<0.05)，p-src表达明显下调(与模型组对比，p<0.05)，提示益气除痰方可以抑制grp94和atf4的表达，抑制src通路的激活。在h1299细胞中，模型组tgf-β培养48h后，grp94、atf、p-src表达明显升高，提示tgf-β48h可以促进h1299细胞内质网应激蛋白grp94、atf4蛋白的表达，可以激活src通路促进上皮间质转化。与tgf-β模型组比较，加入益气除痰方干预后，grp94和atf4表达明显下调(与模型组对比，p<0.05)，p-src表达明显下调(与模型组对比，p<0.05)，提示益气除痰方可以抑制h1299细胞grp94和atf4的表达，抑制src通路的激活(图16)。我们分析了tgf-β作用a549细胞后不同时间点内质网应激标志物xbp1的影响，结果表明，在48h后xbp1mrna表达明显上调(与对照组比较，p<0.05)；加入内质网应激抑制剂4-pba后xbp1mrna表达明显下调(与tgf-β比较，p<0.05)。益气除痰方同样有下调xbp1mrna的作用(与tgf-β比较，p<0.05，图17)。snail是xbp1的直接转录靶标[9]，同时是上皮间质转化的标志转录因子。我们分析了tgf-β作用不同时间点后snailmrna的表达及4-pba、益气除痰方对snailmrna的影响，结果表明，在24h后snailmrna表达即明显上调(与对照组比较，p<0.05)；48h后仍维持较高的表达水平。加入内质网应激抑制剂4-pba后snailmrna表达明显下调(与tgf-β比较，p<0.05)。益气除痰方同样有下调snailmrna的作用(与tgf-β比较，p<0.05)。sox4也是促进上皮间质转化的重要调节蛋白，我们也分析了tgf-β作用不同时间点后sox4mrna的表达及4-pba、益气除痰方对sox4mrna的影响，结果表明，在24h后sox4mrna表达即明显上调(与对照组比较，p<0.05)；48h后仍维持较高的表达水平。加入内质网应激抑制剂4-pba后sox4mrna表达明显下调(与tgf-β比较，p<0.05)。益气除痰方同样有下调sox4mrna的作用(与tgf-β比较，p<0.05)。4、总结4.1益气除痰方抑制肺癌转移的作用本实施例选用了lewis肺癌静脉种植模型来进一步验证益气除痰方抑制肺癌转移的作用，结果表明益气除痰方可以抑制肺癌的转移，延长总生存期。4.2益气除痰方抑制癌细胞上皮间质转化的作用本实施例采用多个细胞系验证益气除痰方对肺癌细胞emt的影响，研究发现益气除痰方对3个细胞系中间质表型的蛋白，特别是vimentin抑制更加明显，而对上皮表型的蛋白表达不一致。4.3tgf-β对上皮间质转化的作用及益气除痰方的干预作用本实施例采用tgf-β诱导多个细胞株的上皮间质转化，结果显示益气除痰方可以抑制多个肺癌细胞株的上皮间质转化。4.4内质网应激在tgf-β诱导上皮间质转化中的作用及益气除痰方的干预目前tgf-β诱导上皮间质转化过程中是否有内质网应激参与较少文献报道，本实施例结果表明，tgf-β诱导上皮间质转化过程中，促进了grp94、atf4、xbp1等内质网应激蛋白或基因的高表达，加入内质网应激抑制剂后，snail及sox4基因表达下调，提示抑制内质网应激可以抑制tgf-β诱导的上皮间质转化，内质网应激在tgf-β诱导的上皮间质转化过程中发挥重要作用。而益气除痰方可以下调grp94、atf4及xbp1的表达。因此，益气除痰方抑制上皮间质转化的作用可能与其下调grp94、atf4及xbp1有关。4.5益气除痰方抑制癌相关成纤维细胞的作用本实施例对肺部转移灶进行a-sma(cafs活化标志物)、tgf-β1(cafs分泌产物)进行免疫组化，结果显示益气除痰方组转移瘤组织内a-sma、tgf-β1表达较模型组降低，提示益气除痰方能降低cafs细胞的数目。本发明是近年来样本量较大的关于中医药维持治疗中晚期非小细胞肺癌的真实世界研究。我们发现中医药维持治疗具有与西医化疗维持不同的疗效特点：以化疗为主的西医维持治疗可以延长无疾病进展生存期，但在延长总生存无明显获益，其获益点在短期疗效；益中医药维持即可以降低疾病进展风险，延长无疾病进展生存期，又可以降低死亡风险，延长总生存期。本发明率先揭示了益气除痰方可能抑制癌相关成纤维细胞活化，调控肺癌细胞在肿瘤微环境中的内质网应激反应，抑制上皮间质转化，抑制转移的作用机制。参考文献：1、jemala,brayf,centermm,etal.globalcancerstatistics[j].cacancerjclin,2011,61(2):69-90.2、chenw,zhengr,baadepd,etal.cancerstatisticsinchina,2015[j].cacancerjclin,2016,66(2):115-32.3、kahlertc,kallurir.exosomesintumormicroenvironmentinfluencecancerprogressionandmetastasis[j].jmolmed(berl),2013,91(4):431-7.4、vonelme,altmandg,eggerm,etal.thestrengtheningthereportingofobservationalstudiesinepidemiology(strobe)statement:guidelinesforreportingobservationalstudies[j].lancet,2007,370(9596):1453-7.5、schemperm,smithtl.anoteonquantifyingfollow-upinstudiesoffailuretime[j].controlclintrials,1996,17(4):343-6.6、wangq,jiaol,wangs,etal.maintenancechemotherapywithchineseherbmedicineformulasvs.withplaceboinpatientswithadvancednon-smallcelllungcancerafterfirst-linechemotherapy:amulticenter,randomized,double-blindtrial[j].frontpharmacol,2018,9:1233.7、jiangy,liuls,shenlp,etal.traditionalchinesemedicinetreatmentasmaintenancetherapyinadvancednon-small-celllungcancer:arandomizedcontrolledtrial[j].complementarytherapiesinmedicine,2016,24:55-62.8、刘苓霜,沈丽萍,姜怡,等.中医综合方案维持疗法对晚期非小细胞肺癌患者生存期的影响[j].中国中西医结合杂志,2014,34(5):526-30.9、cuevasep,erasop,mazonmj,etal.loxl2drivesepithelial-mesenchymaltransitionviaactivationofire1-xbp1signallingpathway[j].scirep,2017,7:44988.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12当前第1页12